JPS6236673B2

JPS6236673B2 -

Info

Publication number: JPS6236673B2
Application number: JP55185676A
Authority: JP
Inventors: Takashi Shimazaki; Yoshihiro Nakamura; Yasutsugu Yamada
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1980-12-29
Filing date: 1980-12-29
Publication date: 1987-08-07
Also published as: FR2497231B1; JPS57115186A; US4411997A; FR2497231A1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、発酵法によるＬ−リジンの製造方法
に関する。本発明者らは、より効率の高いＬ−リ
ジン生産菌を誘導すべく研究した結果、ブレビバ
クテリウム属又はコリネバクテリウム属の微生物
より変異誘導したエチレングリコールに耐性を有
する変異株が、より高い収率でＬ−リジンを生産
することを見い出した。この発明は、この知見に基づいて完成されるに
至つたものである。本発明において使用される変異株は、ブレビバ
クテリウム属又はコリネバクテリウム属に属し、
エチレングリコールに耐性を有し、更に従来のＬ
−リジン生産性付与の為に必要な性質（例えば、
Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以
下、ＡＥＣと記す）耐性、ホモセリン要求性、α
−クロロカプロラクタム耐性等）、即ち、Ｌ−リ
ジン生産能を有しているものである。本変異株の新株となる野性株は、ブレビバクテ
リウム属又はコリネバクテリウム属の特にコリネ
ホルムＬ−グルタミン酸生産性細菌として知ら
れているものであり、例えば、以下のものがあ
る。ブレビバクテリウム・デイバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 17067 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム ATCC 14066 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム ATCC 13870 コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032 これらの親株より本発明の変異株を変異誘導す
る方法は、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンに接触せしめる等の通常の変異誘
導方法が適宜適用である。変異処理した菌株から
本発明の変異株を分離する方法は、親株が生育で
きないような量のエチレングリコールを含む固体
培地中に生育できるような菌株を採取することに
より行われる。エチレングリコールに耐性を有する変異株は、
多くの場合、その親株が生育できないような高濃
度の塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸ア
ンモニウム、グルコース、シユークロース、フラ
クトース等にも耐性を有するので、これらに耐性
を有する変異株も、要はエチレングリコールに耐
性を有する限り、本発明の変異株に含まれる。本発明の変異株の具体的な変異誘導方法と、エ
チレングリコールに対する耐性度とを示す実験例
について以下に示す。実験例１ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ＡＪ 11082（ＦＥＲＭ−Ｐ3840）（AEC^rCCL^r、
Ala^-）をＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジンにて処理（250μｇ／ml、30℃で30
分）した後に、以下に示すエチレングリコール30
ｇ／dlを含有する最少培地に接種し、31.5℃で振
盪し耐性菌の集積培養を行つた。２〜７日後菌の
生育が認められた培養液を下記培地組成の分離用
培地に塗沫し２〜４日間31.5℃にて培養し、生じ
たコロニーを採取した。このようにして得られた
変異株の内、Ｌ−リジン生産能が最も高いＡＪ
11657（FERM−Ｐ5838）を得た。又、同様の方法により、コリネバクテリウム・
アセトグルタミクムAJ 11094（FERM−Ｐ3856）
（AEC^r、Ala^-）及びブレビバクテリウム・フラバ
ムAJ 11275（FERM−Ｐ4549）（Hse^-）を親株と
してAJ 11656（FERM−Ｐ5837）及びAJ 11658
（FERM−Ｐ5839）を採取した。 Ala^-：Ｌ−アラニン要求性 CCL^r：α−クロロカプロン酸耐性 AEC^r：Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン耐
性 Hse^-：Ｌ−ホモセリン要求性最少培地組成：グルコース 2.0ｇ／dl 尿素 0.25ｇ／dl 硫酸アンモニウム 1.0ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 0.1mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl Ｌ−アラニン 50mg／dl ニコチン酸アミド 0.5mg／dl ビオチン 5.0μｇ／dl サイアミン・塩酸塩 10μｇ／dl ＮａＣｌ 50mg／dl pH7.2 実験例２第１表に示す菌株についてエチレングリコール
耐性の度合いを調べ、結果を第１表に示した。

【表】第１表の結果は、試験管に分注した前記の最少
培地３mlに、エチレングリコールを第１表に示す
各濃度となるように溶解して培養液を調製し、そ
れぞれの培養液に、最少培地でよく洗滌した菌を
植えつけ30℃、24時間培養して培養液の562ｍμ
の吸光度を測定して生育度を調べたものである。これらの微生物を用いてＬ−リジンを生産せし
めるには、特に困難はなく、炭素源、窒素源、無
機塩類、生育因子及び使用する微生物が要求する
栄養物質を含有する通常の栄養培地を用いて常法
により行う。用いられる炭素源としては、グルコ
ース、シユークロース、糖蜜、デンプン加水分解
液などの糖類、酢酸、プロピオン酸などの有機
酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール
類などが使用できる。窒素源としては、硫安、硝安、塩安、リン安、
尿素、アンモニアその他が使用できる。培養方法は、通気培養が良く、発酵温度は24〜
37℃、発酵日数は通常２〜７日である。発酵開始
時及び培養中のpHは5.0〜9.0が良く、pHの調整に
は、無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性
物質、更には尿素、炭素カルシウム、アンモニア
ガスなどを使用することができる。発酵液からの
Ｌ−リジンの採取は、通常イオン交換樹脂法、そ
の他の公知の方法を組み合わせることにより行わ
れ、培地の種類によつては、直接晶析法により行
うことも可能である。実施例１下記の組成の培地を20ml宛500ml溶振とうフラ
スコに入れ、110℃にて５分間殺菌した。培地組成グルコース 15ｇ／dl 硫酸アンモニウム 4.5ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl ビオチン 5.0μｇ／dl サイアミン塩酸塩 20.0μｇ／dl 大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物（総窒素７
％） 1.5ml／dl 炭酸カルシウム（別細菌添加）５ｇ／dl pH7.0 上記のように調製したフラスコ中の培地に、あ
らかじめグルコーズ・ブイヨンスラント上で生育
せしめた第２表に示す菌株を一白金耳接種し、そ
れらを31℃にて72時間振とう培養した。72時間培
養後の培地中のＬ−リジン生成量を、酸性−銅ニ
ンヒドリン反応を用いる比色法によつて行つた。
結果を第２表に示す。

【表】

【表】上記のようにしてAJ 11657を培養し、培養終
了液を集め遠心分離によつて菌体及びカルシウム
塩を除いた上清液１を強酸性イオン交換樹脂
（「アンバーライト」ＩＲ−120ＣＨ型）に通過さ
せ、Ｌ−リジンを吸着させた。次いで、３％アン
モニア水で吸着したＬ−リジンを溶出し、溶出液
を減圧濃縮した。濃縮液に塩酸を添加したのち冷
却し、Ｌ−リジンをＬ−リジン塩酸塩第２水和物
として析出させ、結晶36.7ｇを得た。実施例２ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ 11657及びその親株AJ 11082を、それぞれス
ラント上より１白金耳かきとり、次記種培養培地
50mlに接種し、18時間、31℃にて通気攪拌培養を
行つて種培養液を調整した。種培養培地組成：グルコース 1.5ｇ／dl 酢酸アンモニウム 0.3ｇ／dl 尿素 0.1ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl ビオチン 5.0μｇ／dl サイアミン塩酸塩 20.0μｇ／dl 大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物（総窒素７
％）２ml／dl pH7.5 一方、１容小型ガラス製ジヤー・フアーメン
ターに次記の組成より成る主発酵培地を300ml宛
分注し、常法により殺菌した。これらに上記の種培養液をそれぞれ15ml宛接種
し、31℃にて通気攪拌培養を開始した。主発酵培地組成：グルコース 2.0ｇ／dl 酢酸アンモニウム 0.5ｇ／dl 尿素 0.2ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0ml／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl ビオチン 5.0μｇ／ｌサイアミン・塩酸塩 5.0μｇ／ｌニコチン酸アミド 0.1mg／ｌ大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物（総窒素７
％） 3.0ml／dl pH7.2 培養液中に、酢酸と酢酸アンモニウムとの混合
液を培地のpHが7.2〜8.0の間に保持なるように添
加して、31〜33℃で55時間培養を行つた。結果を
第３表に示す。

【表】実施例３下記の組成の培地を20ml宛500ml容振とうフラ
スコに入れ、110℃にて５分間殺菌した。培地組成ビートモラセス（シユークロースとして） 15ｇ／dl 硫酸アンモニウム 4.5ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl ビオチン 5.0μｇ／dl サイアミン塩酸塩 20.0μｇ／dl 大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物（総窒素７
％） 1.5ml／dl 炭酸カルシウム（別殺菌添加）５ｇ／dl pH7.0 上記の如く調製したフラスコ中の培地に、あら
かじめグルコーズ・ブイヨンスラント上で生育せ
しめた第４表に示す菌株各のを１白金耳接種し、
それらを31℃にて72時間振とう培養した。72時間
培養後の培地中のＬ−リジン生成量を、酸性−銅
ニンヒドリン反応を用いる比色比によつて行つ
た。結果を第４表に示す。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属に属し、エチレングリコールに耐性であり、
Ｌ−リジンを培地中に生成蓄積する能力を有する
微生物を培養し、培地中に生成蓄積したＬ−リジ
ンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造
方法。