JP2817155B2 - 発酵法によるｌ‐アルギニンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 Ｌ−アルギニンは肝機能促進薬、アミノ酸輪液及び総
合アミノ酸製剤等の重要な成分である。本発明はこのＬ
−アルギニンを発酵法で製造する方法を改良するもので
ある。

〔従来技術〕

ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属の微
生物がＬ−アルギニン生産能を有するためには、２−チ
アゾールアラニン（以下２−TAと略す。）、アルギニン
ヒドロキサメート等への耐性を付与せしめれば良いこと
がわかっている。更に、前記薬剤耐性に加えてサルファ
剤、アルギノール耐性又は８−アザグアニンα−アミノ
−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を付与するこ
と、及びＬ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニ
ン、Ｌ−トリプトファン又はＬ−リジン等のアミノ酸に
対する要求性を不与することによりＬ−アルギニンの生
産能が向上することは知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

Ｌ−アルギニンの製造コストを低下させるために発酵
収率を向上させることは重要な問題である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は上記問題点を解決するためになされたもので
あり、従来より知られているブレビバクテリウム属及び
コリネバクテリウム属に属するＬ−アルギニン生産能を
有する微生物を改良して更に発酵収率の向上した菌株を
見いだすべく研究した結果、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪
鎖又は脂肪鎖の誘導体）（以下、Ｘ−GNと略す。）に耐
性を付与した菌株の中に、従来のＬ−アルギニン生産菌
よりも高収率でＬ−アルギニンを生産する菌株が存在す
ることを発見した。

即ち、本発明はブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属に属し、Ｘ−GN耐性を有し、且つＬ−アルギ
ニン生産能を有する微生物を液体培地中で培養し、培地
中に生成・蓄積したＬ−アルギニンを採取することを特
徴とするＬ−アルギニンの製造法に関する。

本発明において用いられる微生物はブレビバクテリウ
ム属及びコリネバクテリウム属に属し、Ｘ−GN耐性を有
し、かつＬ−アルギニン生産能を有する変異株である。
本発明の変異株を得るには、下記の野生株に、先にＬ−
アルギニン生産能を付与し、次いでＸ−GN耐性を付与し
ても良いし、又先にＸ−GN耐性を付与し、次いでＬ−ア
ルギニン生産能を付与しても良い。

Ｘ−GNとしては、ブテニルグアニジン、ヘキシルグル
アニジン、オクチルグアニジン等の脂肪鎖グアニジン及
び４−メチル−３−ブテニルグアニジン等の脂肪鎖グア
ニジン誘導体があり、これらは何れもエネルギー転移阻
害剤として知られている。

本変異株の親株となる野生株は、ブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属の特にコリネホルムＬ−グ
ルタミン酸生産性細菌として知られているものであり、
例えば、以下のものがある。

ブレビバクテリウム・デイバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC 14066 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム ATCC 13870 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032 これらの親株より本発明の変異株を変異誘導する方法
は、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ンに接触せしめる等の通常の変異誘導方法が適宜適用で
きる。変異処理した菌株から本発明の変異株を分離する
方法は、Ｘ−GNを含有する培地で生育するような菌株を
採取することによって行われる。

本発明の変異株の具体的な変異誘導方法とＸ−GNの１
種としてのオクチルグアニジン（以下、Ｏ−GNと略す）
濃度と菌株の生育度の関係を以下に示す。

〔変異誘導法〕

ブイヨン寒天スラント上に30℃で24時間生育させたブ
レビバクテリウム・フラバムAJ11169,FERM−P4161（ATC
C14067より誘導した２−TA耐性株）及びコリネバクテリ
ウム・グルタミクムAJ12092,FERM−P7273（ATCC13032よ
り誘導した２−TA耐性株）の菌体をM/30リン酸緩衝液に
懸濁し菌体濃度10⁸〜10⁹/mlの菌体懸濁液に500μg/mlの
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを
加え30℃に20分間保持した。ついで遠心分離して菌体を
集め、M/30リン酸緩衝液で良く洗滌した後、下記組成の
培地に接種し、31.5℃で４〜10日間培養した。

寒天培地に生育した菌株の中から、Ｌ−アルギニン生
産能の高い菌株としてブレビバクテリウム・フラバム
AJ 12429 FERM BP−2227 （２−TA耐性、Ｏ−GN耐性）及びコリネバクテリウム・
グルタミクム AJ 12430 FERM BP−2228 （２−TA耐性、Ｏ−GN耐性）を得た。

このようにして得られた変異株のＯ−GN耐性度を親株
と比較した。

グルコース0.5g/dl、尿素0.15g/dl、硫安0.15g/dl、K
H₂PO₄0.3g/dl、K₂HPO₄0.1g/dl、MgSO₄・7H₂O 0.01g/d
l、CaCl₂・2H₂O 0.1mg/dl、ビオチン100Mg/、サイア
ミン塩酸塩100μg/、FeSO₄・7H₂O 0.002g/dl、MnSO₄
・7H₂O 0.002g/dlおよび表に示す量のＯ−GNを含み、pH
7.0に調節した培地に、天然培地（ペプトン1g/dl、酵母
エキス1g/dl、NaCl 0.5g/dl、pH7.0）スラントで24時
間培養した菌体を殺菌水に懸濁して接種し、24時間培養
して生育度を濁度で測定した。

上述の変異株にサルファグアニジン耐性、アルギニノ
ール耐性、８−アザグアニン耐性のようにすでにＬ−ア
ルギニンの生産性を向上せしめることが知られている性
質を更に付加することにより収率が向上する場合が多
い。

〔作 用〕

このような変異株を培養する際に用いる培地は、炭素
源、窒素源、無機イオン、上記要求性を満足させるべき
物質及び必要に応じビタミン等のその他の有機微量栄養
素を含有する通常の培地である。

炭素源としてはグルコース、シュクロース等の炭水化
物、酢酸等の有機酸等が、窒素源としてはアンモニア
水、アンモニアガス、アンモニウム塩等が好適である。
無機イオンとしてはカリイオン、ナトリウムイオン、マ
グネシウムイオン、リン酸イオンその他が必要に応じ適
宜培地に添加される。

培養は好気的条件が望ましく、培養の間培地のpHを４
ないし８に温度を25℃ないし37℃に調節しつつ行なえば
より好ましい結果が得られる。かくして１ないし７日間
も培養すれば培地中に著量のＬ−アルギニンが生成蓄積
される。

培養液よりＬ−アルギニンを採取する方法は、イオン
交換樹脂による方法等通常の方法で採取できる。

以下実施例にて説明する。

実施例 グルコース10g/dl、（NH₄）₂SO₄7g/dl、KH₂PO₄0.1g/d
l、MgSO₄・7H₂O 0.04g/dl、FeSO₄・7H₂O 1mg/dl、MnSO₄
・4H₂O 1mg/dl、サイアミン・HCl100μg/、ビオチン
100μg/、大豆蛋白酸加水分解液60mg/dl（全窒素と
して）炭酸カルシウム5g/dl（別殺菌）を含む培地をpH
7.0に調節し、その20mlを500ml容肩付フラスコに入れ加
熱殺菌した。これに第１表に示す菌株を一白金耳接種
し、31.5℃に保ちつつ４日間振盪した。各菌株の培養液
中には第２表に示す量のＬ−アルギニンがそれぞれ生成
蓄積していた。

AJ12429を上記の方法で培養して培養液１を得、こ
れにより遠心分離にて菌体他を除き、上清を弱酸性イオ
ン交換樹脂「アンバーライト」Ｃ−50（NH₄ ⁺型）に通過
させた。樹脂を水洗後、2N NH₄OHにてＬ−アルギニンを
溶出し、ついで溶出液を濃縮し、これよりＬ−アルギニ
ンの粗結晶19.5gを得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリ
   ウム属に属しＸ−グアニジン（Ｘは脂肪鎖又は脂肪鎖の
   誘導体）に耐性を有し、且つＬ−アルギニン生産能を有
   する微生物を液体培地中で培養し、培地中に生成・蓄積
   したＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−ア
   ルギニンの製造法。