JP3016883B2 - 発酵法による５’−キサンチル酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、発酵法による５’−キ
サンチル酸の製造法に関する。５’−キサンチル酸は、
呈味物質として有用である。

【０００２】

【従来の技術】従来、５’−キサンチル酸を発酵生産す
る方法としては、コリネバクテリウム属に属する微生物
をデコイニンを含む培地で培養する方法（特公昭４０−
１１５７８４）、アデニン要求性もしくは、グアニン要
求性を有するコリネバクテリウム属に属する変異株を用
いる方法（特公昭４３−２０９３２）などが知られてい
る。

【０００３】また、コリネバクテリウム属に属し細胞壁
合成阻害抗生物質に耐性を有する微生物を用いる方法が
知られている（特公昭６０−１０７９１６）。なお、本
明細書中では、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
と命名されている菌株をコリネバクテリウム・アンモニ
アゲネスに変更して記載する。本菌株属名の変更はイン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック
・バクテリオロジー（International Journal of Syste
matic Bacteriology,442−443,10月, 1987年）に基づく
ものとする。

【０００４】

【問題を解決するための手段】本発明によれば、コリネ
バクテリウム属に属し、脂肪族アミノ酸アナログに耐性
を有し、かつ５’−キサンチル酸生産能を有する微生物
を培地に培養し、培養物中に５’−キサンチル酸を生成
蓄積させ、該培養物より５’−キサンチル酸を採取する
ことを特徴とする発酵法による５’−キサンチル酸の製
造法を提供することができる。

【０００５】以下に本発明を詳細に説明する。用いられ
る微生物としては、コリネバクテリウム属に属し、脂肪
族アミノ酸アナログに耐性を有し、かつ５’−キサンチ
ル酸生産能を有するものであればいずれでもよい。脂肪
族アミノ酸アナログに耐性を有する微生物とは、親株が
生育阻害を示す濃度の脂肪族アミノ酸アナログを含む培
地でも生育することのできる変異株のことをいう。

【０００６】本発明において脂肪族アミノ酸アナログと
は最少培地寒天平板中に該アナログを添加し、コリネバ
クテリウム属に属する５’−キサンチル酸生産菌を培養
したとき、該生産菌の生育を阻害するが、この阻害が脂
肪族アミノ酸たとえばバリン、イソロイシン、ロイシン
などが存在することにより解除されるような化合物をい
う。脂肪属アミノ酸アナログとしては例えば、バリンハ
イドロキサメート、Ｎ−メチル−ＤＬ−バリン、ＤＬ−
４−チアイソロイシン、イソロイシンハイドロキサメー
ト、ロイシンメチルエステル、ロイシンハイドロキサメ
ートなどがあげられる。培地に添加される脂肪族アミノ
酸アナログの量は、１−５g ／l が適当である。

【０００７】上記したような変異株は、コリネバクテリ
ウム属に属する５’−キサンチル酸生産菌に脂肪族アミ
ノ酸アナログ耐性を付与したり、コリネバクテリウム属
に属し脂肪族アミノ酸アナログ耐性を有している菌株に
５’−キサンチル酸生産能を付与したりすることにより
得ることができる。本発明の変異株は、コリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniage
nes) ATCC21075を親株として、これにＮ−メチル−Ｎ’
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理、紫外線照射、
Ｘ線照射など通常の変異処理を施すことにより得られ
る。

【０００８】以下に本発明で用いられる変異株の具体的
取得方法を示す。親株として ATCC21075株を用い、該菌
株 10⁸個／mlをＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン 130mg／ｌで30℃、30分処理した後、親株
が生育阻害を示す濃度（３g／l ）のバリンハイドロキ
サメートを含む最少培地寒天平板（グルコース２０g ／
l,塩化アンモニウム３g ／l,KH₂PO₄ 0.1ｇ／ｌ，Ｋ₂ Ｈ
ＰＯ₄ 0.3 ｇ／ｌ，ＭｇＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ 0.3ｇ／ｌ，
尿素２ｇ／ｌ，ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ 10mg ／ｌ，Ｍｎ
ＳＯ₄ ・４−６Ｈ₂ Ｏ４mg／ｌ，ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ ₂ Ｏ
1mg／ｌ，ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ 0.2mg／ｌ, ＣａＣｌ
₂ ・２Ｈ₂ Ｏ 10mg ／ｌ，Ｌ−システイン40mg／ｌ，サ
イアミン塩酸塩10mg／ｌ，パントテン酸カルシウム20mg
／ｌ，ビオチン 60 μｇ／ｌ，アデニン 20mg ／ｌ，グ
アニン20mg／ｌ，寒天 20 ｇ／ｌ，pH7.2)上に塗布す
る。３０℃で７〜１０日間培養後、生育してくるコロニ
ーのうち、親株より５’−キサンチル酸の生産能が優れ
ている菌株を選んだ。そのうちとくに優れている一株を
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＨ−８０７７
（以下、Ｈ−８０７７株という。）と命名した。

【０００９】また、バリンハイドロキサメートの代わり
にイソロイシンハイドロキサメートを用いる以外は上記
と同様の方法をおこなって、得られた菌株のうち、とく
に５’−キサンチル酸生産性の優れた一株をコリネバク
テリウム・アンモニアゲネスＨ−８０７８（以下、Ｈ−
８０７８株という。）と命名した。また、バリンハイド
ロキサメートの代わりにロイシンハイドロキサメートを
用いる以外は上記と同様の方法をおこなって、得られた
菌株のうち、とくに生産性の優れた一株をコリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスＨ−８０７９（以下、Ｈ−８
０７９株という。）と命名した。

【００１０】Ｈ−８０７７株、Ｈ−８０７８株およびＨ
−８０７９株は、ブダペスト条約に基づいて、平成３年
２月１６日付で工業技術院微生物工業技術研究所にそれ
ぞれ微工研条寄第3282号（ＦＥＲＭ ＢＰ−3282）、第
3283号（ＦＥＲＭ ＢＰ−3283）および第3284号（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−3284）として寄託されている。ＡＴＣＣ２
１０７５株、Ｈ−８０７７株、Ｈ−８０７８株およびＨ
−８０７９株を、それぞれ第１表記載の濃度で脂肪族ア
ミノ酸アナログを含む最少培地寒天平板上で３０℃５日
間培養したときの生育度を第１表に示す。

【００１１】

【表１】

【００１２】本発明で用いられる微生物の培養に際して
は、一般に核酸の発酵生産に用いられる培地が使用され
る。微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類、生
育因子などを含有する培地であれば、合成培地、天然培
地などいかなる培地でも使用できる。炭素源としては、
グルコース、フラクトース、シュクロースあるいは、糖
蜜、澱粉などの加水分解物のほか、酢酸、フマール酸、
クエン酸などの各種有機酸、エタノール、グリセロール
などのアルコール類などが使用できる。

【００１３】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸ア
ンモニウムなどの各種無機酸のアンモニウム塩、フマー
ル酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、エチ
ルアミンなどのアミン類、尿素などの含窒素化合物、な
らびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・ステ
ィープ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕またはそ
の加水分解物、アミノ酸発酵、核酸発酵などの各種発酵
菌体およびその消化物などが用いられる。

【００１４】無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸
第二カリウム、燐酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫
酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなど
が用いられる。そのほか、必要に応じてビオチン、サイ
アミン、ニコチン酸、β−アラニンなどのビタミン類や
グルタミン酸などのアミノ酸類を添加することもでき
る。

【００１５】培養は、振とう、深部攪拌などの好気的条
件下、温度２０−４０℃好ましくは２５−３８℃で、ｐ
Ｈ５−９、好ましくは中性付近に保持しておこなわれ、
通常２−７日間で完了する。培地のｐＨは炭酸カルシウ
ム、無機または有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、
ｐＨ緩衝液などによって調整される。培養終了後、培養
液から菌体などの沈澱物を除去し、イオン交換処理、吸
着法、抽出法、沈澱法などを併用することにより、培養
液から５’−キサンチル酸を採取することができる。

【００１６】以下に本発明の実施例を示す。

【００１７】

【実施例】

【００１８】実施例１ ＡＴＣＣ２１０７５株、Ｈ−８０７７株、Ｈ−８０７８
株およびＨ−８０７９株を種菌として用いた。第２表に
示す組成からなる培地１０mlを大型試験管に分注し、１
２０℃で２０分間加熱滅菌した。

【００１９】

【表２】

【００２０】この培地に、上記種菌をブイヨンスラント
上で３０℃、２４時間培養して得られた菌体を１白金耳
接種し、３０℃で４日間培養した。培養中ｐＨが 6.0−
7.0 になったとき、尿素３ｇ／ｌを添加した。培養中蓄
積された５’−キサンチル酸を第３表に示す。

【００２１】

【表３】

【００２２】実施例２ 種菌として第３表に示す菌株を用いる。第２表の液体培
地（但しグルコース１８ｇ／ｌ）７５０mlを２リットル
容ジャーファメンターに張り込み、１２０℃、１０分間
加熱滅菌した。これに実施例１と同様の方法で調製した
種菌体（それぞれスラント６本の菌体）を接種し、３０
℃で７２時間、通気１リットル／min 、攪拌８００rpm
で培養した。尚、培養期間中の培養液のｐＨはアンモニ
ア水を用いて 6.5−7.5 に維持した。その結果、ＡＴＣ
Ｃ２１０７５株、Ｈ−８０７７株、Ｈ−８０７８株およ
びＨ−８０７９株の培養液中の５’−キサンチル酸生成
量はそれぞれ３０ｇ／ｌ、３８ｇ／ｌ，４０ｇ／ｌおよ
び３６ｇ／ｌであった。

【００２３】このＨ−８０７８株の培養終了液より菌体
を除去して得られた濾液５００mlを１ＮＨＣｌでｐＨ
0.8として強酸性カチオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ＃
１（Ｈ型）に通した後、水でレジンを洗浄した。この流
出液および水洗による最初の流出液を合わせて、飽和水
酸化バリウム液でｐＨ7.2に調節した後、３０℃で減圧
濃縮した。濃縮液１００mlにエタノール２００mlを滴下
して０℃一昼夜放置し、、５’−キサンチル酸バリウム
塩の結晶を得た。これを濾別採取後常法によりキサンチ
ル酸ナトリウム塩にかえ５’−キサンチル酸・２ナトリ
ウム塩の７水塩の結晶１５ｇが得られた。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、５’−キサンチル酸を
工業的に安価に効率よく製造することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 19/00 - 19/64 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネバクテリウム属に属し、脂肪族ア
   ミノ酸アナログに耐性を有し、かつ５’−キサンチル酸
   生産能を有する微生物を培地に培養し、培養液中に５’
   −キサンチル酸を生成蓄積させ、該培養物より５’−キ
   サンチル酸を採取することを特徴とする発酵法による
   ５’−キサンチル酸の製造法。