CN116670299A - 检测非霍奇金淋巴瘤 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于癌症筛查的技术，尤其是但不限于，用于检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)和NHL亚型(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的存在的方法、组合物和相关用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月19日提交的美国临时专利申请号63/067,592的优先权，该临时专利申请据此以引用的方式整体并入。
技术领域
本文提供了用于癌症筛查的技术，尤其是但不限于，用于检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)和NHL亚型(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的存在的方法、组合物和相关用途。
背景技术
淋巴瘤是严重的健康问题，有大约2.1％的男性和女性在其一生中的某个时候会被诊断出患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)。淋巴瘤是男性和女性中第六大最常见的癌症。2009-2013年，美国整体淋巴瘤的年龄调整发病率为每年每100,000人19.1例(参见Siegel RL等人,CACancer J Clin.2016年1月；66(1):7-30)。淋巴瘤对美国中西部尤为重要，明尼苏达州的发病率全国最高，为22.5/100,000。爱荷华州的发病率相似，为22.1/100,000(参见Siegel RL等人,CACancer J Clin.2016年1月；66(1):7-30)。虽然淋巴瘤研究的进展在过去20年中导致淋巴瘤死亡率稳步下降，但是淋巴瘤仍然会导致大量的痛苦和死亡。据估计，2016年美国有20,150人死于淋巴瘤。
淋巴瘤大致分为霍奇金(HL)淋巴瘤和非霍奇金(NHL)淋巴瘤。NHL有多种亚型，详见2016年发布的新修订WHO分类(参见Swerdlow SH等人,Blood 2016；127(20):2375-2390)。最常见的NHL是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，占所有病例的30％，其次是滤泡性淋巴瘤(FL)，占所有病例的20％，再次是T细胞淋巴瘤，占所有病例的15％。这些不同类型的预后差异很大(参见Swerdlow SH等人,Blood 2016；127(20):2375-2390)。
对于未患已知淋巴瘤的患者，不存在简单筛查测试；因此，如果不表现出一些疾病的症状或体征，大多数患者不会在初级保健机构接受CT或PET筛查。大多数患者在发现肿块、出现症状(如疲劳、体重减轻、发烧)或者在其他医学测试或手术时发现淋巴结肿大时被发现患有淋巴瘤。对于简单基于组织和/或基于血液的筛查测试存在未满足的需求。一旦确诊，即可遵循传统的安阿伯(Ann Arbor)1-4期分类进行分期。一般而言，与疾病在诊断时广泛传播的患者相比，患有早期疾病的患者具有更高的存活率(参见Carbone PP等人,CancerRes.1971年11月；31(11):1860-1)，因此分期是国际预后指数的关键部分(参见TheInternational Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project.APredictiveModel for Aggressive Non-Hodgkin'sLymphoma.N Engl J Med.1993年9月30日；329(14):987-94)。在疗法完成后，不定期进行无症状的常规肿瘤成像(监测)。
因此，需要用于检测非霍奇金淋巴瘤的改善的方法。
本发明满足了这些需要。
发明内容
已经将甲基化DNA作为大多数肿瘤类型组织中潜在的一类生物标志物进行研究。在许多情况下，DNA甲基转移酶在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)岛位点处向DNA添加甲基，作为基因表达的表观遗传控制。在生物学上有吸引力的机制中，认为肿瘤抑制基因启动子区域中的获得性甲基化事件会使表达沉默，因而促进肿瘤发生。DNA甲基化可能是比RNA或蛋白质表达更具有化学和生物学稳定性的诊断工具(Laird(2010)Nat Rev Genet 11:191-203)。此外，在如散发性结肠癌等其他癌症中，甲基化标志物提供了极好的特异性，并且比单独的DNA突变具有更广泛的信息且更灵敏(Zou等人(2007)Cancer EpidemiolBiomarkers Prev 16:2686-96)。
当应用于动物模型和人细胞系时，对CpG岛的分析产生了重要的发现。例如，Zhang和同事发现来自同一CpG岛的不同部分的扩增子可能具有不同的甲基化水平(Zhang等人(2009)PLoS Genet 5:e1000438)。此外，甲基化水平在高度甲基化与未甲基化序列之间呈双峰分布，这进一步支持DNA甲基转移酶活性的二元开关样模式(Zhang等人(2009)PLoSGenet 5:e1000438)。在体内对鼠组织以及在体外对细胞系的分析表明，只有约0.3％的高CpG密度启动子(HCP，定义为在300个碱基对区域内具有>7％ CpG序列)被甲基化，而低CpG密度区域(LCP，定义为在300个碱基对区域内具有<5％ CpG序列)往往以动态组织特异性模式频繁甲基化(Meissner等人(2008)Nature 454:766-70)。HCP包括普遍存在的看家基因和高度调控的发育基因的启动子。在>50％甲基化的HCP位点中，有几个已确立的标志物，例如Wnt 2、NDRG2、SFRP2和BMP3(Meissner等人(2008)Nature 454:766-70)。
已经将DNA甲基转移酶在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)岛位点处对DNA的表观遗传甲基化作为大多数肿瘤类型组织中潜在的一类生物标志物进行研究。在生物学上有吸引力的机制中，认为肿瘤抑制基因启动子区域中的获得性甲基化事件会使表达沉默，从而促进肿瘤发生。DNA甲基化可能是比RNA或蛋白质表达更具有化学和生物学稳定性的诊断工具。此外，在如散发性结肠癌等其他癌症中，异常的甲基化标志物比单独的DNA突变具有更广泛的信息且更灵敏，并且提供了极好的特异性。
有几种方法可用于搜索新的甲基化标志物。虽然基于微阵列的CpG甲基化询问是一种合理的高通量方法，但这种策略偏向于已知的感兴趣区域，主要是已确立的肿瘤抑制启动子。在过去十年中，已经开发了用于全基因组DNA甲基化分析的替代方法。有四种基本方法。第一种采用通过识别特定甲基化位点的限制酶消化DNA，然后是几种可能的分析技术，这些技术提供的甲基化数据仅限于酶识别位点或用于在定量步骤中扩增DNA的引物(例如甲基化特异性PCR；MSP)。第二种方法使用针对甲基胞嘧啶或其他甲基化特异性结合结构域的抗体富集基因组DNA的甲基化部分，然后进行微阵列分析或测序以将片段映射至参考基因组。这种方法不提供片段内所有甲基化位点的单核苷酸分辨率。第三种方法首先是对DNA进行亚硫酸氢盐处理，将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后是限制酶消化，并在与接头配体偶联后对所有片段进行完整测序。对限制酶的选择可以富集CpG密集区域的片段，从而减少在分析过程中可能映射至多个基因位置的冗余序列的数目。第四种方法涉及DNA的无亚硫酸氢盐处理，该方法描述了无亚硫酸氢盐和碱基分辨率测序方法，TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)，这些方法用于在不影响未经修饰的胞嘧啶的情况下进行5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的非破坏性和直接检测(参见Liu等人,2019,Nat Biotechnol.37,第424-429页)。在一些实施方案中，无论具体的酶促转化方法如何，仅转化甲基化的胞嘧啶。
在中高读取覆盖率下简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)在单核苷酸分辨率下产生所有CpG岛的80-90％和大多数肿瘤抑制启动子的CpG甲基化状态数据。在癌症病例对照研究中，对这些读数的分析可鉴定差异甲基化区域(DMR)。在之前对胰腺癌样本的RRBS分析中，发现了数百个DMR，其中许多从未与致癌作用相关联，并且许多未注释。对独立组织样品集的进一步验证研究证实了在性能方面具有100％敏感性和特异性的标志物CpG。
本文提供了用于非霍奇金淋巴瘤(NHL)癌症筛查的技术，尤其是但不限于，用于检测NHL和NHL亚型(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的存在的方法、组合物和相关用途。
实际上，如实施例I中所述，在鉴定本发明的实施方案的过程中进行的实验鉴定了一组新的差异甲基化区域(DMR)，用于区分NHL衍生的DNA与非肿瘤对照DNA，以及NHL亚型衍生的DNA与非肿瘤对照DNA的癌症。
这些实验列出和描述了285个区分NHL癌组织与非肿瘤淋巴腺组织的新的DNA甲基化标志物(参见，表1-4，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下能够区分NHL组织与非肿瘤淋巴腺组织的标志物和/或标志物组：
·ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503(参见，表2，实施例I)；以及
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下用于检测血液样品(例如，血浆样品、全血样品、血清样品)中的NHL的标志物和/或标志物组：
·BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表4，实施例I)；以及
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下能够区分滤泡性淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的标志物和/或标志物组：
·ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6(参见，表6，实施例I)；以及
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C(参见，表12，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下用于检测血液样品(例如，血浆样品、全血样品、血清样品)中的滤泡性淋巴瘤的标志物和/或标志物组：
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503(参见表6，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表12，实施例I)；以及
·HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下能够区分DLBCL组织与非肿瘤淋巴腺组织的标志物和/或标志物组：
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表7，实施例I)；以及
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下用于检测血液样品(例如，血浆样品、全血样品、血清样品)中的DLBCL的标志物和/或标志物组：
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见表7，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)；以及
·MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下能够区分套细胞淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的标志物和/或标志物组：
·CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C(参见，表8，实施例I)；以及
·BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1(参见，表14，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下用于检测血液样品(例如，血浆样品、全血样品、血清样品)中的套细胞淋巴瘤的标志物和/或标志物组：
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见表8，实施例I)；以及
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C(参见，表14，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下能够区分边缘区淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的标志物和/或标志物组：
·CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5(参见，表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1(参见，表15，实施例I)；以及
·CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下用于检测血液样品(例如，血浆样品、全血样品、血清样品)中的边缘区淋巴瘤的标志物和/或标志物组：
·BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266(参见表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1(参见，表15，实施例I)；以及
·CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下能够区分外周T细胞淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的标志物和/或标志物组：
·CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1(参见，表10，实施例I)；
·GABRG3、ITGA5和JUP(参见，表16，实施例I)；以及
·CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了以下用于检测血液样品(例如，血浆样品、全血样品、血清样品)中的外周T细胞淋巴瘤的标志物和/或标志物组：
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1(参见表10，实施例I)；
·BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1(参见，表16，实施例I)；以及
·CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
如本文所述，该技术提供了许多甲基化的DNA标志物以及它们的子集(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、57、75、85、99、100、110、125、150、175、200、220、250、275、283、282、285个标志物的集合)，它们对非霍奇金淋巴瘤(NHL)总体和各种类型的NHL(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)具有高度区分力。实验将选择过滤器应用于候选标志物以鉴定提供高信噪比和低背景水平，从而为NHL和NHL亚型筛查或诊断提供高特异性的标志物。
在一些实施方案中，这项技术涉及评估生物样品(例如，淋巴腺组织、血浆样品)中本文鉴定的一种或多种标志物的存在和甲基化状态。这些标志物包含如本文所讨论，例如，如表1和表3中提供的一个或多个差异甲基化区域(DMR)。在这项技术的实施方案中评估甲基化状态。因此，在测量基因甲基化状态的方法中不限制本文提供的技术。例如，在一些实施方案中，通过基因组扫描方法测量甲基化状态。例如，一种方法涉及限制性界标基因组扫描(Kawai等人(1994)Mol.Cell.Biol.14:7421-7427)并且另一实例涉及甲基化敏感性随机引物PCR(Gonzalgo等人(1997)Cancer Res.57:594-599)。在一些实施方案中，特定CpG位点处甲基化模式的变化通过用甲基化敏感性限制酶消化基因组DNA，随后对感兴趣区域进行DNA印迹分析(Southern analysis)(消化-DNA印迹法)来监测。在一些实施方案中，分析甲基化模式的变化涉及基于PCR的方法，所述方法涉及在PCR扩增之前用甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶消化基因组DNA(Singer-Sam等人(1990)Nucl.Acids Res.18:687)。此外，已报告利用DNA的亚硫酸氢盐处理作为甲基化分析的起点的其他技术。这些技术包括甲基化特异性PCR(MSP)(Herman等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826)和从亚硫酸氢盐转化的DNA扩增的PCR产物的限制酶消化(Sadri和Hornsby(1996)Nucl.AcidsRes.24:5058-5059；以及Xiong和Laird(1997)Nucl.Acids Res.25:2532-2534)。已开发PCR技术用于检测基因突变(Kuppuswamy等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1143-1147)和定量等位基因特异性表达(Szabo和Mann(1995)Genes Dev.9:3097-3108；以及Singer-Sam等人(1992)PCR Methods Appl.1:160-163)。这类技术使用内部引物，其与PCR生成的模板退火并紧邻待测定的单个核苷酸的5'端终止。使用如美国专利号7,037,650中所述的“定量Ms-SNuPE测定法”的方法用在一些实施方案中。
在评估甲基化状态时，甲基化状态通常表示为在特定位点(例如，在单个核苷酸、特定区域或基因座、更长的感兴趣序列，例如，高达约100-bp、200-bp、500-bp、1000-bp的DNA子序列或更长序列)处甲基化的单个DNA链相对于包含该特定位点的样品中的DNA总群体的分数或百分比。传统上，未甲基化核酸的量是通过PCR使用校准器来确定。然后，对已知量的DNA进行亚硫酸氢盐处理(或非亚硫酸氢盐处理(参见，Liu等人,2019,NatBiotechnol.37,第424-429页))，并使用实时PCR或其他指数扩增，例如QuARTS测定法(例如，如美国专利号8,361,720；8,715,937；8,916,344；和9,212,392所提供)对所得的甲基化特异性序列进行测定。
例如，在一些实施方案中，方法包括通过使用外部标准来生成未甲基化靶标的标准曲线。标准曲线由至少两个点构建，并将未甲基化DNA的实时Ct值与已知的定量标准相关联。然后，由至少两个点和外部标准构建甲基化靶标的第二条标准曲线。这个第二条标准曲线将甲基化DNA的Ct与已知的定量标准相关联。接着，确定甲基化和未甲基化群体的测试样品Ct值，并根据前两个步骤产生的标准曲线计算DNA的基因组当量。感兴趣位点处的甲基化百分比由甲基化DNA的量相对于群体中DNA的总量计算，例如(甲基化DNA的数目)/(甲基化DNA的数目+未甲基化DNA的数目)×100。
在一些实施方案中，多个不同的靶标区域包括参考靶标区域，并且在某些优选的实施方案中，参考靶标区域包括β-肌动蛋白和/或ZDHHC1，和/或B3GALT6。
本文还提供了用于实施所述方法的组合物和试剂盒。例如，在一些实施方案中，对一种或多种MDM具有特异性的试剂(例如，引物、探针)单独或成组提供(例如，用于扩增多个标志物的引物对组)。还可以提供用于进行检测测定法的其他试剂(例如，酶、缓冲液、用于进行QuARTS、PCR、测序的阳性和阴性对照、亚硫酸氢盐、十-十一易位(TET)酶(例如，人TET1、人TET2、人TET3、鼠TET1、鼠TET2、鼠TET3、耐格里原虫属(Naegleria)TET(NgTET)、灰盖似鬼伞(Coprinopsis cinerea)(CcTET)或它们的变体)、有机硼烷或其他测定法)。在一些实施方案中，试剂盒含有能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶、十-十一易位(TET)酶(例如，人TET1、人TET2、人TET3、鼠TET1、鼠TET2、鼠TET3、耐格里原虫属TET(NgTET)、灰盖似鬼伞(CcTET)或它们的变体)、有机硼烷)，和/或能够检测本文所述的蛋白质标志物的水平增加的试剂。在一些实施方案中，提供了含有一种或多种对于进行方法必需的、充分的或有用的试剂的试剂盒。还提供了含有试剂的反应混合物。还提供了含有多种试剂的预混试剂组，这些试剂可以相互添加和/或添加至测试样品中以完善反应混合物。
在一些实施方案中，本文所述的技术与可编程机器相关联，该可编程机器被设计用于执行由本文所述的方法提供的一系列算术或逻辑运算。例如，这项技术的一些实施方案与计算机软件和/或计算机硬件相关联(例如，在其中执行)。在一个方面，这项技术涉及一种计算机，该计算机包括一种形式的存储器、用于执行算术和逻辑运算的元件以及用于执行一系列指令(例如，本文提供的方法)以读取、操作和存储数据的处理元件(例如，微处理器)。在一些实施方案中，微处理器是系统的一部分，用于：确定甲基化状态(例如，一种或多种DMR，例如如表1和表3中提供的DMR 1-285的甲基化状态)；比较甲基化状态(例如，一种或多种DMR，例如如表1和表3中提供的DMR 1-285的甲基化状态)；生成标准曲线；确定Ct值；计算甲基化的分数、频率或百分比(例如，一种或多种DMR，例如如表1和表3中提供的DMR 1-285的分数、频率或百分比)；鉴定CpG岛；确定测定法或标志物的特异性和/或敏感性；计算ROC曲线和相关的AUC；序列分析；所有均如本文所述或是本领域已知的。
在一些实施方案中，微处理器或计算机在算法中使用甲基化状态数据来预测癌症部位。
在一些实施方案中，软件或硬件组件接收多个测定的结果并基于多个测定的结果确定单个值结果以向用户报告，指示癌症风险(例如，确定例如如表1和表3中提供的多个DMR的甲基化状态)。相关实施方案基于来自多个测定的结果的数学组合(例如加权组合、线性组合)计算风险因子，例如确定多个标志物(例如，如表1和表3中提供的多个DMR)的甲基化状态。在一些实施方案中，DMR的甲基化状态定义了一个维度并且可以在多维空间中具有值并且由多个DMR的甲基化状态定义的坐标是例如向用户报告的结果，例如与癌症相关风险。
一些实施方案包含存储介质和存储器组件。存储器组件(例如，易失性和/或非易失性存储器)可用于存储指令(例如，如本文提供的方法的实施方案)和/或数据(例如工件，例如甲基化测量、序列和与之相关的统计描述)。一些实施方案涉及还包括CPU、图形卡和用户界面(例如，包括例如显示器的输出装置和例如键盘的输入装置)中的一个或多个的系统。
与这项技术相关的可编程机器包括常规的现存技术和正在开发或有待开发的技术(例如，量子计算机、化学计算机、DNA计算机、光学计算机、基于自旋电子学的计算机等)。
在一些实施方案中，这项技术包含用于传输数据的有线(例如，金属电缆、光纤)或无线传输介质。例如，一些实施方案涉及通过网络(例如，局域网(LAN)、广域网(WAN)、自组织网络、互联网等)进行数据传输。在一些实施方案中，可编程机器作为对等体存在于这样的网络上，并且在一些实施方案中可编程机器具有客户端/服务器关系。
在一些实施方案中，数据存储在例如硬盘、闪存、光学介质、软盘等计算机可读存储介质上。
在一些实施方案中，本文提供的技术与协同操作以执行如本文所述的方法的多个可编程装置相关联。例如，在一些实施方案中，多台计算机(例如，通过网络连接)可以并行工作以收集和处理数据，例如，在集群计算或网格计算或一些其他依赖于完整计算机(具有板载CPU、存储器、电源、网络接口等)通过常规网络接口(例如以太网、光纤)或无线网络技术连接到网络(私有、公共或互联网)的分布式计算机架构的执行中。
例如，一些实施方案提供了一种包括计算机可读介质的计算机。该实施方案包括耦合到处理器的随机存取存储器(RAM)。处理器执行被存储在存储器中的计算机可执行程序指令。这样的处理器可以包括微处理器、ASIC、状态机或其他处理器，并且可以是多种计算机处理器中的任一种，例如来自Santa Clara(California)的Intel公司和Schaumburg(Illinois)的Motorola公司的处理器。这样的处理器包括或可以与介质，例如计算机可读介质通信，所述介质存储指令，在由处理器执行时，这些指令使处理器执行本文所述的步骤。
计算机可读介质的实施方案包括但不限于能够为处理器提供计算机可读指令的电子、光学、磁性或其他存储或传输装置。合适介质的其他实例包括但不限于软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、ASIC、配置的处理器、所有光学介质、所有磁带或其他磁性介质，或计算机处理器可以从中读取指令的任何其他介质。此外，各种其他形式的计算机可读介质可以向计算机传输或携带指令，包括路由器、私有或公共网络、或其他有线和无线传输装置或信道。指令可以包含来自任何合适的计算机编程语言的代码，该计算机编程语言包括例如C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl和JavaScript。
在一些实施方案中，计算机连接到网络。计算机还可以包括许多外部或内部装置，例如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器或其他输入或输出装置。计算机的实例是个人计算机、数字助理、个人数字助理、蜂窝电话、移动电话、智能电话、寻呼机、数字平板电脑、膝上型计算机、互联网设备和其他基于处理器的装置。一般来说，与本文提供的技术的各方面相关的计算机可以是在任何操作系统上操作的任何类型的基于处理器的平台，所述操作系统例如为Microsoft Windows、Linux、UNIX、Mac OS X等，其能够支持一个或多个包含本文提供的技术的程序。一些实施方案包括执行其他应用程序(例如，应用程序)的个人计算机。应用程序可以含在存储器中并且可以包括例如文字处理应用程序、电子表格应用程序、电子邮件应用程序、即时消息应用程序、演示应用程序、因特网浏览器应用程序、日历/组织器应用程序和任何其他能够由客户端装置执行的应用程序。
本文所述的与这项技术相关联的所有这类组件、计算机和系统可以是逻辑的或虚拟的。
因此，本文提供了涉及在从受试者获得的样品中筛查NHL和/或各种形式的NHL(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的方法的技术，所述方法包括测定从受试者获得的样品(例如，淋巴腺组织)(例如，血浆样品)中标志物的甲基化状态，以及当标志物的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的标志物的甲基化状态时，将受试者鉴定为患有NHL和/或NHL的特定亚型，其中标志物包含差异甲基化区域(DMR)中的碱基，所述DMR选自由表1和3中提供的DMR 1-285组成的组。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有NHL：ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503(参见，表2，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有NHL：BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有NHL：BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表4，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有NHL：BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有滤泡性淋巴瘤：ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6(参见，表6，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有滤泡性淋巴瘤：ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C(参见，表12，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有滤泡性淋巴瘤：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503(参见表6，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有滤泡性淋巴瘤：ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表12，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有滤泡性淋巴瘤：HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有DLBCL：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表7，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有DLBCL：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有DLBCL：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见表7，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有DLBCL：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有DLBCL：MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有套细胞淋巴瘤：CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C(参见，表8，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有套细胞淋巴瘤：BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1(参见，表14，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有套细胞淋巴瘤：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见表8，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有套细胞淋巴瘤：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C(参见，表14，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有边缘区淋巴瘤：CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5(参见，表9，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有边缘区淋巴瘤：ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1(参见，表15，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有边缘区淋巴瘤：BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266(参见表9，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有边缘区淋巴瘤：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1(参见，表15，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有边缘区淋巴瘤：CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有边缘区淋巴瘤：CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有外周T细胞淋巴瘤：CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1(参见，表10，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有外周T细胞淋巴瘤：GABRG3、ITGA5和JUP(参见，表16，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有外周T细胞淋巴瘤：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1(参见表10，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有外周T细胞淋巴瘤：BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1(参见，表16，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是淋巴腺组织并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有外周T细胞淋巴瘤：CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
在一些实施方案中，其中从受试者获得的样品是血液样品(例如，血浆、血清、全血)并且以下标志物中的一种或多种的甲基化状态不同于在未患NHL或NHL的亚型的受试者中测定的一种或多种标志物的甲基化状态指示受试者患有外周T细胞淋巴瘤：CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
该技术涉及鉴定和区分NHL和/或各种形式的NHL(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)。一些实施方案提供了包括测定多个标志物的方法，例如，包括测定2至11至100或120或198或285个标志物(例如，1-4、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-25、1-50、1-75、1-100、1-150、1-198、1-285个)(例如，2-4、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11、2-12、2-13、2-14、2-15、2-16、2-17、2-18、2-19、2-20、2-25、2-50、2-75、2-100、2-198、2-285个)(例如，3-4、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-11、3-12、3-13、3-14、3-15、3-16、3-17、3-18、3-19、3-20、3-25、3-50、3-75、3-100、3-198、3-285个)(例如，4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15、4-16、4-17、4-18、4-19、4-20、4-25、4-50、4-75、4-100、4-198、4-285个)(例如，5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5-12、5-13、5-14、5-15、5-16、5-17、5-18、5-19、5-20、5-25、5-50、5-75、5-100、5-198、5-285个)。
这项技术不限于所评估的甲基化状态。在一些实施方案中，评估样品中标志物的甲基化状态包括确定一种碱基的甲基化状态。在一些实施方案中，测定样品中标志物的甲基化状态包括确定多种碱基的甲基化程度。此外，在一些实施方案中，标志物的甲基化状态包含相对于标志物的正常甲基化状态增加的标志物甲基化。在一些实施方案中，标志物的甲基化状态包含相对于标志物的正常甲基化状态减少的标志物甲基化。在一些实施方案中，标志物的甲基化状态包含相对于标志物的正常甲基化状态不同的标志物甲基化模式。
此外，在一些实施方案中，标志物是100个或更少碱基的区域，标志物是500个或更少碱基的区域，标志物是1000个或更少碱基的区域，标志物是5000个或更少碱基的区域，或在一些实施方案中，标志物是一个碱基。在一些实施方案中，标志物在高CpG密度启动子中。
这项技术不受样品类型的限制。例如，在一些实施方案中，样品是粪便样品、组织样品(例如，淋巴腺组织样品)、血液样品(例如，血浆、血清、全血)、排泄物或尿液样品。在一些实施方案中，样品包括血液、血清、血浆、胃分泌物、胰液、脑脊液(CSF)样品、胃肠道活检样品和/或从粪便中回收的细胞。在一些实施方案中，受试者是人。样品可以包括来自淋巴腺、乳房、肝脏、胆管、胰腺、胃、结肠、直肠、食道、小肠、阑尾、十二指肠、息肉、胆囊、肛门和/或腹膜的细胞、分泌物或组织。在一些实施方案中，样品包括细胞液、腹水、尿液、粪便、胃段、胰液、在内窥镜检查期间获得的流体、血液、粘液或唾液。
此外，在用于确定甲基化状态的方法中不限制这项技术。在一些实施方案中，分析包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶标捕获。在一些实施方案中，测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。在一些实施方案中，这项技术使用大规模平行测序(例如，下一代测序)来确定甲基化状态，例如，边合成边测序、实时(例如，单分子)测序、珠乳液测序(bead emulsion sequencing)、纳米孔测序等。
这项技术提供了用于检测DMR的试剂，例如，在一些实施方案中提供了一组寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO:1-124提供的序列(参见表5)。在一些实施方案中，提供了包含与在DMR中具有碱基的染色体区域互补的序列的寡核苷酸，例如对DMR的甲基化状态敏感的寡核苷酸。
这项技术提供了用于鉴定NHL的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503(参见，表2，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定NHL的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定NHL的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表4，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定NHL的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定滤泡性淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6(参见，表6，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定滤泡性淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C(参见，表12，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定滤泡性淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503(参见表6，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定滤泡性淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表12，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定滤泡性淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定DLBCL的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表7，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定DLBCL的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定DLBCL的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见表7，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定DLBCL的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定DLBCL的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定套细胞淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C(参见，表8，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定套细胞淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1(参见，表14，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定套细胞淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见表8，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定套细胞淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C(参见，表14，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定边缘区淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5(参见，表9，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定边缘区淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定边缘区淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1(参见，表15，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定边缘区淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266(参见表9，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定边缘区淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1(参见，表15，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定外周T细胞淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1(参见，表10，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定外周T细胞淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定外周T细胞淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：GABRG3、ITGA5和JUP(参见，表16，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定外周T细胞淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1(参见表10，实施例I)。
这项技术提供了用于鉴定外周T细胞淋巴瘤的各种标志物组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有如下注释的染色体区域：BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1(参见，表16，实施例I)。
提供了试剂盒实施方案，例如，试剂盒含有能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶、十-十一易位(TET)酶(例如，人TET1、人TET2、人TET3、鼠TET1、鼠TET2、鼠TET3、耐格里原虫属TET(NgTET)、灰盖似鬼伞(CcTET)或它们的变体)、有机硼烷)；以及对照核酸，其包含来自DMR 1-285(来自表1和3)的一个或多个序列并且具有与未患癌症的受试者相关的甲基化状态。在一些实施方案中，试剂盒包括亚硫酸氢盐试剂和如本文所述的寡核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包括能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶、十-十一易位(TET)酶(例如，人TET1、人TET2、人TET3、鼠TET1、鼠TET2、鼠TET3、耐格里原虫属TET(NgTET)、灰盖似鬼伞(CcTET)或它们的变体)、有机硼烷)；以及对照核酸，其包含来自DMR 1-285(来自表1和3)的一个或多个序列并且具有与患有特定类型的癌症的受试者相关的甲基化状态。一些试剂盒实施方案包括用于从受试者获得样品(例如，粪便样品；组织样品；血浆样品、血清样品、全血样品)的样品收集器；能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶、十-十一易位(TET)酶(例如，人TET1、人TET2、人TET3、鼠TET1、鼠TET2、鼠TET3、耐格里原虫属TET(NgTET)、灰盖似鬼伞(CcTET)或它们的变体)、有机硼烷)；以及如本文所述的寡核苷酸。
这项技术涉及组合物(例如，反应混合物)的实施方案。在一些实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含含有DMR的核酸以及能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶、十-十一易位(TET)酶(例如，人TET1、人TET2、人TET3、鼠TET1、鼠TET2、鼠TET3、耐格里原虫属TET(NgTET)、灰盖似鬼伞(CcTET)或它们的变体)、有机硼烷)。一些实施方案提供包含核酸的组合物，所述核酸包含DMR和如本文所述的寡核苷酸。一些实施方案提供包含核酸的组合物，所述核酸包含DMR和甲基化敏感性限制酶。一些实施方案提供包含核酸的组合物，所述核酸包含DMR和聚合酶。
提供了用于在从受试者获得的样品(例如，淋巴腺组织样品；血浆样品；粪便样品)中筛查NHL和/或各种形式的NHL(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的额外的相关方法实施方案，例如一种方法，所述方法包括确定样品中标志物的甲基化状态，所述标志物包含如DMR 1-285(来自表1和3)中的一个或多个的DMR中的碱基；将来自受试者样品的标志物的甲基化状态与来自未患NHL(例如，NHL和/或以下NHL形式：DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的受试者的正常对照样品的标志物的甲基化状态进行比较；以及确定受试者样品和正常对照样品的甲基化状态差异的置信区间和/或p值。在一些实施方案中，置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，并且p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。方法的一些实施方案提供了使包含DMR的核酸与能够以甲基化特异性方式修饰核酸的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶、十-十一易位(TET)酶(例如，人TET1、人TET2、人TET3、鼠TET1、鼠TET2、鼠TET3、耐格里原虫属TET(NgTET)、灰盖似鬼伞(CcTET)或它们的变体)、有机硼烷)反应的步骤，以产生例如以甲基化特异性方式修饰的核酸；对以甲基化特异性方式修饰的核酸进行测序，以提供以甲基化特异性方式修饰的核酸的核苷酸序列；将以甲基化特异性方式修饰的核酸的核苷酸序列与来自未患特定类型的癌症的受试者的包含DMR的核酸的核苷酸序列进行比较，以鉴定这两个序列的差异；以及当存在差异时，将受试者鉴定为患有特定类型的癌症。在一些实施方案中，癌症是NHL(例如，NHL和/或以下NHL形式：DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)。
这项技术提供了用于在从受试者获得的样品中筛查NHL或NHL的亚型的系统。系统的示例性实施方案包括例如用于在从受试者获得的样品(例如，淋巴腺组织样品；血浆样品；粪便样品)中筛查NHL和/或NHL的类型(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的系统，所述系统包括：分析组件，所述分析组件被配置用于确定样品的甲基化状态；软件组件，所述软件组件被配置用于将样品的甲基化状态与数据库中记录的对照样品或参考样品甲基化状态进行比较；以及警报组件，所述警报组件被配置用于向用户发出关于淋巴瘤相关的甲基化状态的警报。在一些实施方案中，警报由软件组件确定，所述软件组件接收多个测定的结果(例如，确定多种标志物，如例如表1和表3中提供的DMR的甲基化状态)并基于多个结果计算值或结果以进行报告。一些实施方案提供与本文提供的每个DMR相关联的加权参数的数据库，用于计算值或结果和/或警报以向用户(例如，如医师、护士、临床医生等)报告。在一些实施方案中，报告了来自多个测定的所有结果，并且在一些实施方案中，一个或多个结果用于提供评分、值或结果，所述评分、值或结果基于来自多个测定的一个或多个结果的复合物，其指示受试者中的癌症风险。
在系统的一些实施方案中，样品包含含有DMR的核酸。在一些实施方案中，该系统还包括用于分离核酸的组件、用于收集样品的组件，例如用于收集粪便样品血浆样品的组件。在一些实施方案中，系统包含含有DMR的核酸序列。在一些实施方案中，数据库包括来自未患NHL和/或特定类型的NHL(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的受试者的核酸序列。还提供了核酸，例如一组核酸，每个核酸具有包含DMR的序列。在一些实施方案中，核酸组，其中每个核酸具有来自未患NHL和/或特定类型的NHL(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的受试者的序列。相关系统实施方案包括如所述的一组核酸和与该组核酸相关的核酸序列数据库。一些实施方案还包括能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶、十-十一易位(TET)酶(例如，人TET1、人TET2、人TET3、鼠TET1、鼠TET2、鼠TET3、耐格里原虫属TET(NgTET)、灰盖似鬼伞(CcTET)或它们的变体)、有机硼烷)。一些实施方案还包括核酸测序仪。
在某些实施方案中，提供了用于表征来自人患者的样品(例如，淋巴腺组织样品；血浆样品；全血样品；血清样品；粪便样品)的方法。例如，在一些实施方案中，此类实施方案包括从人患者的样品获得DNA；测定DNA甲基化标志物的甲基化状态，所述DNA甲基化标志物包含选自由表1和3的DMR 1-285组成的组的差异甲基化区域(DMR)中的碱基；以及将一种或多种DNA甲基化标志物的测定的甲基化状态与未患NHL和/或特定类型的NHL(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的人患者的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较。
这类方法不限于来自人患者的特定类型的样品。在一些实施方案中，样品是淋巴腺组织样品。在一些实施方案中，样品是血浆样品。在一些实施方案中，样品是粪便样品、组织样品、淋巴腺组织样品、血液样品(例如，血浆样品、全血样品、血清样品)或尿液样品。
在一些实施方案中，此类方法包括测定多个DNA甲基化标志物(例如，1-4、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-25、1-50、1-75、1-100、1-150、1-198、1-285个)(例如，2-4、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11、2-12、2-13、2-14、2-15、2-16、2-17、2-18、2-19、2-20、2-25、2-50、2-75、2-100、2-198、2-285个)(例如，3-4、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-11、3-12、3-13、3-14、3-15、3-16、3-17、3-18、3-19、3-20、3-25、3-50、3-75、3-100、3-198、3-285个)(例如，4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15、4-16、4-17、4-18、4-19、4-20、4-25、4-50、4-75、4-100、4-198、4-285个)(例如，5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5-12、5-13、5-14、5-15、5-16、5-17、5-18、5-19、5-20、5-25、5-50、5-75、5-100、5-198、5-285个)。在一些实施方案中，此类方法包括测定2至11个DNA甲基化标志物。在一些实施方案中，此类方法包括测定12至120个DNA甲基化标志物。在一些实施方案中，此类方法包括测定2至285个DNA甲基化标志物。在一些实施方案中，这类方法包括测定样品中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化状态，包括确定一种碱基的甲基化状态。在一些实施方案中，这类方法包括测定样品中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化状态，包括确定多种碱基处的甲基化程度。在一些实施方案中，这类方法包括测定正向链的甲基化状态或测定反向链的甲基化状态。
在一些实施方案中，DNA甲基化标志物是100个或更少碱基的区域。在一些实施方案中，DNA甲基化标志物是500个或更少碱基的区域。在一些实施方案中，DNA甲基化标志物是1000个或更少碱基的区域。在一些实施方案中，DNA甲基化标志物是5000个或更少碱基的区域。在一些实施方案中，DNA甲基化标志物是一个碱基。在一些实施方案中，DNA甲基化标志物在高CpG密度启动子中。
在一些实施方案中，分析包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶标捕获。
在一些实施方案中，测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。在一些实施方案中，甲基化特异性寡核苷酸选自由SEQ ID NO:1-124(表5)组成的组。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503(参见，表2，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表4，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6(参见，表6，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C(参见，表12，实施例I)。
在一些实施方案，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503(参见表6，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表12，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表7，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见表7，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C(参见，表8，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1(参见，表14，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见表8，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C(参见，表14，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5(参见，表9，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1(参见，表15，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266(参见，表9，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1(参见，表15，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1(参见，表10，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：GABRG3、ITGA5和JUP(参见，表16，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1(参见表10，实施例I)。
在一些实施方案中，具有选自由以下组成的组的注释的染色体区包含DNA甲基化标志物：BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1(参见，表16，实施例I)。
在一些实施方案中，这类方法包括确定两种DNA甲基化标志物的甲基化状态。在一些实施方案中，这类方法包括确定在表1和/或表3的一行中提供的一对DNA甲基化标志物的甲基化状态。
在某些实施方案中，这项技术提供了用于表征从人患者获得的样品(例如，淋巴腺组织样品；血浆样品；全血样品；血清样品；粪便样品)的方法。这类方法包括确定样品中的DNA甲基化标志物的甲基化状态，所述DNA甲基化标志物包含选自由表1和3的DMR 1-285组成的组的DMR中的碱基；将来自患者样品的DNA甲基化标志物的甲基化状态与来自未患NHL癌症和/或NHL的特定形式(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的人受试者的正常对照样品的DNA甲基化标志物的甲基化状态进行比较；以及确定人患者和正常对照样品的甲基化状态差异的置信区间和/或p值。在一些实施方案中，置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，并且p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
在某些实施方案中，这项技术提供了用于表征从人受试者获得的样品(例如，淋巴腺组织样品；血浆样品；全血样品；血清样品；粪便样品)的方法，所述方法包括使包含DMR的核酸与能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)反应，以产生以甲基化特异性方式修饰的核酸；对以甲基化特异性方式修饰的核酸进行测序，以提供以甲基化特异性方式修饰的核酸的核苷酸序列；将以甲基化特异性方式修饰的核酸的核苷酸序列与来自未患NHL或NHL的亚型的受试者的包含DMR的核酸的核苷酸序列进行比较，以鉴定这两个序列的差异。
在某些实施方案中，这项技术提供了用于表征从人受试者获得的样品(例如，淋巴腺组织样品；血浆样品；粪便样品)的系统，所述系统包括：分析组件，所述分析组件被配置用于确定样品的甲基化状态；软件组件，所述软件组件被配置用于将样品的甲基化状态与数据库中记录的对照样品或参考样品甲基化状态进行比较；以及警报组件，所述警报组件被配置用于基于甲基化状态的组合确定单个值并向用户发出关于NHL相关的甲基化状态的警报。在一些实施方案中，样品包含含有DMR的核酸。
在一些实施方案中，这类系统还包括用于分离核酸的组件。在一些实施方案中，这类系统还包括用于收集样品的组件。
在一些实施方案中，样品是粪便样品、组织样品、淋巴腺组织样品、血液样品(例如，血浆样品、全血样品、血清样品)或尿液样品。在一些实施方案中，样品包括血液、血清、血浆、胃分泌物、胰液、脑脊液(CSF)样品、胃肠道活检样品和/或从粪便中回收的细胞。在一些实施方案中，受试者是人。样品可以包括来自淋巴腺、乳房、肝脏、胆管、胰腺、胃、结肠、直肠、食道、小肠、阑尾、十二指肠、息肉、胆囊、肛门和/或腹膜的细胞、分泌物或组织。在一些实施方案中，样品包括细胞液、腹水、尿液、粪便、胃段、胰液、在内窥镜检查期间获得的流体、血液。
在一些实施方案中，数据库包含含有DMR的核酸序列。在一些实施方案中，数据库包含来自未患NHL或NHL的亚型的受试者的核酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的方法中的任一者还包括在所获得的生物样品(例如，粪便样品、组织样品(例如，淋巴腺组织)、器官分泌物样品、CSF样品、唾液样品、血液样品、血浆样品或尿液样品)内检测是否存在与NHL或NHL的亚型一致和/或相关的一个或多个遗传条件。此类方法不限于与NHL或NHL的亚型一致和/或相关的遗传条件。在一些实施方案中，遗传条件是非整倍性。在一些实施方案中，遗传条件是点突变、缺失突变、插入突变、扩增突变或在基因突变数据库中注册的任何其他突变。在一些实施方案中，这种对与NHL或NHL的亚型一致和/或相关的一个或多个遗传条件的是否存在的进一步检测与本文所述的标志物组合使用，以检测一种或多种癌症类型的是否存在。在一些实施方案中，这种对与任何类型的癌症一致和/或相关的一个或多个遗传条件的是否存在的进一步检测增强了本文所述的方法中的任一种的性能结论。在一些实施方案中，这种对与任何类型的癌症一致和/或相关的一个或多个遗传条件的是否存在的进一步检测被用作对本文所述的方法中的任一种的结论的确认。
本文提供了用于检测一类或多类生物标志物的一个或多个成员(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个成员)在从受试者获得的样品中的存在和/或非整倍性在从受试者获得的样品中的存在的方法和材料。在一些实施方案中，一类或多类生物标志物的一个或多个成员的存在和/或非整倍性的存在被同时测试(例如，在一个测试程序中，包括测试程序本身可以包括多个离散的系统测试方法的实施方案)。在一些实施方案中，一类或多类生物标志物的一个或多个成员的存在和/或非整倍性的存在被顺序测试(例如，在两个或更多个不同时间点进行的两个或更多个不同的测试程序中，包括测试程序本身可以包括多个离散的系统测试方法的实施方案)。在针对一类或多类生物标志物的一个或多个成员的存在和/或非整倍性的存在的同时和顺序测试二者的一些实施方案中，测试可以对单个样品进行或者可以对两个或更多个不同的样品(例如，从同一受试者获得的两个或更多个不同的样品)进行。
基于本文所含的教导内容，额外实施方案对于相关领域的技术人员来说将是显而易见的。
附图说明
图1：用于表1和3中列举的各种甲基化的DNA标志物的标志物染色体区域以及相关的引物和探针信息。图中显示了来自PCR靶标区域的天然存在的序列(WT)和亚硫酸氢盐修饰的序列(BST)。
定义
为了便于理解本发明的技术，以下定义了多个术语和短语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另外清楚规定，否则以下术语采用与本文明确相关的含义。如本文所用，短语“在一个实施方案中”不一定指相同的实施方案，尽管其可能是这样。此外，如本文所用，短语“在另一个实施方案中”不一定指不同的实施方案，尽管其可能是这样。因此，如下所述，在不脱离本发明的范围或精神下，可以容易地组合本发明的各种实施方案。
另外，除非上下文另外清楚规定，否则如本文所用，术语“或”是包括性的“或”运算符并且等同于术语“和/或”。除非上下文另外清楚规定，术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的另外的因素。另外，在整个说明书中，“一(a/an)”和“所述”的含义包括复数个提及物。“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。
如在本申请中的权利要求书中使用的过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限于所说明的材料或步骤，“以及实质上不影响所要求的发明的基本和新颖特征的那些材料或步骤”，如In re Herz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA 1976)中所论述。举例来说，“基本上由所列举元素组成的”组合物可以含有一定水平的未列举的污染物，使得污染物尽管存在，但与纯组合物，即“由所列举组分组成”的组合物相比，不会改变所列举组合物的功能。
如本文所用，术语“一个或多个”是指大于一的数。例如，术语“一个或多个”涵盖以下中的任一者：两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、十二个或更多个、十三个或更多个、十四个或更多个、十五个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、100个或更多个或者甚至更多个的数。
术语“一个或多个但小于更大的数字”、“两个或更多个但小于更大的数字”、“三个或更多个但小于更大的数字”、“四个或更多个但小于更大的数字”、“五个或更多个但小于更大的数字”、“六个或更多个但小于更大的数字”、“七个或更多个但小于更大的数字”、“八个或更多个但小于更大的数字”、“九个或更多个但小于更大的数字”、“十个或更多个但小于更大的数字”、“十一个或更多个但小于更大的数字”、“十二个或更多个但小于更大的数字”、“十三个或更多个但小于更大的数字”、“十四个或更多个但小于更大的数字”或者“十五个或更多个但小于更大的数字”不限于更大的数字。例如，更大的数字可以是10,000、1,000、100、50等。例如，更大的数字可以是大约50(例如，50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、32、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2)。
如本文所用，“核酸”或“核酸分子”一般是指任何核糖核酸或脱氧核糖核酸，其可以是未修饰的或修饰的DNA或RNA。“核酸”包括不限于单链和双链核酸。如本文所用，术语“核酸”还包括含有一个或多个修饰碱基的如上所述的DNA。因此，具有出于稳定性或其他原因而进行修饰的主链的DNA是“核酸”。如本文所用，术语“核酸”涵盖这样的化学、酶促或代谢修饰形式的核酸，以及病毒和细胞(包括例如简单和复杂细胞)特征性的DNA化学形式。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个，优选地超过三个和通常超过十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。确切的大小将取决于许多因素，而这些因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或它们的组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
如本文所用，术语核酸的“基因座”或“区域”是指核酸的亚区域，例如染色体上的基因、单个核苷酸、CpG岛等。
术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的核苷酸(例如1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸序列)。例如，序列5'-A-G-T-3'与序列3'-T-C-A-5'互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“全部”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在依赖于核酸之间的结合的扩增反应和检测方法中特别重要。
术语“基因”是指包含产生RNA或多肽或其前体所必需的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。功能性多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留多肽的所需活性或功能特性(例如酶活性、配体结合、信号转导等)即可。当在提及基因时使用时术语“部分”是指该基因的片段。片段的大小可以在几个核苷酸至整个基因序列减去一个核苷酸的范围内变化。因此，“包含基因至少一部分的核苷酸”可以包含基因片段或整个基因。
术语“基因”还涵盖结构基因的编码区，并包括在5'和3'末端与编码区相邻，例如在任一个末端相距约1kb的序列，使得基因对应于全长mRNA(例如包含编码、调控、结构和其他序列)的长度。位于编码区5'并且存在于mRNA上的序列称为5'非翻译或未翻译序列。位于编码区3'或下游并且存在于mRNA上的序列称为3'非翻译或3'未翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA与基因组形式。在一些生物体(例如真核生物)中，基因的基因组形式或克隆含有被称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可以含有调控元件，例如增强子。内含子从核转录本或初级转录本中移出或“剪除”；因此，在信使RNA(mRNA)转录本中不存在内含子。mRNA在翻译期间发挥作用，以指定新生多肽中氨基酸的序列或次序。
除含有内含子外，基因的基因组形式还可以包括位于RNA转录本上存在的序列的5'和3'末端的序列。这些序列被称为“侧接”序列或区域(这些侧接序列位于mRNA转录本上存在的非翻译序列的5'或3')。5'侧接区域可以含有调控序列，例如启动子和强化子，其控制或影响基因的转录。3'侧接区域可以含有指导转录终止、转录后裂解和多腺苷酸化的序列。
在提及基因时术语“野生型”是指具有从天然存在的来源分离的基因特征的基因。在提及基因产物时术语“野生型”是指具有从天然存在的来源分离的基因产物特征的基因产物。如应用于物体的术语“天然存在”是指可以在自然界中发现物体的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从自然界来源分离并且未经实验室人员有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。野生型基因通常是在群体中最常观察到的基因或等位基因，因此被任意指定为基因的“正常”或“野生型”形式。相比之下，在提及基因或基因产物时术语“修饰的”或“突变的”分别是指与野生型基因或基因产物相比显示序列和/或功能特性修饰(例如特征改变)的基因或基因产物。注意，可以分离天然存在的突变体；这些通过它们与野生型基因或基因产物相比特征改变的事实来鉴定。
术语“等位基因”是指基因的变异；所述变异包括但不限于变体和突变体、多态基因座和单核苷酸多态基因座、移码和剪接突变。等位基因可能在群体中天然存在，或者其可能在群体中任何特定个体的一生中出现。
因此，在提及核苷酸序列时使用时术语“变体”和“突变体”是指与另一个通常相关的核苷酸序列相差一个或多个核苷酸的核酸序列。“变异”是两个不同核苷酸序列之间的差异；典型地，一个序列是参考序列。
“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特定情况。其与非特异性模板复制(例如依赖用模板但不依赖于特定模板的复制)形成对比。在这里模板特异性不同于复制保真度(例如合成适当多核苷酸序列)和核苷酸(核糖或脱氧核糖)特异性。模板特异性常根据“靶标”特异性来描述。在设法从其他核酸中分选出来的意义上，靶序列是“靶标”。扩增技术主要是为这种分选而设计的。
在核酸背景下术语“扩增(amplifying或amplification)”是指典型地从少量多核苷酸(例如单个多核苷酸分子)开始，产生多拷贝的多核苷酸或多核苷酸的一部分，其中扩增产物或扩增子一般是可检测的。多核苷酸的扩增涵盖多种化学和酶促过程。在聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR；参见例如美国专利号5,494,810；以引用方式整体并入本文中)期间从靶标或模板DNA分子的一个或几个拷贝产生多个DNA拷贝是扩增的形式。另外类型的扩增包括(但不限于)等位基因特异性PCR(参见例如美国专利号5,639,611；以引用方式整体并入本文中)、装配PCR(参见例如美国专利号5,965,408；以引用方式整体并入本文中)、解旋酶依赖性扩增(参见例如美国专利号7,662,594；以引用方式整体并入本文中)、热启动PCR(参见例如美国专利号5,773,258和5,338,671；各自以引用方式整体并入本文中)、序列间特异性PCR、反向PCR(参见例如Triglia等人(1988)Nucleic Acids Res.,16:8186；以引用方式整体并入本文中)、连接介导的PCR(参见例如Guilfoyle,R.等人,NucleicAcids Research,25:1854-1858(1997)；美国专利号5,508,169；各自以引用方式整体并入本文中)、甲基化特异性PCR(参见例如Herman等人,(1996)PNAS 93(13)9821-9826；以引用方式整体并入本文中)、微型引物PCR、多重连接依赖性探针扩增(参见例如Schouten等人,(2002)Nucleic Acids Research 30(12):e57；以引用方式整体并入本文中)、多重PCR(参见例如Chamberlain等人,(1988)Nucleic Acids Research 16(23)11141-11156；Ballabio等人,(1990)Human Genetics 84(6)571-573；Hayden等人,(2008)BMC Genetics 9:80；各自以引用方式整体并入本文中)、巢式PCR、重叠延伸PCR(参见例如Higuchi等人,(1988)Nucleic Acids Research 16(15)7351-7367；以引用方式整体并入本文中)、实时PCR(参见例如Higuchi等人,(1992)Biotechnology 10:413-417；Higuchi等人,(1993)Biotechnology11:1026-1030；各自以引用方式整体并入本文中)、逆转录PCR(参见例如Bustin,S.A.(2000)J.Molecular Endocrinology 25:169-193；以引用方式整体并入本文中)、固相PCR、热不对称交错PCR和降落PCR(参见例如Don等人,Nucleic Acids Research(1991)19(14)4008；Roux,K.(1994)Biotechniques 16(5)812-814；Hecker等人,(1996)Biotechniques 20(3)478-485；各自以引用方式整体并入本文中)。多核苷酸扩增也可以使用数字PCR来完成(参见例如Kalinina等人,Nucleic Acids Research.25；1999-2004,(1997)；Vogelstein和Kinzler,Proc Natl Acad Sci USA.96；9236-41,(1999)；国际专利公布号WO05023091A2；美国专利申请公布号20070202525；各自以引用方式整体并入本文中)。
术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis的美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法，其描述了一种增加基因组或其他DNA或RNA的混合物中的靶序列区段的浓度的方法，不进行克隆或纯化。这种扩增靶序列的过程由以下组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入含有所需靶序列的DNA混合物中，接着在DNA聚合酶存在下进行精确的热循环序列。两种引物与它们各自的双链靶序列的链互补。为了实现扩增，使混合物变性，然后使引物与它们在靶分子内的互补序列退火。在退火之后，将引物用聚合酶延伸以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以存在多个“循环”)以获得高浓度的所需靶序列的扩增区段。所需靶序列的扩增区段的长度由引物彼此之间的相对位置决定，因此，该长度是一个可控参数。由于所述过程的重复方面，所述方法称为“聚合酶链式反应”(“PCR”)。因为靶序列的所需扩增区段变成混合物中的主要序列(在浓度方面)，所以它们被称为“PCR扩增”并且是“PCR产物”或“扩增子”。本领域的技术人员将理解，术语“PCR”涵盖使用例如实时PCR、巢式PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、单引物和随机引物PCR等最初描述的方法的许多变体。
大部分扩增技术是通过选择酶来实现模板特异性的。扩增酶是在使用它们的条件下将仅加工核酸的异质混合物中的特定核酸序列的酶。例如，在Q-β复制酶的情况下，MDV-1RNA是复制酶的特定模板(Kacian等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:3038[1972])。其他核酸不会被这种扩增酶复制。类似地，在T7 RNA聚合酶的情况下，这种扩增酶对其自身的启动子具有严格的特异性(Chamberlin等人,Nature,228:227[1970])。在T4 DNA连接酶的情况下，酶不会连接两种寡核苷酸或多核苷酸，其中寡核苷酸或多核苷酸底物与模板之间在连接点处存在错配(Wu和Wallace(1989)Genomics 4:560)。最终，发现依赖于热稳定模板的DNA聚合酶(例如Taq和Pfu DNA聚合酶)由于它们能够在高温下发挥作用，而对由引物限制并因此由引物界定的序列显示高特异性；高温产生有利于引物与靶序列杂交而不利于与非靶序列杂交的热力学条件(H.A.Erlich(编辑),PCR Technology,Stockton Press[1989])。
如本文所用，术语“核酸检测测定法”是指测定感兴趣核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定法包括但不限于DNA测序法、探针杂交法、结构特异性裂解测定法(例如INVADER测定法(Hologic,Inc.)，并描述于例如美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816；Lyamichev等人,Nat.Biotech.,17:292(1999)；Hall等人,PNAS,USA,97:8272(2000)和美国专利号9,096,893，它们中的每一者都以引用方式整体并入本文中以用于所有目的)；酶错配裂解法(例如Variagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，以引用方式整体并入本文中)；上述聚合酶链式反应(PCR)；分支杂交法(例如Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，以引用方式整体并入本文中)；滚环复制(例如美国专利号6,210,884、6,183,960和6,235,502，以引用方式整体并入本文中)；NASBA(例如美国专利号5,409,818，以引用方式整体并入本文中)；分子信标技术(例如美国专利号6,150,097，以引用方式整体并入本文中)；电子传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，以引用方式整体并入本文中)；循环探针技术(例如美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，以引用方式整体并入本文中)；Dade Behring信号放大法(例如美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，以引用方式整体并入本文中)；连接酶链式反应(例如Baranay Proc.Natl.Acad.Sci USA88,189-93(1991))；和夹心杂交法(例如美国专利号5,288,609，以引用方式整体并入本文中)。
术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常包含“样品模板”。
术语“样品模板”是指源自针对“靶标”(定义如下)的存在进行分析的样品的核酸。相比之下，“背景模板”用于指代样品中可能存在或不存在的除样品模板以外的核酸。背景模板通常是无意的。它可能是交叉污染的结果，或者可能是由于存在试图从样品中净化掉的核酸污染物。例如，来自生物体的除待检测核酸之外的核酸可能作为测试样品中的背景存在。
术语“引物”是指当置于诱导与核酸模板链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶存在下以及在合适温度和pH值下)时能够充当合成起始点的寡核苷酸，无论天然存在，如例如来自限制消化液的核酸片段，还是合成产生。引物优选是单链的，以获得最大的扩增效率，但也可以是双链的。如果是双链，那么引物在用于制备延伸产物之前首先进行处理以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。
术语“探针”是指能够与另一感兴趣寡核苷酸杂交的寡核苷酸(例如核苷酸序列)，无论天然存在，如纯化的限制消化液中，还是合成、重组或通过PCR扩增产生。探针可以是单链或双链的。探针可用于检测、鉴定和分离特定基因序列(例如，“捕获探针”)。预期本发明中使用的任何探针在一些实施方案中都可以用任何“报告分子”标记，以便在任何检测系统中可检测，包括但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。并不意图将本发明限于任何特定的检测系统或标记。
如本文所用，术语“靶标”是指设法例如通过探针结合、扩增、分离、捕获等从其他核酸中分选出的核酸。例如，当用于聚合酶链式反应时，“靶标”是指由用于聚合酶链式反应的引物结合的核酸区域，而当用于不扩增靶DNA的测定法时，例如在侵入性裂解测定法的一些实施方案中，靶标包括探针和侵入性寡核苷酸(例如，INVADER寡核苷酸)结合形成侵入性裂解结构的位点，以便可以检测到靶核酸的存在。“区段”定义为靶序列内的核酸区域。
因此，如本文所用，“非靶标”，例如，当它用于描述核酸诸如DNA时，是指可以存在于反应中但不是反应所检测或表征的对象的核酸。在一些实施方案中，非靶标核酸可以指例如不含有靶标序列的存在于样品中的核酸，而在一些实施方案中，非靶标可以指外源核酸，即不来源于含有或怀疑含有靶标核酸的样品的核酸，所述核酸被添加至反应中，例如以使酶(例如，聚合酶)的活性归一化，从而降低酶在反应中的性能的可变性。如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶的C5或N4位置的胞嘧啶甲基化、腺嘌呤的N6位置或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常未甲基化，因为典型的体外DNA扩增方法不会保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化的DNA”或“甲基化的DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
如本文所用，术语“扩增试剂”是指除引物、核酸模板和扩增酶之外的扩增所需的那些试剂(脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液等)。通常，扩增试剂与其他反应组分一起放置并包含在反应容器中。
如本文所用，术语“对照”在结合核酸检测或分析使用时是指具有已知特征(例如，已知序列、已知每个细胞的拷贝数)的核酸，与实验靶标(例如，未知浓度的核酸)对比使用。对照可以是内源性的，优选地不变的基因，测定中的测试或靶标核酸可以针对该不变的基因进行归一化。这种归一化控制可以发生在例如样品处理、测定效率等中的样品间变化，并允许对样品间数据进行准确比较。可用于对人样品进行核酸检测测定归一化的基因包括，例如，β-肌动蛋白、ZDHHC1和B3GALT6(参见，例如，美国专利申请序列号14/966,617和62/364,082，每个专利申请均以引用的方式并入本文。
对照也可以是外部的。例如，在定量测定诸如qPCR、QuARTS等中，“校准品”或“校准对照”是已知序列的核酸，例如，与实验靶标核酸的一部分具有相同的序列，并且具有已知浓度或一系列浓度(例如，用于在定量PCR中生成校准曲线的连续稀释的对照靶标)。通常，校准对照使用与实验DNA相同的试剂和反应条件进行分析。在某些实施方案中，校准品的测量与实验测定同时进行，例如，在相同的热循环仪中。在优选的实施方案中，多个校准品可以包括在单个质粒中，以使得不同的校准品序列很容易以等摩尔量提供。在特别优选的实施方案中，质粒校准品被消化，例如，用一种或多种限制酶消化，以从质粒载体释放校准品部分。参见，例如，WO2015/066695，该专利以引用的方式并入本文。
如本文所用，“ZDHHC1”是指编码蛋白质的基因，所述校准物的特征在于含DHHC型1锌指，定位于人DNA的Chr16上(16q22.1)并且属于DHHC棕榈酰基转移酶家族。
如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶的C5或N4位置的胞嘧啶甲基化、腺嘌呤的N6位置或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常未甲基化，因为典型的体外DNA扩增方法不会保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化的DNA”或“甲基化的DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶的C5或N4位置的胞嘧啶甲基化、腺嘌呤的N6位置或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常未甲基化，因为典型的体外DNA扩增方法不会保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化的DNA”或“甲基化的DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
因此，如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指核苷酸碱基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不含甲基部分，但5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的5位含有甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的5位含有甲基部分；然而，就本文而言，当存在于DNA中时，胸腺嘧啶不被视为甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。
如本文所用，“甲基化核酸分子”是指含有一个或多个甲基化核苷酸的核酸分子。
如本文所用，核酸分子的“甲基化状态”、“甲基化概况”和“甲基化状况”是指核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸碱基的存在或不存在。例如，含有甲基化胞嘧啶的核酸分子被认为是甲基化的(例如，核酸分子的甲基化状态是甲基化的)。不含任何甲基化核苷酸的核酸分子被认为是未甲基化的。
特定核酸序列(例如，如本文所述的基因标志物或DNA区域)的甲基化状态可以指示序列中每个碱基的甲基化状态，或者可以指示序列内碱基子集(例如，一个或多个胞嘧啶)的甲基化状态，或者可以指示关于序列内区域甲基化密度的信息，提供或不提供序列内发生甲基化的位置的精确信息。
核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态是指核酸分子中特定基因座处甲基化核苷酸的存在或不存在。例如，当核酸分子中第7个核苷酸处存在的核苷酸为5-甲基胞嘧啶时，核酸分子中第7个核苷酸处胞嘧啶的甲基化状态是甲基化的。类似地，当核酸分子中第7个核苷酸处存在的核苷酸为胞嘧啶(而非5-甲基胞嘧啶)时，核酸分子中第7个核苷酸处胞嘧啶的甲基化状态是未甲基化的。
甲基化状态可以任选地以“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比率、百分比等)。可以例如通过用甲基化依赖性限制酶来定量限制性消化后存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列，或者通过比较TET处理和未处理的核酸来生成甲基化值。因此，值，例如甲基化值，代表甲基化状况并且因此可以用作跨基因座的多个拷贝的甲基化状况的定量指标。当需要将样品中序列的甲基化状况与阈值或参考值进行比较时，这特别有用。
如本文所用，“甲基化频率”或“甲基化百分比(％)”是指分子或基因座被甲基化的实例数相对于分子或基因座未甲基化的实例数。
如本文所用，术语“甲基化分数”是表示标志物或标志物组的检测甲基化事件，与来自不患有所关注的特定肿瘤的哺乳动物随机群体(例如，10、20、30、40、50、100或500只哺乳动物的随机群体)的标志物或标志物组的中位数甲基化事件相比较的分数。标志物或标志物组的升高的甲基化分数可以是任何分数，只要该分数大于相应的参考分数即可。例如，标志物或标志物组的升高的甲基化分数可以比参考甲基化分数高0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍。
因此，甲基化状态描述了核酸(例如，基因组序列)的甲基化状态。此外，甲基化状态是指与甲基化相关的特定基因组基因座处的核酸区段的特征。这类特征包括但不限于，该DNA序列中的任何胞嘧啶(C)残基是否被甲基化、甲基化C残基的位置、甲基化C在核酸任何特定区域中的频率或百分比，以及由于例如等位基因来源的差异而导致的甲基化的等位基因差异。术语“甲基化状态”、“甲基化概况”和“甲基化状况”还指生物样品中核酸的任何特定区域中甲基化C或未甲基化C的相对浓度、绝对浓度或模式。例如，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基被甲基化，那么可以将其称为“高甲基化”或“甲基化增加”，而如果DNA序列内的胞嘧啶(C)残基未甲基化，那么可以将其称为“低甲基化”或“甲基化降低”。同样，如果与另一核酸序列(例如，来自不同区域或来自不同个体等)相比，核酸序列内的胞嘧啶(C)残基被甲基化，那么认为该序列与其他核酸序列相比是高甲基化的或甲基化增加。可替代地，如果与另一核酸序列(例如，来自不同区域或来自不同个体等)相比，DNA序列内的胞嘧啶(C)残基未被甲基化，那么认为该序列与其他核酸序列相比是低甲基化的或甲基化降低。此外，如本文所用的术语“甲基化模式”是指核酸区域上甲基化和未甲基化核苷酸的集合位点。当整个区域中甲基化和未甲基化核苷酸的数量相同或相似但甲基化和未甲基化核苷酸的位置不同时，两个核酸可能具有相同或相似的甲基化频率或甲基化百分比但具有不同的甲基化模式。当序列的甲基化程度(例如一个的甲基化相对于另一个增加或减少)、频率或模式时有差异时，称其为“差异甲基化”或具有“甲基化差异”或具有“不同甲基化状态”。术语“差异甲基化”是指与癌症阴性样品中的核酸甲基化水平或模式相比，癌症阳性样品中的核酸甲基化水平或模式的差异。它还可能指手术后癌症复发的患者与未复发的患者之间水平或模式的差异。差异甲基化和DNA甲基化的特定水平或模式是预后和预测性生物标志物，例如，一旦确定了正确的截止或预测特征。
甲基化状态频率可以用于描述个体群体或来自单一个体的样品。例如，甲基化状态频率为50％的核苷酸基因座在50％的情况下被甲基化，在50％的情况下未甲基化。例如，这种频率可以用于描述个体群体或一批核酸中核苷酸基因座或核酸区域被甲基化的程度。因此，当核酸分子的第一个群体或库中的甲基化不同于核酸分子的第二个群体或库中的甲基化时，第一个群体或库的甲基化状态频率将不同于第二个群体或库的甲基化状态频率。例如，这种频率还可以用于描述单一个体中核苷酸基因座或核酸区域被甲基化的程度。例如，这种频率可以用于描述来自组织样品的一组细胞在核苷酸基因座或核酸区域被甲基化或未甲基化的程度。
如本文所用，“核苷酸基因座”是指核苷酸在核酸分子中的位置。甲基化核苷酸的核苷酸基因座是指甲基化核苷酸在核酸分子中的位置。
典型地，人DNA的甲基化发生在包括相邻鸟嘌呤和胞嘧啶的二核苷酸序列上，其中胞嘧啶位于鸟嘌呤的5'(也称为CpG二核苷酸序列)。CpG二核苷酸内的大多数胞嘧啶在人基因组中被甲基化，但是一些在特定的富含CpG二核苷酸的基因组区域(称为CpG岛)中保持未甲基化(参见例如Antequera等人(1990)Cell 62:503–514)。
如本文所用，“CpG岛”是指基因组DNA的富含G:C的区域，其含有相对于总基因组DNA数量增加的CpG二核苷酸。CpG岛的长度可以是至少100个、200个或更多个碱基对，其中该区域的G:C含量为至少50％，并且观测CpG频率与预期频率的比率为0.6；在某些情况下，CpG岛的长度可以为至少500个碱基对，其中该区域的G:C含量为至少55％并且观测CpG频率与预期频率的比率为0.65。可以根据Gardiner-Garden等人(1987)J.Mol.Biol.196:261–281中提供的方法计算相比于预期频率的观测CpG频率。例如，相比于预期频率的观测CpG频率可以根据公式R＝(A×B)/(C×D)计算，其中R是观测CpG频率与预期频率的比值，A是分析序列中的CpG二核苷酸的数量，B是分析序列中的核苷酸总数，C是分析序列中的C核苷酸总数，并且D是分析序列中的G核苷酸总数。典型地在CpG岛中，例如在启动子区域确定甲基化状态。但应了解，人基因组中的其他序列也易于发生DNA甲基化，例如CpA和CpT(参见Ramsahoye(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:5237-5242；Salmon和Kaye(1970)Biochim.Biophys.Acta.204:340-351；Grafstrom(1985)Nucleic Acids Res.13:2827-2842；Nyce(1986)Nucleic Acids Res.14:4353-4367；Woodcock(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.145:888-894)。
如本文所用，“甲基化特异性试剂”是指根据核酸分子的甲基化状态修饰核酸分子的核苷酸的试剂，或甲基化特异性试剂是指能够以反映核酸分子的甲基化状态的方式改变核酸分子的核苷酸序列的化合物或组合物或其他剂。用这种试剂处理核酸分子的方法可以包括使核酸分子与试剂接触，如果需要，再加上额外的步骤，以实现核苷酸序列的所需改变。这类方法可以以将未甲基化的核苷酸(例如，每个未甲基化的胞嘧啶)修饰成不同核苷酸的方式应用。例如，在一些实施方案中，这种试剂可以使未甲基化的胞嘧啶核苷酸脱氨基，产生脱氧尿嘧啶残基。这类试剂的实例包括但不限于甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂。
甲基化特异性试剂对核酸核苷酸序列的改变也可能产生每个甲基化核苷酸均被修饰为不同的核苷酸的核酸分子。
如本文所用，术语“用化学选择性基团修饰的UDP葡萄糖”是指已经被官能化的尿苷二磷酸葡萄糖分子，特别是在6-羟基位置，具有能够通过点击化学与亲和标签反应的官能团。
术语“氧化的5-甲基胞嘧啶”是指在5-位被氧化的氧化的5-甲基胞嘧啶残基。因此氧化的5-甲基胞嘧啶残基包括5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和5-羧甲基胞嘧啶。根据本发明的一个实施方案，与有机硼烷反应的氧化的5-甲基胞嘧啶残基是5-甲酰基胞嘧啶和5-羧甲基胞嘧啶。
术语“甲基化测定法”是指用于确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定法。
术语“MS AP-PCR”(甲基化敏感性随机引物聚合酶链式反应)是指本领域公认的技术，这项技术允许使用富含CG的引物对基因组进行全局扫描，重点关注最有可能含有CpG二核苷酸的区域，并由Gonzalgo等人(1997)Cancer Research 57:594-599描述。
术语“MethyLightTM”是指Eads等人(1999)Cancer Res.59:2302–2306描述的本领域公认的基于荧光的实时PCR技术。
术语“HeavyMethylTM”是指这样一种测定法，其中覆盖扩增引物之间的CpG位置或被扩增引物覆盖的甲基化特异性阻断探针(本文也称为阻断剂)能够实现核酸样品的甲基化特异性选择性扩增。
术语“HeavyMethylTMMethyLightTM”测定法是指HeavyMethylTMMethyLightTM测定法，它是MethyLightTM测定法的变体，其中MethyLightTM测定法与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化特异性阻断探针组合。
术语“Ms-SNuPE”(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸)是指由Gonzalgo和Jones(1997)Nucleic Acids Res.25:2529-2531描述的本领域公认的测定法。
术语“MSP”(甲基化特异性PCR)是指由Herman等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821–9826和由美国专利号5,786,146描述的本领域公认的甲基化测定法。
术语“COBRA”(联合亚硫酸氢盐限制分析)是指由Xiong和Laird(1997)NucleicAcids Res.25:2532–2534描述的本领域公认的甲基化测定法。
术语“MCA”(甲基化CpG岛扩增)是指由Toyota等人(1999)Cancer Res.59:2307–12和WO 00/26401A1中描述的甲基化测定法。
如本文所用，“选定核苷酸”是指核酸分子中四种典型存在的核苷酸中的一种核苷酸(DNA为C、G、T和A，RNA为C、G、U和A)，并且可以包括典型存在的核苷酸的甲基化衍生物(例如，当C是选定核苷酸时，甲基化和未甲基化的C都包括在选定核苷酸的含义内)，而甲基化的选定核苷酸特指甲基化的典型存在的核苷酸并且未甲基化的选定核苷酸特指未甲基化的典型存在的核苷酸。
术语“甲基化特异性限制酶”是指根据核酸识别位点的甲基化状态选择性消化核酸的限制酶。在识别位点未甲基化或半甲基化下特异性切割的限制酶的情况下(甲基化敏感性酶)，如果在一条或两条链上识别位点甲基化，那么切割不会发生。在只有识别位点甲基化时才特异性切割的限制酶的情况下(甲基化依赖性酶)，如果识别位点未甲基化，那么切割不会发生(或会发生，但效率显著降低)。优选的是甲基化特异性限制酶，其识别序列含有CG二核苷酸(例如识别序列如CGCG或CCCGGG)。对于一些实施方案进一步优选的是如果该二核苷酸中的胞嘧啶在碳原子C5处被甲基化则不会切割的限制酶。
如本文所用，“不同核苷酸”是指化学上与选定核苷酸不同的核苷酸，通常使得不同核苷酸具有不同于选定核苷酸的沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base-pairing)特性，其中与选定核苷酸互补的典型存在的核苷酸不同于与不同核苷酸互补的典型存在的核苷酸。例如，当C是选定核苷酸时，U或T可以是不同核苷酸，例如C与G的互补性和U或T与A的互补性。如本文所用，与选定核苷酸互补或与不同核苷酸互补的核苷酸是指在高严格条件下以比互补核苷酸与四种典型存在的核苷酸中的三种进行碱基配对高的亲和力与选定核苷酸或不同核苷酸进行碱基配对的核苷酸。互补性的一个实例是DNA(例如A-T和C-G)和RNA(例如A-U和C-G)中的沃森-克里克碱基配对。因此，例如，在高严格条件下，G与C碱基配对的亲和力高于G与G、A或T碱基配对，因此，当C是选定核苷酸时，G是与选定核苷酸互补的核苷酸。
如本文所用，给定标志物(或一起使用的标志物组)的“敏感性”是指报告DNA甲基化值高于区分赘生物与非赘生物样品的阈值的样品的百分比。在一些实施方案中，阳性定义为报告DNA甲基化值高于阈值(例如，与疾病相关的范围)的组织学确认的瘤形成，并且假阴性定义为报告DNA甲基化值低于阈值(例如，与无疾病相关的范围)的组织学确认的瘤形成。因此，敏感性值反映了从已知患病样品获得的给定标志物的DNA甲基化测量值在疾病相关测量值范围内的概率。如这里所定义，计算出的敏感性值的临床相关性表示对当将给定标志物应用于患有临床疾患的受试者时将检测到该疾患存在的概率的估计。
如本文所用，给定标志物(或一起使用的标志物组)的“特异性”是指报告DNA甲基化值高于区分赘生物与非赘生物样品的阈值的非赘生物样品的百分比。在一些实施方案中，阴性定义为报告DNA甲基化值低于阈值(例如，与无疾病相关的范围)的组织学确认的非赘生物样品，并且假阳性定义为报告DNA甲基化值高于阈值(例如，与疾病相关的范围)的组织学确认的非赘生物样品。因此，特异性值反映了从已知非赘生物样品获得的给定标志物的DNA甲基化测量值在非疾病相关测量值范围内的概率。如这里所定义，计算出的特异性值的临床相关性表示对当将给定标志物应用于未患临床疾患的受试者时将检测到该疾患不存在的概率的估计。
如本文所用，术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。其尤其是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是针对诊断测试的不同可能切点的真阳性率与假阳性率的关系图。它显示了取决于所选切点的敏感性与特异性之间的平衡(敏感性的任何增加都将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是衡量诊断测试准确性的量度(面积越大越好；最佳值为1；随机测试的ROC曲线位于对角线上，面积为0.5；参考：J.P.Egan.(1975)SignalDetection Theory and ROC Analysis,Academic Press,New York)。
如本文所用，术语“赘生物”是指组织的任何新的异常生长。因此，赘生物可以是癌前赘生物或恶性赘生物。
如本文所用，术语“赘生物特异性标志物”是指可用于指示赘生物存在的任何生物材料或要素。生物材料的实例包括但不限于核酸、多肽、碳水化合物、脂肪酸、细胞成分(例如细胞膜和线粒体)和全细胞。在一些情况下，标志物是特定核酸区域(例如，基因、基因内区域、特定基因座等)。作为标志物的核酸区域可称为例如“标志物基因”、“标志物区域”、“标志物序列”、“标志物基因座”等。
如本文所用，术语“腺瘤”是指腺来源的良性肿瘤。虽然这些生长物是良性的，但随着时间的推移，它们可能会发展为恶性的。
术语“癌前”或“肿瘤发生前”及其等同术语是指任何正在发生恶性转化的细胞增殖性疾病。
赘生物、腺瘤、癌症等的“部位”是受试者体内赘生物、腺瘤、癌症等所在的组织、器官、细胞类型、解剖区域、身体部位等。
如本文所用，“诊断”测试应用包括检测或鉴定受试者的疾病状态或疾患，确定受试者感染给定疾病或疾患的可能性，确定患有疾病或疾患的受试者将对疗法作出反应的可能性，确定患有疾病或疾患的受试者的预后(或其可能的进展或消退)，以及确定治疗对患有疾病或疾患的受试者的影响。例如，诊断可用于检测受试者感染赘生物的存在或可能性，或这类受试者将对化合物(例如药品，例如药物)或其他治疗产生有利反应的可能性。
术语“分离的”如在“分离的寡核苷酸”中当与核酸相关使用时是指从至少一种在天然来源中通常相关联的污染核酸中鉴定并分离的核酸序列。分离的核酸以不同于在自然界中发现的形式或设置存在。相比之下，未分离的核酸，如DNA和RNA，在它们存在于自然界中的状态下被发现。未分离的核酸的实例包括：在宿主细胞染色体上与邻近基因相邻的给定DNA序列(例如，基因)；RNA序列，例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列，在细胞中发现其呈与许多其他编码多种蛋白质的mRNA的混合物。然而，编码特定蛋白质的分离的核酸包括例如在通常表达蛋白质的细胞中的这种核酸，其中该核酸在与天然细胞不同的染色体位置中，或者另外由不同于自然界中发现的核酸侧接。分离的核酸或寡核苷酸可以单链或双链形式存在。当分离的核酸或寡核苷酸用于表达蛋白质时，该寡核苷酸将至少包含有义链或编码链(即寡核苷酸可以是单链的)，但可以同时含有有义链和反义链(即，寡核苷酸可以是双链的)。分离的核酸在从其天然或典型环境分离后，可以与其他核酸或分子组合。例如，分离的核酸可以存在于已置于其中以例如用于异源表达的宿主细胞中。
术语“纯化的”是指从其天然环境中移出、分离或分离出的分子，核酸或氨基酸序列。因此，“分离的核酸序列”可以是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子至少60％不含，优选至少75％不含，更优选至少90％不含与它们天然相关的其他组分。如本文所用，术语“纯化的”或“进行纯化”还指从样品中去除污染物。污染性蛋白质的去除引起样品中感兴趣的多肽或核酸的百分比增加。在另一个实例中，重组多肽在植物、细菌、酵母或哺乳动物宿主细胞中表达，并且通过去除宿主细胞蛋白质来纯化多肽；从而增加了样品中重组多肽的百分比。
术语“包含”给定多核苷酸序列或多肽的“组合物”泛指含有给定多核苷酸序列或多肽的任何组合物。该组合物可包含含有盐(例如NaCl)、去污剂(例如SDS)和其他组分(例如登哈特溶液(Denhardt’s solution)、奶粉、鲑鱼精DNA等)的水溶液。
术语“样品”以其最广泛的含义使用。在某种意义上，它可以指动物细胞或组织。在另一种意义上，它是指从任何来源获得的样本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可以从植物或动物(包括人)获得，并且涵盖流体、固体、组织和气体。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、水和工业样品。这些实例不应被解释为限制适用于本发明的样品类型。
如本文所用，在一些情况下使用的“远程样品”涉及从不是样品的细胞、组织或器官来源的部位收集的样品。例如，当在粪便样品中评估来源于胰腺的样品材料时(例如，不是来自直接取自淋巴腺的样品)，样品是远程样品。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指要经受这项技术提供的各种测试的生物体。术语“受试者”包括动物，优选哺乳动物，包括人。在一个优选的实施方案中，受试者是灵长类动物。在一个更优选的实施方案中，受试者是人。进一步关于诊断方法，优选的受试者是脊椎动物受试者。优选的脊椎动物是温血动物；优选的温血脊椎动物是哺乳动物。优选的哺乳动物最优选是人。如本文所用，术语“受试者”包括人和动物受试者。因此，本文提供了兽医治疗用途。因此，本发明的技术提供了对哺乳动物(例如人)以及以下动物的诊断：那些因濒危而重要的哺乳动物(例如东北虎)；具有经济重要性的动物，例如在农场饲养供人食用的动物；和/或对人具有社会重要性的动物，例如作为宠物或在动物园饲养的动物。这种动物的实例包括但不限于：食肉动物，例如猫和狗；猪科动物，包括猪、肉猪和野猪；反刍动物和/或有蹄类动物，如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；鳍足类动物；和马。因此，还提供了家畜的诊断和治疗，包括但不限于家养猪、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)等。当前公开的主题还包括用于诊断受试者的NHL和/或NHL的亚型的系统。例如，所述系统可作为市售试剂盒提供，所述试剂盒可用于筛查已收集生物样品的受试者患NHL和/或NHL的亚型的风险或者诊断其患NHL和/或NHL的亚型。根据本发明的技术提供的示例性系统包括评估本文所述的标志物的甲基化状态。
如本文所用，术语“试剂盒”是指递送材料的任何递送系统。在反应测定法的情况下，这类递送系统包括允许存储反应试剂(例如适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲液、关于进行测定法的书面说明书等)、将其从一个位置运输或递送至另一个位置的系统。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个外壳(例如，盒)。如本文使用，术语“分段试剂盒”是指包括两个或更多个单独容器的递送系统，每个容器含有全部试剂盒组分的子部分。这些容器可共同或单独递送至预定接受者。例如，第一个容器可含有用于测定法中的酶，而第二个容器含有寡核苷酸。术语“分段试剂盒”意图涵盖含有受联邦食品、药品和化妆品法案第520(e)节监管的分析物特定试剂(ASR)的试剂盒，但不限于此。事实上，包含各自含有全部试剂盒组分的子部分的两个或更多个单独容器的任何递送系统均包括在术语“分段试剂盒”中。相比之下，“组合试剂盒”是指在单一容器中(例如，容纳每个所需组分的单一盒中)含有反应测定法的所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括分段试剂盒和组合试剂盒两者。
本文所用，术语“淋巴瘤”是指淋巴系统中B细胞或T细胞的恶性生长。“淋巴瘤”包括多种类型的恶性生长，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。如本文所用，术语“非霍奇金淋巴瘤”或“NHL”是指不是霍奇金淋巴瘤的淋巴系统中B细胞或T细胞的恶性生长(其特征在于，例如，癌变区域中存在里德-斯德伯格(Reed-Sternberg)细胞)。非霍奇金淋巴瘤涵盖超过29种类型的淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)，它们之间的区别基于癌细胞的类型。
如本文所用，术语“信息”是指任何事实或数据的集合。在提及使用计算机系统(包括但不限于互联网)存储或处理的信息时，该术语是指以任何格式(例如，模拟、数字、光学等)存储的任何数据。如本文所用，术语“与受试者相关的信息”是指与受试者(例如，人、植物或动物)有关的事实或数据。术语“基因组信息”是指与基因组有关的信息，包括但不限于核酸序列、基因、甲基化百分比、等位基因频率、RNA表达水平、蛋白质表达、与基因型相关的表型等。“等位基因频率信息”是指与等位基因频率有关的事实或数据，包括但不限于等位基因身份、等位基因的存在与受试者(例如人受试者)的一种特征之间的统计相关性、个体或群体中等位基因的存在或不存在、在具有一种或多种特定特征的个体中存在等位基因的可能性百分比等。
具体实施方式
在各种实施方案的详细描述中，为了解释的目的，阐述了许多具体细节以提供对所公开的实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在有或没有这些具体细节的情况下实践这些各种实施方案。在其他情况下，结构和装置以框图形式展示。此外，本领域技术人员可以容易地理解，其中呈现和执行方法的特定顺序是例示性的，并且预期这些顺序可以变化并且仍然保持在本文公开的各种实施方案的精神和范围内。
本文提供了用于淋巴瘤筛查的技术，尤其是但不限于，用于检测NHL和/或NHL的特定形式(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的存在的方法、组合物和相关用途。如这项技术在本文中所描述，使用的章节标题仅仅是出于组织的目的，而不应视为以任何方式限制主题。
事实上，如实施例I中所述，在鉴定本发明的实施方案的过程中进行的实验鉴定了一组新的285个差异甲基化区域(DMR)，用于区分淋巴腺癌衍生的DNA与非肿瘤对照DNA的癌症。从这285个新的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定了能够区分不同类型的淋巴瘤与正常淋巴腺组织的标志物。例如，鉴定出的不同组的DMR能够区分1)NHL组织与正常淋巴腺组织，2)滤泡性淋巴瘤组织与正常淋巴腺组织，3)DLBCL组织与正常淋巴腺组织，4)套细胞淋巴瘤组织与正常淋巴腺组织，5)边缘区淋巴瘤组织与正常淋巴腺组织，以及6)外周T细胞淋巴瘤组织与正常淋巴腺组织。此外，DMR被鉴定为能够区分来自患有NHL和NHL的亚型的受试者的血浆与来自未患NHL和NHL的亚型的受试者的血浆。
尽管这里的公开内容涉及某些例示的实施方案，但是应当理解，这些实施方案是作为示例而不是作为限制来呈现的。
在具体方面，本发明的技术提供了用于鉴定、确定和/或分类例如NHL的癌症的组合物和方法。所述方法包括确定从受试者分离的生物样品(例如，粪便样品、淋巴腺组织样品、血浆样品)中至少一种甲基化标志物的甲基化状况，其中所述标志物的甲基化状态的变化指示NHL或NHL的亚型的存在、类别或部位。具体实施方案涉及包含差异甲基化区域(DMR，例如，DMR 1-285，参见表1和3)的标志物，所述标志物用于诊断(例如，筛查)NHL和各种类型的NHL(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)。
除了分析包含本文所提供和表1和3中所列出的DMR(例如DMR，例如DMR 1-285)的至少一种标志物、标志物区域或标志物的碱基的甲基化分析的实施方案以外，这项技术还提供了包含含有DMR的至少一种标志物、标志物区域或标志物的碱基的标志物组，用于检测癌症，尤其是淋巴瘤和淋巴瘤的亚型。
这项技术的一些实施方案基于对包含DMR的至少一种标志物、标志物区域或标志物的碱基的CpG甲基化状况的分析。
在一些实施方案中，本发明的技术提供了以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)的用途，所述试剂与一种或多种甲基化测定法组合，用于确定包含DMR(例如DMR 1-285，参见表1和表3)的至少一种标志物内的CpG二核苷酸序列的甲基化状况。基因组CpG二核苷酸可以是甲基化或未甲基化的(可替代地分别称为高甲基化和低甲基化)。然而，本发明的方法适合于分析非均质性的生物样品，例如在偏远样品(例如血液、器官流出物或粪便)的背景内的低浓度的肿瘤细胞或从中获得的生物材料。因此，当分析这类样品内CpG位置的甲基化状况时，可使用定量测定法来确定具体CpG位置的甲基化水平(例如百分比、分数、比率、比例或程度)。
根据本技术，确定包含DMR的标志物中CpG二核苷酸序列的甲基化状态可用于诊断和表征癌症，诸如NHL和/或NHL的特定形式(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)。
在一些实施方案中，这项技术涉及评估包含来自表1和表3的DMR(例如DMR编号1-285)的标志物的组合的甲基化状态。在一些实施方案中，评估超过一种标志物的甲基化状态增加用于鉴定受试者中的癌症(例如，淋巴瘤和淋巴瘤的亚型)的筛查或诊断法的特异性和/或灵敏度。
在某些实施方案中，用于分析核酸中5-甲基胞嘧啶的存在的方法涉及用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂处理DNA。这类试剂的实例包括但不限于甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂。
常用于分析核酸中5-甲基胞嘧啶的存在的方法是基于Frommer等人描述的用于检测DNA中的5-甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐方法(Frommer等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1827-31，明确地以引用方式整体并入本文中以用于所有目的)或其变体。定位5-甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐方法是基于如下观测结果：胞嘧啶与亚硫酸氢盐离子(又名亚硫酸氢盐)反应，而5-甲基胞嘧啶不反应。反应通常根据以下步骤进行：首先，胞嘧啶与亚硫酸氢盐反应，形成磺化胞嘧啶。然后，磺化的反应中间体自发脱氨基，产生磺化尿嘧啶。最终，磺化尿嘧啶在碱性条件下脱磺酸，形成尿嘧啶。检测是可能的原因在于尿嘧啶碱基与腺嘌呤配对(因此，行为如胸腺嘧啶一样)，而5-甲基胞嘧啶碱基与鸟嘌呤配对(因此，行为如胞嘧啶一样)。这使得通过例如以下区分甲基化胞嘧啶与未甲基化胞嘧啶成为可能：亚硫酸氢盐基因组测序(Grigg G和Clark S,Bioessays(1994)16:431-36；Grigg G,DNA Seq.(1996)6:189-98)、如例如美国专利号5,786,146中公开的甲基化特异性PCR(MSP)或使用包括序列特异性探针裂解的测定法，例如QuARTS瓣状核酸内切酶测定(参见例如Zou等人(2010)“Sensitivequantification of methylated markers with a novel methylation specifictechnology”Clin Chem 56:A199；以及美国专利号8,361,720；8,715,937；8,916,344；和9,212,392)。
一些常规技术涉及如下方法，所述方法包括将待分析的DNA封装在琼脂糖基质中，从而防止DNA的扩散和复性(亚硫酸氢盐仅与单链DNA反应)，并用快速透析代替沉淀和纯化步骤(Olek A等人,(1996)“A modified and improved method for bisulfite basedcytosine methylation analysis”Nucleic Acids Res.24:5064-6)。因此可以分析单个细胞的甲基化状况，这说明了该方法的实用性和敏感性。Rein,T.等人,(1998)Nucleic AcidsRes.26:2255概述了检测5-甲基胞嘧啶的常规方法。
亚硫酸氢盐技术典型地包括在亚硫酸氢盐处理后扩增已知核酸的短的特定片段，然后通过测序(Olek和Walter(1997)Nat.Genet.17:275-6)或引物延伸反应(Gonzalgo和Jones(1997)Nucleic Acids Res.25:2529-31；WO 95/00669；美国专利号6,251,594)测定产物以分析单个胞嘧啶位置。一些方法使用酶消化(Xiong和Laird(1997)Nucleic AcidsRes.25:2532-4)。本领域也描述了通过杂交进行的检测(Olek等人,WO 99/28498)。此外，已经描述了使用亚硫酸氢盐技术检测单个基因的甲基化(Grigg和Clark(1994)Bioessays16:431-6；Zeschnigk等人(1997)Hum Mol Genet.6:387-95；Feil等人(1994)NucleicAcids Res.22:695；Martin等人(1995)Gene 157:261-4；WO 9746705；WO 9515373)。
根据本发明的技术，各种甲基化测定程序可以与亚硫酸氢盐处理结合使用。这些测定法允许确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸(例如CpG岛)的甲基化状态。这类测定法除其他技术外还涉及经亚硫酸氢盐处理的核酸的测序、PCR(用于序列特异性扩增)、DNA印迹分析(Southern blot analysis)和甲基化特异性限制酶如甲基化敏感性或甲基化依赖性酶的使用。
例如，通过使用亚硫酸氢盐处理，已简化基因组测序供分析甲基化模式和5-甲基胞嘧啶分布(Frommer等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827-1831)。此外，对从经亚硫酸氢盐转化的DNA扩增的PCR产物的限制酶消化可用于评估甲基化状态，例如，如Sadri和Hornsby(1997)Nucl.Acids Res.24:5058-5059所述或如在称为COBRA(联合亚硫酸氢盐限制分析)的方法中所体现(Xiong和Laird(1997)Nucleic Acids Res.25:2532-2534)。
COBRATM分析是一种定量甲基化测定法，可用于确定少量基因组DNA中特定基因座的DNA甲基化水平(Xiong和Laird,Nucleic Acids Res.25:2532-2534,1997)。简单地说，限制酶消化用于揭示经亚硫酸氢钠处理的DNA的PCR产物的甲基化依赖性序列差异。根据Frommer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1827-1831,1992)描述的程序，首先通过标准亚硫酸氢盐处理将甲基化依赖性序列差异引入基因组DNA。然后使用对感兴趣的CpG岛具有特异性的引物对经亚硫酸氢盐转化的DNA进行PCR扩增，接着进行限制性内切酶消化、凝胶电泳，并使用特定的标记的杂交探针进行检测。原始DNA样品中的甲基化水平由在广泛的DNA甲基化水平范围内呈线性定量方式的消化和未消化的PCR产物的相对量表示。此外，这项技术可以可靠地应用于从显微解剖的石蜡包埋组织样品中获得的DNA。
用于COBRATM分析的典型试剂(例如，可在典型的基于COBRATM的试剂盒中找到)可能包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、DMR、基因区域、标志物区域、经亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；限制酶和适当的缓冲液；基因杂交寡核苷酸；对照杂交寡核苷酸；寡核苷酸探针的激酶标记试剂盒；和标记的核苷酸。此外，亚硫酸氢盐转化试剂可能包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(如沉淀、超滤、亲和柱)；脱磺酸缓冲液；和DNA回收组分。如“MethyLightTM”(一种基于荧光的实时PCR技术)(Eads等人,Cancer Res.59:2302-2306,1999)、Ms-SNuPETM(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸)反应(Gonzalgo和Jones,Nucleic Acids Res.25:2529-2531,1997)、甲基化特异性PCR(“MSP”；Herman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826,1996；美国专利号5,786,146)和甲基化CpG岛扩增(“MCA”；Toyota等人,Cancer Res.59:2307-12,1999)等测定法单独使用或与这些方法中的一种或多种组合使用。
“HeavyMethylTM”测定技术是一种基于经亚硫酸氢盐处理的DNA的甲基化特异性扩增来评估甲基化差异的定量方法。覆盖扩增引物之间的CpG位置或被扩增引物覆盖的甲基化特异性阻断探针(本文也称为阻断剂)能够实现核酸样品的甲基化特异性选择性扩增。
术语“HeavyMethylTMMethyLightTM”测定法是指HeavyMethylTMMethyLightTM测定法，它是MethyLightTM测定法的变体，其中MethyLightTM测定法与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化特异性阻断探针组合。HeavyMethylTM测定法也可以与甲基化特异性扩增引物结合使用。
用于HeavyMethylTM分析的典型试剂(例如，可在典型的基于MethyLightTM的试剂盒中找到)可以包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛或经亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛等)的PCR引物；阻断寡核苷酸；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。MSP(甲基化特异性PCR)允许评估CpG岛内几乎任一组CpG位点的甲基化状况，而无需使用甲基化敏感性限制酶(Herman等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826,1996；美国专利号5,786,146)。简单地说，亚硫酸氢钠对DNA进行修饰，将未甲基化而非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，随后使用对甲基化与未甲基化DNA具有特异性的引物扩增产物。MSP只需要少量的DNA，对给定CpG岛基因座的0.1％甲基化等位基因敏感，并且可以对从石蜡包埋样品中提取的DNA进行分析。用于MSP分析的典型试剂(例如，可在典型的基于MSP的试剂盒中找到)可以包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的甲基化和未甲基化PCR引物；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及特定的探针。
MethyLightTM测定法是一种高通量的定量甲基化测定法，它利用基于荧光的实时PCR(例如)，在PCR步骤后无需进一步操作(Eads等人,Cancer Res.59:2302-2306,1999)。简单地说，MethyLightTM过程从基因组DNA的混合样品开始，该样品在亚硫酸氢钠反应中根据标准程序转化为甲基化依赖性序列差异的混合库(亚硫酸氢盐过程将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶)。然后在“偏向”反应中例如使用与已知的CpG二核苷酸重叠的PCR引物进行基于荧光的PCR。序列区分发生在扩增过程的水平和荧光检测过程的水平下。
MethyLightTM测定法用作核酸，例如基因组DNA样品中甲基化模式的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平下。在定量型式中，PCR反应在存在与特定假定甲基化位点重叠的荧光探针的情况下提供甲基化特异性扩增。引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸的反应提供了对所述量的输入DNA的无偏向控制。可替代地，通过使用不覆盖已知的甲基化位点的对照寡核苷酸(例如，HeavyMethylTM和MSP技术的基于荧光的型式)或使用覆盖潜在甲基化位点的寡核苷酸探测偏向的PCR池，实现基因组甲基化的定性测试。
MethyLightTM过程与任何合适的探针(例如探针、探针等)一起使用。例如，在一些应用中，双链基因组DNA用亚硫酸氢钠处理并使用探针，例如使用MSP引物和/或HeavyMethyl阻断剂寡核苷酸和探针进行两组PCR反应中的一组。探针使用荧光“报告基因”和“猝灭剂”分子进行双重标记，并且设计成对相对较高GC含量的区域具有特异性，以便它在PCR循环中比正向或反向引物高约10℃的温度下熔化。这允许探针在PCR退火/延伸步骤期间保持完全杂交。当Taq聚合酶在PCR过程中酶促合成一条新链时，它最终将到达退火的探针。然后，Taq聚合酶5'至3'核酸内切酶活性将置换探针，它是通过消化探针以释放荧光报告分子，从而使用实时荧光检测系统对其现在未淬灭的信号进行定量检测。
用于MethyLightTM分析的典型试剂(例如，可在典型的基于MethyLightTM的试剂盒中找到)可以包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；或探针；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。
QMTM(定量甲基化)测定法是基因组DNA样品中甲基化模式的替代定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平下。在这种定量型式中，PCR反应在存在与特定假定甲基化位点重叠的荧光探针的情况下提供无偏向的扩增。引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸的反应提供了对所述量的输入DNA的无偏向控制。可替代地，通过使用不覆盖已知的甲基化位点的对照寡核苷酸(HeavyMethylTM和MSP技术的基于荧光的型式)或使用覆盖潜在甲基化位点的寡核苷酸探测偏向的PCR池，实现基因组甲基化的定性测试。
在扩增过程中，QMTM过程可以与任何合适的探针，例如探针、探针一起使用。例如，双链基因组DNA用亚硫酸氢钠处理，并经受无偏向引物和探针。探针使用荧光“报告基因”和“猝灭剂”分子进行双重标记，并且设计成对相对较高GC含量的区域具有特异性，以便它在PCR循环中比正向或反向引物高约10℃的温度下熔融。这允许探针在PCR退火/延伸步骤期间保持完全杂交。当Taq聚合酶在PCR过程中酶促合成一条新链时，它最终将到达退火的探针。然后，Taq聚合酶5'至3'核酸内切酶活性将置换探针，它是通过消化探针以释放荧光报告分子，从而使用实时荧光检测系统对其现在未淬灭的信号进行定量检测。用于QMTM分析的典型试剂(例如，可在典型的基于QMTM的试剂盒中找到)可以包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；或探针；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。
Ms-SNuPETM技术是一种用于评估特定CpG位点的甲基化差异的定量方法，该方法基于DNA的亚硫酸氢盐处理，然后是单核苷酸引物延伸(Gonzalgo和Jones,Nucleic AcidsRes.25:2529-2531,1997)。简单地说，基因组DNA与亚硫酸氢钠反应，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，同时保持5-甲基胞嘧啶不变。然后使用对经亚硫酸氢盐转化的DNA具有特异性的PCR引物进行所需靶序列的扩增，并且分离所得产物并用作感兴趣CpG位点的甲基化分析的模板。可以分析少量的DNA(例如，显微解剖病理切片)，并且避免使用限制酶来确定CpG位点的甲基化状况。
用于Ms-SNuPETM分析的典型试剂(例如，可在典型的基于Ms-SNuPETM的试剂盒中找到)可能包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；凝胶提取试剂盒；阳性对照引物；针对特定基因座的Ms-SNuPETM引物；反应缓冲液(针对Ms-SNuPE反应)；和标记的核苷酸。此外，亚硫酸氢盐转化试剂可能包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(如沉淀、超滤、亲和柱)；脱磺酸缓冲液；和DNA回收组分。
简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)从对核酸进行亚硫酸氢盐处理以将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶开始，然后进行限制酶消化(例如，通过识别包括CG序列的位点的酶，如MspI)以及在与接头配体偶联后对片段进行完整测序。对限制酶的选择富集CpG密集区域的片段，从而减少在分析过程中可能映射至多个基因位置的冗余序列的数目。因此，RRBS通过选择限制性片段的子集(例如，通过使用制备型凝胶电泳的大小选择)用于测序来降低核酸样品的复杂性。与全基因组亚硫酸氢盐测序相反，限制酶消化产生的每个片段都含有至少一个CpG二核苷酸的DNA甲基化信息。因此，RRBS富集样品中在区域内具有高频率的限制酶切割位点的启动子、CpG岛和其他基因组特征，从而提供了一种评估一个或多个基因组基因座的甲基化状态的测定法。
RRBS的典型方案包括使用限制酶(如MspI)消化核酸样品、填充悬垂和A尾、连接接头、亚硫酸氢盐转化和PCR的步骤。参见例如等人(2005)“Genome-scale DNA methylationmapping of clinical samples at single-nucleotide resolution”Nat Methods 7:133-6；Meissner等人(2005)“Reduced representation bisulfite sequencing forcomparative high-resolution DNA methylation analysis”Nucleic Acids Res.33:5868–77。
在一些实施方案中，使用定量等位基因特异性实时靶标和信号放大(QuARTS)测定法来评估甲基化状态。在每个QuARTS测定法中依次发生三个反应，包括初级反应中的扩增(反应1)和靶探针裂解(反应2)；以及次级反应中的FRET裂解和荧光信号生成(反应3)。当使用特定引物扩增目标核酸时，带有瓣序列的特定检测探针与扩增子松散地结合。靶结合位点处特定侵入性寡核苷酸的存在引起5'核酸酶，例如FEN-1核酸内切酶，通过在检测探针和瓣序列之间切割来释放瓣序列。瓣序列与相应FRET盒的非发夹部分互补。因此，瓣序列充当FRET盒上的侵入性寡核苷酸，并在FRET盒荧光团与猝灭剂之间实现裂解，产生荧光信号。裂解反应可以每个靶标切割多个探针，从而每个瓣释放多个荧光团，提供指数式信号放大。QuARTS可以通过使用具有不同染料的FRET盒来检测单个反应孔中的多个靶标。参见例如Zou等人(2010)“Sensitive quantification of methylated markers with a novelmethylation specific technology”Clin Chem 56:A199)，以及美国专利号8,361,720、8,715,937、8,916,344和9,212,392，它们中的每一者都以引用方式并入本文中，以用于所有目的。
术语“亚硫酸氢盐试剂”是指包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，如本文所公开，其用于区分甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸序列。所述处理方法是本领域已知的(例如PCT/EP2004/011715和WO 2013/116375，它们中的每一者都以引用方式整体并入)。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐处理在变性溶剂例如但不限于正烷撑二醇(n-alkyleneglycol)或二乙二醇二甲醚(DME)的存在下，或在二噁烷或二噁烷衍生物的存在下进行。在一些实施方案中，变性溶剂以介于1％与35％(v/v)之间的浓度使用。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，所述清除剂例如但不限于色烷衍生物，例如6-羟基-2,5,7,8,-四甲基色烷2-甲酸或三羟基苯甲酸和其衍生物，例如没食子酸(参见：PCT/EP2004/011715，以引用方式整体并入)。在某些优选的实施方案中，亚硫酸氢盐反应包括用亚硫酸氢铵处理，例如，如WO 2013/116375中所述。
在一些实施方案中，使用根据本发明的引物寡核苷酸组(例如，参见表5)和扩增酶来扩增经处理的DNA的片段。几个DNA区段的扩增可以在同一个反应容器中同时进行。通常，使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。扩增子的长度通常为100至2000个碱基对。
在所述方法的另一个实施方案中，可以通过使用甲基化特异性引物寡核苷酸来检测在包含DMR(例如DMR 1-285，表1和表3)的标志物内或附近的CpG位置的甲基化状况。这种技术(MSP)已在授予Herman的美国专利号6,265,171中描述。使用甲基化状况特异性引物扩增经亚硫酸氢盐处理的DNA可以区分甲基化与未甲基化的核酸。MSP引物对含有至少一种与经亚硫酸氢盐处理的CpG二核苷酸杂交的引物。因此，所述引物的序列包含至少一个CpG二核苷酸。对未甲基化的DNA具有特异性的MSP引物在CpG的C位置处含有“T”。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于将无细胞DNA中氧化的5-甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基的方法(参见，Liu等人,2019,Nat Biotechnol.37,第424-429页；美国专利申请公开号202000370114)。所述方法涉及选自5-甲酰基胞嘧啶(5fC)、5-羧甲基胞嘧啶(5caC)及其组合的氧化的5mC残基与有机硼烷的反应。氧化的5mC残基可以是天然存在的，或者更典型地，是5mC或5hmC残基先前氧化的结果，例如，用TET家族酶(例如，TET1、TET2或TET3)对5mC或5hmC的氧化，或者，例如，用高钌酸钾(KRuO4)或无机过氧化合物或组合物(诸如过氧化钨酸盐(参见，例如，Okamoto等人(2011)Chem.Commun.47:11231-33)和高氯酸铜(II)/2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)组合(参见Matsushita等人(2017)Chem.Commun.53:5756-59))进行的5mC或5hmC的化学氧化。
有机硼烷的特征可以是硼烷和选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。氮杂环可以是单环的、双环的或多环的，但通常是单环的，呈5或6元环的形式，其包含氮杂原子和任选地一个或多个选自N、O和S的另外的杂原子。氮杂环可以是芳族的或脂环族的。本文优选的氮杂环包括2-吡咯啉、2H-吡咯、1H-吡咯、吡唑啉、咪唑啉、2-吡唑啉、2-咪唑啉、吡唑、咪唑、1,2,4-三唑、1,2,4-三唑、哒嗪、嘧啶、吡嗪、1,2,4-三嗪和1,3,5-三嗪，它们中的任一者可以是未取代的或被一个或多个非氢取代基取代的。典型的非氢取代基是烷基基团，特别是低级烷基基团，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。示例性化合物包括吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷(也称为2-甲基吡啶硼烷)和5-乙基-2-吡啶。
有机硼烷与无细胞DNA中氧化的5mC残基反应具有无毒试剂和温和反应条件的优点；不需要任何亚硫酸氢盐，也不需要任何其他潜在的DNA降解试剂。此外，在“单锅”或“单管”反应中，无需分离任何中间体即可使用有机硼烷将氧化的5mC残基转化为二氢尿嘧啶。这是非常重要的，因为转化涉及多个步骤，即(1)在氧化的5mC中还原连接C-4和C-5的烯烃键，(2)脱氨基，和(3)脱羧基(如果氧化的5mC是5caC)或去甲酰化(如果氧化的5mC是5fC)。
除了将无细胞DNA中氧化的5-甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基的方法外，本发明还提供与上述方法相关的反应混合物。反应混合物包含含有至少一种选自5caC、5fC及其组合的氧化的5-甲基胞嘧啶残基的无细胞DNA样品，以及使至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基有效还原、脱氨基、脱羧基或去甲酰化的有机硼烷。如上所述，有机硼烷是硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。在一个优选的实施方案中，反应混合物基本上不含亚硫酸氢盐，意思是基本上不含亚硫酸氢根离子和亚硫酸氢盐。理想情况下，反应混合物不含亚硫酸氢盐。
在本发明的相关方面，提供了用于将无细胞DNA中的5mC残基转化为二氢尿嘧啶残基的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于阻断5hmC残基的试剂、用于除羟甲基化之外的氧化5mC残基以提供氧化的5mC残基的试剂以及可使氧化的5mC残基有效还原、脱氨基、脱羧基或去甲酰化的有机硼烷。所述试剂盒还可以包括使用这些组分来进行上述方法的说明。
在另一个实施方案中，提供了一种利用上述氧化反应的方法。所述方法能够检测无细胞DNA中5-甲基胞嘧啶残基的存在和位置，包括以下步骤：
(a)修饰片段化的、接头连接的无细胞DNA中的5hmC残基以在其上提供亲和标签，其中亲和标签能够从无细胞DNA中除去含修饰的5hmC的DNA；
(b)从无细胞DNA中除去含修饰的5hmC的DNA，留下含有未修饰的5mC残基的DNA；
(c)氧化未修饰的5mC残基，得到含有选自5caC、5fC及其组合的氧化5mC残基的DNA；
(d)使含有氧化的5mC残基的DNA与有机硼烷接触，以使氧化的5mC残基有效还原、脱氨基、脱羧基或去甲酰化，从而提供含有二氢尿嘧啶残基而不是氧化的5mC残基的DNA；
(e)对含有二氢尿嘧啶残基的DNA进行扩增和测序；
(f)从(e)中的测序结果确定5-甲基化模式。
无细胞DNA从受试者的身体样品中提取，其中身体样品通常是全血、血浆或血清，最典型的是血浆，但是样品也可以是尿液、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便或眼泪。在一些实施方案中，无细胞DNA来源于肿瘤。在其他实施方案中，无细胞DNA来自患有疾病或其他致病性病症的患者。无细胞DNA可以来源于或可以不来源于肿瘤。在步骤(a)中，需要注意的是，待修饰5hmC残基的无细胞DNA是纯化的、片段化形式、与接头连接的。本文中的DNA纯化可以使用本领域的普通技术人员已知和/或相关文献中描述的任何合适的方法进行，并且虽然无细胞DNA本身可以高度片段化，但是有时可以需要进一步片段化，如美国专利公开号2017/0253924中所述。无细胞DNA片段的大小通常在约20个核苷酸至约500个核苷酸的范围内，更通常在约20个核苷酸至约250个核苷酸的范围内。在步骤(a)中修饰的纯化的无细胞DNA片段已使用常规方法(例如，限制性酶)进行了末端修复，使得片段在每个3'和5'末端具有平末端。在一个优选的方法中，如WO2017/176630中所述，还使用聚合酶诸如Taq聚合酶为平末端片段提供包含单个腺嘌呤残基的3'突出端。这有助于随后连接选定的通用接头，即连接到无细胞DNA片段两端并含有至少一个分子条形码的接头，诸如Y接头或发夹接头。接头的使用还可以选择性地PCR富集接头连接的DNA片段。
然后，在步骤(a)中，“纯化的、片段化的无细胞DNA”包含接头连接的DNA片段。如步骤(a)中所述，用亲和标签修饰这些无细胞DNA片段中的5hmC残基，以便随后能够从无细胞DNA中除去含修饰的5hmC的DNA。在一个实施方案中，亲和标签包含生物素部分，诸如生物素、脱硫生物素、氧合生物素、2-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等。使用生物素部分作为亲和标签允许使用链霉亲和素(例如，链霉亲和素珠粒、磁性链霉亲和素珠粒等)轻松除去。
用生物素部分或其他亲和标签标记5hmC残基是通过将化学选择性基团共价连接到DNA片段中的5hmC残基来完成的，其中化学选择性基团能够与官能化的亲和标签发生反应，从而将亲和标签连接到5hmC残基。在一个实施方案中，化学选择性基团是UDP葡萄糖-6-叠氮化物，它与炔烃官能化的生物素部分发生自发的1,3-环加成反应，如Robertson等人(2011)Biochem.Biophys.Res.Comm.411(1):40-3、美国专利号8,741,567和WO 2017/176630中所述。因此，添加炔烃官能化的生物素部分导致生物素部分与每个5hmC残基共价连接。
在一个实施方案中，然后可以在步骤(b)中使用链霉亲和素(形式为链霉亲和素珠粒、磁性链霉亲和素珠粒等)拉下亲和标记的DNA片段，如果需要的话，将其置于一边用于以后的分析。除去亲和标记片段后剩余的上清液含有未修饰的5mC残基和无5hmC残基的DNA。
在步骤(c)中，使用任何合适的方法将未修饰的5mC残基氧化，以提供5caC残基和/或5fC残基。选择氧化剂以氧化除羟甲基化之外的5mC残基，即提供5caC和/或5fC残基。可以使用具有催化活性的TET家族酶以酶促方式进行氧化。如本文所用的那些术语，“TET家族酶”或“TET酶”是指如美国专利号9,115,386中定义的具有催化活性的“TET家族蛋白”或“TET催化活性片段”，该专利的公开内容以引用的方式并入本文。在本文中优选的TET酶是TET2；参见Ito等人(2011)Science 333(6047):1300-1303。氧化也可以通过化学方式进行，如前一节所述，使用化学氧化剂。合适的氧化剂的实例包括但不限于：无机或有机过钌酸盐形式的过钌酸根阴离子，包括金属过钌酸盐诸如过钌酸钾(KRuO4)、四烷基高钌酸铵诸如四丙基高钌酸铵(TPAP)和四丁基高钌酸铵(TBAP)，以及聚合物负载的过钌酸盐(PSP)；以及无机过氧化合物和组合物(诸如过氧化钨酸盐或高氯酸铜(II)/TEMPO组合)。此时无需将含5fC的片段与含5caC的片段分开，因为在该过程的下一步中，步骤(e)将5fC残基和5caC残基都转化为二氢尿嘧啶(DHU)。
在一些实施方案中，5-羟甲基胞嘧啶残基被β-葡糖基转移酶(β3GT)封端，而5-甲基胞嘧啶残基被TET酶氧化以有效提供5-甲酰基胞嘧啶和5-羧甲基胞嘧啶的混合物。含有这两种氧化物质的混合物可以与2-甲基吡啶硼烷或另一种有机硼烷反应，得到二氢尿嘧啶。在该实施方案的变体中，在步骤(b)中不除去含5hmC的片段。相反，“TET辅助的甲基吡啶硼烷测序(TAPS)”、含5mC的片段和含5hmC的片段一起被酶促氧化以提供含5fC和5caC的片段。与2-甲基吡啶硼烷反应会在最初存在5mC和5hmC残基的地方产生DHU残基。“化学辅助甲基吡啶硼烷测序(CAPS)”涉及用高钌酸钾选择性氧化含5hmC的片段，使5mC残基保持不变。
本实施方案的方法有很多优点：不需要亚硫酸氢盐，使用无毒的试剂和反应物；并且该过程在温和的条件下进行。此外，整个过程可以在单管中进行，无需分离任何中间体。
在一个相关的实施方案中，上述方法包括进一步的步骤：(g)鉴定在步骤(b)中从无细胞DNA中除去的含5hmC的DNA的羟甲基化模式。这可以使用WO2017/176630中详细描述的技术进行。该过程可以在单管法中不除去或分离中间体的情况下进行。例如，最初，无细胞DNA片段，优选地接头连接的DNA片段，用βGT催化的尿苷二磷酸葡萄糖6-叠氮化物进行官能化，然后通过化学选择性叠氮基团进行生物素酰化。该过程会在每个5hmC位点产生共价连接的生物素。在下一步中，生物素酰化的链和含有未修饰(天然)5mC的链被同时拉下以进行进一步处理。如本领域已知，使用抗5mC抗体或甲基-CpG-结合的结构域(MBD)蛋白拉下天然含5mC的链。然后，在阻断5hmC残基的情况下，使用任何合适的技术选择性氧化未修饰的5mC残基，以将5mC转化为5fC和/或5caC，如本文别处所述。
通过扩增获得的片段可以带有直接或间接的可检测标记。在一些实施方案中，标记是荧光标记、放射性核素或具有可在质谱仪中检测到的典型质量的可分离分子片段。在所述标记是质量标记的情况下，一些实施方案规定标记的扩增子具有单个正或负净电荷，从而允许在质谱仪中具有更好的可检测性。可以通过例如基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI)或使用电喷雾质谱法(ESI)来进行检测和可视化。
适用于这些测定技术的DNA分离方法是本领域已知的。具体地说，一些实施方案包括分离核酸，如以引用方式整体并入本文中的美国专利申请序列号13/470,251(“Isolation of Nucleic Acids”)中所述。
在一些实施方案中，本文所述的标志物可用于对粪便样品进行的QUARTS测定法。在一些实施方案中，提供了产生DNA样品的方法，特别是产生如下DNA样品的方法，所述DNA样品包含小体积(例如，小于100微升、小于60微升)的高度纯化的低丰度核酸并且基本上和/或实际上不含抑制用于测试DNA样品的测定法(例如，PCR、INVADER、QuARTS测定法等)的物质。这类DNA样品可在定性检测在取自患者的样品中存在的基因、基因变体(例如等位基因)或基因修饰(例如甲基化)的存在或定量测量其活性、表达或数量的诊断测定法中使用。例如，一些癌症与特定突变等位基因或特定甲基化状态的存在相关，因此检测和/或定量这类突变等位基因或甲基化状态在癌症的诊断和治疗中具有预测价值。
许多有价值的遗传标志物以极低的量存在于样品中，并且产生这类标志物的许多事件非常罕见。因此，即使是灵敏的检测方法(例如PCR)也需要大量DNA来提供足够的低丰度靶标，以满足或代替测定法的检测阈值。此外，即使是少量抑制物质的存在也会损害这些旨在检测如此少量靶标的测定法的准确性和精确度。因此，本文提供了对体积和浓度提供必要管理以产生这类DNA样品的方法。
在一些实施方案中，样品包括组织(例如，淋巴腺组织)、血液、血清、血浆或唾液。在一些实施方案中，受试者是人。这类样品可以通过本领域已知的，例如熟练技术人员显而易见的多种方法获得。可以通过使样品经受本领域技术人员已知的各种技术，包括但不限于离心和过滤来获得无细胞或基本上无细胞的样品。尽管通常优选不使用侵入性技术来获得样品，但获得样品例如组织匀浆、组织切片和活检标本仍可能是优选的。这项技术不限于用于制备样品和提供用于测试的核酸的方法。例如，在一些实施方案中，使用直接基因捕获，例如，如美国专利号8,808,990和9,169,511以及WO 2012/155072中所详述，或通过相关方法，从粪便样品或血液或血浆样品中分离DNA。
对标志物的分析可以单独或与一个测试样品中的另外的标志物同时进行。例如，可以将几个标志物组合到一个测试中以有效处理多个样品并潜在地提供更高的诊断和/或预后准确性。此外，本领域技术人员会认识到测试来自同一受试者的多个样品(例如，在连续时间点)的价值。这类系列样品测试可以鉴定标志物甲基化状态随时间的变化。甲基化状态的变化以及甲基化状态没有变化可以提供有关疾病状态的有用信息，包括但不限于鉴定事件发生的大致时间、可挽救组织的存在和数量、药物疗法的适当性、各种疗法的有效性以及对受试者结果的鉴定，包括未来事件的风险。对生物标志物的分析可以呈多种物理格式进行。例如，可以使用微量滴定板或自动化来促进大量测试样品的处理。可替代地，可以开发单一样品格式以促进以及时方式进行即刻治疗和诊断，例如在非卧床运输或急诊室环境中。
预期以试剂盒的形式提供这项技术的实施方案。试剂盒包含本文所述的组合物、装置、设备等的实施方案，以及试剂盒的使用说明书。这类说明书描述了用于从样品制备分析物，例如用于收集样品和从样品制备核酸的合适方法。试剂盒的各个组分被包装在合适的容器和包装(例如，小瓶、盒子、泡罩包装、安瓿、广口瓶、瓶子、管等)中并且这些组分被一起包装在合适的容器(例如，一个盒子或多个盒子)中以方便试剂盒的用户存储、运输和/或使用。应当理解，液体组分(例如，缓冲液)可以呈冻干形式提供以供用户复原。试剂盒可以包括用于评估、验证和/或确保试剂盒性能的对照或参考。例如，用于测定样品中存在的核酸量的试剂盒可以包括对照，其包含已知浓度的用于比较的相同或另一种核酸，并且在一些实施方案中，对对照核酸具有特异性的检测试剂(例如引物)。试剂盒适用于临床环境，并且在一些实施方案中，适用于用户家中。在一些实施方案中，试剂盒的组件提供用于从样品制备核酸溶液的系统的功能。在一些实施方案中，系统的某些组件由用户提供。
利用例如如通过与预测特异性和敏感性有关的统计技术鉴定的标志物的多种组合预测多种癌症。这项技术提供了鉴定一些癌症的预测组合和验证预测组合的方法。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与至少一种试剂或一系列试剂接触，所述试剂区分至少一个包含DMR(例如，DMR 1-285，例如，如表1和3中所提供)的标志物内的甲基化的和未甲基化的CpG二核苷酸，以及
2)检测NHL或NHL亚型(例如以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503，以及
2)检测NHL(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B，以及
2)检测NHL(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C，以及
2)检测NHL(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B，以及
2)检测NHL(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6，以及
2)检测滤泡性淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C，以及
2)检测滤泡性淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503，以及
2)检测滤泡性淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C，以及
2)检测滤泡性淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1，以及
2)检测滤泡性淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503，以及
2)检测DLBCL(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503，以及
2)检测DLBCL(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503，以及
2)检测DLBCL(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503，以及
2)检测DLBCL(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1，以及
2)检测DLBCL(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C，以及
2)检测套细胞淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1，以及
2)检测套细胞淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503，以及
2)检测套细胞淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C，以及
2)检测套细胞淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5，以及
2)检测边缘区淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5，以及
2)检测边缘区淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1，以及
2)检测边缘区淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266，以及
2)检测边缘区淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1，以及
2)检测边缘区淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1，以及
2)检测外周T细胞淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5，以及
2)检测外周T细胞淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：GABRG3、ITGA5和JUP，以及
2)检测外周T细胞淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1，以及
2)检测外周T细胞淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)使从受试者获得的核酸(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)与区分至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1，以及
2)检测外周T细胞淋巴瘤(例如以大于或等于80％的敏感性和大于或等于80％的特异性提供)。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用以下试剂处理生物样品中的基因组DNA来测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的甲基化水平，所述试剂以甲基化特异性方式修饰DNA(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)，其中一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503；
(ii)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(iv)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经处理的基因组DNA；以及
3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离和靶标捕获来确定所述一个或多个基因的甲基化水平。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用以下试剂处理生物样品中的基因组DNA来测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的甲基化水平，所述试剂以甲基化特异性方式修饰DNA(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)，其中一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(v)HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经处理的基因组DNA；以及
3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离和靶标捕获来确定所述一个或多个基因的甲基化水平。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用以下试剂处理生物样品中的基因组DNA来测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的甲基化水平，所述试剂以甲基化特异性方式修饰DNA(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)，其中一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；以及
(v)MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经处理的基因组DNA；以及
3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离和靶标捕获来确定所述一个或多个基因的甲基化水平。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用以下试剂处理生物样品中的基因组DNA来测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的甲基化水平，所述试剂以甲基化特异性方式修饰DNA(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)，其中一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C；
(ii)BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503；以及
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经处理的基因组DNA；以及
3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离和靶标捕获来确定所述一个或多个基因的甲基化水平。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用以下试剂处理生物样品中的基因组DNA来测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的甲基化水平，所述试剂以甲基化特异性方式修饰DNA(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)，其中一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经处理的基因组DNA；以及
3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离和靶标捕获来确定所述一个或多个基因的甲基化水平。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用以下试剂处理生物样品中的基因组DNA来测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的甲基化水平，所述试剂以甲基化特异性方式修饰DNA(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)，其中一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1；
(ii)GABRG3、ITGA5和JUP；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1；
(iv)BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经处理的基因组DNA；以及
3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离和靶标捕获来确定所述一个或多个基因的甲基化水平。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)测量来自生物样品的DNA中至少一个甲基化的标志物基因(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)的量，其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503；
(ii)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(iv)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B；
2)测量DNA中的至少一种参考标志物的量；以及
3)将在DNA中测量的至少一种甲基化标志物基因的量的值计算为在DNA中测量的参考标志物基因的量的百分比，其中该值指示在样品中测量的至少一种甲基化标志物DNA的量。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)测量来自生物样品的DNA中至少一个甲基化的标志物基因(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)的量，其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(v)HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1；
2)测量DNA中的至少一种参考标志物的量；以及
3)将在DNA中测量的至少一种甲基化标志物基因的量的值计算为在DNA中测量的参考标志物基因的量的百分比，其中该值指示在样品中测量的至少一种甲基化标志物DNA的量。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)测量来自生物样品的DNA中至少一个甲基化的标志物基因(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)的量，其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；以及
(v)MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1；
2)测量DNA中的至少一种参考标志物的量；以及
3)将在DNA中测量的至少一种甲基化标志物基因的量的值计算为在DNA中测量的参考标志物基因的量的百分比，其中该值指示在样品中测量的至少一种甲基化标志物DNA的量。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)测量来自生物样品的DNA中至少一个甲基化的标志物基因(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)的量，其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C；
(ii)BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503；以及
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C；
2)测量DNA中的至少一种参考标志物的量；以及
3)将在DNA中测量的至少一种甲基化标志物基因的量的值计算为在DNA中测量的参考标志物基因的量的百分比，其中该值指示在样品中测量的至少一种甲基化标志物DNA的量。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)测量来自生物样品的DNA中至少一个甲基化的标志物基因(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)的量，其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5；
2)测量DNA中的至少一种参考标志物的量；以及
3)将在DNA中测量的至少一种甲基化标志物基因的量的值计算为在DNA中测量的参考标志物基因的量的百分比，其中该值指示在样品中测量的至少一种甲基化标志物DNA的量。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)测量来自生物样品的DNA中至少一个甲基化的标志物基因(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)的量，其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1；
(ii)GABRG3、ITGA5和JUP；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1；
(iv)BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5；
2)测量DNA中的至少一种参考标志物的量；以及
3)将在DNA中测量的至少一种甲基化标志物基因的量的值计算为在DNA中测量的参考标志物基因的量的百分比，其中该值指示在样品中测量的至少一种甲基化标志物DNA的量。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理生物样品中的基因组DNA，从而测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经修饰的基因组DNA；以及
3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503；
(ii)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(iv)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理生物样品中的基因组DNA，从而测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经修饰的基因组DNA；以及
3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(v)HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理生物样品中的基因组DNA，从而测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经修饰的基因组DNA；以及
3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；以及
(v)MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理生物样品中的基因组DNA，从而测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经修饰的基因组DNA；以及
3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C；
(ii)BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503；以及
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理生物样品中的基因组DNA，从而测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经修饰的基因组DNA；以及
3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5。
在这项技术的一些实施方案中，提供包括以下步骤的方法：
1)通过用能够以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理生物样品中的基因组DNA，从而测量人个体的生物样品(例如，基因组DNA，例如，从体液诸如血液或血浆或淋巴腺组织中分离)中的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平；
2)使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经修饰的基因组DNA；以及
3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
(i)CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1；
(ii)GABRG3、ITGA5和JUP；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1；
(iv)BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5。
优选地，这类方法的敏感性为约70％至约100％，或约80％至约90％，或约80％至约85％。优选地，特异性为约70％至约100％，或约80％至约90％，或约80％至约85％。
基因组DNA可以通过任何方式分离，包括使用市售试剂盒。简单地说，当感兴趣的DNA被细胞膜包裹时，生物样品必须通过酶促、化学或机械方式进行破坏和溶解。然后可以例如通过用蛋白酶K消化来清除DNA溶液中的蛋白质和其他污染物。然后从溶液中回收基因组DNA。这可以通过多种方法进行，这些方法包括盐析、有机萃取或将DNA结合到固相载体上。对方法的选择将受到几种因素的影响，这些因素包括时间、费用和所需的DNA数量。包含赘生物或肿瘤发生前物质的所有临床样品类型都适用于本发明的方法，例如细胞系、组织切片、活检、石蜡包埋组织、体液、粪便、淋巴腺组织、结肠流出物、尿液、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞以及它们的组合。
这项技术不限于用于制备样品和提供用于测试的核酸的方法。例如，在一些实施方案中，使用直接基因捕获，例如，如美国专利申请序列号61/485386中所详述，或通过相关方法，从粪便样品或血液或血浆样品中分离DNA。
然后用至少一种试剂或一系列试剂处理基因组DNA样品，所述试剂区分包含DMR(例如，DMR 1-285，例如，如表1和3所提供)的至少一种标志物内的甲基化的与未甲基化的CpG二核苷酸。
在一些实施方案中，试剂将在5'-位置未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为方面与胞嘧啶不同的另一碱基。然而，在一些实施方案中，试剂可以是甲基化敏感性限制酶。
在一些实施方案中，基因组DNA样品通过如下方式进行处理，使得将在5'-位置未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为方面与胞嘧啶不同的另一碱基。在一些实施方案中，这种处理是用亚硫酸氢盐(亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐)，然后碱水解进行的。
然后分析处理过的核酸以确定靶基因序列(来自包含DMR，例如至少一个选自例如如表1和3中提供的DMR 1-285的DMR的标志物的至少一个基因、基因组序列或核苷酸)的甲基化状态。分析方法可选自本领域已知的那些，包括本文所列的那些，例如本文所述的QuARTS和MSP。
异常甲基化，更具体地说，包含DMR(例如，DMR 1-285，例如，如表1和3中所提供)的标志物的高甲基化与淋巴瘤淋巴瘤的亚型相关。
这项技术涉及对与淋巴瘤或淋巴瘤的亚型相关的任何样品的分析。例如，在一些实施方案中，样品包含从患者获得的组织和/或生物流体。在一些实施方案中，样品包含分泌物。在一些实施方案中，样品包含血液、血清、血浆、胃分泌物、胰液、胃肠活检样品、来自淋巴腺活检的显微解剖细胞和/或从粪便中回收的细胞。在一些实施方案中，样品包含淋巴腺组织。在一些实施方案中，受试者是人。样品可以包括来自淋巴腺、乳房、肝脏、胆管、胰腺、胃、结肠、直肠、食道、小肠、阑尾、十二指肠、息肉、胆囊、肛门和/或腹膜的细胞、分泌物或组织。在一些实施方案中，样品包含细胞液、腹水、尿液、粪便、胰液、在内窥镜检查期间获得的流体、血液、粘液或唾液。在一些实施方案中，样品是粪便样品。在一些实施方案中，样品是淋巴腺组织样品。
这类样品可以通过本领域已知的，例如熟练技术人员显而易见的多种方法获得。例如，尿液和粪便样品很容易获得，而血液、腹水、血清或胰液样品可以通过使用例如针头和注射器以肠胃外方式获得。可以通过使样品经受本领域技术人员已知的各种技术，包括但不限于离心和过滤来获得无细胞或基本上无细胞的样品。尽管通常优选不使用侵入性技术来获得样品，但获得样品例如组织匀浆、组织切片和活检标本仍可能是优选的。
在一些实施方案中，这项技术涉及一种用于治疗患者(例如，患有淋巴瘤或淋巴瘤的亚型的患者(例如，患有DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤中的一者或多者的患者))的方法，所述方法包括确定如本文提供的一种或多种DMR的甲基化状态并基于确定甲基化状态的结果对患者进行治疗。治疗可以是施用药物化合物、疫苗、进行手术、对患者进行成像、进行另一测试。优选地，所述使用是在临床筛查方法、预后评估方法、监测疗法结果的方法、鉴定最可能对特定治疗性治疗有反应的患者的方法、对患者或受试者进行成像的方法以及药物筛查和开发的方法中。
在这项技术的一些实施方案中，提供了一种用于诊断受试者中的淋巴瘤或淋巴瘤的亚型的方法。如本文所用，术语“诊断(diagnosing)”和“诊断(diagnosis)”是指熟练技术人员可以估计甚至确定受试者是否患有给定疾病或疾患或将来是否可能显现给定疾病或疾患的方法。熟练技术人员通常基于一种或多种诊断指标做出诊断，所述诊断指标例如生物标志物(例如，如本文公开的DMR)，其甲基化状态指示疾患存在、严重性或不存在。
连同诊断一起，临床癌症预后涉及确定癌症的侵袭性和肿瘤复发的可能性，以规划最有效的疗法。如果可以做出更准确的预后，或者甚至可以评估显现癌症的潜在风险，则可以为患者选择适当的疗法，在某些情况下，可以选择不太严重的疗法。癌症生物标志物的评估(例如，确定甲基化状态)可用于将不需要疗法或需要有限疗法的具有良好预后和/或显现癌症风险低的受试者与更可能显现癌症或遭受癌症复发的受益于更深入的治疗的受试者分开。
因此，如本文所用，“做出诊断”或“诊断”还包括确定显现癌症的风险或确定预后，这可以基于本文公开的诊断生物标志物(例如，DMR)的测量预测临床结果(有或没有医学治疗)、选择适当的治疗(或治疗是否有效)或监测当前治疗并可能改变治疗。此外，在本公开主题的一些实施方案中，可以随时间对生物标志物进行多次测定以促进诊断和/或预后。生物标志物的时间变化可用于预测临床结果、监测淋巴瘤或淋巴瘤的亚型的进展和/或监测针对癌症的适当疗法的功效。例如，在这样的实施方案中，可能期望在有效疗法过程期间的时间内看到生物样品中的一种或多种本文公开的生物标志物(例如DMR)(以及可能的一种或多种额外生物标志物，如果被监测)的甲基化状态的变化。
在一些实施方案中，本发明公开的主题还提供了一种用于确定是否在受试者中开始或继续癌症的预防或治疗的方法。在一些实施方案中，该方法包括在一段时间内提供来自受试者的一系列生物样品；分析该系列生物样品以确定每个生物样品中至少一种本文公开的生物标志物的甲基化状态；以及比较每个生物样品中一种或多种生物标志物的甲基化状态的任何可测量变化。一段时间内生物标志物甲基化状态的任何变化都可用于预测显现癌症的风险、预测临床结果、确定是否开始或继续癌症的预防或疗法，以及当前疗法是否有效治疗癌症。例如，可以在开始治疗之前选择第一时间点并且可以在开始治疗之后的某个时间选择第二时间点。甲基化状态可以在取自不同时间点的每个样品中测量，并记录定性和/或定量差异。来自不同样品的生物标志物水平的甲基化状态的变化可与受试者中的NHL或NHL亚型风险、预后、确定治疗功效和/或癌症进展相关。
在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物用于在早期阶段，例如在疾病症状出现之前治疗或诊断疾病。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物用于在临床阶段治疗或诊断疾病。
如所述，在一些实施方案中，可以对一种或多种诊断或预后生物标志物进行多次测定，并且可以使用标志物的时间变化来确定诊断或预后。例如，可以在初始时间确定诊断标志物，并在第二时间再次确定。在这样的实施方案中，标志物从初始时间到第二时间的增加可以诊断癌症的特定类型或严重程度，或给定的预后。同样，标志物从初始时间到第二时间的减少可以指示癌症的特定类型或严重程度，或给定的预后。此外，一种或多种标志物的变化程度可能与癌症的严重程度和未来的不良事件有关。技术人员将理解，虽然在某些实施方案中可以在多个时间点对相同的生物标志物进行比较测量，但也可以在一个时间点测量给定的生物标志物，并在第二个时间点测量第二种生物标志物，并且比较这些标志物可以提供诊断信息。
如本文所用，短语“确定预后”是指熟练技术人员可以预测受试者的疾患的进程或结果的方法。术语“预后”并不是指能够以100％的准确度预测疾患的进程或结果，甚至不是基于生物标志物(例如DMR)的甲基化状态大概预测给定的进程或结果发生的可能性。相反，熟练技术人员会理解，术语“预后”是指某个过程或结果发生的可能性增加；也就是说，与未表现出给定疾患的那些个体相比，表现出疾患的受试者更可能发生过程或结果。例如，在未表现出疾患(例如，具有一种或多种DMR的正常甲基化状态)的个体中，给定结果(例如，患有淋巴瘤或淋巴瘤亚型)的机会可能非常低。
在一些实施方案中，统计分析将预后指标与不利结果的倾向相关联。例如，在一些实施方案中，与从未患癌症的患者获得的正常对照样品中的甲基化状态不同的甲基化状态可以表示受试者比水平更类似于对照样品中的甲基化状态的受试者更可能患上癌症，如由统计显著性水平确定。此外，甲基化状态相对于基线(例如，“正常”)水平的变化可以反映受试者的预后，并且甲基化状态的变化程度可以与不良事件的严重程度相关。通常通过比较两个或更多个群体并确定置信区间和/或p值来确定统计显著性。参见例如Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York,1983，以引用方式整体并入本文中。本发明主题的示例性置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而示例性p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
在其他实施方案中，可以建立本文公开的预后或诊断生物标志物(例如，DMR)的甲基化状态变化的阈值程度，并且简单地比较生物样品中生物标志物的甲基化状态变化程度与甲基化状态变化的阈值程度。本文提供的生物标志物的甲基化状态的优选阈值变化为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％和约150％。在其他实施方案中，可以建立“列线图”，通过该“列线图”，预后或诊断指标(生物标志物或生物标志物的组合)的甲基化状态与给定结果的相关倾向直接相关。熟练技术人员熟悉使用这类列线图来关联两个数值，并理解该测量中的不确定度与标志物浓度中的不确定度相同，因为参考的是单个样品测量值，而不是总体平均值。
在一些实施方案中，对照样品与生物样品同时分析，使得从生物样品获得的结果可以与从对照样品获得的结果进行比较。此外，预期可提供标准曲线，生物样品的测定结果可与之进行比较。如果使用荧光标记，则这类标准曲线将生物标志物的甲基化状态呈现为测定单位的函数，例如荧光信号强度。使用取自多个供体的样品，可以提供正常组织中一种或多种生物标志物的对照甲基化状态，以及取自具有化生的供体或患有淋巴瘤或淋巴瘤亚型的供体的组织中一种或多种生物标志物的“风险”水平的标准曲线。在该方法的某些实施方案中，在从受试者获得的生物样品中鉴定本文提供的一种或多种DMR的异常甲基化状态后，受试者被鉴定为具有化生。在该方法的其他实施方案中，在从受试者获得的生物样品中检测到一种或多种这类生物标志物的异常甲基化状态使得该受试者被鉴定为具有癌症。
对标志物的分析可以单独或与一个测试样品中的另外的标志物同时进行。例如，可以将几个标志物组合到一个测试中以有效处理多个样品并潜在地提供更高的诊断和/或预后准确性。此外，本领域技术人员会认识到测试来自同一受试者的多个样品(例如，在连续时间点)的价值。这类系列样品测试可以鉴定标志物甲基化状态随时间的变化。甲基化状态的变化以及甲基化状态没有变化可以提供有关疾病状态的有用信息，包括但不限于鉴定事件发生的大致时间、可挽救组织的存在和数量、药物疗法的适当性、各种疗法的有效性以及对受试者结果的鉴定，包括未来事件的风险。
对生物标志物的分析可以呈多种物理格式进行。例如，可以使用微量滴定板或自动化来促进大量测试样品的处理。可替代地，可以开发单一样品格式以促进以及时方式进行即刻治疗和诊断，例如在非卧床运输或急诊室环境中。
在一些实施方案中，如果与对照甲基化状态相比，样品中至少一种生物标志物的甲基化状态存在可测量的差异，则受试者被诊断为患有淋巴瘤淋巴瘤的亚型。相反，当在生物样品中未鉴定出甲基化状态的变化时，可以鉴定受试者为未患淋巴瘤或淋巴瘤亚型、没有患癌症的风险或具有低的患癌症的风险。在这点上，具有癌症或其风险的受试者可以与具有低至基本上没有癌症或其风险的受试者相区分。那些有显现NHL或NHL亚型风险的受试者可以进行更密集和/或定期的筛查计划，包括内窥镜监测。另一方面，那些具有低至基本上没有风险的受试者可以避免接受额外的NHL或NHL亚型风险测试(例如，侵入性程序)，直到例如未来的筛查，例如根据本发明的技术进行的筛查表明在那些受试者中出现了NHL风险或NHL亚型风险的时间。
如上所述，根据本发明的技术方法的实施方案，检测一种或多种生物标志物的甲基化状态的变化可以是定性测定，也可以是定量测定。因此，将受试者诊断为患有淋巴瘤或淋巴瘤的亚型或有显现淋巴瘤或淋巴瘤的亚型风险的步骤表明进行了某些阈值测量，例如，生物样品中一种或多种生物标志物的甲基化状态不同于预定的对照甲基化状态。在该方法的一些实施方案中，对照甲基化状态是生物标志物的任何可检测的甲基化状态。在对照样品与生物样品同时测试的方法的其他实施方案中，预定甲基化状态是对照样品中的甲基化状态。在该方法的其他实施方案中，预定甲基化状态基于标准曲线和/或由标准曲线鉴定。在该方法的其他实施方案中，预定甲基化状态是特定状态或状态范围。因此，可以在本领域技术人员显而易见的可接受限度内，部分地基于所实践的方法的实施方案和期望的特异性等来选择预定甲基化状态。
进一步关于诊断方法，优选的受试者是脊椎动物受试者。优选的脊椎动物是温血动物；优选的温血脊椎动物是哺乳动物。优选的哺乳动物最优选是人。如本文所用，术语“受试者”既包括人受试者也包括动物受试者。因此，本文提供了兽医治疗用途。因此，本发明的技术提供了对哺乳动物(例如人)以及以下动物的诊断：那些因濒危而重要的哺乳动物(例如东北虎)；具有经济重要性的动物，例如在农场饲养供人食用的动物；和/或对人具有社会重要性的动物，例如作为宠物或在动物园饲养的动物。这种动物的实例包括但不限于：食肉动物，例如猫和狗；猪科动物，包括猪、肉猪和野猪；反刍动物和/或有蹄类动物，如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；和马。因此，还提供了家畜的诊断和治疗，包括但不限于家养猪、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)等。
当前公开的主题进一步包括用于诊断受试者的淋巴瘤和/或特定形式的淋巴瘤(例如，DLBCL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)的系统。例如，所述系统可作为市售试剂盒提供，所述试剂盒可用于筛查已收集生物样品的受试者患NHL和/或NHL亚型的风险或者诊断其患NHL和/或NHL亚型的风险。根据本发明的技术提供的示例性系统包括评估如表1和3中提供的DMR的甲基化状态。
实施例
实施例I.
本实施例描述了非霍奇金淋巴瘤(NHL)和NHL亚型特异性标志物的发现和组织验证。
组织、细胞悬浮液、细胞系和血液样品均来自Mayo临床生物样品储存库。样品的选择严格遵守主题研究授权和纳入/排除标准。
病例由27个淋巴瘤细胞系、18个弥漫性大B细胞淋巴瘤、12个滤泡性淋巴瘤、20个套细胞淋巴瘤、15个边缘区淋巴瘤、7个可疑淋巴瘤和8个外周T细胞淋巴瘤组成。对照包括11个非肿瘤淋巴腺组织和30个来自无癌症患者的血沉棕黄层样品。还包括24个霍奇金淋巴瘤。组织被宏观解剖并由专业病理学家进行组织学检查。样品经年龄匹配、随机化和设盲。使用QIAamp DNA组织小型试剂盒和QIAamp DNA血液小型试剂盒(Qiagen,Valencia CA)纯化DNA。用AMPure XP珠粒(Beckman-Coulter,Brea CA)重新纯化DNA，并通过PicoGreen(Thermo-Fisher,Waltham MA)进行定量。使用qPCR评估DNA完整性。
RRBS测序文库根据Meissner方案(Gu等人，Nature Protocols 2011)进行修改而制备。样品以4重格式组合，并由Mayo基因组学设施在Illumina HiSeq 2500仪器(Illumina,San Diego CA)上测序。读数由Illumina管道模块处理，用于图像分析和碱基判读。使用Mayo开发的生物信息学套件SAAP-RRBS进行二次分析。简单地说，使用Trim-Galore清理读数，并与使用BSMAP构建的GRCh37/hg19参考基因组比对。对于覆盖率≥10X且碱基质量分数≥20的CpG，对于映射到反向链的读段，甲基化比率是通过计算C/(C+T)或相反地G/(G+A)来确定的。
在所有NHL样品、B细胞/T细胞和亚型水平上进行病例/对照比较。单个CpG按高甲基化比率排序，即给定基因座的甲基化的胞嘧啶数量与该位点的总胞嘧啶计数之比。对于病例，比率要求≥0.20(20％)；对于组织对照，≤0.04(5％)组织与组织分析；≥0.20(20％)组织与血沉棕黄层；对于血沉棕黄层对照，≤0.02(1％)。不符合这些标准的CpG被丢弃。随后，候选CpG通过基因组位置框并到DMR(差异甲基化的区域)，范围为大约40-220bp，最小截止值为每个区域5个CpG。CpG密度过高(>30％)的DMR被排除在外，以避免在验证阶段出现GC相关的扩增问题。对于每个候选区域，创建一个2维矩阵，该矩阵以样品到样品的方式比较病例和对照的单个CpG。然后将这些CpG矩阵与参考序列进行比较，以评估在初始过滤过程中是否丢弃了基因组上连续的甲基化位点。从这些区域的子集中，最终选择需要在每个样品水平上整个DMR序列的单个CpG的协调和连续的超甲基化(在某些情况下)。相反，对照样品的甲基化必须比病例低至少5倍，并且CpG模式必须更随机且协调性更低。DMR内的每个CpG位点至少需要10％的癌症样品具有至少50％的高甲基化率。
在单独的分析中，使用专有的DMR鉴定管道和回归包根据CpG的平均甲基化值来推导DMR。比较不同类别的非霍奇金淋巴瘤、组织对照和血沉棕黄层对照平均甲基化百分比的差异；每个映射的CpG的100个碱基对内的平铺阅读框被用于鉴定DMR，其中对照甲基化<5％(组织)和<0.1％(WBC)；仅当总覆盖深度平均为每个受试者10个读段且子组间方差>0时，才对DMR进行分析。假设优势率的生物学相关增加>3倍且覆盖深度为10个读段，则每组需要≥18个样品才能在显著性水平为5％的双侧测试中达到80％的功效，并且假设二项式方差膨胀系数为1。在回归后，DMR按p值、接受者操作特征曲线下面积(AUC)和病例与所有对照之间的倍数变化差异进行排序。由于计划进行先验独立验证，因此在该阶段未对错误发现进行任何调整。
选择DMR的一个子集进行进一步开发。标准主要是ROC曲线下的逻辑衍生面积指标，该指标提供对区域的判别潜力的性能评估。选择0.85的AUC作为粗略截止值，具有其他强或必要正向特征的标志物除外。此外，还计算甲基化倍数变化率(平均癌症高甲基化率/平均对照高甲基化率)，组织与组织比较采用下限5，组织与血沉棕黄层比较采用下限10。P值要求小于0.01。DMR必须在平均和单个CpG选择过程中表现出来。在大多数癌症样品中，DMR内的所有单个CpG都必须完全甲基化。使用MethPrimer(Li LC和DahiyaR.Bioinformatics 2002年11月；18(11):1427-31)为候选区域设计定量甲基化特异性PCR(qMSP)引物，并且针对20ng(6250当量)阳性和阴性基因组甲基化对照进行QC检查。测试多个退火温度以获得最佳区分力。在qMSP的两个阶段中进行验证。第一个阶段由重新测试已测序的DNA样品组成。这样做是为了验证DMR是真正具有区分力，而不是过度拟合极其庞大的下一代数据集的结果。第二个阶段使用更大的独立样品集。
组织如前所述由专家进行临床和病理检查。使用Qiagen QIAmp FFPE组织试剂盒进行DNA纯化。EZ-96DNA甲基化试剂盒(Zymo Research,Irvine CA)用于亚硫酸氢盐转化步骤。在Roche 480LightCyclers(Roche,Basel Switzerland)上使用SYBR Green检测来扩增10ng转化的DNA(每个标志物)。连续稀释的通用甲基化基因组DNA(Zymo Research)用作定量标准。CpG无关的ACTB(β-肌动蛋白)测定法被用作输入参考和归一化对照。结果表示为ACTB的甲基化的拷贝(特定标志物)/拷贝。
结果针对单个MDM(甲基化的DNA标志物)性能进行逻辑分析。对于标志物的组合，使用随机森林回归(rForest)方法生成500个适合原始数据自举样品(大约2/3的训练数据)的单独模型，并用于估计整个MDM组的交叉验证误差(1/3的测试数据)，并重复500次，以避免低估或高估真实交叉验证指标的虚假分裂。然后对500次迭代的结果取平均值。
比较淋巴瘤组织样品与非肿瘤淋巴腺组织的甲基化，鉴定出102个DMR(表1)(表1中所示区域的基因组坐标基于2009年2月人(GRCh37/hg19)组装)，包括NHL特定区域和NHL亚型特定区域。表2显示1)所鉴定的区分淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)与非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积，2)淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)与非肿瘤淋巴腺组织的倍数变化(FC)，以及3)淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)与非肿瘤淋巴腺组织的p值。
表1.所鉴定的区分淋巴瘤(例如，NHL和NHL亚型)组织与非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域。
表2.表2显示1)所鉴定的区分淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)与非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积，2)淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)与非肿瘤淋巴腺组织的倍数变化(FC)，以及3)淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)与非肿瘤淋巴腺组织的p值。
淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)与白细胞(血沉棕黄层)的分析产生183个组织DMR，WBC中的噪声小于1％(表3)(表3中所示区域的基因组坐标基于2009年2月人(GRCh37/hg19)组装)，包括NHL特定区域和NHL亚型特定区域。表4显示1)所鉴定的区分淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)与白细胞(血沉棕黄层)的甲基化区域的曲线下面积，2)淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)白细胞(血沉棕黄层)的倍数变化(FC)，以及3)淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)白细胞(血沉棕黄层)的p值。
表3.所鉴定的区分淋巴瘤(例如，NHL和NHL亚型)组织与白细胞(血沉棕黄层)的甲基化区域。
表4.表4显示1)所鉴定的区分淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)与白细胞(血沉棕黄层)的甲基化区域的曲线下面积，2)淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)白细胞(血沉棕黄层)的倍数变化(FC)，以及3)淋巴瘤组织(例如，NHL和NHL亚型)白细胞(血沉棕黄层)的p值。
从组织和血沉棕黄标志物组中，30个候选标志物(例如，ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503；参见表1和2)(例如，BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；参见表3和4)被选中用于进一步研究。开发出甲基化特异性PCR测定法并针对两轮组织样品进行测试；那些所测序的(冷冻、细胞悬浮液、细胞系)和更大的独立队列(FFPE、细胞悬浮液)。短扩增子引物(<120bp)被设计为靶向DMR中最具区分力的CpG，并针对对照进行测试，以确保完全甲基化的片段以线性方式稳健地扩增；未甲基化的和/或未转化的片段不扩增。60个引物序列和退火温度列于表5中(其中“-F”表示正向引物5'-3'序列，“-R”表示反向引物5'-3'序列)。
表5.
对第一阶段验证的结果进行逻辑分析以确定AUC和倍数变化。分别对组织和血沉棕黄层对照进行分析。滤泡性淋巴瘤的结果在表6中突出显示，DLBCL的结果在表7中突出显示，套细胞淋巴瘤的结果在表8中突出显示，边缘区淋巴瘤的结果在表9中突出显示，外周T细胞淋巴瘤的结果在表10中突出显示。蓝色阴影的程度表示标志物测定法的区分强度。与正常血沉棕黄层相比，许多测定法具有100％的区分力，与对照组织相比，若干测定法具有100％的区分力。
表6.表6显示1)所鉴定的区分滤泡性淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积，2)所鉴定的区分滤泡性淋巴瘤组织与血沉棕黄层(正常)的甲基化区域的曲线下面积，3)滤泡性淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的倍数变化(FC)，以及4)来自血沉棕黄层(正常)的滤泡性淋巴瘤组织的倍数变化(FC)。
表7.表7显示1)所鉴定的区分DLBCL组织与非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积，2)所鉴定的区分DLBCL组织与血沉棕黄层(正常)的甲基化区域的曲线下面积，3)DLBCL组织与非肿瘤淋巴腺组织的倍数变化(FC)，以及4)来自血沉棕黄层(正常)的DLBCL组织的倍数变化(FC)。
表8.表8显示1)所鉴定的区分套细胞淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积，2)所鉴定的区分套细胞淋巴瘤组织与血沉棕黄层(正常)的甲基化区域的曲线下面积，3)套细胞淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的倍数变化(FC)，以及4)来自血沉棕黄层(正常)的套细胞淋巴瘤组织的倍数变化(FC)。
表9.表9显示1)所鉴定的区分边缘区淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积，2)所鉴定的区分边缘区淋巴瘤组织与血沉棕黄层(正常)的甲基化区域的曲线下面积，3)边缘区淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的倍数变化(FC)，以及4)来自血沉棕黄层(正常)的边缘区淋巴瘤组织的倍数变化(FC)。
表10.表10显示1)所鉴定的区分外周T细胞淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积，2)所鉴定的区分外周T细胞淋巴瘤组织与血沉棕黄层(正常)的甲基化区域的曲线下面积，3)外周T细胞淋巴瘤组织与非肿瘤淋巴腺组织的倍数变化(FC)，以及4)来自血沉棕黄层(正常)的外周T细胞淋巴瘤组织的倍数变化(FC)。
然后根据以下各项在独立样品中测试标志物：
与上一步一样，接下来将整个样品和标志物集以一个批次运行。每个标志物运行约10ng的样品来源的DNA总共300个。估计接受者操作特征曲线下面积(AUC)和相应的95％置信区间(CI)以评估单个MDM的预测准确性(淋巴瘤与正常)。
在30个运行中，前10个MDM的单变量AUC(淋巴瘤与正常)列于表11中。
表11.
针对滤泡性淋巴瘤组织与组织和血沉棕黄层的个体MDM的AUC结果如表12所示，针对DLBCL组织与组织和血沉棕黄层的AUC结果如表13所示，针对套细胞淋巴瘤组织与组织和血沉棕黄层的AUC结果如表14所示，针对边缘区淋巴瘤组织与组织和血沉棕黄层的AUC结果如表15所示，针对外周T细胞淋巴瘤组织与组织和血沉棕黄层的AUC结果如表16所示。单个标志物候选物的接受者操作特征分析，针对癌症与对照组织比较的曲线下面积(AUC)范围为0.35至1。滤泡性淋巴瘤、大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤和T细胞淋巴瘤亚型的中位数AUC分别为0.91、0.88、0.73、0.72和0.57。随机森林回归，对数据集的500个自举样品进行平均预测，被用于基于所有30个候选MDM构建淋巴瘤的多变量预测模型(参见，表17)。留一法交叉验证被用于估计模型性能。对淋巴瘤总体以及按亚型进行检测的灵敏度，如正常对照中的适当百分位数所定义，在预先确定的特异性水平(即第90个百分位、第95个百分位)下进行测量。袋外误差率7.89％(淋巴瘤：4.7％，正常：23.0％)，总体AUC＝0.986。对于癌症与血沉棕黄层比较，AUC范围为0.39至1。滤泡性淋巴瘤、大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤和T细胞淋巴瘤亚型的中位数AUC分别为0.95、0.93、0.83、0.85和0.74。表18显示了在95％特异性下用于检测血液样品内的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的各种亚型的灵敏度。
表12.表12显示了所鉴定的区分滤泡性淋巴瘤组织与血沉棕黄层(正常)和非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积。
表13.表13显示了所鉴定的区分DLBCL组织与血沉棕黄层(正常)和非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积。
表14.表14显示了所鉴定的区分套细胞淋巴瘤组织与血沉棕黄层(正常)和非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积。
表15.表15显示了所鉴定的区分边缘区淋巴瘤组织与血沉棕黄层(正常)和非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积。
表16.表16显示了1)所鉴定的区分外周T细胞淋巴瘤与血沉棕黄层(正常)和非肿瘤淋巴腺组织的甲基化区域的曲线下面积。
表17.随机森林建模
表18.表18显示了在95％特异性下用于检测血液样品内的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的各种亚型的灵敏度。
图1进一步提供了用于甲基化标志物的标志物染色体区域以及相关的引物和探针信息。
总之，全甲基化组测序、严格过滤标准和生物学验证产生了针对非霍奇金淋巴瘤的出色候选MDM。一组十种新的MDM在病例和良性对照样品之间实现了非常高的区分力。
以引用方式并入
本文中所提及的每一个专利文献和科技文章的全部公开内容都出于全部目的以引用方式并入。
在不脱离所描述的技术的范围和精神的情况下，所描述的组合物、方法和技术的使用的各种修改和变化对本领域的技术人员将是显而易见的。尽管已结合具体示例性实施方案对技术进行了描述，但是应当理解所要求保护的本发明不应当不适当地限于此类具体实施方案。事实上，对药理学、生物化学、医学科学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 梅约医学教育与研究基金会(MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION ANDRESEARCH)
精密科学公司(EXACT SCIENCES CORPORATION)
<120> 检测非霍奇金淋巴瘤
<130> PPI23170162US
<150> US 63/067,592
<151> 2020-08-19
<160> 186
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 120
cgagatcgag tagggtgagc 20
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 121
aggccacgga cgcgttacgg aattgcgttt t 31
<210> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 122
gacgtttttg gttttacgga gttttc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 123
cctataacta atcgactaaa actatactaa aaccg 35
<210> 124
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 124
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<210> 125
<211> 129
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 125
gcccggccgc cgcccattgg ccggaggaat ccccaggaat gcgagcgccc ctttaaaagc 60
gcgcggctcc tccgccttgc cagccgctgc gcccgagctg gcctgcgagt tcagggctcc 120
tgtcgctct 129
<210> 126
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 126
gttcggtcgt cgtttattgg tcggaggaat ttttaggaat gcgagcgttt ttttaaaagc 60
gcgcggtttt ttcgttttgt tagtcgttgc gttcgagttg gtttgcgagt ttagggtttt 120
tgtcgtttt 129
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 127
aggccacgga cgcgcggttt tttcgttttg 30
<210> 128
<211> 216
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
aggcgcgcgc ggtgatctcg gctctccgcc gctgcccgga gcgtcatcca cgttcggttc 60
cctcccacat tagacaagaa atctgaggtc aggagagcta agtaacttgc ccaaagtcgc 120
tcacaaggca gtgacgaagc aaactcacat ccgcggctcc ttttttctcc ttgaacgccg 180
ggctctgcgg aggctcaggc cctgcaggaa tcgccc 216
<210> 129
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 129
aggcgcgcgc ggtgatttcg gtttttcgtc gttgttcgga gcgttattta cgttcggttt 60
ttttttatat tagataagaa atttgaggtt aggagagtta agtaatttgt ttaaagtcgt 120
ttataaggta gtgacgaagt aaatttatat tcgcggtttt tttttttttt ttgaacgtcg 180
ggttttgcgg aggtttaggt tttgtaggaa tcgttt 216
<210> 130
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 130
cgcgccgagg cgaacaacga cgaaaaacc 29
<210> 131
<211> 276
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
ggctgaagtc ggggtgctcg gccagcgtcg ccgcctgccg gggaggctgg cccagggtcc 60
ccggcgcata gcggccaacg ctcagctcat ccgcggcgtc ggcgcccagc aggaacgagt 120
ccacgtagta gttgcccagg gccccagtgg tggccatcac cgtgcccagc gcctggcccg 180
cccggcccga cccacggaaa ttatgaaact gcagatttca tgtaacaact tggtggcacc 240
gggggggaag tacagtcacc taataagttg ccggcg 276
<210> 132
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 132
ggttgaagtc ggggtgttcg gttagcgtcg tcgtttgtcg gggaggttgg tttagggttt 60
tcggcgtata gcggttaacg tttagtttat tcgcggcgtc ggcgtttagt aggaacgagt 120
ttacgtagta gttgtttagg gttttagtgg tggttattat cgtgtttagc gtttggttcg 180
ttcggttcga tttacggaaa ttatgaaatt gtagatttta tgtaataatt tggtggtatc 240
gggggggaag tatagttatt taataagttg tcggcg 276
<210> 133
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 133
aggccacgga cgcgccgcga ataaactaaa c 31
<210> 134
<211> 204
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 134
gcagcctcgc gcctgccttc cctccactgt cctcagccaa ggtgtagtaa agcgtctccg 60
aacgcggcgc gaccctcgcc cacgcccgct cgcgggggga ccgcaccgcc ccaggggtcc 120
tcgctagggg ttcccggaga aggggtggga gatgggggtg cgggggggca caggagcgcg 180
ggccagcacc cagacctgct cggt 204
<210> 135
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 135
gtagtttcgc gtttgttttt tttttattgt ttttagttaa ggtgtagtaa agcgttttcg 60
aacgcggcgc gattttcgtt tacgttcgtt cgcgggggga tcgtatcgtt ttaggggttt 120
tcgttagggg ttttcggaga aggggtggga gatgggggtg cgggggggta taggagcgcg 180
ggttagtatt tagatttgtt cggt 204
<210> 136
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 136
cgcgccgagg cgtttacgtt cgttcgcg 28
<210> 137
<211> 258
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 137
cgggccccac tgcgcctttt cctagccctc cgctgtcacg cagcagcaag cttaatcccg 60
cataaaaaac gcatgcgccg agagcgtgcc cgcagcaggg cccacggaac gatgacagca 120
ggcacctcct atctgccccc gcccccggcg tcacgtgact agctgcgctg gtgcacgcag 180
ccgggagggg cgggctcctt cccctggcaa gccggaagct ccgcacctgt aagtagaggt 240
tcaggcttcg accacgcg 258
<210> 138
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 138
cgggttttat tgcgtttttt tttagttttt cgttgttacg tagtagtaag tttaatttcg 60
tataaaaaac gtatgcgtcg agagcgtgtt cgtagtaggg tttacggaac gatgatagta 120
ggtatttttt atttgttttc gttttcggcg ttacgtgatt agttgcgttg gtgtacgtag 180
tcgggagggg cgggtttttt tttttggtaa gtcggaagtt tcgtatttgt aagtagaggt 240
ttaggtttcg attacgcg 258
<210> 139
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 139
aggccacgga cgcgtaacgc cgaaaacga 29
<210> 140
<211> 142
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 140
cgggactgtt aagggagctc gaagtcgggg gccgggggct tcccgtcccg gcgcttccca 60
tgcaaacccc tgaaggaagc ggcaggcgca gccgcgggct ccgcagccca ggcccacttc 120
ctgtcactcc aggaaaacct cg 142
<210> 141
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 141
cgggattgtt aagggagttc gaagtcgggg gtcgggggtt tttcgtttcg gcgtttttta 60
tgtaaatttt tgaaggaagc ggtaggcgta gtcgcgggtt tcgtagttta ggtttatttt 120
ttgttatttt aggaaaattt cg 142
<210> 142
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 142
cgcgccgagg cgggggtttt tcgtttcg 28
<210> 143
<211> 129
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 143
gctctaattt cctcagattc cgcggcggag aaaccagaag ctagatgggc agtcgcagcg 60
gcggcggctc aacaccgcga ggagcgctgg gctctccgcc cttcccggcc acgtgacgcc 120
cggggacgc 129
<210> 144
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 144
gttttaattt ttttagattt cgcggcggag aaattagaag ttagatgggt agtcgtagcg 60
gcggcggttt aatatcgcga ggagcgttgg gtttttcgtt tttttcggtt acgtgacgtt 120
cggggacgt 129
<210> 145
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 145
aggccacgga cgcggcggtt taatatcgcg 30
<210> 146
<211> 267
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 146
ccaggaggcg tcggagcctg gcgtggtagg gctgtgctgc gcggtccttc ccattcaccc 60
tagtctggcg ctcgccggcg tgggcgggcc ggaccttcgc cgcttccagg aagggccaca 120
acggccgtcg gaccacggcg cggcgggtaa ggtcgtcagc gtcttcctgt cagcggtcgg 180
cagagcctcg gcgggcgggc ggcgcgtggg gcagccggtg tcgcactggg agggctgcgt 240
gggcgcggag ggcctgggcg ctcccca 267
<210> 147
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 147
ttaggaggcg tcggagtttg gcgtggtagg gttgtgttgc gcggtttttt ttatttattt 60
tagtttggcg ttcgtcggcg tgggcgggtc ggattttcgt cgtttttagg aagggttata 120
acggtcgtcg gattacggcg cggcgggtaa ggtcgttagc gtttttttgt tagcggtcgg 180
tagagtttcg gcgggcgggc ggcgcgtggg gtagtcggtg tcgtattggg agggttgcgt 240
gggcgcggag ggtttgggcg tttttta 267
<210> 148
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 148
cgcgccgagg cggattacgg cgcg 24
<210> 149
<211> 114
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 149
gaggaaggtg accgaacccg tagcagcttc cgagagcgta cccgtttgca aattgctgca 60
ggaagagcga ggcgggcctt gcgcttttta atccggaacg ggaagcactg ggga 114
<210> 150
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 150
gaggaaggtg atcgaattcg tagtagtttt cgagagcgta ttcgtttgta aattgttgta 60
ggaagagcga ggcgggtttt gcgtttttta attcggaacg ggaagtattg ggga 114
<210> 151
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 151
aggccacgga cgcgagagcg tattcgtttg t 31
<210> 152
<211> 147
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 152
ggtcggcgcc acacaccccc agccggcgac cgcgcccagg gacctaattc aatcgccccc 60
agcctaatga atagccgcgc gctaatcgga tctccgcgcg cttcggggat ttacgcttcc 120
cggctctccc cctcgtgccc cgcggcc 147
<210> 153
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 153
ggtcggcgtt atatattttt agtcggcgat cgcgtttagg gatttaattt aatcgttttt 60
agtttaatga atagtcgcgc gttaatcgga ttttcgcgcg tttcggggat ttacgttttt 120
cggttttttt tttcgtgttt cgcggtt 147
<210> 154
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 154
cgcgccgagg cgatcgcgtt tagggattta a 31
<210> 155
<211> 135
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 155
atgagccttt ctgttttaaa gccggaaccc agccgggccg cgccgcgagg aggctcccct 60
gaggctggca ggagagacct gcagaaactc gtgcgcgccg agcgaggcgg gcgccctggg 120
gctggggcac gcggc 135
<210> 156
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 156
atgagttttt ttgttttaaa gtcggaattt agtcgggtcg cgtcgcgagg aggttttttt 60
gaggttggta ggagagattt gtagaaattc gtgcgcgtcg agcgaggcgg gcgttttggg 120
gttggggtac gcggt 135
<210> 157
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 157
aggccacgga cgcgcgtcgc gaggag 26
<210> 158
<211> 189
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 158
tagcgctggt actcctgggc tgggtctcct cgtcttctcc cacctcctcg gcatcctcct 60
tctcctcctc ggcgccgttc ctggcttccg ccgtgtccgc ccagcccccg ctgccggacc 120
agtgccccgc gctgtgcgag tgctccgagg cagcgcgcac agtcaagtgc gttaaccgca 180
atctgaccg 189
<210> 159
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 159
tagcgttggt atttttgggt tgggtttttt cgtttttttt tattttttcg gtattttttt 60
tttttttttc ggcgtcgttt ttggttttcg tcgtgttcgt ttagttttcg ttgtcggatt 120
agtgtttcgc gttgtgcgag tgtttcgagg tagcgcgtat agttaagtgc gttaatcgta 180
atttgatcg 189
<210> 160
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 160
cgcgccgagg cgcgttgtgc gagtg 25
<210> 161
<211> 189
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 161
agacgccgca gctgcgcgcc agggtccagc ccggcgggga tcgggctcgg gactcacccg 60
ctccggcgag ctcgactcag ctcgggctcc cgcctcggct aggcagccgc ctggggctgc 120
gtcccgcgca gggtcagcgc ggatcgggca ggaggcgccc tcttggcaaa gtcggctaga 180
ggcgccagc 189
<210> 162
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 162
agacgtcgta gttgcgcgtt agggtttagt tcggcgggga tcgggttcgg gatttattcg 60
tttcggcgag ttcgatttag ttcgggtttt cgtttcggtt aggtagtcgt ttggggttgc 120
gtttcgcgta gggttagcgc ggatcgggta ggaggcgttt ttttggtaaa gtcggttaga 180
ggcgttagt 189
<210> 163
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 163
aggccacgga cgcgtttcgg cgagttcg 28
<210> 164
<211> 113
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 164
cgtcacctgc cggaaacacc cgaatgttca tcccgcgcgc agtttctgag atgctgggtg 60
aaggcgaccc gcagataggt ctgtgacaga cgcctaaagc gccgaaccat ccc 113
<210> 165
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 165
cgttatttgt cggaaatatt cgaatgttta tttcgcgcgt agtttttgag atgttgggtg 60
aaggcgattc gtagataggt ttgtgataga cgtttaaagc gtcgaattat ttt 113
<210> 166
<211> 247
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 166
ggggacgcgg ctgcctgctg ggggtgtgag cgagaggctg agcgctgccc gctcggcgca 60
tccattccgc accgccccct ccctgcgggc ctcggaggaa gccccccgcg ctgtgcggag 120
gcgcctcggc tgccgggctg cggagccccg gcccagcaag aggtgagtgc cgccgccggc 180
tccctagctt acccgcgcgc gcgctctctt ttcttcttcc ctcggtcctc gcttctctct 240
agggtgt 247
<210> 167
<211> 247
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 167
ggggacgcgg ttgtttgttg ggggtgtgag cgagaggttg agcgttgttc gttcggcgta 60
tttatttcgt atcgtttttt ttttgcgggt ttcggaggaa gtttttcgcg ttgtgcggag 120
gcgtttcggt tgtcgggttg cggagtttcg gtttagtaag aggtgagtgt cgtcgtcggt 180
tttttagttt attcgcgcgc gcgttttttt tttttttttt ttcggttttc gttttttttt 240
agggtgt 247
<210> 168
<211> 79
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 168
ggtgcacggc gcggggcggg agcctggcgc agccggcaga ccgccagcag atggaggcgc 60
tcactcggta cctgcgcgc 79
<210> 169
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 169
ggtgtacggc gcggggcggg agtttggcgt agtcggtaga tcgttagtag atggaggcgt 60
ttattcggta tttgcgcgt 79
<210> 170
<211> 108
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 170
tccggcgccg cgttttctag agaaccgggt ctcagcgatg ctcatttcag ccccgtctta 60
atgcaacaaa cgaaacccca cacgaacgaa aaggaacatg tctgcgct 108
<210> 171
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 171
ttcggcgtcg cgttttttag agaatcgggt tttagcgatg tttattttag tttcgtttta 60
atgtaataaa cgaaatttta tacgaacgaa aaggaatatg tttgcgtt 108
<210> 172
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 172
cgcaaacata ttccttttcg ttcg 24
<210> 173
<211> 102
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 173
accctggcca aggaggccgc cgcctccaac accaacacgc tcaacaggaa aaccacgcct 60
gtgtaggggc gcggcggggg agccgagggg cgtgtccggg gc 102
<210> 174
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 174
attttggtta aggaggtcgt cgtttttaat attaatacgt ttaataggaa aattacgttt 60
gtgtaggggc gcggcggggg agtcgagggg cgtgttcggg gt 102
<210> 175
<211> 189
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 175
cggtgccctt tgcgttcctt cccgctcctc tcccggaccc cctccccctt ggccctcagc 60
ggcgtccctc ttcctcccgc cctctccccc gagtctctcg gtcactcgct ggtgcccttg 120
ggcgcgcggt gcgttgaagg cgtgagtccc gggtcttcgg gatcccggct ttggccgcca 180
gagagcagc 189
<210> 176
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 176
cggtgttttt tgcgtttttt ttcgtttttt tttcggattt tttttttttt ggtttttagc 60
ggcgtttttt tttttttcgt tttttttttc gagtttttcg gttattcgtt ggtgtttttg 120
ggcgcgcggt gcgttgaagg cgtgagtttc gggttttcgg gatttcggtt ttggtcgtta 180
gagagtagt 189
<210> 177
<211> 179
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 177
gtcccgcccg caccctttgc tttcagccca ctcggttccc tctcctaggt ttccacgagc 60
gcgagggccg cccctactgc cgccgggact tcctgcagct gttcgccccg cgctgccagg 120
gctgccaggg ccccatcctg gataactaca tctcggcgct cagcgcgctc tggcacccg 179
<210> 178
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 178
gtttcgttcg tattttttgt ttttagttta ttcggttttt ttttttaggt ttttacgagc 60
gcgagggtcg tttttattgt cgtcgggatt ttttgtagtt gttcgtttcg cgttgttagg 120
gttgttaggg ttttattttg gataattata tttcggcgtt tagcgcgttt tggtattcg 179
<210> 179
<211> 314
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 179
ggggcggggt gtacgagggg cgtgtacact ggctcaggga cacgcgctct cggccacagc 60
aactggctcc aagttccctc cctcactctc cggcgaagcc tgcctgagcc ctcccactcg 120
gtgcagaccg aaccatcgcg gccgccgcca gccgggccct tcgcggccgc gcgtcctggg 180
cccgttccgc cagccccgtc tgctctctac ccgcggcccc gcggcggcga ccgtgaacac 240
tcggcggccc ctacagcccg ctctcggccc ttcgtccctc gcgggccccg actctccctc 300
cttgcagtcc cccg 314
<210> 180
<211> 314
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 180
ggggcggggt gtacgagggg cgtgtatatt ggtttaggga tacgcgtttt cggttatagt 60
aattggtttt aagttttttt ttttattttt cggcgaagtt tgtttgagtt tttttattcg 120
gtgtagatcg aattatcgcg gtcgtcgtta gtcgggtttt tcgcggtcgc gcgttttggg 180
ttcgtttcgt tagtttcgtt tgttttttat tcgcggtttc gcggcggcga tcgtgaatat 240
tcggcggttt ttatagttcg ttttcggttt ttcgtttttc gcgggtttcg attttttttt 300
tttgtagttt ttcg 314
<210> 181
<211> 168
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 181
ccccctcgga gctccgcccc cttcctggcc tcaaactccg agtccattca aacctcgcct 60
tcctcgccct gcgcgttgtc aggcgtgtaa ttggggaaac tcctccccgc cgggaccgcc 120
tcggaggcgc tgccagggga cagccgccca gctgccccca cctcccag 168
<210> 182
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 182
ttttttcgga gtttcgtttt ttttttggtt ttaaatttcg agtttattta aatttcgttt 60
ttttcgtttt gcgcgttgtt aggcgtgtaa ttggggaaat tttttttcgt cgggatcgtt 120
tcggaggcgt tgttagggga tagtcgttta gttgttttta ttttttag 168
<210> 183
<211> 165
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 183
cctggcggcc cgcgccatca tccgcgactt cgagcagctg gcggagcgcg agggcgagat 60
cgagcagggt gagcgccacg gaactgcgcc cctcccgcgg acggcctccg gaggacagcc 120
ccgctccaca gccgctcccc cttccccacc cgcccccggt gatcc 165
<210> 184
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 184
tttggcggtt cgcgttatta ttcgcgattt cgagtagttg gcggagcgcg agggcgagat 60
cgagtagggt gagcgttacg gaattgcgtt tttttcgcgg acggttttcg gaggatagtt 120
tcgttttata gtcgtttttt tttttttatt cgttttcggt gattt 165
<210> 185
<211> 183
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 185
gctgagttgg gaataaggat cctcctttga gatttccagg gtcctgagtc cttcattctg 60
acgttcttgg ccccacggag cccccgtctc cccagcttcc gaccccagcc ccagaagtcc 120
cggtctcagc acagctccag ccgaccagct acaggaaacc agcttttctc ttcctcccaa 180
gag 183
<210> 186
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 186
gttgagttgg gaataaggat ttttttttga gatttttagg gttttgagtt ttttattttg 60
acgtttttgg ttttacggag ttttcgtttt tttagttttc gattttagtt ttagaagttt 120
cggttttagt atagttttag tcgattagtt ataggaaatt agtttttttt ttttttttaa 180
gag 183
Claims (148)
1.一种用于表征生物样品的方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平：
(i)ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503；
(ii)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(iv)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
(b)将所述甲基化水平与无淋巴瘤的对照样品中的一组相应基因的甲基化水平进行比较；以及
(c)当在所述一个或多个基因中测量的所述甲基化水平高于在各自对照样品中测量的所述甲基化水平时确定所述个体患有非霍奇金淋巴瘤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物选自表5所示的组。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
7.如权利要求1所述的方法，
其中如果所述生物样品是组织样品(例如，淋巴腺组织样品)，则所述一个或多个基因包括
(i)ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503；或者
(ii)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B，或者
其中如果生物样品是血浆样品，则一个或多个基因包括
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；或者
(iv)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B。
8.一种用于表征生物样品的方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(v)HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1；
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
(b)将所述甲基化水平与无淋巴瘤的对照样品中的一组相应基因的甲基化水平进行比较；以及
(c)当在所述一个或多个基因中测量的所述甲基化水平高于在各自对照样品中测量的所述甲基化水平时确定所述个体患有滤泡性淋巴瘤。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物选自表5所示的组。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
14.如权利要求8所述的方法，
其中如果所述生物样品是组织样品(例如，淋巴腺组织样品)，则所述一个或多个基因包括
(i)ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6；或者
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C，或者
其中如果生物样品是血浆样品，则一个或多个基因包括
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；或者
(v)HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1。
15.一种用于表征生物样品的方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(v)MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1；
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
(b)将所述甲基化水平与无淋巴瘤的对照样品中的一组相应基因的甲基化水平进行比较；以及
(c)当在所述一个或多个基因中测量的所述甲基化水平高于在各自对照样品中测量的所述甲基化水平时确定所述个体患有DLBCL癌症。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物选自表5所示的组。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
21.如权利要求15所述的方法，
其中如果所述生物样品是组织样品(例如，淋巴腺组织样品)，则所述一个或多个基因包括
(i)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503；或者
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503，或者
其中如果生物样品是血浆样品，则一个或多个基因包括
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；或者
(v)MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1。
22.一种用于表征生物样品的方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C；
(ii)BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503；以及
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
(b)将所述甲基化水平与无淋巴瘤的对照样品中的一组相应基因的甲基化水平进行比较；以及
(c)当在所述一个或多个基因中测量的所述甲基化水平高于在各自对照样品中测量的所述甲基化水平时确定所述个体患有套细胞淋巴瘤。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物选自表5所示的组。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
28.如权利要求22所述的方法，
其中如果所述生物样品是组织样品(例如，淋巴腺组织样品)，则所述一个或多个基因包括
(i)CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C；或者
(ii)BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1，或者
其中如果生物样品是血浆样品，则一个或多个基因包括
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503；或者
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C。
29.一种用于表征生物样品的方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5
所述测量在人个体的淋巴腺样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
(b)将所述甲基化水平与无淋巴瘤的对照样品中的一组相应基因的甲基化水平进行比较；以及
(c)当在所述一个或多个基因中测量的所述甲基化水平高于在各自对照样品中测量的所述甲基化水平时确定所述个体患有边缘区淋巴瘤。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物选自表5所示的组。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
35.如权利要求29所述的方法，
其中如果所述生物样品是组织样品(例如，淋巴腺组织样品)，则所述一个或多个基因包括
(i)CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5；或者
(ii)ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1；或者
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5；并且
其中如果生物样品是血浆样品，则一个或多个基因包括
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266；或者
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1；或者
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5。
36.一种用于表征生物样品的方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1；
(ii)GABRG3、ITGA5和JUP；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1；
(iv)BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；
(b)将所述甲基化水平与无淋巴瘤的对照样品中的一组相应基因的甲基化水平进行比较；以及
(c)当在所述一个或多个基因中测量的所述甲基化水平高于在各自对照样品中测量的所述甲基化水平时确定所述个体患有外周T细胞淋巴瘤。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物选自表5所示的组。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
40.如权利要求36所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
41.如权利要求36所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
42.如权利要求36所述的方法，
其中如果所述生物样品是组织样品(例如，淋巴腺组织样品)，则所述一个或多个基因包括
(i)CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1；或者
(ii)GABRG3、ITGA5和JUP，或者
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5；
其中如果生物样品是血浆样品，则一个或多个基因包括
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1；或者
(iv)BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1；或者
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5。
43.一种方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503；
(ii)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(iv)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物在表5中列举。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
47.如权利要求43所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
48.如权利要求43所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
49.一种方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(v)HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1；
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物在表5中列举。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
52.如权利要求49所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
53.如权利要求49所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
54.如权利要求49所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
55.一种方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；以及
(v)MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1；
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物在表5中列举。
57.如权利要求55所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
58.如权利要求55所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
59.如权利要求55所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
60.如权利要求55所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
61.一种方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C；
(ii)BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503；以及
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物在表5中列举。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
64.如权利要求61所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
65.如权利要求61所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
66.如权利要求61所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
67.一种方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物在表5中列举。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
70.如权利要求67所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
71.如权利要求67所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
72.如权利要求67所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
73.一种方法，所述方法包括：
(a)测量选自以下的一个或多个基因的CpG位点的甲基化水平
(i)CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1；
(ii)GABRG3、ITGA5和JUP；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1；
(iv)BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5
所述测量在人个体的生物样品中通过以下进行：
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA；以及
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物在表5中列举。
75.如权利要求73所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)。
76.如权利要求73所述的方法，其中所述一个或多个基因由表1和/或3中所示的基因组坐标描述。
77.如权利要求73所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
78.如权利要求73所述的方法，其中所述测量一个或多个基因的CpG位点的所述甲基化水平包括选自由以下组成的组的确定：确定所述CpG位点的甲基化评分和确定所述CpG位点的甲基化频率。
79.一种在从受试者获得的样品中筛查淋巴瘤的方法，所述方法包括：
1)测定包含具有选自由以下组中的一者组成的组的注释的染色体区域的DNA甲基化标志物的甲基化状态：
(i)ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503；
(ii)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(iv)BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B，以及
2)当所述标志物的所述甲基化状态不同于在未患淋巴瘤的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为患有淋巴瘤。
80.如权利要求79所述的方法，所述方法包括测定多种标志物。
81.如权利要求79所述的方法，其中所述标志物在高CpG密度启动子中。
82.如权利要求79所述的方法，其中所述样品是粪便样品、组织样品、淋巴腺组织样品、血浆样品或尿液样品。
83.如权利要求79所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶标捕获。
84.如权利要求79所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。
85.一种在从受试者获得的样品中筛查滤泡性淋巴瘤的方法，所述方法包括：
1)测定包含具有选自由以下组中的一者组成的组的注释的染色体区域的DNA甲基化标志物的甲基化状态：
(i)ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C；以及
(v)HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1；
2)当所述标志物的所述甲基化状态不同于在未患淋巴瘤的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为患有滤泡性淋巴瘤。
86.如权利要求85所述的方法，所述方法包括测定多种标志物。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述标志物在高CpG密度启动子中。
88.如权利要求85所述的方法，其中所述样品是粪便样品、组织样品、淋巴腺组织样品、血浆样品或尿液样品。
89.如权利要求85所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶标捕获。
90.如权利要求85所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。
91.一种在从受试者获得的样品中筛查DLBCL的方法，所述方法包括：
1)测定包含具有选自由以下组中的一者组成的组的注释的染色体区域的DNA甲基化标志物的甲基化状态：
(i)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503，以及
(v)MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1；
2)当所述标志物的所述甲基化状态不同于在未患淋巴瘤的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为患有DLBCL。
92.如权利要求91所述的方法，所述方法包括测定多种标志物。
93.如权利要求91所述的方法，其中所述标志物在高CpG密度启动子中。
94.如权利要求91所述的方法，其中所述样品是粪便样品、组织样品、淋巴腺组织样品、血浆样品或尿液样品。
95.如权利要求91所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶标捕获。
96.如权利要求91所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。
97.一种在从受试者获得的样品中筛查套细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括：
1)测定包含具有选自由以下组中的一者组成的组的注释的染色体区域的DNA甲基化标志物的甲基化状态：
(i)CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C；
(ii)BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503；以及
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C，以及
2)当所述标志物的所述甲基化状态不同于在未患淋巴瘤的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为患有套细胞淋巴瘤。
98.如权利要求97所述的方法，所述方法包括测定多种标志物。
99.如权利要求97所述的方法，其中所述标志物在高CpG密度启动子中。
100.如权利要求97所述的方法，其中所述样品是粪便样品、组织样品、淋巴腺组织样品、血浆样品或尿液样品。
101.如权利要求97所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶标捕获。
102.如权利要求96所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。
103.一种在从受试者获得的样品中筛查边缘区淋巴瘤的方法，所述方法包括：
1)测定包含具有选自由以下组中的一者组成的组的注释的染色体区域的DNA甲基化标志物的甲基化状态：
(i)CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5；
(ii)ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1；
(iii)BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266；
(iv)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5
2)当所述标志物的所述甲基化状态不同于在未患淋巴瘤的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为患有边缘区淋巴瘤。
104.如权利要求103所述的方法，所述方法包括测定多种标志物。
105.如权利要求103所述的方法，其中所述标志物在高CpG密度启动子中。
106.如权利要求103所述的方法，其中所述样品是粪便样品、组织样品、淋巴腺组织样品、血浆样品或尿液样品。
107.如权利要求103所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶标捕获。
108.如权利要求103所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。
109.一种在从受试者获得的样品中筛查外周T细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括：
1)测定包含具有选自由以下组中的一者组成的组的注释的染色体区域的DNA甲基化标志物的甲基化状态：
(i)CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1；
(ii)GABRG3、ITGA5和JUP；
(iii)ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1；
(iv)BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1；以及
(v)CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5
2)当所述标志物的所述甲基化状态不同于在未患淋巴瘤的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为患有外周T细胞淋巴瘤。
110.如权利要求109所述的方法，所述方法包括测定多种标志物。
111.如权利要求109所述的方法，其中所述标志物在高CpG密度启动子中。
112.如权利要求109所述的方法，其中所述样品是粪便样品、组织样品、淋巴腺组织样品、血浆样品或尿液样品。
113.如权利要求109所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶标捕获。
114.如权利要求109所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。
115.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
1)亚硫酸氢盐试剂；以及
2)对照核酸，其包含来自选自由表1和/或3的DMR 1-285组成的组的DMR的序列并具有与未患淋巴瘤的受试者相关的甲基化状态。
116.一种试剂盒，所述试剂盒包括亚硫酸氢盐试剂和根据SEQ ID NO 1-124的寡核苷酸。
117.一种试剂盒，所述试剂盒包括用于从受试者获得样品的样品收集器；用于从所述样品分离核酸的试剂；亚硫酸氢盐试剂；以及根据SEQ IDNO 1-124的寡核苷酸。
118.根据权利要求117所述的试剂盒，其中所述样品是粪便样品、组织样品、淋巴腺组织样品、血浆样品或尿液样品。
119.一种组合物，所述组合物包含含有DMR的核酸和亚硫酸氢盐试剂。
120.一种组合物，所述组合物包含含有DMR的核酸和根据SEQ ID NO1-124的寡核苷酸。
121.一种组合物，所述组合物包含含有DMR的核酸和甲基化敏感性限制酶。
122.一种组合物，所述组合物包含含有DMR的核酸和聚合酶。
123.一种方法，所述方法包括：
通过以下步骤来测量人个体的生物样品中的一个或多个基因的甲基化水平：
将所述生物样品中的基因组DNA用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂处理；
使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物扩增经处理的基因组DNA；以及
通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离和靶标捕获来确定所述一个或多个基因的甲基化水平；
其中所述一个或多个基因包含具有选自以下组中的一者的注释的染色体区域：
·ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503(参见，表2，实施例I)；
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)；
·BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表4，实施例I)；
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)；
·ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6(参见，表6，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C(参见，表12，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503(参见表6，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表12，实施例I)；
·HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表7，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见表7，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)；
·MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)；
·CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C(参见，表8，实施例I)；
·BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1(参见，表14，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见表8，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C(参见，表14，实施例I)；
·CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5(参见，表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1(参见，表15，实施例I)
·BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266(参见表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1(参见，表15，实施例I)；
·CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1(参见，表10，实施例I)；
·GABRG3、ITGA5和JUP(参见，表16，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1(参见表10，实施例I)；
·CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)；以及
·BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1(参见，表16，实施例I)。
124.如权利要求123所述的方法，其中将所述DNA用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂处理。
125.如权利要求124所述的方法，其中所述试剂包含甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂中的一种或多种。
126.如权利要求125所述的方法，其中将所述DNA用亚硫酸氢盐试剂处理以产生经亚硫酸氢盐处理的DNA。
127.如权利要求125所述的方法，其中所述测量包括多重扩增。
128.如权利要求123所述的方法，其中测量至少一种甲基化标志物基因的量包括使用一种或多种选自由以下组成的组的方法：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化特异性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序、瓣状核酸内切酶测定法、PCR-瓣测定法和亚硫酸氢盐基因组测序PCR。
129.如权利要求123所述的方法，其中所述样品包括血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)中的一者或多者。
130.如权利要求123所述的方法，
其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物在表5中列举。
131.一种表征样品的方法，所述方法包括：
a)测量从所述样品中提取的DNA中至少一个甲基化标志物基因的量，其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
·ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503(参见，表2，实施例I)；
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)；
·BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表4，实施例I)；
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)；
·ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6(参见，表6，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C(参见，表12，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503(参见表6，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表12，实施例I)；
·HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表7，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见表7，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)；
·MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)；
·CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)；
·CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C(参见，表8，实施例I)；
·BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1(参见，表14，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见表8，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C(参见，表14，实施例I)；
·CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5(参见，表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1(参见，表15，实施例I)
·BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266(参见表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1(参见，表15，实施例I)；
·CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1(参见，表10，实施例I)；
·GABRG3、ITGA5和JUP(参见，表16，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1(参见表10，实施例I)；以及
·BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1(参见，表16，实施例I)；
b)测量所述DNA中的至少一种参考标志物的量；以及
c)将在所述DNA中测量的所述至少一种甲基化标志物基因的所述量的值计算为在所述DNA中测量的所述参考标志物基因的所述量的百分比，其中所述值指示在所述样品中测量的至少一种甲基化标志物DNA的量。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述至少一个参考标志物包括一个或多个选自B3GALT6 DNA、ZDHHC1 DNA、β-肌动蛋白DNA和非癌性DNA的参考标志物。
133.如权利要求131所述的方法，其中所述样品包括血浆样品、血液样品或组织样品(例如，淋巴腺组织)中的一者或多者。
134.如权利要求131所述的方法，其中所述一个或多个基因包含选自由表1和3的DMR1-285组成的组的差异甲基化区域(DMR)中的碱基。
135.如权利要求131所述的方法，其中将所述DNA用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂处理。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述试剂包含甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂中的一种或多种。
137.如权利要求136所述的方法，其中将所述DNA用亚硫酸氢盐试剂处理以产生经亚硫酸氢盐处理的DNA。
138.如权利要求135所述的方法，其中使用一组针对所选择的一个或多个基因的引物来扩增经修饰的DNA。
139.如权利要求138所述的方法，
其中所述一组针对所选择的一个或多个基因的引物在表5中列举。
140.如权利要求131所述的方法，其中测量甲基化标志物基因的量包括使用聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离和靶标捕获中的一种或多种。
141.如权利要求140所述的方法，其中所述测量包括多重扩增。
142.如权利要求140所述的方法，其中测量至少一个甲基化标志物基因的量包括使用一种或多种选自由以下组成的组的方法：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化特异性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序、瓣状核酸内切酶测定法、PCR-瓣测定法和亚硫酸氢盐基因组测序PCR。
143.一种用于表征生物样品的方法，所述方法包括：
测量从所述生物样品中提取的DNA中至少一个甲基化标志物基因的量，其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
·ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503(参见，表2，实施例I)；
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)；
·BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表4，实施例I)；
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)；
·ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6(参见，表6，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C(参见，表12，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503(参见表6，实施例I)；
·CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表12，实施例I)；
·HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表7，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见表7，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)；
·MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)；
·CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C(参见，表8，实施例I)；
·BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1(参见，表14，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见表8，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C(参见，表14，实施例I)；
·CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5(参见，表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1(参见，表15，实施例I)
·BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266(参见表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1(参见，表15，实施例I)；
·CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1(参见，表10，实施例I)；
·GABRG3、ITGA5和JUP(参见，表16，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1(参见表10，实施例I)；以及
·BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1(参见，表16，实施例I)；
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用对每个标志物基因的CpG位点具有特异性的引物来扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，其中对每个标志物基因具有特异性的引物能够结合由表5中列举的所述标志物基因的引物序列结合的扩增子，其中由表5中列举的所述标志物基因的所述引物序列结合的所述扩增子是表1和/或3中列举的所述标志物基因的遗传区域的至少一部分；
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR来确定针对一个或多个基因的所述CpG位点的所述甲基化水平。
144.如权利要求143所述的方法，其中所述生物样品是血液样品或组织样品。
145.如权利要求144所述的方法，其中所述组织是淋巴腺组织。
146.如权利要求143所述的方法，其中所述CpG位点存在于编码区或调控区中。
147.一种用于测量从所述生物样品中提取的DNA中至少一个甲基化标志物基因中的一个或多个CpG位点的甲基化水平的方法，其中所述一个或多个基因选自以下组中的一者：
·ADRA1D、DNAH14_A、FAM110B、FAM221A、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644047-184644181、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805123-19805338、MNX1、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、VWA5B1和ZNF503(参见，表2，实施例I)；
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)；
·BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FOXP4、ITGA5、JUP、MAX.chr1.61508719-61508998、MAX.chr3.44038141-44038266、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表4，实施例I)；
·BNC1_B、ADRA1D、HOXA9、GABRG3、MAX.chr17:79367190-79367336、FAM110B、TPBG_C、SYT6、MAX.chr6.19805123-19805338和CACNG8_B(参见，表11，实施例I)；
·ADRA1D、CACNG_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4和SYT6(参见，表6，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6和TPBG_C(参见，表12，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、HOXA9、ITGA5、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、TPBG_C、VWA5B1和ZNF503(参见表6，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CDK20_A、DNAH14_A、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1和TPBG_C(参见，表12，实施例I)；
·HOXA9、CDK20_B、BNC1_B、DNAH14_B、NRN1_B、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)；
·CACNG8_B、ADRA1D、TGFB1I1、FAM110B_A、GABRG3、VWA5B1和ITGA5(参见，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表7，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、EBF3_B、FAM110B、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、DNAH14_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、GATA6、HOXA9、ITGA5、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见表7，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、EBF3_B、FAM110B、FLRT2、GABRG3、GATA6、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr5:74349626-74349841、MAX.chr6.19805195-19805266、NRN1_A、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1、THBS1、TPBG_C和ZNF503(参见，表13，实施例I)；
·MAX.chr5:74349626-74349841、HOXA9、BNC1_B、NRN1_B、TPBG_D、SYT2和CALN1(参见，表18，实施例I)；
·CACNG8_B、FAM110B、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr4.184644069-184644158和TPBG_C(参见，表8，实施例I)；
·BNC1_B、FAM110B、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158和MNX1(参见，表14，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FAM110B、GABRG3、HOXA9、MAX.chr1:61508832-61508969、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MAX.chr6.19805195-19805266、MNX1、NRN1_A、SYT6、TPBG_C和ZNF503(参见表8，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、FOXP4、HOXA9、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr4.184644069-184644158、MNX1、NRN1_A和TPBG_C(参见，表14，实施例I)；
·CACNG8_B、FAM110B、GABRG3和ITGA5(参见，表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和THBS1(参见，表15，实施例I)
·BNC1_B、CACNG8_B、FAM110B、GABRG3、HOXA9、ITGA5和MAX.chr6.19805195-19805266(参见表9，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、CDK20_A、FOXP4、GABRG3、HOXA9、MAX.chr5:74349626-74349841、NRN1_A、SH3BP4和THBS1(参见，表15，实施例I)；
·CACNG8_B、FOXP4、GABRG3、ITGA5、TGFB1I1和VWA5B1(参见，表10，实施例I)；
·GABRG3、ITGA5和JUP(参见，表16，实施例I)；
·ADRA1D、BNC1_B、CACNG8_B、FLRT2、FOXP4、GABRG3、HOXA9、ITGA5、JUP、MAX.chr17:79367190-79367336、MAX.chr6.19805195-19805266、SH3BP4、SYT6、TGFB1I1和VWA5B1(参见表10，实施例I)；以及
·BNC1_B、FOXP4、ITGA5、SH3BP4、SYT6和TGFB1I1(参见，表16，实施例I)；
所述方法包括；
a)从怀疑患有或患有肿瘤的人个体的生物样品中提取基因组DNA，其中所述肿瘤是NHL或亚型或NHL；
b)用亚硫酸氢盐来处理所述提取的基因组DNA，
c)用对所述一个或多个基因具有特异性的引物来扩增经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，其中对所述一个或多个基因具有特异性的所述引物能够结合表1和/或3中列举的所述标志物的染色体区域的所述经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的至少一部分；以及
d)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析或亚硫酸氢盐基因组测序PCR来测量一个或多个CpG位点的甲基化水平。
148.一种用于表征生物样品的方法，所述方法包括：
通过以下步骤来测量人个体的生物样品中的表1和/或3中所示的标志物中的一种或多种的CpG位点的甲基化水平
将所述生物样品中的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理；
使用对表1和/或3中所示的所述一种或多种标志物具有特异性的引物来扩增所述经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，其中对表1和/或3中所示的所述标志物中的每一种具有特异性的所述引物能够结合由表5中所示的各自引物对序列结合的扩增子，其中由表5中所示的各自引物对序列结合的所述扩增子是包含表1和/或3中所示的各自染色体坐标的遗传区域的至少一部分；
通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR来确定表1和/或3中所示的所述标志物的所述CpG位点的甲基化水平。
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