KR100588578B1

KR100588578B1 - 5'-크산틸산 생성 미생물 및 이를 사용한 5'-크산틸산의생산 방법

Info

Publication number: KR100588578B1
Application number: KR1020040100026A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 김형석; 이진남; 오기훈; 김정환; 오윤석; 심재익; 최경오
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2004-12-01
Filing date: 2004-12-01
Publication date: 2006-06-14
Anticipated expiration: 2024-12-01
Also published as: KR20060061135A; TW200634150A; TWI298743B; WO2006059877A1

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJXFT0301(KCCM-10530)의 변이주로서, 직접 발효법에 의해 5’-크산틸산을 고농도 및 고수율로 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul 0401(KCCM-10609), 및 이러한 미생물을 이용하여 고농도 및 고수율로 배양액중에 5’-크산틸산을 직접 축적시켜 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 미생물은 CJXFT0301(KCCM-10530) 균주의 특성인 아데닌요구성, 구아닌요구성, 라이소자임감수성, 프롤린유사체내성, 글루타민유사체내성, 트립토판유사체내성 뿐만 아니라, 테트라히드로 폴산 (tetrahydrofolic acid)의 전구체인 디히드로프테로산 (dihydropteroate)의 합성을 증가 시키기 위해 술파디아진(Sulfadiazine) 내성을 부여함으로써 테트라히드로폴산의 양이 증가하여 동일한 발효 시간 내에 크산틸산을 고수율, 고농도로 배양액 중에 직접 축적시킨다.

코리네박테리움 암모니아게네스, 크산틸산, 술파디아진 내성

Description

5'-크산틸산 생성 미생물 및 이를 사용한 5'-크산틸산의 생산 방법{Microorganism producing 5'-xanthylic acid and production method of 5'-xanthylic acid using the same}

본 발명은 5'-크산틸산(5'-xanthylic acid)을 생산하는 미생물 및 이를 사용한 5'-크산틸산의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 설명하면, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJXFT0301(KCCM-10530)의 변이주로서, 디히드로프테로산의 합성을 증가시키기 위해 술파디아진(sulfadiazine) 내성을 부여하여 테트라히드로폴산의 양을 증가시킴으로써 동일한 발효 시간 내에 CJXFT0301(KCCM-10530) 균주 보다 직접 발효법에 의해 보다 더 고농도 및 고수율로 5'-크산틸산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul 0401(KCCM-10609) 및 이를 이용하여 5'-크산틸산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

5'-크산틸산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적 으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 용도로 다방면에서 이용되고 있으며, 특히, 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승 효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는, 핵산계 조미료 중의 하나이다.

5’-크산틸산은 퓨린 뉴클레오타이드(purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간 생성물로 5’-구아닐산 (5'-guanylic acid)의 제조원료로서 중요한 물질이다. 정미성이 강하고 상품적 가치가 높은 5’-구아닐산의 제조방법으로서 현재 널리 이용되고 있는 방법은 미생물 발효법으로서, 5’-크산틸산을 생산하고 이를 효소학적으로 5’-구아닐산으로 전환시키는 과정이 가장 경제적이어서 5’-구아닐산의 수요만큼 5’-크산틸산도 필요하다.

종래 5’-크산틸산의 제조 방법에는 화학 합성법, 또는 효모 중의 리보핵산을 분해하여 제조된 5’-구아닐산을 탈아미노화하는 제조법, 발효법으로는 발효 배지내 전구물질로 크산틴(xanthine)을 첨가하는 방법과 미생물 변이주에 의한 제조법, 항생물질 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-1477, 소44-20390) 및 계면활성제 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-3825, 소42-3838) 등이 알려져 있다.

상기한 바와 같이, 5'-크산틸산을 생산하는 방법들이 공지되어 있으며, 가장 중요한 사항은 경제적으로 고농도 및 고수율의 5'-크산틸산을 생산하는데 있다. 이 중에서도 미생물 변이주에 의한 5’-크산틸산의 직접적인 발효 제조 방법이 공업적으로 유리하므로 본 발명자들은 기존의 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301(KCCM-10530)가 소유하고 있는 형질을 개량하여 5'-크산틸산이 최대로 생산될 수 있는 형질을 부여함으로써 5'-크산틸산의 생산성이 월등히 증가한 변이주 를 개발하고자 하였다. 그 결과, 공지의 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301(KCCM-10530)로부터 술파디아진 내성이 부여된 신규한 변이 균주가 동일한 시간 내에 직접 발효법으로 고농도, 고수율의 5'-크산틸산을 생산한다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다

따라서, 본 발명의 목적은 직접 발효법에 의해 5'-크산틸산을 고농도 및 고수율로 생산하는 술파디아진에 대해 내성을 갖는 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 5'-크산틸산을 고농도 및 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 술파디아진 내성을 내성을 갖고 5'-크산틸산을 고수율 및 고농도로 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul 0401(KCCM-10609)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul 0401(KCCM-10609)를 배양하고, 그 배양물 중에 고농도 및 고수율로 5'-크산틸산을 직접 축적시켜 5'-산틸산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul 0401(KCCM-10609) 은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301(KCCM-10530) 의 변이주이다. 본 발명에서 친주(parent strain)로 사용된 코리네박테리움 암모니아게네스

CJXFT0301(KCCM-10530)은 특허출원 제 10-2003-089714 호에 기술되어 있으며, 본 발명에 따른 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301(KCCM-10530)의 하기 주요 특성 및 효과를 공유한다.

i) 아데닌 요구성

ii) 구아닌 요구성

iii) 라이소자임 감수성

iv) 프롤린 유사체 내성

v) 글루타민 유사체 내성

vi) 트립토판 유사체 내성

또한, 본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul 0401(KCCM-10609)는 상기 특성들 이외에, 술파디아진에 대해 내성을 추가로 가짐으로써, 5'-크산틸산을 보다 더 고농도 및 고수율로 배양액 중에 직접 축적시킬 수 있다.

XMP를 만들기 위한 생합성 경로는 매우 복잡하며 다양한 아미노산 및 조효소들이 부가적으로 참여하는 반응이 연속되고 있다. 특히 PRPP (Phosphoribosylpyrophosphate) 로부터 XMP 까지 11단계의 반응으로 이루어져있으며 글루타민 2분자, 글리신 1분자, 아스파테이트 1분자, HCO₃- 1분자, N₅N₁₀-메틸렌 테트라히드로폴산 (THF-CHO) 두분자가 참여하게 된다. 따라서, 푸린 염기에 참여하는 이들 물질의 증가는 푸린 염기 합성에 도움을 줄 수 있다.

술파계항생제의 하나인 술파디아진은 파라아미노벤조산 (ｐ-aminobenzoic acid, PABA) 의 구조 유도체의 하나로서, 미생물의 디히드로프테로산 합성효소 (dihydropteroate synthetase)의 작용을 막아 엽산(folic acid)합성의 중간체인 디히이드로폴산(dihydrofolic acid)가 생성되는 것을 막는다. 이러한 작용에 의해 미생물내의 테트라히드로폴산(tetrahydrofolic acid)의 합성을 저해시킨다.

테트라히드로폴산은 퓨린(purine), 티미딘(thymidine), DNA등의 합성에 중요한 역할을 하기 때문에 테트라히드로폴산의 감소에 의해 미생물의 생장이 저해된다. 술파디아진 내성주인 CJXSul 0401(KCCM-10609)은 술파디아진에 의한 성장저해를 극복하기 위하여 디히드로프테로산의 합성이 증가할 것으로 사료된다. 따라서, 이로 인하여 크산틸산 합성에 필수적인 테트라히드로폴산의 양이 증가된다. 이는 과량의 크산틸산 합성을 유도하여 직접 발효법에 의해 5'-크산틸산을 기존에 비해서 고농도, 고수율로 생산할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

미생물을 변이시키는 데는 X-선, 자외선, 화학적 변이 유도제(예: N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌, 디에틸설페이트, 에틸아민 등) 등이 있으며, 본 발명에 따른 미생물을 수득하기 위해서, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301(KCCM-10530)를 친주로 하여 N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)의 변이유발제로 통상적인 방법에 따라 처리하였으며, 술파디아진이 농도별로 첨가된 주 3의 술파디아진 첨가 배지에서 생육할 수 있는 변이주들 중에서 선별하였다.

이때 실험에 사용된 배지 중의 술파디아진 농도는 5mg/l이었다. 친주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJFT0301의 경우 술파디아진 농도 0.2 mg/l 까지 내성이 있으며 0.3 mg/l 이상에서는 전혀 성장이 일어나지 않았으나, 술파디아진 내성 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul0401(KCCM-10609)은 술파디아진 농도 1mg/l에서도 생육 가능함을 확인할 수 있었다.

이러한 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul 0401으로 명명하였으며, 이를 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2004년11월 16일자로 수탁번호 KCCM-10609호로 기탁하였다.

본 발명에서 분리한 신규의 변이주 CJXSul 0401(KCCM-10609)의 생화학적 특성은 표 2의 기재와 같으며 1mg/l 농도의 술파디아진 첨가배지에서도 생육 가능한 균주이다.

CJXFT0301와 비교한 본 발명의 변이 균주의 술파디아진 내성 특성은 표 1에 기재된 바와 같다.

본 발명의 신규 균주를 사용하여 5'-크산틸산을 생산하는 방법은 다음과 같다.

본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul 0401(KCCM-10609)를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

탄소원으로서는 글루코오스, 프락토오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다.

무기화합물로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.

배양은 호기적 조건 하에서 예를 들면, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 5 내지 6일 동안 지속하였으며, 직접 발효법에 의해서 축적된 5'-크산틸산을 상법에 따라 분석하였다.

이의 결과 직접 발효법에 의해 친주인 CJXFT0301를 이용 5'-크산틸산을 발효하는 경우 152.2 g/L의 5'-크산틸산을 얻을 수 있는 반면, 본 발명의 결과인 코리네박테리움 암모니아게네스 돌연변이체 CJXSul0401의 경우 동일한 조건하에서 160.4 g/L의 5'-크산틸산을 얻을 수 있었다. 따라서, 술파디아진 내성을 부여함으로써 얻어진 CJSul0401은 친주인 CJXFT0301에 비하여 5'-크산틸산 생산능력이 우수함을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의거 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 어떤 형태로든 실시예에 의해 제한되는 것을 의미하지는 않는다.

<실시예>

본 발명에서 미생물 배양을 위해 표 3에 나타난 바와 같은 조성을 갖는 영양 배지('주 1'로 표시됨), 최소 배지('주 2'로 표시됨), 술파디아진 첨가배지('주 3'으로 표시됨), 플라스크 종배지('주 4'로 표시됨), 플라스크 발효 본배지('주 5'로 표시됨), 플라스크 발효 별살배지('주 6'으로 표시됨), 발효조 1차 종배지('주 7'로 표시됨), 발효조 2차 종배지('주 8'로 표시됨), 발효조 발효배지('주 9'으로 표시됨)를 사용하였다. 그러나, 배지 조성은 표 2에 제시된 것으로 제한되지는 않으며, 코리네박테리움 암모니아게네스의 배양에 적합한 모든 배양 배지를 사용할 수 있다.

실시예 1: 술파디아진 내성 균주의 선별

본 발명에 따른 변이주는 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CJXFT0301(KCCM-10530)을 친주로 하여 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 30μg/ml가 되도록 첨가하고 30℃에서 60분 동안 처리하여 돌연변이를 유발시킨 후, 3회에 걸쳐서 0.85% 식염수로 세척하고 이후, 한천 1.7%를 함유된 최소배지(주 2)에 술파디아진이 lmg/l 함유한 배지에서 적절히 희석한 후, 도말하여 콜로니(colony)를 수득하였다. 각각의 콜로니를 영양 배지(주 1)에서 배양하고 종 배지(주 4)에서 24시간 배양한 후, 발효 배지(주 5)와 별살배지(주 6)을 혼합하여 4일 배양한 결과 발효배양액에 축적되는 5'-크산틸산 생산량이 가장 우수한 균주를 선별하여 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul 0401으로 명명하였으며, 이를 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2004년 11월 16일자로 수탁번호 KCCM-10609호로 기탁하였다.

실시예 2 : 삼각플라스크 발효역가 실험

사용균주: CJXSul 0401 및 CJXFT0301

플라스크 종배지: 표 1의 주 4 참조

플라스크 발효 본배지: 표 1의 주 5 참조

플라스크 발효 별살배지: 표 1의 주 6 참조

상기 종배지 5ml을 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한 후 사용 균주를 접종하고 180rpm으로 30℃에서 18시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 중 본배지와 별살배지를 각각 상법에 따라 가압 살균하여 미리 가압 살균한 500ml 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 29ml과 10ml 씩 분주하고 종배양액 1ml을 식균한 다음 90시간 배양하였다. 회전수는 200rpm, 온도 30℃로 조절하였다. 배양 완료 후 5’-크산틸산의 배지내 축적량은 기존 균주 CJXFT0301(KCCM-10530)는 28.6g/l 이며, 본 발명의 변이주 CJXSul 0401(KCCM-10609)는 30.7g/l 이었다. 5’-크산틸산의 축적 농도는 5’-크산틸산나트륨·7H2O로 표시하였다.

실시예 3 : 발효조에서의 발효역가 실험

사용균주: CJXSul 0401 및 CJXFT0301

발효조 1차 종배지: 표 1의 주 7 참조

발효조 2차 종배지: 표 1의 주 8 참조

발효조 발효배지: 표 1의 주 9 참조

1차 종배양: 상기 1차 종배양 배지 50ml을 500ml 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 20분간 가압 살균하여 냉각한 후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 180rpm으로 24시간 진탕 배양하였다.

2차 종배양: 2차 종배지를 5리터 용량의 실험용 발효조에 2리터씩 분주하고 121℃에서 20분간 가압 살균한 후 냉각하여 1차 종배양액의 배양완료액 50ml을 접종한 후 공기를 0.5vvm으로 공급하면서 900rpm, 31℃에서 24시간 배양하였다. 배양 중 pH는 암모니아수로 7.3로 조절하였다.

발효방법: 상기 발효배지를 30리터 용량의 실험용 발효조에 8리터씩 분주하고 121℃에서 20분간 가압 살균한 뒤 냉각하여 2차 종배양액을 1.5리터씩 접종한 후 공기를 1vvm으로 공급하면서 400rpm, 33℃에서 배양하되 배양중 잔존 당 농도가 1% 이하가 되면 살균된 포도당을 공급하여 발효배지에 첨가된 총당의 합계가 30%로 조절하였다. 배양 중 pH는 암모니아가스로 7.3로 조절하여 80시간 배양하였다. 배양완료 후 5’-크산틸산의 배지내 축적량은 종래균주 CJXFT0301는 152.2g/l이었고 본 발명의 변이주 CJXSul 0401(KCCM-10609)는 160.4g/l 이었다.

5’-크산틸산의 축적농도는 5’-크산틸산 나트륨.7H2O로 표시하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXSul0401(KCCM-10609)을 이용하여 5'-크산틸산을 생산하는 경우, 직접 발효법에 의해 경제적으로 5'-크산틸산을 보다 더 고농도 및 고수율로 생산할 수 있다.

Claims

기탁번호 KCCM-10609의 술파디아진 내성을 갖는 5'-크산틸산(5'-xanthylic acid)-생산 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJXSul 0401.
제1항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산을 생산하는 방법.