JPH09512428A

JPH09512428A - リゾルベース開裂による突然変異の検出

Info

Publication number: JPH09512428A
Application number: JP7527754A
Authority: JP
Inventors: リチャードジー．エイチ．コットン; リマユイル; ボーリスダブリュー．ケンパー
Original assignee: アビテックディアゴノスティックスインク
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 1997-12-16
Also published as: DE69531612D1; EP0760002A4; US5698400A; WO1995029251A1; AU693198B2; EP0760002B1; CA2188660A1; ATE248224T1; CA2188660C; EP0760002A1; AU2425395A; US5958692A

Abstract

(57)【要約】同種の対照DNAと共にヘテロ二本鎖を形成させ、該ヘテロ二本鎖をヘテロ二本鎖内の少なくとも一個の単独の塩基対の誤対合を認識することができるリゾルベースと接触させるための、単離された被験核酸における一個又はそれ以上の突然変異を検出する方法が開示される。本発明の好適な態様において、リゾルベースはバクテリオファージ T4エンドヌクレアーゼ VIIである。

Description

【発明の詳細な説明】リゾルベース開裂による突然変異の検出発明の背景コーディングDNA及び非−コーディングDNA、並びにRNAにおける突然変異を検出する能力は、遺伝性疾患の診断の際に重要である。遺伝子の突然変異は、必須タンパク質をコードするDNA配列における単独のヌクレオチドの変化又は複数個のヌクレオチドの変化である。単独のヌクレオチドの変化又は複数個のヌクレオチドの変化により、遺伝子内でフレームシフト、終止コドン、又は非保存アミノ酸置換が生じることがあり、これらはそれぞれ独立に、コードされたタンパク質の不活性化を引き起こしうる。しかしながら遺伝子の突然変異は、機能的な変化を検出できないようなタンパク質産物（即ち、無害な多形性遺伝子）を生じる、いわゆる無害の場合もある。反復DNAにおける突然変異はまた、例えばヒトフラガイル-X症候群（human fragile-X syndrome）、脊椎及び延髄の筋ジストロフィー、並びに萎縮性筋硬直症などの疾患を引き起こすこともある。単独のヌクレオチドの変化又は複数個のヌクレオチドの変化を含む変異型の核酸は、変性し、その後に対応する野生型の核酸及び相補的な核酸とアニール化すると、一個又はそれ以上の塩基対の誤対合を形成する。例えばG：A、C：T、C：C 、G：G、A：A、T：T、C：A、及びG：Tは核酸のヘテロ二本鎖において見られる8 個のとりうる単独の塩基対の誤対合を表す。この際、核酸の鎖がRNAの場合にはU がTに置き換えられる。核酸のループは、ヘテロ二本鎖の少なくとも一本の鎖にD NA又はRNAの欠失、置換、挿入、転位、又は逆位が含まれる場合に形成される。数種のスクリーニング方法が、ヘテロ二本鎖におけるDNA誤対合を検出するためにこれまでに計画されてきた。これらの方法には、PCR−及びプライマー伸長に基づく検出法（Cotton，Curr．Opinion in Biotech．3，24(1992)参照）だけでなく、RN Ase Aによる消化法、化学的開裂法が含まれる。リゾルベース（resolvase）（例えば、酵母及びバクテリオファージT4のX−ゾルベース、Jensch et al.，EMBO J．8，4325(1989)参照）は、何百ものヌクレオチドを含む分岐したDNA代謝中間体（例えば十字形DNA）の分解に対して触媒作用を有する核酸分解酵素である。一般的にこれらの酵素は、DNAのねじれ部位近くに作用する（Bhattacharyya et al.，J，Mol．Biol．221，1191(1991)参照）。バクテリオファージT4の遺伝子49の産物であるT4 エンドヌクレアーゼ VII（Kleff et al.，EMBO J．7，1527(1988)参照）はリゾルベースであり（West，Annu．Re v．Biochem．61，603(1992)参照）、それはホリデー構造（Holliday structure ）を分解することが示された最初のものである（Mizuuchi et al.，Cell 29，35 7(1982)参照）。T4 エンドヌクレアーゼVIIは十字形DNA（Bhattacharyya et al. ，supra、Mizuuchi et al.，supra）及びDNAループ（Kleff et al.，supra）を認識することがわかっており、そこではパッチ修復が行われているらしい。バクテリオファージT7 エンドヌクレアーゼ Iも十字形DNAを認識して開裂することがわかっている（West，Ann．Rev．Biochem．61，603(1992)参照）。真核のリゾルベース、特に酵母のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から得られたリゾルベースが十字形DNAを認識して開裂することも開示されている（West，supra、Jensch，et al.，EMBO J．8，4325(1989)参照）。他のヌクレアーゼはDNAの誤対合を認識して開裂することがわかっている。例えばS1ヌクレアーゼは、被験DNAと対照DNAとがヘテロ二本鎖を形成するようにアニール処理された場合に、形成されたDNA誤対合を認識して開裂させる能力を有している（Shenk et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．72，989(1975)参照）。しかしながら開裂速度は非加速度的でゆっくりである（Dodgson et al.，Biochemist ry 16，2374(1977)参照）。大腸菌のMut Y修復タンパク質も、DNAの誤対合を検出して開裂する能力を備えている。しかしながらMut Y 修復タンパク質は、突然変異DNAセグメントに生じている全体の突然変異数のうち50％を検出する能力しかない（Lu et al.，Genomics 14，249(1992)参照）。発明の概要一般的に本発明は、単離された対照DNAに選択的にハイブリダイズする単離された被験核酸における一個又はそれ以上の突然変異を検出するための方法を特徴とする。この方法には、次の段階が含まれる。 a）単離された被験核酸及び単離された対照DNAを、変性された被験核酸及び変性された対照DNAを形成するよう十分に個別に又は共に変性する段階、 b）該被験核酸を該対照DNAに、被験核酸と対照DNAとの間でヘテロ二本鎖を形成するよう十分にアニール化する段階、 c）リゾルベースがヘテロ二本鎖に一個又はそれ以上のDNA開裂を生じさせる条件の下で、該ヘテロ二本鎖を該ヘテロ二本鎖における少なくとも一個の塩基の誤対合を認識することができるリゾルベースに接触させる段階、及び d）該単離された被験核酸における一個又はそれ以上の突然変異の存在の指標として開裂を検出する段階。この方法の好ましい態様におけるリゾルベースは、バクテリオファージリゾルベース、好ましくはバクテリオファージT4 エンドヌクレアーゼVII又はバクテリオファージT7 エンドヌクレアーゼIのいずれかである。又はこのリゾルベースは、真核細胞のリゾルベース、好ましくは酵母のサッカロミセス・セレビシエ（Sa ccharomyces cerevisiae）由来のリゾルベース、更に好ましくは酵母のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のEndo X1、Endo X2、又はEndo X3リゾルベースのうちのいずれかである。他の好ましい態様における被験核酸及び／又は対照DNAは、真核細胞、真正細菌細胞、バクテリオファージ、DNAウイルス、又はRNAウイルスのうちの一つに由来する。好ましいRNAウイルスとしては、ヒトT細胞白血病ウイルス及びヒト免疫不全ウイルスが含まれ、HTLV−Ｉ、HTLV−II、HIV−1、又はHIV−2のうちのいずれかであることが好ましい。好ましいDNAウイルスとしては、アデノビリデ（Ade noviridae）科、パポバビリデ（Papovaviridae）科、又はヘルペトビリデ（Herp etoviridae）科の一つが含まれる。他の好ましい態様において、対照DNAは真核細胞の癌遺伝子又は腫瘍のサプレッサー遺伝子、好ましくは哺乳動物の癌遺伝子又は哺乳動物の腫瘍サプレッサー遺伝子から単離される。好ましくは哺乳動物の癌遺伝子は、abl、akt、crk、erb −A、erb−B、ets、fes／fps、fgr、fms、fos、jun、kit、mil／raf、mos、myb 、myc、H−ras、K−ras、rel、ros、sea、sis、ski、src、又はyes癌遺伝子のうちのいずれかであり、また腫瘍サプレッサー遺伝子は、p53、網膜芽腫、好ましくはRB1、腺腫ポリポーシスコリ（adenomatous polyposis coli）、NF−1、NF− 2、乱H−1、MTS−1、MSH−2、又はヒト非−ポリポーシス遺伝子のうちのいずれかである。他の好ましい態様において対照DNAはβ−グロブリン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α₁−アンチトリプシン、21−ヒドロキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1α−サブユニット、ジヒドロプテリジンレダクターゼ、ロドプシン、β−アミロイド、神経生長因子、スーパーオキサイドジスムターゼ、ハンチントン病、嚢胞性繊維症、アデノシンデアミナーゼ、β−サラセミア、オルニチントランスカルバミラーゼ、コラーゲン、bcl−2、β−ヘキソサミニダーゼ、トポイソメラーゼII、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、フェニルアラニン4−モノオキシゲナーゼ、因子VIII、因子IX、ヌクレオシドホスホリラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、デュシェーネ型筋ジストロフィー、ボンヒッペルリンデュー病（vo n Hippel Lindeau）、又は真核細胞のマウスモデル化メンケス（Menkes）遺伝子のうちのいずれかである。他の好ましい態様において、対照DNAは細胞周期調節タンパク質、好ましくはp 21、p27、又はp16をコードする遺伝子である。他の好ましい態様において、対照DNAは真正細菌細胞から単離される。好ましくはスピロカエタレス（Spirochaetales）目、キノトプラスチダ（Kinetoplasti da）目又はアクチノミセタレス（Actinomycetales）目の真正細菌細胞、更に好ましくはトレポネマタソー（Treponemataceae）科、トリポアノソマチデ（Trypo anosomatidae）科、又はミコバクテリアソー（Mycobacteriaceae）科の真正細菌細胞、最も好ましくはミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tube rculosis）種、トレポネマ・パリダム（Treponema pallidum）種、トレポネマ・ペルテヌー（Treponema pertenue）種、（ボレリア・ブルグドルフェリ）Borrel ia burgdorferi種、又はトリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）種である。他の好ましい態様において対照DNAは、制限酵素断片である。；対照DNAはPCR 増幅によって製造される。；対照DNAは真核細胞、バクテリオファージ、真正細菌細胞、昆虫ウイルスのうちのいずれか、好ましくはバキュロウイルス由来ベクター又は動物ウイルスのうちのいずれかで増殖させることによって製造される。好ましい動物ウイルスはシミアンウイルス（Simian Virus）−40又はアデノウイルス由来ベクターである。更に他の好ましい態様において、被験DNAは100ヌクレオチド又はそれ以上の長さであり、また、段階（c）のリゾルベース反応はDNAリガーゼの存在下で行われるか、又は段階（c）のリゾルベース反応の後でヘテロ二本鎖がDNAリガーゼと接触させられる。関連のある面において本発明は、上記の段階（c）の前に単離された対照DNA及び／又は単離された被験核酸が少なくとも一個の検出用物質で標識されている方法を特徴とする。ここで検出用物質は、放射性のヌクレオチド、好ましくは³²P 、³³P、又は³⁵Sで標識されたヌクレオチド、又はビオチン、又はジゴキシゲニン、又は蛍光発生試薬、好ましくは蛍光性ヌクレオチド、更に好ましくはフルオレセインで標識されたヌクレオチド、又は染料、好ましくはエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、DAPI、ヘキストダイ（Hoechst dye）、又は酵素である。好ましい対照DNAは、5’末端のみが検出用物質で標識されている。もう一つの関連のある面においてと、本発明は前記の段階（c）及び段階（d）の間にヘテロ二本鎖が少なくとも一つの検出用物質で標識されている方法を特徴とする。ここで検出用物質とは放射性のヌクレオチド、好ましくは³²P、³³P、又は³⁵Sで標識されたヌクレオチド、又はビオチン、又はジゴキシゲニン、又は蛍光発生試薬、好ましくは蛍光性ヌクレオチド、更に好ましくはフルオレセインで標識されたヌクレオチド、又は染料、好ましくはエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、DAPI、ヘキストダイ（Hoechst dye）、又は酵素である。好ましくはヘテロ二本鎖は、5’末端でのみ検出用物質で標識されている。更にもう一つの関連のある面において本発明は、前記のヘテロ二本鎖が一つの 5’末端で固体支持体に結合している方法を特徴とする。ここで好ましい固体支持体はアビジン−又はトレプトアビジン−被覆の表面、ストレプトアビジン−強磁性のビーズ、又はナイロン膜である。本発明はまた、単離された対照DNAに選択的にハイブリダイズする単離された被験DNAに存在する一個又はそれ以上の突然変異を検出するための方法を特徴とする。この方法には、次の段階が含まれる。 a）単離された被験DNA及び単離された対照DNAを、一本鎖被験DNA及び一本鎖対照DNAを形成するよう十分に個別に又は共に変性させる段階、 b）該一本鎖被験DNAを該一本鎖対照DNAに、該一本鎖被験DNAと該一本鎖対照DN Aのと間でヘテロ二本鎖を形成するよう十分にアニール化させる段階、 c）エンドヌクレアーゼがヘテロ二本鎖における一個又はそれ以上のDNAの誤対合、好ましくは1個から7個の間（両端の個数を含めて）のDNAの誤対合を認識し、かつ該ヘテロ二本鎖に一個又はそれ以上のDNA開裂を生じさせる条件の下で、該ヘテロ二本鎖をバクテリオファージT4 エンドヌクレアーゼVIIに接触させる段階、及び d）該単離された被験DNAにおける一個又はそれ以上の突然変異の存在の指標としてDNAの開裂を検出する段階。この方法の好ましい態様における被験DNA及び／又は対照DNAは、真核細胞、真正細菌細胞、バクテリオファージ、DNAウイルス、又はRNAウイルスのうちのいずれかに由来する。好ましいRNAウイルスとしては、ヒトT細胞白血病ウイルス及びヒト免疫不全ウイルスが含まれ、好ましくはHTLV−I、HTLV−II、HIV−1、又はH IV−2のうちのいずれか一つである。好ましいDNAウイルスとしては、アデノビリデ（Adenoviridae）科、パポバビリデ（Papovaviridae）科、又はヘルペトビリデ（Herpetoviridae）科のうちのいずれか含まれる。他の好ましい態様では、対照DNAは真核細胞の癌遺伝子又は腫瘍のサプレッサー遺伝子、好ましくは哺乳動物の癌遺伝子又は哺乳動物の腫瘍サプレッサー遺伝子に由来する。好ましくは哺乳動物の癌遺伝子は、abl、akt、crk、erb−A、erb −B、ets、fes／fps、fgr、fms、fos、jun、kit、mil／raf、mos、myb、myc、H −ras、K−ras、rel、ros、sea、sis、ski、src、又はyes癌遺伝子のうちのいずれか一つであり、また腫瘍サプレッサー遺伝子は、p53、網膜芽腫、好ましくはR B1、腺腫ポリポーシスコリ（adenomatou spolyposis coli）、NF−1、NF−2、ML H−1、MTS−1、MSH−2、又はヒト非−ポリポシス遺伝子のうちのいずれかである。他の好ましい態様において、対照DNAはβ−グロブリン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α₁−アンチトリプシン、21−ヒドロキシラーゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼ E1α−サブユニット、ジヒドロプテリジンレダクターゼ、ロドプシン、β−アミロイド、神経生長因子、スーパーオキサイドジスムターゼ、ハンチングトン病、嚢胞性繊維症、アデノシンデアミナーゼ、β−サラセミア、オルニチントランスカルバミラーゼ、コラーゲン、bcl−2、β−ヘキソサミニダーゼ、トポイソメラーゼII、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、フェニルアラニン 4−モノオキシゲナーゼ、因子VIII、因子IX、ヌクレオシドホスホリラーゼ、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、デュシェーネ型筋ジストロフィー、ボンヒッペルリンデュー病（von Hippel Lindeau）、又は真核細胞のマウスモデル化メンケス（Menkes ）遺伝子のうちのいずれかである。他の好ましい態様において、対照DNAは細胞周期調節タンパク質、好ましくはp 21、p27、又はp16をコードする遺伝子である。他の好ましい態様において、対照DNAは真正細菌細胞から単離される。好ましくはスピロカエタレス（Spirochaetales）目、キネトプラスチダ（Kinetoplasti da）目又はアクチノミセタレス（Actinomycetales）目の真正細菌細胞、更に好ましくはトレポネマタソー（Treponemataceae）科、トリポアノソマチデ（Trypo anosomatidae）科、又はミコバクテリアソー（Mycobacteriaceae）科の真正細菌細胞、最も好ましくはミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tube rculosis）種、トレポネマ・パリダム（Treponema pallidum）種、トレポネマ・ペルテヌー（Treponema pertenue）種、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）種、又はトリパソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）種である。他の好ましい態様において対照DNAは制限酵素断片である。；対照DNAはPCR増幅によって製造される。;対照DNAは真核細胞、バクテリオファージ、真正細菌細胞、昆虫ウイルスのうちのいずれか、好ましくはバキュロウイルス由来ベクター、又は動物ウイルスのうちのいずれかで増殖させることによって製造される。好ましい動物ウイルスはシミアン・ウイルス（Simian Virus）−40又はアデノウイルス由来ベクターである。更に他の好ましい態様において、被験DNAは100ヌクレオチド又はそれ以上の長さであり、また、段階（c）のT4エンドヌクレアーゼVII反応はDNAリガーゼの存在するところで行われるか、又は段階（c）のT4エンドヌクレアーゼVII反応の後でヘテロ二本鎖がDNAリガーゼと接触される。関連のある面において本発明は、前記の段階（c）の前に単離された対照DNA及び／又は単離された被験核酸が少なくとも一個の検出用物質で標識されている方法を特徴とする。ここで検出用物質は、放射線活性のヌクレオチド、好ましくは³² P、³³P、又は³⁵Sで標識されたヌクレオチド、又はビオチン、又はジゴキシゲニン、又は蛍光発生試薬、好ましくは蛍光性ヌクレオチド、更に好ましくはフルオレセインで標識されたヌクレオチド、又は染料、好ましくはエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、DAPI、ヘキストダイ（Haechst dye）、又は酵素である。好ましい対照DNAは、5’末端のみが検出用物質で標識されている。もう一つの関連のある面において、本発明は前記の段階（c）及び段階（d）の間にヘテロ二本鎖が少なくとも一つの検出用物質で標識されている方法を特徴とする。ここで検出用物質は放射線活性のあるヌクレオチド、好ましくは³²P、³³P 、又は³⁵Sで標識されたヌクレオチド、又はビオチン、又はジゴキシゲニン、又は蛍光発生試薬、好ましくは蛍光性ヌクレオチド、更に好ましくはフルオレセインで標識されたヌクレオチド、又は染料、好ましくはエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、DAPI、ヘキストダイ（Haechst dye）、又は酵素である。好ましくはヘテロ二本鎖は、5’末端でのみ検出用物質で標識されている。当業者であれば、本発明の構成を突然変異検出のためのキットに組み立てることができることは容易に認識できる。典型的には、このようなキットは、突然変異を検出することの可能な少なくとも一つのリゾルベースを含む。好ましくはこのキットは、好適な緩衝液中にバクテリオファージT4 エンドヌクレアーゼVIIを含み、また選択的に、単離された対照DNA及び反応条件を標準化するための予め形成されたヘテロ二本鎖を備えている。本明細書で用いられるように「単離された核酸」という用語は、その核酸が由来する器官の天然のゲノムにおいて直接接触している（即ち共有結合をしている）いずれの核酸とも直接接触しないような核酸セグメント、即ち核酸断片のことをいう。したがってこの用語は、例えばベクターに導入される核酸を含む。例えばDNAは、バクテリオファージ、ウイルス、又は自律複製能を有するプラスミドベクターに導入されていてもよい。さらにRNAは、逆転写酵素によってDNAに変換された後バクテリオファージ、ウイルス、又は自律複製能を有するプラスミドベクターに導入することができる。「単離された核酸」という用語はまた、化学的手法又は制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成された核酸断片のような、他の核酸と無関係に分離分子として存在する核酸も含む。本明細書において核酸に関して用いられるように「相同な」という用語は、二つの核酸間におけるヌクレオチド配列の同一性を言う。第一のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列と同一である場合、第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列は100％相同である。いずれか二つの核酸間での相同性は、その配列におけるある位置で対合しているヌクレオチドの数に対して直線関数を保つ。例えば、二つの核酸で全体のヌクレオチドの数のうち半数が同じであるならば、それらは50％の相同性があることになる。本発明において、単離された被験核酸及び対照核酸は少なくとも90％の相同性を持っている。好ましくは単離された被験核酸と対照核酸とが少なくとも95％の相同性を有し、より好ましくは少なくとも99％の相同性を有している。本明細書で用いられるように「突然変異」とは、単離された核酸におけるヌクレオチド配列の変化（即ち、ヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入のこと）をいう。突然変異を受けた単離された核酸は、対応する野生型の個体群より単離された相同な核酸と、配列が統計的に異なる核酸配列を持っている。対応する野生型の個体群から単離された相同な、又は関連のある核酸と配列が統計的に異なる突然変異を起こしている核酸配列の例が、これまでに報告されている（Balazs et al.，Am．J．Hum．Genet.44，182(1989)、Sommer et al.，Mayo Clin．Proc．64 ，1361(1989)、Sommer et al.，BioTechniques 12，82(1992)、Caskey et al.， Science 256，784(1992)、及びこれらに引用された参照文献を参照）。本発明の方法は、単離された被験又は対照核酸において、1個から50個の間（両端の個数を含めて）のヌクレオチド配列の変化を含む突然変異を検出するのに特に有効である。単離された被験又は対照核酸における突然変異は、好ましくは、1個から1 0個の間（両端の個数を含めて）のヌクレオチド配列の変化を含むものでり、更に好ましくは、1個から7個の間（両端の個数を含めて）のヌクレオチド配列を含むものである。本明細書で用いられるように相補性という用語は、二つの相同な核酸、例えば DNA又はRNAが、二本鎖の領域を生成するための塩基対を形成することができる一連の連続ヌクレオチドを含むことを意味する。この領域は二本鎖と言われる。二本鎖は、ホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖のいずれであってもよく、それらはRNA鎖又はDNA鎖ではヌクレオチドが方向性を有していることにより核酸の間で形成される鎖である。即ち特定の塩基は、多数のワトソン−クリック塩基対を形成するために相互に引きつけられ結合する。こうしてDNA又はRNAの一本の鎖に含まれるアデニンは、逆方向のDNA相補鎖に含まれるチミンと結合するか、又は逆方向のR NA相補鎖に含まれるウラシルと結合する。DNA又はRNAの一本の鎖に含まれるグアニンは、逆方向の相補鎖に含まれるシトシンと結合する。「ヘテロ二本鎖」という用語は、二本のアニール化され、相補性があり、そして相同な核酸（たとえばアニール化して単離された被験及び対照核酸）の間で形成される構造を意味する。そこでは一個又はそれ以上の突然変異が起きているために、第一の鎖の一個又はそれ以上のヌクレオチドが、第二の反対方向で相補的、そして相同な核酸配列と対合することができない。異なるタイプのヘテロ二本鎖の例としては、点突然変異（即ちバブル(bubble)）、挿入又は欠失突然変異（即ちバルジ型(bulge)）を示すものが含まれる。これらは「Bhattacharya and Lilley，Nucl．Acids．Re s．17，6821-6840(1989)」に開示されている。「誤対合」という用語は、DNA又はRNAの一本の鎖に存在するヌクレオチドが反対方向の相補的なDNA鎖又はRNA鎖に含まれるヌクレオチドと、ワトソン−クリック型塩基対及びπ電子積み重ね相互作用を形成しないか又は形成できないことを意味している。こうしてDNAの一方の鎖又はRNAに含まれるアデニンは、反対方向の相補的なDNA鎖又はRNA鎖に存在するアデニンと誤対合を形成する。第二のヌクレオチドが存在しない場台には、第一のヌクレオチドは、反対方向の相補的なDN A鎖又はRNA鎖に含まれる第二のヌクレオチドと対合することができない（即ち、非対合ヌクレオチド）。本明細書において用いられるように、対照DNAは、対応する野生型の個体群から得られる相同なDNAと、配列が統計学的に区別できないようなヌクレオチド配列を有するDNAである。対照DNAは少なくとも20個のヌクレオチドからなる長さである。対照DNAは100個から40，000個のヌクレオチドの長さであることが好ましく、より好ましくは150個から5，000個のヌクレオチドの長さである。本明細書において用いられるように、被験核酸はDNA又はRNAであって、それぞれ少なくとも一個の突然変異を有する。被験核酸は、対応する野生型の個体群から得られる相同のDNAと配列を統計学的に区別することができる。被験核酸は少なくとも20個の長さのヌクレオチドからなる。被験核酸は100個から40，000個のヌクレオチドの長さであることが好ましく、より好ましくは、150個から5，000 個のヌクレオチドの長さである。二本鎖の形成は、二本の相同的及び相補的な核酸鎖をアニール化することによるハイブリダイゼーション反応で行われる。このハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション条件を調整（ハイブリダイゼーションの緊縮ともよく言われる）し、その条件の下でハイブリダイゼーション反応を進行させることにより高度な特異性をもたらすようにできる。これは二本の核酸鎖が実質的に、又は完全に相補的であるような確かな数のヌクレオチドを特異的配列に含んでいるのでなければ、この二本の核酸鎖の間でのハイブリダイゼーションは安定な二本鎖、即ち例えば普通の緊縮条件の下で二本鎖の領域を保持する二本鎖を形成しないことによる。したがって本明細書において用いられるように「選択的にハイブリダイズする」とういう語句は、第二の相補的で相同な核酸鎖とは通常のハイブリダイゼーション条件の下で安定な二本鎖、即ちホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖のいずれかをアニール化して形成し、また他の核酸分子とは同様の通常のハイブリダイゼーション条件の下で安定な二本鎖を形成しないような核酸鎖のことを意味する。「通常のハイブリダイゼーション条件又は通常の緊縮条件」とは、以下に開示するようなハイブリダイゼーション又は緊縮の条件である。別途定義をしない限り、ここで用いられている全ての技術用語及び化学用語は、本発明の技術分野に属する人に一般的に理解されているのと同じ意味である。本明細書において記された刊行物は全て参照文献として本明細書に含まれる。好適な方法及び材料の例を記載するが、これらの例は、ここに記載されている方法及び材料と同じか又は同等の方法及び材料が本発明の実施又は試行で用いることができることを当業者が理解できるように単に例示されたものであって、限定を目的とするものではない。本発明の他の特徴及び効果は、次に記載した詳細な説明及び請求の範囲より明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図1は、PDH E1α遺伝子（突然変異体 13A）についてCCM分析及びEMC分析を行ったオートラジオグラフィーを示している。この遺伝子は、結果的に検出可能な誤対合を形成している、断片の5’末端から87塩基対離れたところにC→A突然変異を含んでいる。図2は、結果的に検出可能な誤対合を形成しているPCR断片の5’末端から191塩基対離れたところに同型のG→A突然変異を含むPAH遺伝子（突然変異体 IVS 12NT 1）についてEMC分析を行ったオートラジオグラフィーを示している。図3Aは、エキソン2にC→G突然変異を含むPAH遺伝子について、CCM分析及びEMC 分析を行ったオートラジオグラフィーを示している。この断片の5’末端から73 塩基対離れたところから得られる突然変異が結果的に検出可能な誤対合になる。図3Bは、エキソン2にC→G突然変異を含むPAH遺伝子（パネルＡに示したのと同じ断片）を消化後5’末端に標識形成をしたもののオートラジオグラフィーを示している。この突然変異が結果的に検出可能な誤対合となる。図4は、21−ヒドロキシラーゼ A 遺伝子（突然変異体 A64）の塩基対1004でT →A突然変異を含むその遺伝子について、CCM分析及びEMC分析を行ったオートラジオグラフィーを示している。この断片の5’末端から110塩基対離れたところから得られる突然変異が結果的に検出可能な誤対合となる。図5は、調べられた遺伝子の部分の5’末端から631塩基対離れたところにある相同性の−AA欠失を含むPSH Elα遺伝子（突然変異体18A（K387 FS））を消化後 5’末端に標識形成をしたもののオートラジオグラフィーを示している。この突然変異が結果的に検出可能な誤対合となる。図6は、単離された被験核酸（A）及び対照DNA（B）の変性及びアニール化によりヘテロ二本鎖と二つのホモ二本鎖が生じることを示した概略図である。示されている特定の被験核酸は一つのヌクレオチド誤対合を含んでいる。バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIは、それぞれのヘテロ二本鎖にある一個の塩基対誤対合を認識して分割する。好ましい態様の説明本発明者らは、バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVII、即ち分岐した、又はループしたDNA構造と同様にホリデー型構造も開裂することがわかっているリゾルベースが、一つのヌクレオチド誤対合を持つヘテロ二本鎖を認識して開裂する能力もあることを見いだした。バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼ VIIが有しているこの予期せぬ能力により、発明者らは少なくとも一つの突然変異を含む被験核酸における突然変異をすばやく検出することが可能になった。一般的には得られた結果は、リゾルベース、特にバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼ VIIが、被験核酸に存在する突然変異、特に一個の塩基対誤対合を検出するのに有用であることを示している。 I．バクテリオファージ T4 エンドヌクレアーゼ VII の調製 T4エンドヌクレアーゼVIIは、Kosak及びKemper（Kosak et al.，Eur．J．Bioc hem．194，779(1990)参照）によって記載されたように調製した。保存溶液は3,7 00U／μlに維持した。このアッセイで用いたT4エンドヌクレアーゼVII反応緩衝液は、以前に記述された（Kosak et al.，supra）濃度の10倍濃度で調製した。ヘテロ二本鎖アニール化緩衝液は、以前に記述された（Cotton，Methods in Mol ecular Biology 9，39(1991)参照）濃度の2倍濃度で調製した。ポリヌクレオチドキナーゼを用いる5’末端標識DNAのための条件、及び変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うための一般法は、文献に記述されている（Sambrook et al. ，Molecular Cloning，A Laboratory Manual．Znd Ed．Cold Spring Harbor Lab oratory Press(1989)参照）。 II．対照DNA及び被験DNAの調製対照DNA及び被験DNAは、PCR増幅法によって調製した（PCR法に関しては、Ausu bel，F．M．Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 15，Greene Pu blishing Associates，Inc．and John Wiley & Sons，Inc(1993)参照）。これらの実験で発明者らは、ヒトゲノムDNA（例えば、β−グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（即ちPAH）、及びα₁−アンチトリプシンヒトゲノムDNA ）、プラスミドDNA（例えば、ヒト21−ヒドロキシラーゼ遺伝子プラスミド及びマウスモデル化（Menkes）遺伝子プラスミドDNA）、又はcDNA（例えば、ヒトピルビン酸デヒドロゲナーゼ−Elαサブユニット（即ち、PDH Elα）、ヒトジヒドロプテリジンリダクターゼ（即ち、DHPR）cDNA、及びヒトロドプシンDNA）に存在する突然変異を検出することを対象とした。 i）PAH遺伝子： PAH遺伝子突然変異体であるIVS12 ntl及びR408Wは、以前に記述された方法（DiLella et al.，Lancet 1，497(1988)参照）にしたがってプライマーA及びBを用いてそれぞれ個別にPCR増幅した。PAH遺伝子のエキソン2 は、プライマー5’−GCA TCT TAT CCT GTA GGA AA−3’（配列番号１）及びプライマー5’−AGT ACT GAC CTC AAA TAA GC−3’（配列番号２）を用いてPCR増幅した。PCRの条件は、95℃で105秒間、58℃で150秒間、そして72℃で 3分間、35回繰り返した。 ii）21−ヒドロキシラーゼ遺伝子：正常の（即ち、野生型の）340 bp断片及び突然変異21−ヒドロキシラーゼB遺伝子は、プライマー5’−CTG CTG TGG AAC TGG TGG AA−3’（配列番号３）及びプライマー5’−ACA GGT AAG TGG CTC AGG TC−3’（配列番号４）を用いてそれぞれ個別に増幅した。正常の178 bp断片及び突然変異の21−ヒドロキシラーゼB遺伝子は、プライマー5’− GCT CTT GAG CTA TAA GTG G−3’（配列番号５）及びプライマー’−GGG AGG TCG GGC TGC AGC A−3’（配列番号６）を用いてそれぞれ個別に増幅した。正常の21−ヒドロキシラーゼB遺伝子及び21−ヒドロキシラーゼA遺伝子は、プライマー5’−CTG CAC AGC GGC CTG CTG AA−3’（配列番号７）及びプライマー5’−CAG TTC AGG ACA AGG AGA GG−3’（配列番号８）を用いてそれそれ増幅した。21−ヒドロキシラーゼAと正常の又は突然変異の遺伝子断片を増幅する際のPCRの条件は、95℃で105秒間、62℃で150秒間、そして72℃ で3分間である。このA及びB遺伝子のDNA配列は、その対立遺伝子の突然変異体と同様にRodriques et al．（EMBO J．6，1653-1661(1987)参照）及びCotton et a l.,supraの文献に開示されている。 iii）他の遺伝子： β−グロビン、α₁−アンチトリプシン、及びPDH Elα 遺伝子のPCR増幅に関しては、既に開示されている。例えば、β−グロビン遺伝子の突然変異（−87（C→T））、フレームシフトコドン6（−A）、ナンセンスコドン39（C→T）、及びシックル（sickle）突然変異コドン6（A→T）は、プライマーa及びbを用いてそれぞれ増幅し、IVS II−745突然変異体は以前に記載された方法（Dianzani et al.，Genomics II，48(1991)参照）にしたがってプライマーc及びdを用いて増幅した。α₁−アンチトリプシン遺伝子は文献記載（Forrest et a l.，Prenatal Diagnosis 12，133(1992)参照）にしたがって増幅した。PDH Elα 遺伝子（PDH遺伝子突然変異体13A、18A、及び31A）は、以前に記載された方法（ Dahl et al.，Am．J．Hum．Genet．47．286(1990)参照）にしたがってプライマーPDH−P及びプライマーPDH−Eを用いて増幅した。DHPR遺伝子は、以前に記載された方法（Smooker et al.，Biochemistry 32，6443(1990)参照）に従ってプライマーGD及びプライマーFを用いて増幅した。マウスモデル化メンケス（menkes ）遺伝子（MMK）は、以前に記載された方法にしたがって増幅した。ロドプシン遺伝子（突然変異83（コドン15においてAsp→Ser））は、以前に記述された方法（Sullivan et al.，Arch．Opphthalmol．111，1512(1993)参照）にしたがって増幅した。 A）PCR生成物の精製： PCR増幅生成物は、アガロース（1．5％）ゲル電気泳動を用いて、Whatman Iペーパー上に電気的溶出を行ったあと1X TE（pH8．0）で溶出することにより精製した。全ての実験において対照DNAには、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer-Mannheim）を用いて［ガンマー³²P］で5’末端を標識した。キナーゼ処理を行った後でその標識された対照DNAをエタノール沈澱させ、そのペレットを70％のエタノールで3回洗浄してDNAに導入されなかった標識を除去した。洗浄したDNAペレットを蒸留水中に懸濁し、1μlあたり約5ngの5 ’末端標識のDNAを調製した。 III．対照と被験DNAヘテロ二本鎖の形成 i）一般法：一本鎖のDNAは、二本鎖の被験DNAと二本鎖の対照DNAを熱（即ち、両端温度を含む90℃と100℃との間）で変性することによって調製した。これと別の方法では、変性は周知の変形法によって、例えば変性用緩衝液にグリセロールを添加することによって低温で進行することができる。図6に示されているように、再生後（下部参照）では4本の二本鎖を形成することができる。発明者らはバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIが、上記に示したそれぞれのヘテロ二本鎖の一つの塩基対誤対合を開裂する能力があり、これに対して一般にホモ二本鎖は開裂しないことを見いだした。したがってそれぞれのヘテロ二本鎖はバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIによって開裂するため、ヘテロ二本鎖に存在する一個又はそれ以上の誤対合を容易に検出することができる。同様にヘテロ二本鎖における非対合の塩基対もこの方法で検出される。当業者は変性もアルカリ変性することで簡単に行うことができ、続いて中性の緩衝液中で再生できることの効果を認めている。また、被験核酸がRNA、好ましくはmRNAである場合には、熱変性は鎖内部でヌクレオチド塩基対が形成されていないRNAを生成するために行われ、これによって変性した被験RNAをヘテロ二本鎖形成のための優れた鋳型にする（Sambrook et al.，supra）。もう一つの別法では、対照核酸及び被験核酸は、熱又はアルカリのいずれかによって別個に変性することができ、ヘテロ二本鎖を形成するために共に混合することができる。 ii）ヘテロ二本鎖形成：対照DNA及び被験DNAの間でのヘテロ二本鎖の形成は、以前に記載されている方法（Cotton，supra）にしたがって50μl（全体量）の1倍量のアニール化緩衝液を含む溶液中で行った。ただしアニール化の温度は1 時間は65℃で、そして続く20分間は室温であった。DNAの濃度の算出は、一反応当り標識されていないDNA（10倍以上）が50−60ngであることと5’末端が標識されたDNAが5ngであることに基づいている。ヘテロ二本鎖は50μlの容量の「バルク（bulk）」中で調製し、そのペレットを適量の蒸留水中に懸濁した。例えば6 つ反応を行うのであれば、300ngの突然変異DNA及び、30ngの標識された野生型DN Aが用いられた。ヘテロ二本鎖を形成した後、そのペレットを30μlの蒸留水（即ち5μlの蒸留水が一反応あたり用いられる。）に懸濁した。ホモ二本鎖を、バクテリオファージエンドヌクレアーゼVIIが非特異的にホモ二本鎖を開裂できるかどうかを調べる目的で調製した。標識されたホモ二本鎖DN Aを調製するために、過剰量の標識されていない対照DNAを標識された対照DNAと共にアニール化したこと以外は同じ方法を行った。 IV．酵素による誤対合開裂アッセイ（即ち、EMC） 5μlの標識されたホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖（50−60ng）をそれぞれ別個に、39μlの蒸留水と5μlの10倍量の反応緩衝液に加えた。それぞれの試料を氷冷した。開裂反応を、1μlのバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVII（特定された量で100−3，000 U／μl）を添加することによって開始した。エンドヌクレアーゼのストック溶液が目的の活性になるように、バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVII希釈緩衝液中で希釈した。リゾルベースを添加した後、そのチューブをわずかに回転し、特定されていないのであれば37℃で1時間インキュベートした。バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼが添加されていないゲル電気泳動の対照試料を配置して37℃で1時間インキュベートした。なおこの際、このエンドヌクレアーゼの代わりに1μlの希釈緩衝液を用いた。インキュベーションの後それぞれの試料をエタノール沈澱し、70％のエタノールで洗浄してから簡単に乾燥し、染料が添加されているホルムアミドウレア5μl中で攪拌することにより徹底的に再懸濁した。この5μlの試料を100℃に加熱してから直ちに8％のウレアホルムアミドアクリルアミド配列決定用ゲルに添加した。開裂生成物をオートラジオグラフィーにより可視化し、その生成物のサイズを放射標識が施されたex 174 HaeIIIのサイズマーカーと比較した。核酸試料を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する方法の考察については、「Sambrook et al.，Molec ular Cloning: A Laboratory Approach，Chapter 6(1989)」を参照されたい。 V．ヘテロ二本鎖の消化後5’末端標識それぞれの形成された二本鎖にある4個すべての当初の5’末端に5’末端を標識する処理は、バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼ開裂のあとで行った。 EMC法の感度は、これらの新たな5’末端を標識することによって増加した。消化後に5’末端を標識する方法は、時間及びコストの面で最も有利な手法でキロベース長のDNAをスクリーニングするために開発された。ヘテロ二本鎖は、標識されていない対照DNA及び標識されていない被験DNAの比を1：1として調製した。ヘテロ二本鎖形成のために取られた条件は、それぞれの DNA試料を25ngずつ一反応あたり用いたこと以外は上述した条件と同じであった。リゾルベースによる消化は、50ngの標識されていないヘテロ二本鎖DNAに行い、そして消化した生成物は、1倍量のキナーゼ緩衝液と2ユニットの5’ポリヌクレオチドキナーゼと1μlの1／10に希釈した新たな［ガンマー³²P］ATPとからなる全体量が10μlの溶液中で5’末端に標識した。37℃で45分間インキュベートしたのち、その試料を70℃で10分間変性し、その反応混合液をエタノール沈澱させた。得られたペレットを70％のエタノールで3回洗浄した後、簡単に乾燥し、染料を添加した 5μlのホルムアミドウレア中に懸濁してから上述したように変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。本発明者らは、等モル濃度の突然変異DNA及び野生型DNAの間で二本鎖を形成すること、開裂すること、及び有用に変形したポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う前にすべての5’末端に5’末端標識することを、簡単で実用的な手法で行うことを見いだした。消化後5’末端標識をすることによって、エンドヌクレアーゼにより誘導される開裂を、放射線標識したプローブを製造する必要なくそれぞれの鎖について分析できるようになり、これによって被験DNAに存在する突然変異を検出する頻度が最大になった。消化後5’末端を標識する方法を行うと、二つの別れたバンドが常に観察され、それらは対照鎖と被験鎖の両方で開裂生成物が標識されていることを示していた。当業者は、上述した消化前5’末端標識法及び消化後5’末端標識法の両法において、被験DNA又は対照DNAのいずれかからなるホモ二本鎖が、非特異的開裂を調べる目的でバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIで消化されることに価値を認めるであろう。 VI．誤対合の化学的間裂（CCM）ヘテロ二本鎖の化学的開裂は、ヘテロ二本鎖が完全に形成されたことを証明するために用いた。オスミウムテトラオキシド（tetroxide）とヒドロキシルアミンとを用いるCCMは、以前の文献記載（Cotton，supra）にしたがって行った。 VII．バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIを用いるDNA誤対合の検出異なる被験DNAと対照DNAとの間でヘテロ二本鎖の形成を行った結果形成された一個の塩基対誤対合の4個すべてのタイプの組合せを、これらの実験で検出した。DNA誤対合の組合せをタイプによって系統化し、次の表1にまとめた。図6は、被験DNAに存在する一個の突然変異が、これらの実験で形成される二本のヘテロ二本鎖のそれぞれで検出された4個の変化を持っているかどうかを概略的に示している。それぞれのヘテロ二本鎖は、リゾルベース、好ましくはバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIによって開裂することのできる二つの誤対合DNA鎖を含んでいる。突然変異をうまく検出するためには、それぞれのセットの誤対合のペアにある少なくとも一本の鎖が開裂されなくてはならない。ほとんどの場合、過剰の標識されていない被験DNAを用い、したがって標識されたプローブに存在する二つの誤対合塩基を含むDNA鎖の開裂だけをアッセイした。実験結果は次の表2にまとめられている。表2に示されているそれぞれの突然変異は、特に記載されていない限り被験DNA に一度だけ起こった。それぞれの実験の詳細な説明は以下に記載されている。これらのデータは、バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIを用いた開裂についてテストされた12個のタイプ1、3個のタイプ2、4個のタイプ3、2個のタイプ 4、及び4個の欠失の突然変異の結果を示している。 i）タイプ1（誤対合のセット G．A／T．C） PAH Elα13A遺伝子は、研究された特異的突然変異遺伝子（即ち、F205L）の3 ’末端から5’末端にC→A突然変異87bpを含んでいる。5’末端が標識されたプローブとしての対照DNAを用いると、得られるヘテロ二本鎖はバクテリオファージT 4エンドヌクレアーゼVIIで検出できる誤対合C^*．TとA．G^*を含んでいた（図1参照）。図1におけるレーン1、2、及び3は、ヒドロキシルアミン（即ち、レーンHA ）と共に0、1、及び2時間インキュベートした後の対照ホモ二本鎖DNA（即ち、レーンC）の試料である。レーン4、5、及び6は、それぞれ0、1、及び2時間ヒドロキシルアミンと共にインキュベートした後の被験DNA（即ち、レーン13A）を含むヘテロ二本鎖DNAの試料である。レーン7、8、及び9は、それぞれ0、1000、及び3 000ユニットのT4 エンドヌクレアーゼ VIIと共にインキュベートした後のホモ二本鎖DNA（即ち、レーンC）の試料である。レーン10−14は、それぞれ0、250、10 00、2000、及び3000ユニットのT4エンドヌクレアーゼ VIIと共にインキュベートした後の被験DNAを含むヘテロ二本鎖DNAの分解を表している。ヒドロキシルアミンは誤対合したシトシンを修飾する能力だけを備えているため、レーン5及び6で 87bpの断片が変性アクリルアミドゲル上で観察された。EMCを用いた場合（レーン10−14）、87bp断片よりもわずかに大きい一つのバンドが観察され、それはC^* ．T誤対合のC^*の開裂した3’末端を示している。ここに示された図において、オートラジオグラフをするまでもない図によってそれぞれの実験で形成された二つのタイプのヘテロ二本鎖を概略的に表している。破線は対照DNA鎖を表しており、直線は被験DNA鎖を表している。矢印は、それぞれのヘテロ二本鎖において末端が標識されている鎖のエンドヌクレアーゼ開裂部位を示している。黒丸は放射線活性のある標識が施されたヌクレオチドを表している。黒三角は、CCM反応で実際に開裂した部位を表している。上付文字（³）は、EMCによって観測されたバンドの大きさを意味しており、それはCCMによって測定された予期したバンドの大きさよりも大きいことがわかった。Mは、ex174DNA を分解した5’末端が標識されたHaeIIIを意味する。 ii）タイプ2（誤対合のセット G．T／A．C） G→A突然変異（IVS12（ntl））と相同の患者のPAH遺伝子から得た254bpゲノム DNAセグメントを、PCR増幅法によって調製した。この特定のPAH遺伝子突然変異は、PCR増幅生成物の5’末端から191bp3’末端に生じる（図２参照）。5’末端の標識された対照DNAを、ヘテロ二本鎖を形成するために標識されていない被験D NAにアニール化した。バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIを用いて開裂した後、二つのバンド、即ちそのうちの一つは191bpよりもわずかに大きくもう一つは54bpのバンドよりもわずかに大きいバンドが観察された（図２参照）。図2では、レーン1から4はすべて、0、250、500、及び1000ユニットのT4 エンドヌクレアーゼ VIIと共にインキュベートした後の対照ホモ二本鎖DNA（即ち、レーンC）の試料であり、レーン5−8はすべて、それぞれ0、250、500、及び1000ユニットのT4エンドヌクレアーゼ VII と共にインキュベートした後の対照及び被験DNAを含むヘテロ二本鎖DNAの試料である。これらのオートラジオグラムは、DN AがそれぞれG^*（G^*．T誤対合）及びC^*（A．C^*誤対合）の近くで誤対合していることを示している。 iii）タイプ3（誤対合のセットC．C／G．G）もう一つの突然変異PAH遺伝子セグメントは、被験DNAを形成するためにPCR増幅した。このPAH突然変異遺伝子セグメントは、エキソン2に57塩基でヘテロ接合のC→G突然変異を含んでいた。この特定のPAH突然変異は、分析された133bpセグメントの5’末端から3’末端に73bp生じる（図3A参照）。図3Aは、このテストPA H遺伝子セグメントをCCM及びEMC分析したオートラジオグラフである。レーン1、 2、及び3は、ヒドロキシルアミンと共に0、1、及び1．5時間インキュベートした後の対照のホモ二本鎖DNA（即ち、レーンC）の試料である。レーン4、5、及び6 は、それぞれ0、1、及び1．5時間ヒドロキシルアミンと共にインキュベートした後の対照及び被験DNA（即ち、レーンPAH）を含むヘテロ二本鎖の試料である。レーン7から11はすべて、それぞれ0、1000、2000、2500、及び3000ユニットのT4 エンドヌクレアーゼ VIIと共にインキュベートした後の対照ホモ二本鎖の試料である。レーン12及び13は、それぞれ0及び1000ユニットのT4エンドヌクレアーゼ VII と共にインキュベートした後のPAHヘテロ二本鎖の試料である。図3Bは、エキソン2に同じヘテロ接合型のC−＞G突然変異を含むPAH遺伝子の消化後5’末端標識（後述）したもののオートラジオグラフである。レーン1、2、及び3は、0、250、及び1000ユニットのT4エンドヌクレアーゼVIIとともにインキュベートしたあとでの対照ホモ二本鎖DNA（即ち、レーンC）の試料であり、レーン4から8はすべて、それぞれ0、100、250、500、及び1000ユニットのT4エンドヌクレアーゼVIIを用いてインキュベートしたあとでの対照DNA及び被験DNA（即ち、レーンPAH）を含むヘテロ二本鎖の試料である。図3A及び3Bの両図に示されているように、5’末端が標識された対照DNA及び標識されていない被験DNAの間で形成されるヘテロ二本鎖は、C^*．C及びG．G^*誤対合を生成する。ヒドロキシルアミンを用いるCCMは、ヘテロ二本鎖を含むC^*．Cだけを検出した。例えば、対照DNAプローブ（この場合はセンス鎖）から誘導された73bp5’末端標識鎖は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で観察した。同じヘテロ二本鎖のEMCは、73bp断片よりもわずかに大きいバンドも現れたこと以外は、関連した開裂パターンを示した（図3A参照）。このバンドは、C^*．Cヘテロ二本鎖近くの開裂によって生じる。 T4エンドヌクレアーゼVIIによってヘテロ二本鎖が開裂することにより、3’OH 及び5’PO₄末端を持つ新しいヌクレオチドを生成する。5’末端の標識は、5’T4 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［ガンマ−³²P］ATPで増幅されたDNAの5’OH 末端を標識することのみが関与する。したがって、ヘテロ二本鎖の開裂部位に結合した断片3’は、オートラジオグラフィーで観察されない。しかしながら消化後5’末端標識をすることによって、図3Aにおいて前は検出されたかった60塩基対の断片が検出できるようになった。例えば、図3Aで分析したヘテロ二本鎖の消化後5’末端標識をすることによって、60bp及び73bpのバンドよりもわずかに大きいバンドがオートラジオグラフィーで検出できるようになった（図3B参照）。図3A及び図3Bを共に行って比較すると、バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVII開裂のあとで、消化後5’末端標識段階を追加して行うことによって、一つの突然変異に起因する特別な開裂が同定できることがわかった。 iv）タイプ4（誤対合のセット A．A／T．T）突然変異体21−ヒドロキシラーゼA遺伝子の204bpセグメントは、プラスミドDN A（上述した記載参照）からPCR増幅した。このDNAセグメントは、21−ヒドロキシラーゼA遺伝子のヌクレオチド1004でT−＞A突然変異を含んでいた。この突然変異は、その遺伝子セグメントの5’末端から110bp3’である。一本鎖にした対照DNAを一本鎖にした被験DNAにアニール化すると、A．A^*及びT^*．Tの誤対合を含むヘテロ二本鎖が生成した。 5’末端が標識された対照DNAを用いるEMCは、変性ポリアクリルアミドゲル上に二つのバンドを検出した。その一つは110bpよりもわずかに大きく、そしてもう一つは94bpよりもわずかに大きかった（図４参照）。図4では、レーン1及び2 は、オスミウムテトロキサイド（OT）とともに0及び5分間インキュベートしたあとでの対照のホモ二本鎖DNA（即ち、レーンC）の試料を示し、レーン3及び4は、 0及び250ユニットのT4エンドヌクレアーゼVIIとともにインキュベートしたあとでの対照ホモ二本鎖DNAの試料を示している。レーン5及び6は、0及び5分間OTとともにインキュベートしたあとでの対照DNA及び被験DNA（即ち、204bpの突然変異体21−ヒドロキシラーゼA遺伝子セグメント）を含むヘテロ二本鎖DNAの試料を示している。レーン7及び8は、それぞれ0及び250ユニットのT4エンドヌクレアーゼVIIとともにインキュベートしたあとでの試料である。レーン9、10、及び11は、500ユニットのT4エンドヌクレアーゼVII を用いて1、3、及び16時間インキュベートしたあとでの被験DNAの試料である。レーン12、13、及び14は、1000ユニットのT4エンドヌクレアーゼVIIを用いてそれぞれ1、3、及び16時間37℃でインキュベートしたあとでの被験DNAの試料である。これらの結果は、バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIにはヘテロ二本鎖の二本の対照DNA鎖、即ちそのそれぞれがDNA誤対合を含んでいるDNA鎖を認識する能力があることを確認するものである。この試料についてのCCMでは、そのプローブのセンス鎖に存在する誤対合のT塩基を修飾し開裂したあとで得られる110bp断片のみを表した。 v）タイプ5：ヘテロ二本鎖ループを形成するDNA欠失 PDH Elα18Aは、遺伝子セグメントの5’末端から631bp離れたところで二つのデオキシアデノシンを欠失している突然変異体PDH遺伝子の797塩基対断片である。 EMCは、「TT」ループの近くでのみ開裂していることを意味する166bpよりもわずかに大きい一個のバンドを検出した（データは示されていない。）、同じセグメントの消化後5’末端標識は二つのバンドを示し、そのうちの一つは「TT」ループの近くで開裂することによって生じる166bpよりもわずかに大きいバンドであり、もう一つは反対方向の鎖にある「AA」位近くで開裂することによって生じる 631bpよりもわずかに大きいバンドである（図５参照）。図5において、レーン1 、2及び3は、0、500、及び1000ユニットのT4エンドヌクレアーゼVIIとともにインキュベートしたあとでの対照ホモ二本鎖DNA（即ち、レーンC）の試料である。レーン4から7はすべて、それぞれ0、500、1000、及び2000ユニットのT4 エンドヌクレアーゼ VIIとともにインキュベートした後の対照DNAと被験DNAを含む被験ヘテロ二本鎖の試料である。突然変異を検出する上述の方法が、前記に記載したバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVII検出方法に限られないことが当業者には明らかである。例えば、十字形DNAを認識して開裂することが知られている数種のリゾルベースが以下に記述されている。上述した方法は、単離された被験核酸の突然変異を検出する能力について、これらのリゾルベースを調べるために用いることができる。さらに当業者は、上述した方法がいかなる特殊な核酸鋳型、標識導入法、又は検出技術に限定されないことを認識するであろう。本発明の他の態様について以下に列挙する。 i）他のリゾルベース：バクテリオファージエンドヌクレアーゼVIIは、十字形DNAを開裂することが知られているリゾルベースの一例である。同様の活性を持つ他のリゾルベースとしては、バクテリオファージT7エンドヌクレアーゼI、及びS．Cerevisiae 十字形開裂酵素であるEndoX1、EndoX2、及びEndoX3（West， supraの記載参照）が挙げられる。バクテリオファージT7エンドヌクレアーゼIを精製する方法（deMassy et al.，J．Mol．Biol．193，359(1987)参照）、EndoX1 を精製する方法（West and Korner，PNAS 82，6445(1985)、West et al.，J．Bi ol．Chem．262，12752(1987)参照）、Endo X2を精製する方法（Symington and K olodner，PNAS 82，7247(1985)参照）、及びEndoX3を精製する方法（Jensch et al.，EMBO J．8，4325(1989)参照）について報告されている。予備的研究でEndo X3がバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIとほぼ同じようにC．C誤対合を検出できる能力があることがわかった。それはバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIのような酵母のリゾルベースも、ヘテロ二本鎖の一個の塩基対誤対合近くを認識して開裂する能力があることを示している。バクテリオファージ T7エンドヌクレアーゼIと酵母のリゾルベースの特徴を更に詳細に調べる目的で、それぞれの酵素を上述した方法によって精製することができる。突然変異を検出するそれぞれの精製されたリゾルベースの能力は、ここに記述されたアッセイを用いることによって調べることができる。 ii）追加のDNA配列：上述した方法は、バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIがヘテロ二本鎖の一個又はそれ以上の塩基対の誤対合を検出することができることを示している。当業者は、これらの方法がここに記載された特定の核酸配列のいずれにも限定されないことを知るであろう。例えば、少なくとも一個のDNA突然変異を生じていることが推測される既知又は未知のDNA配列のDNA制限断片を、ヘテロ二本鎖を形成する際に被験DNAとして用いることができる。このDNA制限断片は少なくとも20塩基対の長さであることが望ましい。更に好ましくは、このDNA制限断片の長さはは50塩基対から40,000塩基対までであろう。最も好ましい場合には100塩基対から5000塩基対までの長さである。特に大きいDNA 断片（即ち、2kb以上の大きさ）が分析されている実験においては、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（＜2kb）に好適な大きさの断片を得るために、第2の制限酵素を用いてその断片を開裂することが望ましいであろう。第2の制限酵素を選択するには、この制限断片の制限酵素マップをつくることによって指針とされる。もう一つの例では、少なくとも一つのDNA突然変異を持っていることが予想される被験DNAの鋳型であってそれについて少なくとも一部分のDNA配列が知られている鋳型が、PCR増幅される被験DNAのソースとして用いることができる。DNAの鋳型は、1）少なくとも一つのDNA突然変異を持つことが予想される領域と、2）D NAオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション及びPCR増幅のための鋳型として用いることができるように、推測された突然変異の左右に充分なDNA を含むことの2点を備えていなくてはならない。このPCR増幅された領域は、DNA の鋳型にハイブリダイズされた二つのDNAオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端間に介在する領域である。この介在領域は、少なくとも一つのDNA突然変異を持っている。上記に概略を示したように、PCR増幅は、少なくとも一つのDNA突然変異を持っているDNAの鋳型に二つのDNAオリゴヌクレオチドプライマーをまずハイブリダイズすることによって始まり、続いて完成した集まりがPCR増幅の完成である。このPCR増幅したDNAが、前記に記載したようにヘテロ二本鎖の形成のための被験DN Aとして用いられる。DNAの鋳型を増幅して被験DNAを調製するのに用いられた二つのDNAオリゴヌクレオチドプライマーの設計は、推測された突然変異の左右に位置するDNA配列と、二つの重要なパラメーター、即ち1）DNAオリゴヌクレオチドプライマーのサイズと、2）DNAの鋳型にハイブリダイズするDNAオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端の間に介在する領域のサイズによって導かれる。DNA オリゴヌクレオチドプライマーは、長さが少なくとも12ヌクレオチドであることが好ましいであろう。更に好ましくはDNAオリゴヌクレオチドプライマーが15個から50個までの長さのヌクレオチドの場合で、最も好ましいのは15個から25個までの長さのヌクレオチドの場合である。DNAの鋳型にハイブリダイズした二つのD NAオリゴヌクレオチドの3’末端の間の介在領域のサイズは、1）PCRによって増幅された鋳型の周知のサイズの限界と、2）リゾルベース開裂部位を検出するのに用いられる特定のゲル（即ち、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル）の分解能力（下記参照）によって支配されるであろう。一般に、DNAの鋳型にハイブリダイズする二つのDNAオリゴヌクレオチドの3’末端間の介在領域は、少なくとも50塩基対までの長さであろう。PCR技術における最近の進歩によれば、40kbのD NAにまで増幅することができるようになった。好ましくはその介在領域は、100 から40,000塩基対までの長さであり、更に好ましくは150から5000塩基対までの長さである。当業者は、左右に位置しているDNA配列が部分的にわかっているだけの状況で、変性したDNAオリゴヌクレオチドプライマーをPCR増幅によって被験 DNAを調製するために用いることができることに価値を認めるであろう。もう一つの例において、少なくとも一つのDNA突然変異を持つことが推測されたDNAの鋳型は、好適なクローニングベクターにサブクローン化することができ、そのクローニングベクターにハイブリダイズしてDNAの鋳型の挿入部位に隣接するような既知のDNAオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。この例において、PCR増幅のために用いられるDNAオリゴヌクレオチドプライマーが、既知のDNA配列のベクターにハイブリダイズされ、挿入された鋳型のDNAにはハイブリダイズされないため、鋳型のDNAの配列情報は必要ではない。例えば、B luescript（登録商標）ベクターは、操作指示書（Stratagene Cloning Systems ，La Jolla，CA，Product Catalogue(1992)参照）にしたがって受容部位にDNAの鋳型をサブクローニングするために用いることができる。このBluescriptベクターのT7及びT3 DNAプライマーは、挿入されたDNAの鋳型をPCR増幅するために（又は挿入されたDNAの鋳型を不随的に配列するために）用いることができる。他の商業的に入手可能なサブークローニングベクターも用いることができる。これらには、ファージラムダに基づく挿入ベクター、及び原核生物のベクターないし真核生物のベクター｛即ち、バクテリオファージ、昆虫ウイルス（バキュロウイルス）、又は「Stratagene，supra」、及び「Sambrook et al.，supra」に記載された動物ウイルス（SV−40又はアデノウイルス）に基づくベクター｝が含まれるが、これらに限定されるわけではない。前記に記載したようにPCR増幅された被験DNA鋳型は、リゾルベース、好ましくはバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIを用いて開裂するためのヘテロ二本鎖を形成する際の、被験DNAのソースとして用いることができる。これとは別の方法では、少なくとも一つのDNA突然変異を持つDNA挿入部を含むベクターは、PCR増幅を行う前に細菌、ファージ、昆虫又は動物の細胞内で増殖させることによってまず増幅させることができる（Sa mbrook et al.，supra参照）。かりに充分量のDNA（即ち、少なくとも1ナノグラム）が入手できるのであれば、PCR増幅段階は省略することができる。更にもう一つの例では、少なくとも一つの突然変異を持っていることが推測されたRNAを、当業者には周知の方法によって細胞又は組織から精製することができる。例えばRNAは、mRNAを調製するためのオリド−dTクロマトグラフィーによって任意に精製することができる（例えば、Sambrook et al.，supra及びAusube l et al.，supra参照）。リボソームRNAが分析の目的物である場合、又は特定の mRNA（例えばコラーゲン）が豊富にある場合では、オリゴ−dTクロマトグラフィーは必要ではないであろう。精製されたRNA又はmRNAは、完全な一本鎖を形成するために熱変性し、RNA：DNAヘテロ二本鎖を形成するために対照DNA（即ち、対照cDN A）を用いてハイブリダイズされるであろう。RNA：DNA二本鎖を形成する方法は当業者に周知であり、文献に詳細に記載されている（Sambrook et al.，supra， pp．7.62-7.65参照）。RNA：DNAヘテロ二本鎖を形成した後で前述したEMC法を、 cDNAとRNAとの間で誤対を作ることによって生成した誤対合を検出するために用いることができる。好適な態様では、対照DNAは5’末端が標識されており、一方 RNAは標識されていない。これとは別法では、生きた細胞又は組織に放射線で標識したウラシルを添加することによってRNAを均一に標識することができる。本発明は、クローン化されたDNAにおける一個の塩基対の突然変異、例えばクローン化されたDNAを実験的操作（例えば、形質転換、突然変異生成、PCR増幅、又は増殖して貯蔵した後又は凍結：解凍を繰り返した後）した場合に導入された突然変異を検出するのにとりわけ有効である。一例として、DNAセグメントをヘテロ二本鎖を形成するために用いることができる。なお、この際の対照DNAは実験的操作が行われなかったDNAであり、被験DNAは実験的操作が行われたDNAである。ここに記載された方法は、クローン化された核酸に存在する突然変異をチェックするための迅速で安価なスクリーニングとして用いることができる。当業者は、本発明がまた、細菌タイプ及びウイルスタイプに用いることができることに価値を認めるであろう。「タイプ」によって、同一又は関連のある細菌又はウイルス以外の菌株から特定の菌株を区別する一個又はそれ以上の核酸の突然変異を検出することにより、同型の細菌又はウイルスの菌株を特徴づけることを意味している。例えば、特異的なDNA突然変異を共有している細菌又はウイルスは、同じタイプと言える。一例として、ヒト免疫不全ウイルスの遺伝子的な変化は、区別できる遺伝子の突然変異をそれぞれが生じていて、異なるHIVのタイプを単離できるようにしている（Lopez-Galindes et al.，PNAS 88，4280(1991) 参照）。タイプ分けに対して特定の関心がもたれる被験DNAの例としては、Retro viridae科のウイルス、好ましくはヒトT−リンパ球ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスが挙げられ、特にHTLV−I、HTLV−II、HIV−1、又はHIV−2のうちのいずれか一つである。当業者は、レトロウイルスRNAが逆転写することが可能で、DNA を生成するためにvacciniaウイルスベクターに簡単にサブクローニングできることに価値を認めるであろう（Yammamoto et al.，J．Immunol．144，1999、Nixon et al .，Nature 33，484(1988)、Hu et al.，WO 87/02038、及びここに記載した参照文献を参照のこと）。タイプ分けに対して関心のもたれる被験DNAのこの他の例としては、哺乳類、好ましくはヒトに対して病原性の微生物から単離された被験 DNAとともに、アデノビリデ（Adenoviridae）科、パポバビリデ（Papovaviridae ）科、又はヘルペトビリデ（Herpetoviridae）科のDNAウイルスが挙げられる。タイプ分けに際して好ましい微生物には、スピロカエタレス（Spirochaetales）目の細菌、好ましくはトレポネマ（Treponema）属又はボレリア（Borrelia）属の細菌や、キネトプラスチダ（Kinetoplastida）目の細菌、好ましくはトリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）種の細菌や、アクチノミセタレス（Actin omycetales）目の細菌、好ましくはミコバクテリアソー（Mycobacteriaceae）科の細菌、さらに好ましくはミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacteriu m tuberculosis）種の細菌や、又はストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌などが含まれる。本発明はまた、哺乳動物の疾患に関与する反復DNAにおける突然変異を検出するためにも有用である。例えば、反復DNAに存在する一つ又はそれ以上の突然変異は、ヒトフラガイル−X症候群（human fragile-X syndrome）、脊椎及び延髄の筋ジストロフィー、及び萎縮性筋硬直症などの疾患に関与している（Caskey e t al.，supra 参照）。これらのそれぞれの遺伝子に由来する反復DNAは、ここに記載した方法において被験核酸として用いることができる。 iii）追加の標識技術：上述した方法は、放射線活性のリンを用い、ヘテロ二本鎖を形成する前かヘテロ二本鎖を形成し開裂した後（即ち、消化後5’末端標識）のいずれかの時点でDNAの5’末端に標識することを開示している。当業者は、ヘテロ二本鎖が一つ又はそれ以上の放射性の検出用物質又は非放射性の検出用物質を用いてさまざまな方法で標識できることに価値を認めるであろう。例えば、ヘテロ二本鎖を形成するためのDNAを得る目的でそのDNAをPCR増幅している間に、α位が放射性のリン又は硫黄（³²P、³³P、又は³⁵S）で放射線標識されたデオキシリボヌクレオチド（即ち、dNTP：dA、dG、dC、又はT）の一つ又はそれ以上を、被験DNAを内部的に識別する目的でPCR増幅段階に添加することができる。一般的には、一つ又はそれ以上の放射性標識されたdNTPの0．1−50μCiがPCR反応に加えられ、そして過剰の標識はセファデックス（Sephadex）G−50カラムクロマトグラフィー（即ち、回転型カラム）によって除去される。さらに、バクテリオファージ T4エンドヌクレアーゼVII消化の前又は後のいずれかの時点で行う被験DNAの5’ 末端標識は、放射標識されたデオキシリボヌクレオチドを用いることによって行うことができる。また別の方法において被験DNA又は対照DNAは、ヘテロ二本鎖形成の前、又はヘテロ二本鎖の形成及び開裂の後で、ビオチンを用いて標識することができる（Tizard et al.，PNAS 87，4514(1990)参照）。ポリアクリルアミドゲル電気泳動のあとでビオチン化されたDNAの検出を行う方法についてこれまでに開示されている（Ausubel et al.，supra Chapter 7参照）。更に別の方法では、被験DNA又は対照DNAは蛍光性のdNTP（即ち、フルオレセイン： Ansorge et al.，Nucl．Acids Res．15，4593(1987)、Johnston-Dow et al.，BioTechnique s 5，754(1987)、Prober et al.，Science 238，336(1987)参照）を用いて、ヘテロ二本鎖形成の前、又はヘテロ二本鎖の形成及び開裂の後で標識することができる。更に他の例では、ある種のDNAポリメラーゼ、特定するとT4DNAポリメラーゼの3’−−＞5’エキソヌクレアーゼ活性を、開裂した後でヘテロ二本鎖DNAを放射線標識するために用いることができる。開裂したDNAは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーによって分析することができる。 iv）追加の検出技術 a）ゲル技術：上述したような周知の基本的な変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（即ち、40cmの長さで均一の厚みのゲルに4％から8％のポリアクリルアミドと7Mのウレアを用いた手法：Sambrook et al.，supra参照）に加えて、さまざまな電気泳動法がバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVII開裂生成物の分解度を上げるために用いられ、特に大きな開裂生成物（即ち、＞2kb）を分析するために用いられる。分解度が増した変性ポリアクリルアミドゲルは、被験DNAの突然変異の特定部位を、より正確に検出できるようにする効果を有している。さらにこのようなゲルは、開裂したDNAに対しても改良した分析を行えるようにする。例えば、くさび型のスペーサーをフィールド勾配を形成するため、又は緩衝液の勾配を導入するため、電解質の勾配を形成するため、即ちアクリルアミド段階傾斜を形成する目的で用いてもよい。ホルムアミドが標準の変性ポリアクリルアミドゲルに含有されていてもよいし、またもっと長いゲル（80〜100cm）が用いられていてもよい。こうし電気泳動法は詳細に記述されている（Ausbel et al． supra Chapter 7参照）。2kb以上の大きさの開裂生成物は、断片のサイズを小さくするために制限酵素で特異的に切断することができる。当業者は、大きな開裂生成物を特異的に切断する特定の制限酵素の選択が、分析される特定のDNAの制限酵素マップによって制限を受けることが理解できるであろう。他の方法では、大きな開裂生成物を変性（即ち、アルカリ性の）アガロースゲル上で電気泳動し、DNAと相互作用をする試薬（例えば、染料、即ち色素）、例えば銀、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、4，6−ジアミジノ−2−フェニルインドール（即ち、DAPI）、ヘキストダイ（Hoechst dye）、及び類似の試薬（Sambrook et al.，supra and Bassam et al.，Anal．Biochem．196，80（1991）参照）によって直接可視化することができる。すなわち、電気泳動したDNAを膜、例えばD EAE−セルロース、ナイロン、又は他の好適な膜に転写し、その転写した膜に結合しているDNAを放射性の標識プローブ又は非放射性の標識プローブ（即ち、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン）を用いてろ紙ハイブリダイゼーションを行うことによって可視化され、その後オートラジオグラフィー、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ、ジゴキシゲニン可視化法（ClonTech Produ ct Catalogue，1989/1990、Boehringer Mannheim Catalog(1993)参照）、又は蛍光検出が行われる。 ii）固体支持体へのヘテロ二本鎖DNAの係留：ヘミ−ビオチン化した被験D NA又は対照DNAは、一個の5’末端をビオチンで標識したオリゴヌクレオチドプライマーをPCR増幅反応に添加することによって調製することができる。このようなPCR法では、一本のDNA鎖だけが5’末端にビオチン標識を含んでいる。PCR増幅の後で被験DNAと対照DNAを個別に又は共に変性させ、続いてアニール化してヘテロ二本鎖を形成させる。次にヘテロ二本鎖を、固体支持体に係留させる。好ましい固体支持体は、アビジン−被覆又はストレプトアビジン−被膜の表面、例えばアビジン−又はストレプトアビジン−被膜の施されたマイクロタイター皿、又はストレプトアビジン−被膜の施された強磁性のビーズである。ヘミ−ビオチン化したDNAを磁性体のビーズに係留する方法は、これまでに開示されている（Hultman et al.，BioTechniques 10，84(1991)、Kaneoka et al.，BioTechniques 10，3 0(1991)参照）。磁性体ビーズに係留したビオチン化ヘテロ二本鎖が得られた後、その係留したヘテロ二本鎖を、リゾルベース、好ましくはバクテリオファージ T4エンドヌクレアーゼVIIを用いてその両鎖を開裂する。開裂した後、新しくできたフリーの5’末端を上述したように一つ又はそれ以上の検出用物質を用いて標識し、好ましくはビオチンを新しくできた未結合の5’末端を標識するために用い、そしてその磁性体のビーズをマイクロフュージ遠心分離によって濃縮する。その上澄み又はビーズをゲル電気泳動（前記の記載参照）することによって、又はより簡単にストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ可視化法（Beth esda Research Laboratories Catalogue and Reference Guide(1989)、Clontech Catalogue(1989/1990)参照）を利用することによって、ビオチン化された（即ち、開裂された）DNAについて分析することができる。これとは別の方法で、一つの5’末端がビオチンを用いて標識されたヘミ−ビオチン化DNAを、アビジン−又はストレプトアビジン−被膜の表面に結合させたあとで他の5’末端に別の検出用物質を用いて標識することができる。好ましくは蛍光性のヌクレオチド（即ち、蛍光標識されたヌクレオチド、Clontech Catal og(1989/1990)参照）が他の5’末端に標識されるか、又は放射線活性のヌクレオチドが他の5’末端を標識するために用いられる。アビジン又はストレプトアビジンを含む表面に結合したあと、リゾルベース開裂、好ましくはバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIを用いた開裂が起こり、その上清が蛍光又は放射活性について分析される。もう一つの別法では、PCRのためのDNAオリゴヌクレオチドプライマーが、ジゴキシゲニンのような検出用物質を用いて標識することができる。増幅及び二本鎖の形成をおこなった後、標識されたDNAはジゴキシゲニンを結合する能力のある抗体を備えた表面に係留する（Boehringer Mannheim Catalog(1993)参照）。また別の方法では、DNAはオリゴ−dTテールのような検出用物質を用いて標識することができ、そのオリゴ−dTテールを架橋する紫外線をナイロン支持体に照射することでナイロン支持体に結合させる。特有の核酸配列がオリゴ−dTテールを介してナイロン支持体に保持されており、二本鎖形成に役立つことができる。これらの二つのそれぞれの方法では、DNAは結合していない末端に、ビオチン、蛍光性ヌクレオチド、又は放射性ヌクレオチドを用いて更に標識することができ、続いて二本鎖の形成を行ったのち、リゾルベース、好ましくはバクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIを用いて開裂する。開裂した後で関与した核酸を、上述した適切な方法によって検出することができる。当業者は、さまざまな手法がDNAの検出部位を添加するために存在することに価値を認めるであろう。例えばClontechは、ビオチン、FITC、又は他の発蛍光団を用いてDNAを標識するために用いることができるアミノ修飾因子及びチオール修飾因子について開示している（Clontech Catalog(1989/1990)参照）。 VIII．リガーゼの存在下での酵素誤対合の開裂ヘテロ二本鎖基質における非特異性のニックから生じる背景を減少させるために、リガーゼ（即ち、E.coli.又は好ましくはT4リガーゼ）を本明細書に記載したリゾルベースの開裂反応混合液に含有させることができる。T4エンドヌクレアーゼ VII及びヘテロ二本鎖DNA基質の場合では、この方法は好ましくは次のように進行する。 500μlのビュレットチューブに入れた2μlの蒸留水に、5−100ng（好ましくは、5−15ng）の標識され、アニール化処理されたヘテロ二本鎖DNA（5μl中に含まれる）、及び1μlの10倍量のエンド VII−リガーゼ反応緩衝液（即ち、Kosak et al.，Eur．J．Biochem．194，779(1990)によって記載されているエンド VII反応緩衝液の10倍量に10mMのATPを添加した溶液）を添加した。次に、酵素希釈緩衝液｛10mMのトリス−HCl、pH8．0、50％のグリセロール（高圧滅菌したH₂O中に含まれる）、0．1mMのグルタチオン、100μg／mlのBSA（ヌクレアーゼが含まれていない）｝で望ましい濃度に希釈された1μlのT4 エンドヌクレアーゼ VII（1 0−1000U／μl、好ましくは30−100U／μl）、及びリガーゼ保存緩衝液（50mMの KCl、10mMのトリス−HCl、pH7．4、0．1mMのEDTA、1mMのジチオトレイトール、2 00μg／mlのBSA、50％のグリセロール）で望ましい濃度に希釈された1μlのT4リガーゼ（少なくとも10U／μl、好ましくは10−1000U／μl、更に好ましくは50− 150U／μl）を加えることによって反応を開始させる。この酵素を添加した後、そのチューブをわずかに遠心することによって、そのチューブの側面に付いている水滴を落し、その反応混合物を25℃で1−3時間インキュベートする。酵素が入っていない対照は平行してインキュベートすることが好ましい。この反応混合物は、2μl の酵素希釈緩衝液でリガーゼ及びT4エンドヌクレアーゼVIIを置き換えたこと以外は上述したものと同じである。この反応の生成物の分析は、ここに記載した方法によって行なわれる。好ましい方法では、緩衝液（95％のホルムアミド、20mMのEDTA、0．05％のブロモフェノールブルー、0．05％のキシレンシアノール）に入れた5μlのホルムアミドをその反応混合液に添加し、その混合液を100℃で2分間加熱してから、直ちに8％の変性アクリルアミド配列決定用ゲル（0．8mmの厚みのゲル：８％のアクリルアミド−ビス（29：1）、7Mウレア）にサメ歯形状の櫛に代えて適当に形成された櫛を用いて載せ、全体量で15μlを保持させる。これとは別に、分析を行うためにより小容量を載せてもよい。このゲルを50Wで2−3時間、１×TBE緩衝液（0．0 89Mのトリス−塩基、0．089Mのホウ酸、0．002MのEDTA）中で泳動し、その開裂生成物をオートラジオグラフィーによって可視化して、放射標識された分子量マーカー（例えば、AT Biochem，Malvern，PA又はNew England Biolabs，Beverly ，MAより入手できる、BioMarker（登録商標）EXT Plusマーカー、ex174 HaeIII マーカー、BioMarker（登録商標）Highマーカー、又はBioMarker（登録商標）Lo wマーカー）と比較する。これに代わる好適な方法において、リガーゼ反応は次に記載したように、ヘテロ二本鎖をT4エンドヌクレアーゼVIIとともに予備インキュベーションした後に行われる。 500μlのビュレットチューブに入れた3μlの蒸留水に、5−100ng（好ましくは、5−15ng）の標識され、アニール化処理されたヘテロ二鎖DNA（5μl中に含まれる）と、1μlの10×エンドVII−リガーゼ反応緩衝液（即ち、Kosak et al.，Eur ．J．Biochem．194，779(1990)によって記載されているエンドVII反応緩衝液の1 0倍量に10mMのATPを添加した溶液）とを添加した。次に、酵素希釈緩衝液｛10mM のトリス−HCl、pH8．0、50％のグリセロール（高圧滅菌したH₂O中に含まれる）、0．1mMのグルタチオン、100μg／mlのBSA（ヌクレアーゼが含まれていない）｝で望ましい濃度に希釈された1μlのT4エンドヌクレアーゼVII（10−1000U／ μl、好ましくは100−1000U／μl）を加えることによって反応を開始させる。この酵素を添加した後、そのチューブをわずかに遠心することによって、そのチューブの側面に付いている水滴を落し、その反応混合物を37℃で1時間インキュベートする。酵素が入っていない対照は平行してインキュベートすることが好ましい。この反応混合物は、1μlの酵素希釈緩衝液でT4エンドヌクレアーゼVIIを置き換えたこと以外は上述したものと同じである。1時間のインキュベートを行った後、リガーゼ保存緩衝液（50mMのKCl、10mMのトリス−HCl、pH7．4、0．1mMの EDTA、1mMのジチオトレイトール、200μg／mlのBSA、50％のグリセロール）で望ましい濃度に希釈された1μlのT4リガーゼ（少なくとも500U／μl、好ましくは5 00−5000U／μl、更に好ましくは1500−2500U／μl）を添加し、この反応混合液を16−37℃（好ましくは25℃）でさらに1−12時間（好ましくは3時間）インキュベートする。この反応の生成物の分析は、エンドVII／リガーゼを一緒にインキュベートする方法として上記に記載した方法と同様に行われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ユイルリマオーストラリア国ヴィクトリア州メルボルンキーラーパークラクランコート４ (72)発明者ケンパーボーリスダブリュー. ドイツ国ケルン 40 ガルテンウェッグ 31

Claims

【特許請求の範囲】 1．単離された対照DNAに選択的にハイブリダイズする単離された被験核酸に存在する一個又はそれ以上の突然変異を検出するための方法であって、 a）単離された被験核酸及び単離された対照DNAを、一本鎖被験核酸及び一本鎖対照DNAを形成するよう十分に個別に又は共に変性する段階、 b）該一本鎖被験核酸を該一本鎖対照DNAに、該一本鎖被験核酸と該一本鎖対照 DNAとの間でヘテロ二本鎖が形成されるよう十分にアニール化させる段階、 c）リゾルベースがヘテロ二本鎖に一個又はそれ以上の開裂を生じさせる条件の下で、該ヘテロ二本鎖を該ヘテロ二本鎖における少なくとも一個の単独の塩基の誤対合を認識することのできるリゾルベースに接触させる段階、及び d）該被験核酸における一個又はそれ以上の突然変異の存在の指標として一個又はそれ以上の開裂を検出する段階、を含む方法。 2．リゾルベースがバクテリオファージ又は真核細胞のリゾルベースである、請求の範囲1の方法。 3．バクテリオファージリゾルベースがバクテリオファージ T4 エンドヌクレアーゼ VII又はバクテリオファージ T7 エンドヌクレアーゼ Iである、請求の範囲 2の方法。 4．真核細胞のリゾルベースがサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cer evisiae）から単離されるものである、請求の範囲2の方法。 5．サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のリゾルベースがEndo X1、Endo X2、又はEndo X3のリゾルベースのうちのいずれかである、請求の範囲4の方法。 6．単離された対照DNAに選択的にハイブリダイズする単離された被験DNAにおける一個又はそれ以上の突然変異を検出するための方法であって、 a）単離された被験DNA及び単離された対照DNAを、一本鎖被験DNA及び一本鎖対照DNAが形成されるよう十分に個別に又は共に変性する段階、 b）該一本鎖被験DNAを該一本鎖対照DNAに、該一本鎖被験DNAと該一本鎖対照DN Aとの間でヘテロ二本鎖が形成されるよう十分にアニール化させる段階、 c）エンドヌクレアーゼがヘテロ二本鎖における一個又はそれ以上のDNAの誤対合を認識し、かつヘテロ二本鎖に一個又はそれ以上のDNA開裂を生じさせる条件の下で、該ヘテロ二本鎖をバクテリオファージ T4 エンドヌクレアーゼVIIに接触させる段階、及び d）該被験DNAにおける一個又はそれ以上の突然変異の存在の指標としてDNAの開裂を検出する段階、を含む方法。 7．被験核酸が真核細胞、真正細菌細胞、バクテリオファージ、DNAウイルス、又はRNAウイルスのうちのいずれか一つから単離される、請求の範囲1又は6の方法。 8．対照DNAが段階（c）の前又は後のいずれかにおいて少なくとも一個の検出用物質で標識される、請求の範囲1又は6の方法。 9．対照DNAが段階（c）の前に5’未端のみにおいて標識される、請求の範囲8の方法。 10．対照DNAが制限酵素断片である、請求の範囲1又は6の方法。 11．対照DNAがPCR増幅法によって製造される、請求の範囲1又は6の方法。 12．ヘテロ二本鎖が5’末端で固体支持体に結合している、請求の範囲1又は6の方法。 13．被験DNAが100ヌクレオチド又は100ヌクレオチド以上の長さである、請求の範囲1又は6の方法。 14．段階（c）がDNAリガーゼの存在下で行われる、請求の範囲1又は6の方法。 15．ヘテロ二本鎖が段階（c）の後でDNAリガーゼと接触させられる、請求の範囲 1又は6の方法。