DE60120570T2

DE60120570T2 - Bakterium, das befähigt ist L-Glutaminsäure, L-Prolin und L-Arginin herzustellen, und Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, L-Prolin und L-Arginin

Info

Publication number: DE60120570T2
Application number: DE60120570T
Authority: DE
Inventors: Maria Grigorievna Lunts; Svetlana Aleksandrovna Fomina; Tatyana Viktorovna Leonova; Mikhail Markovich Gusyatiner
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-07-06
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: DE60120570D1; EP1172433B1; EP1172433A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren auf dem Gebiet der mikrobiellen Industrie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin durch Fermentation und ein in diesem Verfahren eingesetztes Bakterium. L-Glutaminsäure, L-Arginin und L-Prolin sind wichtig als Nahrungsmittel, Arzneimittel und dergleichen.
L-Arginin und L-Prolin werden von E. coli-Zellen aus dem gemeinsamen Vorläufer L-Glutaminsäure synthetisiert. Deshalb hängt das Ausmaß der Produktion von L-Arginin oder L-Prolin von der Verfügbarkeit des gemeinsamen Vorläufers L-Glutaminsäure ab.
Es gibt bekannte Stämme von E. coli mit einer erhöhten Syntheserate für L-Glutaminsäure. Insbesondere sind Mutanten, die von dem Stamm E. coli K12 abgeleitet sind und die in ihrer 2-Ketoglutaratdehydrogenase-Aktivität unzulänglich oder verringert sind, in der Lage, L-Glutaminsäure mit einer ziemlich hohen Produktivität herzustellen (U.S. Patente Nr. 5,393,671 und 5,908,768).
Ebenso ist bekannt, daß einige E. coli-Mutanten L-Arginin und L-Prolin produzieren können. Sie wurden als Mutanten erhalten, die gegenüber Analoga dieser Aminosäuren resistent sind, und wurden durch Klonen einiger Gene, die für die Biosynthese wichtig sind, erhalten (britische Patentveröffentlichung Nr. 2080825A).
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Bakterium mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin und ein Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin durch Verwendung der Bakterien mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin bereitzustellen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß L-Isoleucin-Auxotrophe von E. coli mit einer Unzulänglichkeit in einem ilvA-Gen L-Glutaminsäure produzierten. Daneben können Stämme mit einer Unzulänglichkeit in einem ilvA-Gen als Ausgangsstämme zum Züchten von L-Prolin- und L-Arginin-Produzenten eingesetzt werden. Anders ausgedrückt haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, daß L-Isoleucin-Auxotrophie für die Verbesserung von L-Glutaminsäure-, L-Prolin- oder L-Arginin-Produzenten eingesetzt werden kann.
Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
Die vorliegende Erfindung stellt folgendes bereit:

(1) Ein Escherichia-Bacterium, das L-Isoleucin-auxotroph ist und L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin produzieren kann.
(2) Das Escherichia Bakterium nach (1), worin eine beliebige Aktivität eines Enzyms der L-Isoleucin-Biosynthese unzulänglich ist.
(3) Das Escherichia-Bacterium nach (2), worin die Threonindeaminase-Aktivität unzulänglich ist.
(4) Das Escherichia-Bacterium nach einem der Punkte (1) bis (3), das Escherichia coli ist.
(5) Ein Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin, welches das Kultivieren des Escherichia-Bacteriums nach einem der Punkte (1) bis (4) in einem Medium, das L-Isoleucin enthält, umfaßt, wobei L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin in einer Kultur produziert wird und L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin aus der Kultur gewonnen wird.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
<1> Erfindungsgemäßes Bakterium
Das erfindungsgemäße Bakterium ist ein Bakterium der Gattung Escherichia, das L-Isoleucin-auxotroph ist und L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin produzieren kann. Ein Beispiel des Escherichia-Bakteriums ist Escherichia coli.
Der Ausdruck "ein Bakterium kann L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin produzieren" bedeutet, daß das Bakterium eine signifikante Menge von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin in einem Medium anhäufen kann, wenn das Bakterium in dem Medium kultiviert wird, oder daß der Gehalt an L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin in dem Bakterium erhöht wird. Der Ausdruck "ein Bakterium ist L-Isoleucin-auxotroph" bedeutet, daß das Bakterium L-Isoleucin (üblicherweise nicht weniger als 10 mg/l) in einem Medium für das Wachstum benötigt.
Das erfindungsgemäße Bakterium produziert mindestens L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin und kann zwei oder mehr Typen von L-Aminosäuren produzieren.
Das erfindungsgemäße Bakterium kann dadurch erhalten werden, daß einem Escherichia-Bacterium mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin L-Isoleucin-Auxotrophie verliehen wird, oder dadurch, daß einem L-Isoleucin-auxotrophen Escherichia-Bacterium die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin verliehen wird.
Um die L-Isoleucin-Auxotrophie zu verleihen, kann ein Verfahren eingesetzt werden, welches die Mutagenese von Escherichia-Bakterien, das Zulassen der Bildung von Kolonien durch Escherichia-Bakterien auf einem Agar-Medium, das L-Isoleucin enthält, durch Replica-Plattieren der Kolonien auf ein Medium, das kein L-Isoleucin enthält, und das Selektieren von Stämmen umfaßt, die auf dem Medium, das kein L-Isoleucin enthält, nicht wachsen können. Die Mutagenese umfaßt die UV-Bestrahlung und Behandlungen mit Mutagenesemitteln, die für übliche Mutagenesebehandlungen eingesetzt werden, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) und salpetrige Säure. Alternativ dazu können natürlich vorkommende Mutanten selektiert werden.
Die Isoleucin-Auxotropie beruht vorzugsweise auf einer Unzulänglichkeit in einer beliebigen der L-Isoleucinbiosynthese-Enzymaktivitäten (Aktivitäten von Enzymen, die Reaktionen der L-Isoleucin-Biosynthese katalysieren). Die L-Isoleucin-Biosyntheseenzyme umfassen Threonindeaminase, Acetohydroxysäuresynthase, Acetohydroxysäureisomerreductase, Dihydroxysäuredehydratase. Es ist bevorzugt, daß die Threonindeaminase-Aktivität unzulänglich ist. Der Ausdruck "die Aktivität ist unzulänglich" bedeutet, daß die intrazelluläre Aktivität des Enzyms niedriger als diejenige eines Wildtyp-Stammes ist, und wenn ein Stamm, worin die Aktivität des Enzyms unzulänglich ist, erhalten durch Modifikation unter Einsatz von Genrekombinationsverfahren oder dergleichen, ist die intrazelluläre Aktivität des Enzyms niedriger als diejenige des Stammes vor der Modifikation.
Um die Unzulänglichkeit der Enzymaktivität wie vorstehend beschrieben zu erhalten, kann eine Mutation, welche die Unzulänglichkeit der Enzymaktivität verursacht, in ein Gen, welches für das Enzym kodiert, durch herkömmliche Mutageneseverfahren oder gentechnische Verfahren eingeführt werden.
Beispiele der Mutagenesetechniken umfassen das Verfahren, bei dem eine Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder mit UV-Licht verwendet wird, ein Verfahren, bei dem die Behandlung mit einem Mutagenesemittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und dergleichen, verwendet wird. Die Stelle des Gens, in die eine Mutation eingeführt wird, kann eine für ein Enzymprotein kodierende Region oder eine Expressionsregulationsregion, wie ein Promotor, sein.
Beispiele der gentechnischen Verfahren umfassen die genetische Rekombination, genetische Transduktion, Zellfusion und dergleichen. Beispielsweise wird eine Arzneimittelresistenz in ein Zielgen eingeführt, um ein funktionell inaktiviertes Gen (defektes Gen) herzustellen. Dann wird dieses defekte Gen in eine Zelle eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia eingeführt, und das Zielgen auf einem Chromosom wir durch homologe Rekombination durch das defekte Gen ersetzt (Genstörung).
Ob in einem Mikroorganismus die Aktivität eines Zielenzyms gesenkt wird oder die Aktivität fehlt, sowie der Grad der Abnahme der Aktivität können durch Messen der Enzymaktivität eines bakteriellen Zellextrakts oder einer gereinigten Fraktion eines Kandidatenstamms und Vergleichen der Ergebnisse mit denjenigen eines Wildtyp-Stamms oder eines Ausgangsstamms bestimmt werden. In Abhängigkeit von dem Zielenzym kann eine Zielvariante auf der Grundlage eines Phänotyps der Variante selektiert werden.
Um die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin zu verleihen, können Verfahren eingesetzt werden, die herkömmlicherweise zum Züchten von Escherichia-Bakterien oder dergleichen eingesetzt werden, beispielsweise solche Verfahren zur Herstellung von auxotrophen Mutantenstämmen, Stämmen, die gegen L-Aminosäure-Analoga resistent sind, oder Stämme mit einer Mutation in der metabolischen Kontrolle, und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Stämmen, wobei L-Aminosäure-Biosyntheseenzym-Aktivitäten verstärkt sind (vgl. "Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1. Auflage, veröffentlicht am 30. Mai 1986, S. 77 bis 100). Bei der Züchtung von Aminosäure produzierenden Bakterien können Eigenschaften, wie Auxotrophie, Resistenz gegen L-Aminosäure-Analoga und Mutation der metabolischen Kontrolle allein oder in Kombination von zwei oder mehreren dieser Eigenschaften verliehen werden. Die L-Aminosäure-Biosyntheseenzymaktivität kann allein oder in Kombination von zwei oder mehreren verstärkt werden. Außerdem kann die Verleihung der Eigenschaft, wie Auxotrophie, Resistenz gegen L-Aminosäure-Analoga und Mutation der metabolischen Kontrolle mit der Verstärkung der L-Aminosäure-Biosyntheseenzymaktivität kombiniert werden.
Beispielsweise können L-Glutaminsäure produzierende Bakterien als Mutanten gezüchtet werden, die Auxotrophie für Oleinsäure oder dergleichen zeigen.
Ebenso kann die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure beispielsweise durch Einführen einer DNA verliehen werden, die für eines der unter Glutamatdehydrogenase (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) 61-268185/1986), Glutaminsynthetase, Gutamatsynthase, Isocitratdehydrogenase (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 62-166890/1987 und 63-214189/1988), Aconitathydratase (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 62-294086/1987), Citratsynthase (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 62-201585/1987 und 63-119688/1988), Phosphoenolpyruvatcarboxylase (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 60-87788/1985 und 62-55089/1987), Pyruvatdehydrogenase, Pyruvatkinase, Phosphoenolpyruvatsynthase, Enolase, Phosphoglyceromutase, Phosphoglyceratkinase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Fructosebisphosphataldolase, Phosphofructokinase (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 63-102692/1988), Glucosephosphatisomerase, Glutaminoxoglutarataminotransferase (WO99/07853) und dergleichen ausgewählten Enzyme kodiert.
Außerdem kann das erfindungsgemäße Bakterium hinsichtlich der Aktivität eines Enzyms, das eine Reaktion zum Erzeugen einer Verbindung, die nicht L-Glutaminsäure ist, durch Abzweigen von dem Biosyntheseweg für L-Glutaminsäure katalysiert, unzulänglich gemacht werden. Das Enzym, das die Reaktion zum Erzeugen der Verbindung, die nicht Glutaminsäure ist, durch Abzweigen von dem Biosyntheseweg für L-Glutaminsäure katalysiert, umfaßt α-Ketoglutaratdehydrogenase, Isocitratlyase, Phosphatacetyltransferase, Acetatkinase, Acetohydroxysäuresynthase, Acetolactatsynthase, Formiatacetyltransferase, Lactatdehydrogenase, Glutamatdecarboxylase, 1-Pyrrolindehydrogenase und dergleichen.
Die Fähigkeit zur Produktion von L-Prolin kann beispielsweise dadurch verliehen werden, daß das Bakterium hinsichtlich der Rückkopplungshemmung von γ-Glutamylkinase durch L-Prolin unempfindlich gemacht wird und/oder dadurch, daß das L-Prolin-Abbausystem zerstört wird. Das Verfahren, bei dem das Bakterium hinsichtlich der Rückkopplungshemmung von γ-Glutamylkinase durch L-Prolin unempfindlich gemacht wird, ist beispielsweise ein Verfahren, welches das Einführen einer DNA, die für γ-Glutamylkinase kodiert, die hinsichtlich der Rückkopplungshemmung durch L-Prolin unempfindlich gemacht worden ist, in Zellen umfaßt (J. Bacteriol. 170, 5943 (1988)). Das Verfahren zum Zerstören des L-Prolin-Abbausystems ist beispielsweise ein Verfahren, welches das Einführen einer Mutation in ein Prolindehydrogenasegen umfaßt, so daß keine aktive Prolindehydrogenase exprimiert wird. Das Bakterium, worin das L-Prolin-Abbausystem zerstört ist, kann auch dadurch erhalten werden, daß ein Stamm erhalten wird, der in seiner Fähigkeit zur L-Prolin-Assimilation unzulänglich ist und durch Selektieren eines Stammes, der L-Prolin extrazellulär produziert, aus den gehaltenen Stämmen unter Einsatz der L-Prolin-Auxotrophie als Index.
Die Fähigkeit zur Produktion von L-Arginin kann beispielsweise dadurch verliehen werden, daß eine Resistenz gegen α-Methylmethionin, p-Fluorphenylalanin, D-Arginin, Argininhydroxamat, S-(2-Aminoethyl)-cystein, α-Methylserin, β-2-Thienylalanin oder Sulfaguanidin (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 56-106598) verliehen wird oder ein argA-Gen, das für N-Acetylglutamatsynthase kodiert, eingeführt wird (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 57-5693).
<2> Erfindungsgemäßes Verfahren
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt das Kultivieren des erfindungsgemäßen Bakteriums in einem L-Isoleucin enthaltenden Medium, wobei L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin in einer Kultur produziert und angehäuft wird, und das Gewinnen von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin aus der Kultur.
Das Medium kann ein übliches Medium sein, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls andere organische Komponenten enthält, mit der Maßgabe, daß es L-Isoleucin enthält. Die Menge des L-Isoleucins ist ausreichend, um zuzulassen, daß das erfindungsgemäße Bakterium L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin produziert und anhäuft, und ist üblicherweise 25 bis 250 mg/l.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose und Stärkeydrolysat, Alkohole, wie Glycerin und Sorbitol oder organische Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure, eingesetzt werden.
Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas oder wässeriges Ammoniak eingesetzt werden.
Es ist bevorzugt, daß erforderliche Substanzen, wie Vitamin B1 oder Hefeextrakt, in geeigneten Mengen als organische Spurennährstoffe enthalten sind. Daneben werden bei Bedarf Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen in kleinen Mengen zugegeben.
Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 16 bis 72 Stunden durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird bei 25°C bis 45°C kontrolliert, und der pH-Wert wird während der Kultivierung bei 5 bis 8 kontrolliert. Anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen sowie Ammoniakgas oder dergleichen können für die pH-Einstellung eingesetzt werden.
Die Kultur umfaßt ein Medium und Zellen, wobei ein Medium bevorzugt ist.
Das Gewinnen von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin aus der Kultur kann üblicherweise durch Kombinieren eines Ionen austauschverfahrens, eines Ausfällungsverfahrens und anderer bekannter Verfahren durchgeführt werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele genauer erklärt.
Beispiel 1
Produktion von L-Glutaminsäure durch einen ilvA defizienten Stamm
A) Verwendung einer Insertion des Transposons Tn5 (oder eines beliebigen anderen Transposons) in das ilvA-Gen
Zellen des Stamms E. coli K12 vom Wildtyp (VKPM B-7) wurden mit einem Bacteriophagen P1 behandelt, der auf Zellen des L-Isoleucin auxotrophen Stammes E. coli C600 ilvA::Tn5 mit einer Insertion des Transposons Tn5 in dem ilvA-Gen gezüchtet worden war, und auf LB-Agarplatten, die Kanamycin (20 μg/ml) enthielten, zur Selektion von Kanamycin-resistenten Transductanten gegeben. Es wurde ein Derivat des Wildtyp-Stamms von E. coli K12 mit einer Insertion des Transposons Tn5 in dem ilvA-Gen erhalten Dieser Stamm wurde B7ILE genannt und wurde bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) am 18 Juli 2000 hinterlegt und in eine Hinterlegung nach dem Budapester Abkommen am 18. Mai 2001 überführt und erhielt die Hinterlegungsnummer VKPM B-8013.
B) Konstruktion eines ilvA-defizienten Derivats von dem Wildtypstamm E. coli K12 mit einer Mutation in dem ilvA-Gen
Der Stamm VL334 (VKPM B-1641) ist ein L-Isoleucin- und L-Threonin-auxotropher Stamm mit Mutationen in dem thrC- und ilvA-Gen (U.S. Patent Nr. 4,278,765). Ein Wildtyp-Allel des thrC-Gens wurde unter Einsatz des Bacteriophagen P1, der auf Zellen des Wildtyp-Stammes E. coli strain K12 (VKPM B-7) gezüchtet worden war, durch ein allgemeines Transduktionsverfahren übertragen. Es wurde ein L-Isoleucin-auxotropher Stamm VL334thrC⁺ erhalten.
(C) Produktion von L-Glutaminsäure durch den L-Isoleucin-auxotrophen Stamm mittels Reaktionsröhrchen-Fermentation
Das Fermentationsmedium enthielt 60 g/l Glucose, 25 g/l Ammoniumsulfat, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 0,1 mg/l Thiamin, 50 mg/l L-Isoleucin und 25 g/l Kalk (pH 7,2). Glucose und Kalk wurden getrennt voneinander sterilisiert. 2 ml des Mediums wurden in die Teströhrchen gegeben und mit einer Impföse getesteter Mikroorganismen angeimpft, und die Kultivierung wurde 2 Tage bei 37°C unter Schütteln durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Beispiel 2
Produktion von L-Prolin durch einen ilvA-defizienten L-Prolin-Produzenten
Die Zellen des Wildtyp-Stammes E. coli K12 (VKPM B-7) wurden mit dem Mutagen, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (0,1 mg/ml) während 20 Minuten bei 37°C behandelt, gewaschen und auf ein Minimalagarmedium M9, das mit 1,25 mg/ml Trypton, 10 mg/ml L-Prolin und 0,05 mg/ml 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid supplementiert war, plattiert. Die meisten Kolonien, die nach 3-tägiger Inkubation bei 37°C auftraten, waren rot gefärbt. Wenige Kolonien, die L-Prolin nicht oxidieren konnten, waren weiß. Eine dieser Kolonien wurde als Ausgangsstamm für die Erzeugung von Mutanten, die gegen Prolinanaloga (3,4-Dehydroxyprolin und Azetidin-2-carboxylat) resistent waren, eingesetzt, wobei die Analoga in M9-Agarmedium in einer Konzentration von 2 jeweils mg/ml zugegeben wurden.
Einige der aufgetretenen Mutanten konnten L-Prolin produzieren. Der beste L-Prolin-Produzent 702 wurde mit einem Bacteriophagen P1, der auf Zellen des Stammes TG1, worin das ilvA-Gen durch Insertion des Chloramphenicol (Cm)-Resistenzgens (Cm^r) zerstört war, gezüchtet worden war, behandelt. Eine der erhaltenen Cm-resistenten Transductanten, nämlich 702ilvA, war L-Isoleucin-auxotroph und war ein viel effektiverer L-Prolin-Produzent als der prototrophe L-Isoleucin-Ausgangsstamm 702 (Tabelle 2). Die Fermentation wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Tabelle 2
Die Stämme 702 und 702ilvA wurden bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) am 18. Juli 2000 hinterlegt und am 18. Mai 2001 in eine Hinterlegung nach dem Budapester Abkommen mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-8011 bzw. VKPM B-8012 überführt.
Beispiel 3
Produktion von L-Arginin durch einen ilvA-defizienten L-Arginin-Produzenten
Der Stamm 237, ein L-Arginin-produzierender Stamm, der als Mutante, die gegen das Pyrimidin-Analogon 6-Azauracil resistent ist, selektiert worden war, wies eine Insertion des Transposons Tn5 in dem ilvA-Gen auf und war deshalb L-isoleucin-auxotroph. Der Stamm 237 wurde bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) am 10. April 2000 hinterlegt und am 18. Mai 2001 in eine Hinterlegung nach dem Budapester Abkommen mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-7925 überführt.
Zellen des Stammes 237 wurden mit einem Bacteriophagen P1, der auf Zellen des Wildtypstammes E. coli K12 (VKPM B-7) gezüchtet worden war, behandelt, und es wurden L-Isoleucin-prototrophe Transformanten selektiert. Die L-Arginin-Produktion aller L-Isoleucin-prototrophen Transductanten war drastisch verringert (Tabelle 3). Die Fermentation wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Tabelle 3

Claims

Escherichia-Bakterium, das L-Isoleucin-auxotroph ist und L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin produzieren kann.
Escherichia-Bakterium nach Anspruch 1, worin eine beliebige Aktivität eines Enzyms der L-Isoleucinbiosynthese unzulänglich ist.
Escherichia-Bakterium nach Anspruch 2, worin die Threonindeaminaseaktivität unzulänglich ist.
Escherichia-Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das Escherichia coli ist.
Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-8011.
Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-8012.
Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-8013.
Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-7925.
Verfahren zum Herstellen von L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin, welches das Kultivieren des Escherichia-Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Medium, das L-Isoleucin enthält, umfasst, wobei L-Glutaminsäure, L-Prolin oder L-Arginin in einer Kultur produziert und angehäuft werden.