JPH05244970A - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 エシェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタ
ミン酸の生産能を向上させ、安価かつ効率的なＬ−グル
タミン酸の製造法を提供する。 【構成】 エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタル酸
デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下しかつＬ−グ
ルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸生産能
を有する変異株またはこれらの性質に加えａｃｅオペロ
ンの発現が構成的となっている変異株を液体培地で培養
し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタ
ミン酸の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるＬ−グルタ
ミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は食品、医
薬品等として重要なアミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】従来Ｌ−グルタミン酸は主としてブレビ
バクテリウム属、コリネバクテリウム属またはミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるグルタミン酸生産菌また
はそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている
（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５
頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法による
Ｌ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、スト
レプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方
法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナ
ス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ
属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８
５７号）等が知られている。従来の方法によりＬ−グル
タミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需
要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率
的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められてい
る。

【０００３】大腸菌はその増殖速度の大きさ並びに遺伝
子解析の進み方から将来的に優れたＬ−グルタミン酸生
産菌として利用される可能性を有しているが、従来の報
告では大腸菌によるＬ−グルタミン酸の蓄積量は２．３
ｇ／ｌと極めて低いレベルにある（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、第５０巻、１６４〜１６５頁、１９６１年）。

【０００４】

【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エ
シェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタミン酸生産能
を向上させ、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造
法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、大腸菌の
変異株によるＬ−グルタミン酸の製造法について鋭意研
究を重ねた結果、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ
（以下、α−ＫＧＤＨと略す）活性が欠損もしくは低下
しかつＬ−グルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタ
ミン酸生産能を有する大腸菌の変異株並びにこれらの性
質に加えマレートシンターゼ（ａｃｅＢ）・イソシトレ
ートリアーゼ（ａｃｅＡ）・イソシトレートデヒドロゲ
ナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（ａｃｅＫ）オペロ
ン（以下、ａｃｅオペロンと略す）の発現が構成的にな
った変異株が高いＬ−グルタミン酸生産能を持つことを
見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、エシェリヒア属に属
し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＬ−グ
ルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸生産能
を有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グ
ルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を提供
するものである。また本発明は、エシェリヒア属に属
し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＬ−グ
ルタミン酸分解活性が低下し、さらにａｃｅオペロンの
発現が構成的になっており、Ｌ−グルタミン酸生産能を
有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グル
タミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を提供す
るものである。

【０００７】本発明で使用する変異株は、エシェリヒア
属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつ
Ｌ−グルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸
生産能を有する変異株並びにこれらの性質に加えａｃｅ
オペロンの発現が構成的になった変異株である。さらに
これらの性質に加えてＬ−グルタミン酸生産能の向上に
有効な公知の性質、例えば各種栄養要求性、薬剤耐性、
薬剤感受性、薬剤依存性等の性質を併せ持っていてもよ
い。変異株の具体例としては次のものが挙げられる。

【０００８】 エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５４） エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５３）

【０００９】本発明の変異株を誘導するために使用され
る親株としては、エシェリヒア属に属する微生物で病原
性のない菌株が用いられる。具体的な例としては、次の
ような株が挙げられる。

【００１０】 エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８） エシェリヒア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）

【００１１】これら親株から本発明の変異株を得る方法
としては、通常の変異処理法、例えばＸ線や紫外線の照
射あるいはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン（以下、ＮＧと略す）等の変異剤に接触せしめ
る等の方法が適用できる。また、このような変異株は、
他の遺伝的手法、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、
細胞融合法等によっても誘導することができる。

【００１２】変異株取得のためのより具体的な手段は次
のようなものである。

【００１３】α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した
変異株は、例えば好気的培養条件下でグルコースを含む
最少培地で生育できないかもしくは生育速度が著しく低
下し、コハク酸またはリジン・メチオニンを添加したグ
ルコース培地で生育可能な変異株または嫌気的培養条件
下でグルコースを含む最少培地で生育可能な変異株とし
て分離できる（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、第１０５巻、１８２〜１９０頁、１９６９年）。

【００１４】ａｃｅオペロンの発現が構成的になった変
異株は、フォスフォエノールピルベートシンターゼ（ｐ
ｐｓ）欠損株を親株とし、乳酸を炭素源とする最少培地
で生育し、ピルビン酸または酢酸・ピルビン酸を炭素源
とする最少培地では生育できない株として得られる他、
好気的培養条件下でα−ＫＧＤＨ欠損もしくは低下株の
生育を改善する変異株としても得られる（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．、第９６巻、２１８５〜２１８６頁、１９
６８年）。

【００１５】Ｌ−グルタミン酸の分解能が低下した変異
株は、単一炭素源としてグルコースの代わりにＬ−グル
タミン酸を含む最少培地または単一窒素源として硫酸ア
ンモニウムの代わりにＬ−グルタミン酸を含む最少培地
で生育できないかもしくは生育速度が著しく低下する変
異株として分離できる。但し、栄養要求性を有する変異
株を用いる場合は、生育に必要な栄養素の必要最少限量
を当然培地に添加しなければならない。

【００１６】かくして得られる本発明の変異株は、ＴＣ
Ａサイクルのα−ケトグルタル酸を経てＬ−グルタミン
酸に至る生合成経路の流れが改善されており、かつ生成
したＬ−グルタミン酸の分解活性が著しく低い変異株ま
たはさらにａｃｅオペロンが構成的に発現するために生
育が改善した変異株であるため、Ｌ−グルタミン酸の生
産能が向上している。

【００１７】以上の方法で取得した変異株を用いてＬ−
グルタミン酸を生産せしめるには、炭素源、窒素源、無
機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有
機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法に
より行うことができる。合成培地または天然培地のいず
れも使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素
源は、使用菌の利用可能なものならばいずれの種類を用
いてもよい。炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノ
ース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が
使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独
あるいは他の炭素源と併用して用いられる。窒素源とし
ては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アン
モニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用され
る。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂
肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カ
ザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用す
る場合には要求される栄養素を補添する事が必要であ
る。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カル
シウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。

【００１８】培養方法は、発酵温度２０ないし４５℃、
ｐＨを５ないし９に制御しつつ通気培養を行う。培養中
にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、
アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０
時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著
量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。

【００１９】培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸
を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよ
い。例えば培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する
方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって
採取される。

【実施例】次に実施例によって本発明をさらに詳細に説
明する。

【００２０】実施例１ （１）Ｌ−グルタミン酸の分解活性が低下した変異株の
誘導。 酵母エキス０．５％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウ
ム０．５％（ｐＨ７．０）を含むＬブロスで３７℃、３
時間培養して得たエシェリヒア・コリＷ３１１０の生菌
体を５００μｇ／ｍｌの濃度のＮＧで３７℃、１５分間
処理することにより変異を誘導後、レプリカ法により表
１に示す基本最少培地上には生育するが、同じく表１に
示すＬ−グルタミン酸を単一炭素源とする最少培地
（Ａ）上およびＬ−グルタミン酸を単一窒素源とする最
少培地（Ｂ）上では生育が著しく遅れる変異株エシェリ
ヒア・コリＧＨ−１を取得した（培養温度：３７℃、培
養日数２日間）。

【００２１】

【表１】

【００２２】得られた変異株のＬ−グルタミン酸分解活
性を調べるために、本変異株および親株であるエシェリ
ヒア・コリＷ３１１０を上記３種類の最少培地と同じ組
成の液体培地で３７℃、４８時間培養し生育度を測定し
た。その結果を表２に示す。エシェリヒア・コリＧＨ−
１は親株に比べてＬ−グルタミン酸を単一炭素源または
単一窒素源とする最少培地での生育が著しく悪く、Ｌ−
グルタミン酸分解活性が低下していた。

【００２３】

【表２】

【００２４】（２）α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低
下した変異株の誘導。 上述のようにして得られたエシェリヒア・コリＧＨ−１
株を（１）と同様の方法で変異処理し、レプリカ法によ
り表１に示す基本最少培地上では生育が著しく遅れる
が、同じく表１に示すコハク酸を添加した最少培地
（Ｃ）上およびＬ−リジンとＬ−メチオニンを添加した
最少培地（Ｄ）上では良好に生育する変異株エシェリヒ
ア・コリＡＪ１２６２８を取得した（培養温度３７℃、
培養日数２日間）。

【００２５】本変異株並びに比較のためにエシェリヒア
・コリＷ３１１０のα−ＫＧＤＨ活性をＲｅｅｄらの方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第
１３巻、５５頁、１９６９年）により測定した。その結
果を表３に示す。エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８に
はα−ＫＧＤＨ活性は検出されなかった。

【００２６】

【表３】

【００２７】（３）ａｃｅオペロンの発現が構成的にな
った変異株の誘導。 大腸菌ジェネティックストックセンター（米国エール
大）より入手したａｃｅオペロンの構成的発現株エシェ
リヒア・コリＰＬＫ８３１（ｉｃｌＲ７、ｇａｌ、ｔｒ
ｐＥ、ｐｙｒＦ、ｆｎｒ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＲ）を供与
菌とし、（２）で得られたエシェリヒア・コリＡＪ１２
６２８を受容菌としてＰ１ｖｉｒファージによるｉｃｌ
Ｒマーカーの形質導入をおこなった。Ｌ−ブロスを用い
て対数増殖期まで培養したエシェリヒア・コリＰＬＫ８
３１の培養液に２．５×１０^-3ＭとなるようにＣａＣｌ
₂を加え、次いでＰ１ｖｉｒをｍ．ｏ．ｉ．すなわち１
細胞当りのファージ数が５となるように加えた後、３７
℃で９０分間培養を続け溶菌液を得た。この溶液にクロ
ロホルムを加え残存菌を死滅させた後遠心分離して上清
をファージ溶液とした。次にＬ−ブロスで対数増殖期ま
で培養したエシェリヒア・コリＡＪ１２６２８の培養液
にＣａＣｌ₂を上と同じ濃度加え、続いてファージ溶液
をｍ．ｏ．ｉ．が０．２となるように加え、３７℃で３
０分間静置した。その後遠心分離により上清を除き、
２．５×１０^-3ＭのＣａＣｌ₂を含む生理食塩水に菌体
を懸濁し希釈して表１の（Ｄ）に示したプレート培地に
播種した。３７℃、２日間培養後、エシェリヒア・コリ
ＡＪ１２６２８より生育が速くなった株としてエシェリ
ヒア・コリＡＪ１２６２４を取得した。

【００２８】次にこれらの株を同上の液体培地で好気的
に培養し、イソシトレートリアーゼ活性をＶａｎｄｅｒ
ｗｉｎｋｅｌらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１２巻、１５７頁、１
９６３年）により測定した。その結果を表４に示す。エ
シェリヒア・コリＡＪ１２６２４は親株であるエシェリ
ヒア・コリＡＪ１２６２８に比較してイソシトレートリ
アーゼ活性が著しく高まっており、形質導入の結果ａｃ
ｅオペロンの発現が構成的になっていることが示され
た。

【００２９】

【表４】

【００３０】（４）得られた変異株によるＬ−グルタミ
ン酸の生産。 エシェリヒア・コリＷ３１１０、ＧＨ−１、ＡＪ１２６
２８及びＡＪ１２６２４をそれぞれ表５の組成の培地２
０ｍｌを注入した５００ｍｌ容振とうフラスコに接種し
て、３７℃にて添加糖が消費されるまで振とう培養した
ところ、表６に示すようにＬ−グルタミン酸の生成蓄積
が認められた。この結果から明らかなように、α−ＫＧ
ＤＨ活性が欠損しかつＬ−グルタミン酸分解能が低下
し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する変異株ではＬ−グ
ルタミン酸の蓄積量の著しい向上が認められた。さらに
これらの性質に加えａｃｅオペロンの発現が構成的にな
っている変異株は発酵時間の大幅な短縮効果が確認され
た。

【００３１】

【表５】

【００３２】

【表６】

【００３３】（５）コハク酸もしくはＬ−リジンとＬ−
メチオニンの無添加培養 エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８、ＡＪ１２６２４を
それぞれ表７の組成の培地２０ｍｌを注入した５００ｍ
ｌ容振とうフラスコに接種して、３７℃にて添加糖が消
費されるまで振とう培養した。表７の生産培地Ｂは、表
５に示されるものと同一のものである。

【００３４】表８に示すようにａｃｅオペロンが構成的
に発現していないＡＪ１２６２８ではコハク酸もしくは
Ｌ−リジンとＬ−メチオニンを添加することにより発酵
時間の大幅な短縮が観察された。これに対してａｃｅオ
ペロンを構成的に発現しているＡＪ１２６２４ではコハ
ク酸もしくはＬ−リジンとＬ−メチオニンを添加しなく
とも、ＡＪ１２６２８に比して発酵時間の短縮が認めら
れた。これらよりａｃｅオペロンを構成的に発現させる
ことにより、培地へコハク酸もしくはＬ−リジンとＬ−
メチオニンを添加せずに発酵時間を短縮することができ
ることを確認した。すなわち、ａｃｅオペロンを構成的
に発現させることにより、培地の組成を単純にすること
が可能であり、かつ高価なＬ−リジンとＬ−メチオニン
の培地への添加を不要とすることができる。

【００３５】

【表７】

【００３６】

【表８】

【００３７】

【発明の効果】本発明の方法により、エシェリヒア属に
属する変異株のＬ−グルタミン酸生産能を高めることが
でき、Ｌ−グルタミン酸を安価かつ効率的に製造するこ
とができる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 河原 義雄 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタ
   ル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下しかつＬ
   −グルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸生
   産能を有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ
   −グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取すること
   を特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法。
2. 【請求項２】 該変異株がさらにマレートシンターゼ
   （ａｃｅＢ）・イソシトレートリアーゼ（ａｃｅＡ）・
   イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファ
   ターゼ（ａｃｅＫ）オペロンの発現が構成的になった変
   異株である請求項１記載のＬ−グルタミン酸の製造法。