JPH0655148B2

JPH0655148B2 - アミドの生物学的製造法

Info

Publication number: JPH0655148B2
Application number: JP63231744A
Authority: JP
Inventors: 秀明山田; 透長沢
Original assignee: 秀明山田
Priority date: 1987-09-18
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1994-07-27
Anticipated expiration: 2009-07-27
Also published as: FI884279L; DK174516B1; HUT50215A; BG48934A3; ES2043752T3; ATE85082T1; PT88540A; RO101578B; DD274631A5; NO175489B; NO884114D0; KR0134094B1; CN1032436A; DE3877869D1; US5334519A; DE3877869T2; HU204099B; EP0307926B1; CA1298222C; EP0307926A3

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕（技術分野）本発明は、微生物由来のニトリルヒドラターゼの作用に
よってニトリルを水和してこれを対応するアミドに変換
させる方法に関する。さらに具体的には、本発明は、使
用する微生物およびニトリルヒドラターゼの産生方法に
主要な特徴を有するアミドの生物学的製造法に関する。

（先行技術）低級脂肪族アミド、たとえばアクリルアミド、は対応す
るニトリル、たとえばアクリロニトリルの水和によって
製造されるが、この水和を微生物の産生する酵素（ニト
リラーゼあるいはニトリルヒドラターゼ）の作用によっ
て行なう方法が提案されている（たとえば、特公昭６２
−２１５１９号、特開昭６１−１６２１９３号、特開昭
６２−９１１８９号、特公昭５６−１７９１８号および
特公昭５９−３７９５１号公報参照）。このようなアミ
ドの生物学的製造法は、工業的にも実施されていて、ア
クリルアミドの有利な製造法として注目されている。

このようなアミドの生物学的製造法に使用されるものと
して既にいくつかの微生物が提案されているのである
が、本発明者らの知るところでは、これらの微生物は低
級脂肪族ニトリルの水和には有効であっても、芳香族ニ
トリルの水和には必ずしも有効ではない。たとえば、３
−シアノピリジンを水和してニコチン酸アミドを製造す
る方法は、収率が低くて工業的には実施し難い。

ところで、微生物の培養を鉄イオンあるいはマンガンイ
オンの存在下に行なうことが一般に知られており、アミ
ドの生物学的製造法にもこの技術は利用されていて、た
とえばロドコッカス属の微生物の培養を鉄イオンの存在
下に行なう例を特開昭６１−１６２１９３号および特開
昭６２−９１１８９号各公報にみることができる。

本発明者らの検討したところによれば、シュードモナス
属細菌由来のニトリル水和酵素（ニトリルヒドラター
ゼ）はその活性中心にＦｅ⁺⁺⁺を含んでおり、従ってこ
の微生物の培養には培地中に鉄イオンが存在することが
必須であったが、ロドコッカス属の微生物についての前
記の公知例の場合にもその培養の際の培地中の鉄イオン
はニトリル水和酵素産生のために必須のものであると推
定される。

〔発明の概要〕

（要旨）本発明は、上記の知見に反して、ロドコッカス属の特定
の菌株、すなわちロドクロウス種のＪ−１株、が鉄イオ
ン含有培地ではニトリルヒドラターゼを産生しないこと
ならびにコバルトイオン含有培地においてはじめてニト
リルヒドラターゼを産生すること、ならびにこのように
して産生されたニトリルヒドラターゼは芳香族ニトリル
をも基質としてそれをアミドに変換すること、の発見に
基いてなされたものである。

従って、本発明によるアミドの製造法は、微生物由来の
ニトリルヒドラターゼ酵素の作用によってニトリルを水
和してこれを対応するアミドに変換する方法において、
該ニトリルヒドラターゼが、ロドコッカス属ロドクロウ
ス種（Rhodococcus rhodochrous）の微生物をコバルト
イオン存在下に培養して得たものであること、を特徴と
するものである。

（効果）本発明によれば、鉄イオン含有培地ではニトリルヒドラ
ターゼ活性がゼロであるのに対して、コバルトイオン含
有培地ではじめてニトリルヒドラターゼ活性が発現す
る。ニトリルヒドラターゼ発現についてこの特定の微生
物の金属イオン要求性の臨界性は、全く思いがけなかっ
たことと解される。

また、本発明によれば、芳香族ニトリルの水和を有利に
行なうことができる。ビタミン原料等としてのニコチン
酸アミド（すなわち３−シアノピリジンの水和物）ある
いは抗結核薬として有用なピラジンアミド（すなわちシ
アノピラジンの水和物）の重要性からいって、本発明の
この効果は有用なものである。

〔発明の具体的説明〕

１．アミドの生物学的製造の基本的内容本発明は微生物由来のニトリルヒドラターゼの作用によ
ってニトリルを水和してこれをアミドに変換する方法で
あるが、この方法は基本的には微生物の培養およびニト
リルヒドラターゼの誘導ならびに得られたニトリルヒド
ラターゼの基質ニトリルに対する作用からなる。

これらは単位操作としてそれ自身公知であって、本発明
でも合目的的な任意の態様を採ることができる。本発明
で「微生物をコバルトイオン存在下に培養して得たもの
である」ということは、ニトリルヒドラターゼの誘導が
行なわれたことを当然の前提とするものである。

本発明が前提とする「微生物由来のニトリルヒドラター
ゼ酵素の作用によってニトリルを水和してこれを対応す
るアミドに変換する方法」は、ニトリルヒドラターゼの
作用のさせ方について合目的的な任意の態様を包含する
ものである。そのような態様の一つとして、微生物に産
生させた酵素を回収して、これを酵素標品として使用す
る方法があるが、このようなふつうの触媒反応のような
場合をも本発明では「生物学的製造法」として扱うもの
とする。

２．水和反応の詳細１）微生物本発明で使用する微生物は、ロドコッカス属ロドクロウ
ス種（Rhodococcus rhodochrous）のものである。

この種の株の代表的なものは、Ｊ−１株である。

Ｊ−１株の詳細は下記の通りである。

（１）由来および寄託Ｊ−１株は、本発明者らが京都市左京区の土壌から採取
したものであって、昭和６２年９月１８日に工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されて、ＦＥＲＭＢＰ−
１４７８号の受託番号を得ている。

（２）菌学的性質 (a)形態 (1)細胞の形および大きさ０．９〜１．０μ×３〜１０
μ (2)細胞の多形性の有無培養初期に長桿状を呈し、棍
棒状で湾曲なくスナッピングを伴った発育を示し、のち
に短桿菌状に断裂する (3)運動性なし (4)胞子の有無なし (5)グラム染色性陽性 (6)抗酸性陰性 (7)異染小体認められる (b)各培地における生育状態（３０℃） (1)肉汁寒天平板培養直径１mm（４８時間）円形、
不規則、平滑で表面乾き気味、扁平、不透明、淡オレン
ジピンク色 (2)肉汁寒天斜面培養糸状、表面平滑、断面はやや隆
起状で乾き気味、淡オレンジピンク色 (3)肉汁液体培養菌膜を形成し、旺盛に発育する。生
育するにしたがって、中程度の濁り、沈澱を生ずる。

(4)肉汁ゼラチン穿刺培養表面に良く生育、穿刺部に
そってロート状に発育するが、下層部にはほとんど発育
しない。ゼラチンは、液化は認められない。

(5)リトマスミルク変化しない (c)生物学的性質 (1)硝酸塩の還元陽性 (2)脱窒反応陰性 (3)ＭＲテスト陰性 (4)ＶＰテスト陰性 (5)インドールの生成陽性 (6)硫化水素の生成陽性 (7)デンプンの加水分解陰性 (8)クエン酸の利用コーサーの培地：陰性クリステンセンの培地：陽性 (9)無機窒素源の利用硝酸塩：陽性アンモニウム塩：陽性 (10)色素の生成陰性 (11)ウレアーゼ陽性 (12)オキシダーゼ陰性 (13)カタラーゼ陽性 (14)セルロースの陰性加水分解 (15)生育の範囲 pH：５〜１０温度：１０〜４１℃ (16)酸素に対する態度好気性 (17)チロシンの分解陽性 (18)アデニンの分解陽性 (19)ホスファターゼ陽性 (20)Ｔｗｅｅｎ８０陽性加水分解 (21)Ｏ−Ｆテスト０（弱い） (22)耐熱性（１０％スキなしムミルク中７２℃、１５分） (23)糖から酸および酸の生成ガスの生成ガスの生成Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース＋ − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース＋ − 麦芽糖＋ − ショ糖＋ − 乳糖 − − トレハロース − − Ｄ−ソルビット＋ − Ｄ−マンニット＋ − グリセリン＋ − (24)単一炭素源としての生育イノシトール − 麦芽糖＋Ｄ−マンニット＋ラムノース − Ｄ−ソルビット＋ｍ−ハイドロキシ安息香酸＋アジピン酸ナトリウム＋安息香酸ナトリウム＋クエン酸ナトリウム＋乳酸ナトリウム＋テストテトロン＋Ｌ−チロシン＋グリセリン(1％)(W/V) （＋）トレハロース（＋）ｐ−ハイドロキシ＋安息香酸(1％)(W/V) （＋）弱いが陽性である。

(25)脂肪酸と細胞壁分析不飽和、飽和直鎖脂肪酸、お
よびツベルクロステアリン酸を含む。ミコール酸のＴＬ
Ｃは単一スポットを与える。

以上の菌体的性質をバージーの細菌分類書（Bergy's Ma
nual of Systematic Bacteriology）(1986)に基づいて
分類すると、Ｊ−１株は、好気性、グラム陽性、弱抗酸
性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌であり、
鞭毛を着生しない。また、発育の初期過程で長桿菌状で
菌糸状を呈し、枝分れ（Branching）を伴なった発育を
示し、後に短桿菌状に断裂することよりノカルディア型
の細菌に属するものと認められる。

脂肪酸組成の分析は、ツベルクロステアリン酸を含む不
飽和、飽和の直鎖脂肪酸を含む。ミコール酸のＴＬＣは
標準菌Rodococcus rhodochrous(IFO 3338)と同じＲｆを
示す単一スポットを与えることから、Mycobacterium属
とは区別される。またミコール酸の組成（炭素数）から
Nocardia属とは区別される。その他生化学的諸性質の検
討から、本菌はRhodococcus rhodochousと認められる。

２）基質／ニトリル上記のような微生物の産生するニトリルヒドラターゼの
基質となるニトリルは、芳香族および脂肪族のモノニト
リルまたはジニトリル、就中モノニトリル、である。

本発明の特色を最もよく享受するのは、芳香族ニトリ
ル、特に芳香環を形成する炭素数が４〜１０のもの、で
ある。芳香族ニトリルの具体例のいくつかを例示すれば
下記の通りであって、下記の一般式〔Ｉ〕〜〔VI〕で示
される化合物が挙げられる。

例えば、４−、３−、および２−シアノピリジン、がそ
れである。

（ここで、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ、Ｈ、ＣＨ₃、Ｏ
Ｈ、ＯＣＨ₃、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＮＨ₂またはＮＯ₂であ
る。）例えば、ベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−およびｐ−クロロ
ベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−およびｐ−フルオロベンゾ
ニトリル、ｏ−およびｍ−ニトロベンゾニトリル、ｐ−
アミノベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−およびｐ−トルニト
リル、４−シアノフェノール、アニソニトリル、フタロ
ニトリル、イソフタロニトリル、テレフタロニトリル、
２，６−ジクロロベンゾニトリル、２，４−ジクロロベ
ンゾニトリル、２，６−ジフルオロベンゾニトリル、が
それである。

例えば、α−およびβ−ナフトニトリル、がそれであ
る。

（ここで、ＸはＳまたはＯである）例えば、２−チオフェンカルボニトリルおよび２−フロ
ニトリル、がそれである。

例えば、５−シアノインドール、がそれである。

すなわち、シアノピラジンである。

本発明で対象とするニトリルの他の一群は、脂肪族ニト
リルである。炭素数２〜６のモノまたはジニトリル、就
中モノニトリル、が適当である。生成アミドの有用性か
らいって、アクリロニトリルが代表的であり、また生産
性も良好である。

これらのニトリルに対応するアミドは、ＣＮ基がＣＯＮ
Ｈ₂基に変換されたものであることはいうまでもない。
なお、ジニトリルの場合はＣＮ基の少なくとも１個がＣ
ＯＮＨ₂に変換したものを対応するアミドと考えるもの
とする。

３）培養／ニトリルヒドラターゼの産生ロドコッカス属ロドクロウス種の微生物の培養は、培地
にコバルトイオンが存在するということを除けば、他の
条件に関してはそれが合目的的なものである限り制限は
ない。倍地中に酵素誘導剤（詳細後記）を存在させてお
いてニトリルヒドラターゼを菌体中に蓄積させることが
ふつうであることは前記したところである。

（１）基本培地適当な培地のいくつかを例示すれば、下記の通りであ
る。挙示の成分の量を変え、ある成分を他の成分と置き
かえ、ある成分を省略し、あるいは他の成分を追加する
ことは、当業者にとって容易であろう。

（イ）培地Ａ成分量（培地１中）ビタミン混合物^*1 ０．１ml Ｋ₂ＨＰＯ₄ １３．４ｇＫＨ₂ＰＯ₄ ６．５ｇＮａＣｌ
１．０ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．２ｇ蒸留水残部（pH７．０）＊１組成（溶液１中）ビオチン２μｇパントテン酸カルシウム０．４mg イノシトール２mg ニコチン酸０．４mg 塩酸チアミン０．４mg 塩酸ピリドキシン０．４mg ｐ−アミノ安息香酸０．２ｎｇリボフラビン０．２mg 葉酸０．０１ｎｇ蒸留水残部（ロ）培地Ｂグリセロール１０ｇペプトン５ｇモルトエキス３ｇイーストエキス３ｇ蒸留水残部（pH７．２）（ハ）培地Ｃイーストエキス３ｇＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇＫ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５ｇ蒸留水残部（pH７．２）（２）酵素誘導剤ロドコッカス属ロドクロウス種の微生物にニトリルヒド
ラターゼを誘導産生させる酵素誘導剤は、合目的的な任
意のものがありうる。

本発明で適当な誘導剤は、ニトリルおよびアミドが代表
的である。

Ｊ−１株についてその効果を確認している酵素誘導剤の
具体例を挙げれば、下記のものがある。

クロトンアミド、アセトニトリル、プロピオニトリル、
ベンズアミド、プロピオンアミド、アセトアミド、イソ
バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニト
リル、ｎ−カプロニトリル、３−ペンテンニトリル、ピ
バロニトリル、ｎ−ブチルアミド、イソブチルアミド、
ｎ−バレルアミド、ｎ−カプロンアミド、メタクリルア
ミド、フェニルアセトアミド。

（３）コバルト源上記のような酵素誘導剤を培地に存在させてもニトリル
ヒドラターゼは得られないので、本発明では培地にコバ
ルトイオンを存在させることが必須である。

培地が水性であるところより、コバルトイオンは水溶性
コバルト化合物を培地に添加することによって生成させ
ることがふつうである。水溶性のコバルト化合物は化学
辞典類の明らかにするところであり、適当なものを選択
使用することは（場合によっては簡単な予備試験を行な
って）当業者は容易であろう。代表的なコバルト化合物
は、たとえばＣｏ⁺⁺またはＣｏ⁺⁺⁺を与えるもの、特に
Ｃｏ⁺⁺を与えるもの、であって、具体的には塩化コバル
ト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、臭化コバルト、硼酸
コバルト、その他を例示することがてできる。

この他、本発明ではビタミンＢ₁₂および金属コバルトも
使用できる。ビタミンＢ₁₂中にはコバルトが錯体として
含まれており、培養の際イオン化する。また、金属コバ
ルトは培養中微生物による酸化力でイオン化する。

（４）培養ニトリルヒドラターゼを菌体内に産生蓄積させるための
培養は、使用微生物たとえばＪ−１株を前記のような培
地で適当な条件で実施すればよい。

酵素誘導剤の使用量は培地１リットル中２〜６ｇ程度で
あり、コバルトイオンの使用量は培地１リットル当りＣ
ｏＣｌ₂換算で５〜１５mg程度である。

具体的な培養培地組成を示せば、下記の通りである。

（イ）培地Ａ１リットルアセトニトリル（誘導剤）２ｇＣｏＣｌ₂ １０mg （ロ）培地Ｂ１リットルイソバレロニトリル（誘導剤）２ｇＣｏＣｌ₂ １０mg （ハ）培地Ｃ１クロトンアミド（誘導剤）２ｇＣｏＣｌ₂ １０mg このような培養培地で１５〜５０℃程度、好ましくは２
０〜４５℃程度、特に好ましくは３０℃前後、pH７〜９
で約３０時間以上、好ましくは４０時間以上（上限は、
たとえば１２０時間）、Ｊ−１株を振盪培養すれば、ニ
トリルヒドラターゼを有利に産生させることができる。
酵素誘導剤は培養当初から存在させることが好ましく、
特に高活性の菌体を調製するためには、たとえば２８℃
７６時間振盪培養するときに、２６時間目および５６時
間目にそれぞれ０．２％（ｗ／ｖ）の濃度となるように
クロトンアミドを培地に追加添加する方法を採ることが
望ましい。

４）ニトリルの水和本発明が前提とする「微生物由来のニトリルヒドラター
ゼ酵素の作用によってニトリルを水和してこれを対応す
るアミドに変換する方法」とは、ニトリルヒドラターゼ
の作用のさせ方について合目的的な種々の態様を包含す
るものであることは前記したところである。

そのような態様の一つは、微生物の培養系に基質のニト
リルを存在させておいて、培地中にアミドを生成させる
ことである。

ニトリルヒドラターゼを作用させる態様の他の一つは、
ニトリルヒドラターゼが蓄積されている培養液に基質ニ
トリルを添加して水和反応を行なわせることである。こ
の態様の改変例として、菌体を破砕した培養液を使用す
る方法が挙げられよう。

ニトリルヒドラターゼを作用させる態様のさらに他の一
つは、ニトリルヒドラターゼを蓄積した菌体を培養液か
ら分離して、好ましくはこれを適当な担体に担持させて
「固定化」して、基質と接触させる方法である。この方
法、特にこの好ましい態様は、上記の第二の態様と並ん
で、あるいは第二の態様以上に、工業的実施に適したも
のということができる。担体の種類および微生物の担持
方法を含めて、そして所謂バイオリアクターとしての固
定化微生物の利用も含めて、この技術は周知のものであ
る。

ニトリルヒドラターゼを作用させる態様の他の一つは、
ニトリルヒドラターゼ酵素標品を得て、この酵素によっ
ていわば非生物学的にニトリルを水和する方法である。
水和反応は、酵素活性が失なわれない範囲のpHおよび温
度条件で行なわれることはいうまでもなく、これらの条
件は一般に上記の生物学的手法でのそれと同じであると
いうことができる。このような酵素作用時に微生物が存
在しない態様も本発明では「生物学的製造法」として取
扱うことは前記した通りである。

本発明によるニトリルヒドラターゼは至適pHが７〜９、
最適pHが８．０である。反応液pHが７未満では、酵素の
活性は急激に低下する傾向がある。従って、反応液には
緩衝剤を添加することが望ましい。緩衝剤がリン酸カリ
ウムバッファー、トリス／ＨＣｌバッファー、ＨＥＰＥ
Ｓ／ＫＯＨバッファーおよびホウ酸ナトリウムバッファ
ーであっても、ニトリルヒドラターゼの酵素活性に差は
生じない。

培養液ないし水和反応液中の基質濃度は、基質の種類に
よっても異なるが、通常０．５〜１５モル／リットルで
あり、また反応温度は通常１０〜３０℃の範囲である。

３．実験例以下の実験例でニトリルヒドラターゼ活性の測定法およ
び活性の単位は、下記の通りに定義されたものである。

（１）ニトリルヒドラターゼ活性の測定法ニトリルヒドラターゼ活性は、ベンゾニトリル１０ｍ
Ｍ、リン酸カリウムバッファー（pH７．０）３０ｍＭ、
および所定量の菌体（培養液から分離したもの）を含む
反応混合液２mlについて、１０℃で５分間反応を行なわ
せてから０．２mlの１ＮＨＣｌを添加して反応を停止さ
せることによって測定する。

（２）ユニットの定義ニトリルヒドラターゼ活性の１ユニット（Ｕ）は、上記
の条件でベンゾニトリルからベンズアミドを１μモル／
分の速度で生成させる酵素の量、として定義されたもの
である。

参考例１下記の組成の培地および培養条件でＪ−１株を培養し、
その際にＣｏＣｌ₂および（または）ＦｅＳＯ₄を添加し
てニトリルヒドラターゼ活性の発現を調べた。

（イ）培地組成成分量（培地１中）ビタミン混合物３ml Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５ｇプロピオニトリル２ml 蒸留水残り（pH７．２）（ロ）培養条件２８℃／７０〜８０時間得られた結果は、下記の通りであった。

基本培地にＦｅＳＯ₄を添加してもニトリルヒドラター
ゼ活性は発現しないこと、ＣｏＣｌ₂の添加によってニ
トリルヒドラターゼ活性が発現すること、ならびにＣｏ
Ｃｌ₂添加系にＦｅＳＯ₄を添加しても結果はむしろ悪化
すること、が判る。

参考例２Ｊ−１株に対する各種のニトリルまたはアミドの酵素誘
導剤としての効果は、下表に示すとおりである。

下表の結果は、Ｊ−１株を前記の培地Ｂで前培養（２８
℃）し、同株が充分に増殖してから、ニトリルまたはア
ミドを前者については０．１％（ｖ／ｖ）、後者につい
ては０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、さらに０．０
０１％（ｗ／ｖ）ＣｏＣｌ₂を添加した前記培地Ｃに移
し、３６〜４８時間培養を行なったときのものである。

実施例１前記の培地ＣにＣｏＣｌ₂０．０１ｇ／リットルおよび
クロトンアミド２ｇ／リットルを添加してなる培地で培
養して得られるＪ−１株の菌体と各種のニトリルを基質
として用いて反応させた。反応は、培養液２mlより得ら
れる菌体、１０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（pH
８．０）および２００ｍＭの基質よりなる反応液（２m
l）を用い、２５℃で７６時間行なった。反応は０．２m
lの１ＮＨＣｌを加えて停止させ、各基質に対するニト
リルヒドラターゼ活性は反応生成物の生成量または基質
の消費をＨＰＬＣで測定して３−シアノピリジンを基質
として用いたときのニトリルヒドラターゼ活性に対する
比率（モル基準）、すなわち比活性（％）、として示し
た。

結果は、下記の通りであった。

基質比活性（％）３−シアノピリジン１００アクリロニトリル１０６４−シアノピリジン１２９２−シアノピリジン６４５−シアノインドール９２−チオフェンカルボニトリル１１６２−フロニトリル７１ベンゾニトリル８０４−シアノフェノール２４ｐ−アミノベンゾニトリル１６ｍ−ニトロベンゾニトリル７ｏ−ニトロベンゾニトリル１６ｍ−クロロベンゾニトリル２９ｐ−トルニトリル５ｏ−トルニトリル４６ｍ−トルニトリル３２アニソニトリル２０ｏ−クロロベンゾニトリル４１ｐ−クロロベンゾニトリル７２，４−ジクロロベンゾニトリル２２，６−ジクロロベンゾニトリル１シアノピラジン８０実施例２前記培地ＣにＣｏＣｌ₂０．０１ｇ／リットルおよびク
ロトンアミド２ｇ／リットルを添加してなる培地４００
mlを１リットルの坂口フラスコ中に入れ、Ｊ−１株を接
種し、そして振とう機上で２８℃で培養した。培養３０
時間と６０時間後に、クロトンアミドを０．２％（ｗ／
ｖ）（８００mg／４００ml）添加して培養を続け、培養
開始から８０時間の時点で培養を終えた。

菌体を遠心分離機（日立ＳＣＲ２０Ｂ）で、１２０００
ｇにて１５分間遠心分離することによって採取し、０．
８５％ＮａＣｌで洗浄し、再び遠心分離し、同液の４０
ml中に再び懸濁させた。その懸濁液の少量の試料を取
り、その中の菌体の乾燥重量を測定するのに用いた。

乾燥菌体２．３３mg相当を含む該懸濁液を１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（pH８．０）と４．５７Ｍの濃度の３
−シアノピリジンを含む反応液（４ml）に加え、さらに
反応開始３時間および６時間後に、それぞれ０．５５Ｍ
および０．４９Ｍの３−シアノピリジンを添加して、２
５℃で一夜反応を行った。培養開始から１８時間後の生
成ニコチン酸アミドの量は、５．５８Ｍであった。従っ
て、転換率は９９．５％であって、培養液１リットル当
り６８１ｇのニコチン酸アミドが蓄積されたことに対応
する。この濃度では反応混合物はニコチン酸アミドの析
出によって固化した。

なお、生成ニコチン酸アミドの同定は、これを結晶とし
て分離して、元素分析、ＩＲ、ＮＭＲおよび質量分析に
よって行なった。ニコチン酸の生成は検出されなかっ
た。

実施例３実施例２で得た菌体懸濁液（乾燥菌体２．３３mg相当）
を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と種々の
濃度のシアノピラジンを含む反応液（４ml）に加えた。
反応は２５℃で行い、６時間の反応で４Ｍのシアノピラ
ジンが、また９時間の反応で６Ｍのシアノピラジンが、
１００％の転換率でピラジンアミドに転換された。一
方、前記の２．３３mgの代りに乾燥重量４．６６mgに相
当する菌体を含む懸濁液を同様の反応液（４ml）に加え
た場合は、６時間の反応で７Ｍのシアノピラジンが、９
時間の反応で８Ｍのシアノピラジンが、１００％の転換
率でピラジンアミドに転換された。ピラジンカルボン酸
の生成は認められなかった。

ピラジンアミドは、それが生成するにつれて溶液から晶
出した。この結晶性沈澱物を直接回収し、メタノールか
ら再結晶させた。この結晶は元素分析、ＩＲ、ＮＭＲお
よび質量分析によりピラジンアミドと同定された。

なお、シアノピラジン、ピラジンアミドおよびピラジン
カルボン酸の分析は高速液体クロマトグラフィーによっ
て行なった。

以下の実施例においても本実施例と同様に分析を行っ
た。

実施例４実施例２で得た菌体懸濁液（乾燥菌体４．６６mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と３Ｍのメ
タクリロニトリルを含む反応液（４ml）に加え、されに
反応開始１時間および３時間後に、それぞれ３Ｍのメタ
クリロニトリルを添加し、２５℃で反応を行なったとこ
ろ、反応開始１２時間後に９Ｍのメタクリルアミドが１
００％の転換率で生成した。

また、上記反応において、反応開始５時間後にさらに１
Ｍのメタクリロニトリルを添加したところ、反応開始２
４時間後に１０Ｍのメタクリルアミドが１００％の転換
率で生成した。１０Ｍ濃度は、反応液１リットル当り８
５１ｇのメタクリルアミドが生成、蓄積されたことにな
る。

この反応液を水で希釈し、遠心分離処理（１２０００ｇ
１５分間）により菌体を除去し、エバポレーターで濃
縮、結晶化させ、次いでこの結晶を水に溶解して再結晶
させることによりメタクリルアミドの結晶を得た。

実施例５実施例２で得た菌体懸濁液（乾燥菌体４．６６mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と１Ｍのク
ロトンニトリルを含む反応液（４ml）に加え、さらに反
応開始後１時間毎に１Ｍのクロトンニトリルを５回添加
し、２５℃で反応を行なったところ、反応開始６時間後
に６Ｍのクロトンアミドが１００％の転化率で生成し
た。さらに、反応開始６時間および１０時間後に、それ
ぞれ１Ｍのクロトンニトリルを添加したところ、反応開
始１０時間および２２時間後に、それぞれ７Ｍおよび８
Ｍのクロトンアミドが１００％の転換率で生成した。８
Ｍ濃度は、反応液１リットル当たり６８１ｇのクロトン
アミドが生成、蓄積されたことになる。

クロトンアミドの結晶化は実施例４と同様に行った。

実施例６実施例２で得た菌体懸濁液（乾燥菌体４．６６mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と３Ｍのア
セトニトリルを含む反応液（４ml）に加え、さらに反応
開始１時間および３時間後にそれぞれ３Ｍ、および反応
開始６時間後に５Ｍ、のアセトニトリルを添加して２５
℃で反応を行ったところ、反応開始１２時間後に１４Ｍ
のアセトアミドが１００％の転換率で生成した。すなわ
ち、反応液１リットル当たり８２７ｇのアセトアミドが
生成、蓄積されたことになる。

この反応液を水で希釈し、遠心分離処理して菌体を除
き、その上澄液をエバポレーターにより濃縮、乾固し、
これをメタノールに溶解して結晶化させることによりア
セトアミドの結晶を得た。

実施例７実施例２で得た菌体懸濁液（乾燥菌体４．６６mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と３Ｍの３
−ヒドロキシプロピオニトリルを含む反応液（４ml）に
加え、さらに反応開始後１時間毎に３Ｍの３−ヒドロキ
シプロピオニトリルを４回添加して２５℃で反応を行っ
たところ、反応開始５時間後に１５Ｍの３−ヒドロキシ
プロピオアミドが１００％の転換率で生成した。ここで
さらに３Ｍの３−ヒドロキシプロピオニトリルを添加し
たところ、反応開始１１時間後に１８Ｍの３−ヒドロキ
シプロピオアミドが１００％の転換率で生成した。すな
わち、反応液１リットル当たり１６００ｇの３−ヒドロ
キシプロピオアミドが生成、蓄積されたことになる。

この反応液を水で希釈し、菌体を遠心分離で除去したの
ち、エバポレーターにより濃縮し、−２０℃で結晶化さ
せ、次いでこの結晶をイソプロパノールに溶解して再結
晶させることにより３−ヒドロキシプロピオアミドの結
晶を得た。

実施例８前記接地ＣにＣｏＣｌ₂０．０１ｇ／リットルおよびク
ロトンアミド２ｇ／リットルを添加してなる培地４００
mlを１リットルの坂口フラスコ中に入れ、Ｊ−１株を接
種し、そして振とう機上で２８℃で培養した。培養２６
時間と５６時間後に、クロトンアミドを０．２％（ｗ／
ｖ）（８００mg／４００ml）添加して培養を続け、培養
開始から７６時間の時点で培養を終えた。

菌体を遠心分離機（日立ＳＣＲ２０Ｂ）で、１００００
ｇにて２０分間遠心分離することによって採取し、０．
８５％ＮａＣｌで洗浄し、再び遠心分離し、同液の４０
ml中に再び懸濁させた。その懸濁液の少量の試料を取
り、その中の菌体の乾燥重量を測定するのに用いた。

乾燥菌体２．９６mg相当を含む該懸濁液を１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（pH８．０）と種々の濃度の３−シア
ノピリジンを含む反応液（４ml）に加えた。反応は２５
℃で行い、９時間の反応で８Ｍの３−シアノピリジン
が、また２２時間の反応で９Ｍの３−シアノピリジン
が、１００％の転換率でニコチン酸アミドに転換され
た。一方、前記の２．９６mgの代りに乾燥重量５．９２
mgに相当する菌体を含む懸濁液を同様の反応液（４ml）
に加えた場合は、５時間の反応で９Ｍの３−シアノピリ
ジンが、９時間の反応で１２Ｍの３−シアノピリジン
が、１００％の転換率でニコチン酸アミドに転換され
た。１２Ｍ濃度は、反応液１リットル当り１，４６５ｇ
ニコチン酸アミドが生成蓄積されたことになる。ニコチ
ン酸の生成は認められなかった。

ニコチン酸アミドは、それが生成するにつれて溶液から
晶出した。この結晶を回収し、メタノールから再結晶さ
せた。

実施例９実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５．９２mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と１Ｍのベ
ンゾニトリルを含む反応液（４ml）に加え、さらに反応
開始１、２、３、４、５および７時間後に、それぞれ１
Ｍのベンゾニトリルを添加し、２５℃で反応を行なった
ところ、反応開始２４時間後に７Ｍ（８４８ｇ／リット
ル）のベンズアミドが１００％の転換率で生成した。

実施例１０実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５．９２mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と０．５Ｍ
の２，６−ジフルオロベンゾニトリルを含む反応液（４
ml）に加え、さらに反応開始２、４、６および８時間後
に、それぞれ０．５Ｍの２，６−ジフルオロベンゾニト
リルを添加し、２５℃で反応を行なったところ、反応開
始２２時間後に２．５Ｍ（３９３ｇ／リットル）の２，
６−ジフルオロベンズアミドが１００％の転換率で生成
した。

実施例１１実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５．９２mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と１Ｍの２
−チオフェンカルボニトリルを含む反応液（４ml）に加
え、さらに反応開始１時間後に、１Ｍの２−チオフェン
カルボニトリルを添加し、２５℃で反応を行なったとこ
ろ、反応開始５時間後に２Ｍ（２５４ｇ／リットル）の
２−チオフェンカルボキサミドが１００％の転換率で生
成した。

実施例１２実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５．９２mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と１Ｍの２
−フロニトリルを含む反応液（４ml）に加え、さらに反
応開始１、２、４、６、８、１１および２３時間後に、
それぞれ１Ｍの２−フロニトリルを添加し、２５℃で反
応を行なったところ、反応開始３０時間後に８Ｍ（８８
８ｇ／リットル）の２−フランカルボキサミドが１００
％の転換率で生成した。

実施例１３実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５．９２mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と４Ｍの３
−インドールアセトニトリルを含む反応液（４ml）に加
え、２５℃で反応を行なったところ、反応開始２４時間
後に４Ｍ（６９７ｇ／リットル）の３−インドールアセ
トアミドが１００％の転換率で生成した。

実施例１４実施例２で得た菌体懸濁液（乾燥菌体４．６６mg相当）
を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）と３Ｍのア
クリロニトリルを含む反応液（４ml）に加え、さらに反
応開始０．５、１および２時間後に、それぞれ２Ｍのア
クリロニトリルを添加し、２５℃で反応を行なったとこ
ろ、反応開始８時間後に９Ｍ（６４０ｇ／リットル）の
アクリルアミドが１００％の転換率で生成した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 17/12 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物由来のニトリルヒドラターゼ酵素の
作用によってニトリルを水和してこれを対応するアミド
に変換する方法において、該ニトリルヒドラターゼが、
ロドコッカス属ロドクロウス種（Rhodococcus rhodochr
ous）の微生物をコバルトイオン存在下に培養して得た
ものであることを特徴とする、アミドの生物学的製造
法。
【請求項２】微生物が、ロドコッカス属ロドクロウス種
のＪ−１株（ＦＥＲＭＢＰ−１４７８号）である、請
求項１記載のアミドの生物学的製造法。
【請求項３】ニトリルが、芳香環を形成する炭素数が４
〜１０の芳香族ニトリルである、請求項１〜２のいずれ
か１項記載のアミドの生物学的製造法。
【請求項４】芳香族ニトリルが、下記の一般式〔Ｉ〕〜
〔VI〕で示される化合物のいずれかである、請求項３記
載のアミドの生物学的製造法。（ここで、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれＨ、ＣＨ₃、Ｏ
Ｈ、ＯＣＨ₃、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＮＨ₂またはＮＯ₂であ
る）（ここで、ＸはＳまたはＯである）
【請求項５】芳香族ニトリルが２−シアノピリジン、３
−シアノピリジンまたは４−シアノピリジンである、請
求項４記載のアミドの生物学的製造法。
【請求項６】芳香族ニトリルが３−シアノピリジンであ
る、請求項５記載のアミドの生物学的製造法。
【請求項７】芳香族ニトリルがシアノピラジンである、
請求項４記載のアミドの生物学的製造法。
【請求項８】ニトリルが、炭素数２〜６の脂肪族ニトリ
ルである、請求項１〜２のいずれか１項記載のアミドの
生物学的製造法。
【請求項９】炭素数２〜６の脂肪族ニトリルが、アクリ
ロニトリルである、請求項８記載のアミドの生物学的製
造法。