JPH07112438B2 - 生育の改善されたアミノ酸生産菌を用いた発酵法によるアミノ酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロトプラスト融合法により生育速度及び発酵
速度の改善されたアミノ酸生産菌を培養することを特徴
とする発酵法によるアミノ酸の製造方法に関する。

アミノ酸発酵にはグルタミン酸発酵のように発酵時間の
短いものもあるが、大部分のアミノ酸発酵では長時間の
発酵を必要とし、通常３〜４日間を要している。従来、
高生産性のアミノ酸生産菌の育種は人工変異を繰り返し
て行い夫々のアミノ酸発酵に有用な性質を付与すること
によって行われるが、一般にアミノ酸の生産性が高くな
るにつれて、即ち、人工変異の頻度が多くなるに従って
変異株の生育速度が低下し発酵が遅くなることが大きな
欠点であった。

本発明者等は高生産性でかつ生育速度の速い実用的な変
異株を育種することを目的として種々研究を重ねた結果
ブレビバクテリウム、又はコリネバクテリウム属に属す
る生育の遅いアミノ酸生産菌のプロトプラストと生育の
速い微生物のプロトプラストを細胞融合せしめることに
より、アミノ酸生産性が高く、かつ生育の早い変異株が
育種できることを発見した。本発明はこの発見に基いて
完成されたものである。

生育を改善すべき微生物としては次のようなブレビバク
テリウム、又はコリネバクテリウム属のアミノ酸生産菌
が挙げられる。

ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ11082 （FERM-P3840）（AEC^r.,CCL^r,Ala^-） （リジン生産菌） ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM−P4948） （2TA^r,SG^r,His^-，アルギニノール^r） （Ｌ−アルギニン生産菌） ブレビバクテリウム・フラバムAJ11055（FERM−P3673） （α−AHV^r,2TA^r，βHL^r） （Ｌ−イソロイシン生産菌） ブレビバクテリウム・フラバムB1−１（FERM−P213） （α−AHV^r,lle^-） （Ｌ−スレオニン生産菌） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラムAJ11342 （FERM−P4945）（SD^r,DS^r） （Ｌ−アルギニン生産菌） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラムAJ3390 （FERM−P1569）（2TA^r,Lys^-） （Ｌ−ヒステジン生産菌） 尚、括弧内の符号は以下に示す性質の略号である。

AEC^r:S−（２−アミノエチル）−システイン耐性 CCL^r：α−クロロカプロラクタム耐性 Ala^- :L−アラニン要求性 2TA:2−チアゾールアラニン耐性 SG^r :スルファグアニジン耐性 α−AHV^r：α−アミノ−β−ヒドロキシ−吉草酸耐性 β−HL^r :β−ハイドロキシロイシン耐性 lle^-:L−イソロイシン要求性 SD^r :スルファダイアジン耐性 DS^r :ジアミノサクシネート耐性 上記アミノ酸生産菌はアミノ酸発酵工業で使用されてい
る実用的な高生産性の変異株であるが、いずれも生育速
度が遅く、ほとんどのアミノ酸発酵が72時間以上を必要
としている。

例えば上記変異株の生育速度を特定培地に於るグルコー
ス消費速度で表わすと第１表に示す如くであり、グルコ
ース消費速度はいずれも0.35g/dl以下であり、グルタミ
ン酸生産菌が0.48であるのと比較すると著しく低いこと
がわかる。

第１表に示すグルコース消費速度は以下の方法に従って
測定した値である。

第２表に示す特定の培地300mlを1.0l容の小型ジャーフ
ァーメンターに張り込み、110℃で10分間滅菌した。こ
の培地に夫々の種培養液を30ml接種し、31.5℃で通気攪
拌培養（1/2V.V.M.,攪拌数1000rpm）し、培養液中のグ
ルコース濃度を経時的に測定して単位時間当りのグルコ
ース消費速度を求めた。

尚、一般に、微生物の生育速度は特定培地で培養した場
合の単位時間当りの微生物菌体の増加量で示されるが、
発酵速度の改良を目的とする本発明では、発酵速度とよ
り密接な関係にある糖消費速度で示す。

一方、生育の速い微生物としてはブレビバクテリウム、
又はコリネバクテリウム属に属し、そのグルコース消費
速度が第１表の特定培地で0.4g/dl以上のものであれば
どんな菌株であっても使用できるが、特に次に示すよう
なコリネフオームのＬ−グルタミン酸生産菌が望まし
い。

ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムATCC 13869 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・デバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリテイカム ATCC 14066 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムATCC 13870 上記の野性株の他に薬剤耐性、栄養要求性等を有する微
生物であっても生育の速いものであれば使用できる。又
融合株を選択する場合には目印（選択マーカー）が付与
されていた方が効果的である。このような例としては次
のようなものが有る。

ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ11638 FERM−BP74（デコイニン耐性） （グルタミン酸生産菌） これら細菌の栄養細胞からフロトプラストの形成は公知
（Agr,Biol hem.,43（５）、1007〜1013,1979）の方法
に順じて行われる。生育の遅いアミノ酸生産菌と生育の
早い微生物を完全栄養培地で培養し、リゾチームに感受
性の細胞とするため、対数増殖期にペニシリン等細胞壁
合成阻害剤を添加し、再に30〜90分間培養する。

夫々の培養液から菌体を分離し、高張液で洗滌後、同高
張液に懸濁し、これにリゾチームを２〜5mg/ml添加して
30〜37℃で15分から21時間リゾチームを作用せしめてプ
ロトプラスト化を行う。プロトプラスト化の確認は顕微
鏡で観察して行う。

上記高張液としては公知のものを使用すれば良く、例え
ば、0.25Mシュークロース、0.25Mコハク酸２ナトリウ
ム、100mM塩化カルシウム、20mMリン酸１カリウム、100
mMリン酸２カリウム及び5mM EDTAからなるHP液等が使用
される。

プロトプラストの融合方法は公知の方法（Agr.Biol.Che
m.,43（５）、1007〜1013,1979）の方法に従って行えば
良いが、融合頻度が低い場合には高張液としてカルシウ
ムイオンを10〜200mM含むものを使用し、更にそのpHを
8.0〜12.0に調節した高張液を用いることにより高頻度
で融合させることができる。

融合株の選択は親株であるアミノ酸生産菌の有している
薬剤耐性、栄養要求性等を選択マーカーとして利用し、
かつプレート上で生育の良好なるコロニーを採取するこ
とにより行なわれる。

このようにして育種されたアミノ酸生産性が高く、かつ
生育速度の早い融合株として次のものが挙げられる。

ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ11794 FERM−P6417（AEC^r,CCL^r,Ala^-,Dec^r） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムAJ11793 FERM−P6416（SD^r,DS^r） 融合株であるAJ11794及びAJ11793の単位時間当りのグル
コース消費速度は0.41及び0.42g/dlであり、親株のアミ
ノ酸生産菌が夫々0.18g/dlであるのと比較すると著しく
改善されている。

得られたアミノ酸生産菌は、通常の方法で培養さる。即
ち、培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、栄養要求性
を満足せしめるべき栄養素更に必要によりビタミン、ア
ミノ酸等の有機微量栄養素を含有する通常のものが使用
できる。炭素源としては、グルコーズ、シュクロース、
フラクトース等の糖類及びこれらを含有する澱粉分解
物、転化糖、モラセス、果汁等が使用できる。窒素源と
しては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩等が好ましい。無機イオンとしては、燐酸イオン、カ
リイオン、ナトリウムイオン、鉄イオン、マグネシウム
イオン等が、必要により適宜培地に添加される。

糖消費速度の比較は、培養pH7.0、培養温度31.5℃で通
常行なわれる。

上記培地を使用して通常の培養条件下で培養すると良好
に生育し培養液中にアミノ酸が著量著積され、培養時間
は親株の約1/2以下に短縮することができる。

以下、実施例にて詳細に説明する。

実施例１ ペプトン1.0g/dl、酵母エキス1.0g/dl、塩化ナトリウム
0.5g/dl、シュークロース0.5g/dlを含むpH7.0のCM培地
を大型試験管に10ml宛分注し、110℃で10分間加熱し
た。この培地に、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメ
ンタムAJ11082（AEC^r,CCL^r,Ala^-のリジン生産菌）及びA
J11638（デコイニン耐性のグルタミン酸生産菌）を接種
し、31.5℃で振盪培養を行った。対数増殖中期（10⁸個/
ml）にペニシリンＧを添加（３単位/10ml）し、更に90
分間培養を続け、遠心分離して培養液から細胞を回収し
た。夫々の細胞をpH7.0のHP高張希釈液で洗滌後、これ
を5000μg/mlのリゾチーム、0.41Mシュークロース、及
び0.01M硫酸マグネシウムを含む第３表の最少培地に懸
濁し、31.5℃に静置した。プロトプラスト化は21時間で
完了した。プロトプラスト化後、プロトプラストを集
め、AJ11082のプロトプラストとAJ11638のプロトプラス
トを等量宛0.5mlのHP液に懸濁し、これに33％のポリエ
チレングリコール6000溶液を5.0ml添加し、36℃に30分
間放置してプロトプラストの融合を行った。

融合反応液を遠心分離して融合プロトプラストを集め、
pH10.5のHP液に懸濁し、これを、デコイニン1000μg/m
l、AEC3000μg/ml及びコハク酸２ナトリウムを含んだ第
３表の高張最少寒天プレート培地に接種し、その上面を
同寒天培地（寒天0.8％）の薄層状に覆い31.5℃で10日
間培養し寒天プレート上に出現したコロニーを薬剤耐性
組み換え株（AEC^r,Dec^r）として分離した。組み換え株
の出現頻度は10^-4〜10^-6であった。分離した組み換え株
の内から最も生育の早い株AJ11794を選択した。

0.5mg/dlのニコチン酸アミドを含む第２表の液体培地30
0mlを1.0l容ジャーファーメンターに張り込み、110℃で
10分間加熱滅菌した後、これにAJ11794の種培養液15ml
を接種し31.5℃で通気攪拌培養（通気量1/2VVM、攪拌数
1000rpm）を行い、Ｌ−リジンの生産量、及びグルコー
スの消費速度を測定した。その結果を第４表に示す。

第４表に示すように融合株AJ11794のグルコース消費速
度は0.41g/dl/hrであり、親株に比べて2.3倍であり生育
が著しく改善されており、親株に比べて発酵時間は1/2
以下に短縮されている。

次に融合株AJ11794のAEC及びデコイニンに対する耐性度
を調べた。第５表及び第６表に示す濃度のＳ−（２−ア
ミノエチル）−システィン又はデコイニンを含む最少培
地に融合株AJ11794株を接種し、31.5度で24時間振盪培
養（4ml/大型試験管）し、培養液の562nmに於る吸光度
を測定して生育度を求めた。親株AJ11082及びAJ11638を
対照として求めた相対生育度を夫々第５表及び第６表に
示す。

第５表及び第６表に示すように融合株AJ11794は両親株
の薬剤耐性を有しており、CM培地で10代培養しても耐性
及びグルコース消費速度は安定に保持されることが確認
された。

実施例２ 実施例１と同様の方法で、コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラムAJ11342（SD^r,DS^rのＬ−アルギニン生産
菌）及びコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032
（Ｌ−グルタミン生産菌）をプロトプラスト化し、次い
でプロトプラスト融合を行った。

融合したプロトプラストを、グルコース2.0g/dl、尿素
0.3g/dl、硫酸アンモニウム1.0g/dl、KH₂PO₄0.1g/dl、M
gSO₄・7H₂O0.04g/dl、Feイオン2ppm、Mnイオン2ppm、ビ
オチン100μg/l、サイアミン・塩酸塩200μg/l、ジアミ
ノサクシネート100mg/dl、コハク酸２ナトリウム13.5g/
l及び寒天2.0g/dlを含むpH7.0の高張寒天プレートに接
種し31.5℃で培養した。次いでプレート上に生育したコ
ロニーの内最も生育の早い融合株AJ11793株を選んだ。

AJ11793を50μg/dlのビオチンを含む第２表の培地で実
施例１と同様の方法で通気攪拌培養を行い、Ｌ−アルギ
ニンの蓄積量及びグルコースの消費速度を調べた、その
結果を第７表に示す。

第７表に示すようにAJ11793はグルコース消費速度は約
2.3倍に改善され、この性質は10代培養を継続しても安
定に保持された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） 審判番号 平5−20707 (56)参考文献 特開 昭56−109587（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリ
   ウム属に属し、1.0l中にグルコース130g、KH₂PO₄1.0g、
   MgSO₄・7H₂O0.4g、FeSO₄・7H₂O0.001g、MnSO₄・4H₂O0.001
   g、硫酸アンモニウム25g、ビオチン0.5mg、サイアミン
   塩酸塩0.2mg及び総窒素濃度7.0g/dlの大豆蛋白質塩酸分
   解液15.0mlを含むpH7.0の特定培地で31.5℃にて通気攪
   拌培養した場合に於る単位時間当りのグルコース消費速
   度が0.4g/dl未満の生育の遅いアミノ酸生産菌のプロト
   プラストと、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリ
   ウム属に属し、該特定培地でのグルコース消費速度が0.
   4g/dlを越える生育の速い微生物のプロトプラストとを
   細胞融合せしめることにより作成した、該特定培地に於
   るグルコース消費速度が0.4g/dl以上のアミノ酸生産性
   融合株を培養することを特徴とする、発酵法によるアミ
   ノ酸の製造方法。