JP3163224B2 - 菌体または固定化菌体の懸濁液の保存方法 - Google Patents
菌体または固定化菌体の懸濁液の保存方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、菌体または固定化菌体
の懸濁液の保存方法、より詳しくは、微生物菌体を培養
により製造した後、得られた菌体またはその固定化物を
水性媒体中に懸濁した状態で安定に保存する方法に関す
る。
の懸濁液の保存方法、より詳しくは、微生物菌体を培養
により製造した後、得られた菌体またはその固定化物を
水性媒体中に懸濁した状態で安定に保存する方法に関す
る。
【０００２】微生物の産生する酵素は、化学変換反応の
触媒として多くの場面で使用されている。とりわけ、ニ
トリル基の水和または加水分解能を有するニトリルヒド
ラターゼ、ニトリラーゼ等の利用は、化学工業上重要な
アミド、カルボン酸、α−ヒドロキシカルボン酸等の安
価な製造を可能にする。さらに、光学特異的水和または
光学特異的加水分解能をもつ該酵素の利用は、医薬、農
薬の製造原料として重要な光学活性カルボン酸、アミノ
酸、α−ヒドロキシカルボン酸等の製造も可能にする。
触媒として多くの場面で使用されている。とりわけ、ニ
トリル基の水和または加水分解能を有するニトリルヒド
ラターゼ、ニトリラーゼ等の利用は、化学工業上重要な
アミド、カルボン酸、α−ヒドロキシカルボン酸等の安
価な製造を可能にする。さらに、光学特異的水和または
光学特異的加水分解能をもつ該酵素の利用は、医薬、農
薬の製造原料として重要な光学活性カルボン酸、アミノ
酸、α−ヒドロキシカルボン酸等の製造も可能にする。
【０００３】
【従来の技術】微生物酵素を触媒とする化学変換反応に
おいては、培養、集菌した微生物細胞またはその固定化
物を使用時まで安定に保存しておく必要がある。すなわ
ち、酵素の触媒能が失われたり、低下したりすることな
く、また雑菌が混入して、腐敗したり、あるいは溶菌し
たりしないように保存しておかなければならない。そこ
で一般的には、凍結や冷蔵などの手法で酵素の失活や溶
菌、腐敗等を抑制し保存されている。
おいては、培養、集菌した微生物細胞またはその固定化
物を使用時まで安定に保存しておく必要がある。すなわ
ち、酵素の触媒能が失われたり、低下したりすることな
く、また雑菌が混入して、腐敗したり、あるいは溶菌し
たりしないように保存しておかなければならない。そこ
で一般的には、凍結や冷蔵などの手法で酵素の失活や溶
菌、腐敗等を抑制し保存されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】これまでに知られてい
る保存方法のうち、菌体あるいは固定化菌体粒子を凍結
する方法では、凍結、融解操作が煩雑であり、またその
操作に伴い酵素活性が失われたり、低下したりする可能
性がある。また冷蔵して保存する方法では雑菌の混入防
止と菌体細胞の安定化のために、比較的低温での保存が
必要となり、冷却コスト面での負担が大きい。
る保存方法のうち、菌体あるいは固定化菌体粒子を凍結
する方法では、凍結、融解操作が煩雑であり、またその
操作に伴い酵素活性が失われたり、低下したりする可能
性がある。また冷蔵して保存する方法では雑菌の混入防
止と菌体細胞の安定化のために、比較的低温での保存が
必要となり、冷却コスト面での負担が大きい。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、培養、集
菌した菌体またはその固定化物を、安価でしかも安定的
に保存する条件について鋭意検討した結果、菌体または
その固定化物をｐＨ７〜１０で且つ１００ｍＭ乃至飽和
濃度の無機塩類水溶液中に保存することで、室温下でも
溶菌や酵素の失活を起こさず、３００日以上もの安定保
存が可能であることを見い出し、本発明に至った。
菌した菌体またはその固定化物を、安価でしかも安定的
に保存する条件について鋭意検討した結果、菌体または
その固定化物をｐＨ７〜１０で且つ１００ｍＭ乃至飽和
濃度の無機塩類水溶液中に保存することで、室温下でも
溶菌や酵素の失活を起こさず、３００日以上もの安定保
存が可能であることを見い出し、本発明に至った。
【０００６】すなわち、本発明は、ニトリルヒドラター
ゼ活性またはニトリラーゼ活性を有する微生物菌体また
はその固定化物を水性媒体に懸濁した状態で、酵素活性
および菌体細胞を長期間安定に保存する方法において、
該水性媒体がｐＨ７〜１０で且つ１００ｍＭ乃至飽和濃
度の無機塩類水溶液であることを特徴とする菌体または
固定化菌体の懸濁液の保存方法、である。
ゼ活性またはニトリラーゼ活性を有する微生物菌体また
はその固定化物を水性媒体に懸濁した状態で、酵素活性
および菌体細胞を長期間安定に保存する方法において、
該水性媒体がｐＨ７〜１０で且つ１００ｍＭ乃至飽和濃
度の無機塩類水溶液であることを特徴とする菌体または
固定化菌体の懸濁液の保存方法、である。
【０００７】本発明の無機塩類水溶液は、燐酸塩、硼酸
塩、硫酸塩、亜硫酸塩および塩酸塩から選ばれた少なく
とも１種の塩の水溶液であり、燐酸塩および硼酸塩の水
溶液は、それぞれ所謂、燐酸緩衝液および硼酸緩衝液で
あることが好ましい。また、塩の種類としては、ナトリ
ウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等である。
塩、硫酸塩、亜硫酸塩および塩酸塩から選ばれた少なく
とも１種の塩の水溶液であり、燐酸塩および硼酸塩の水
溶液は、それぞれ所謂、燐酸緩衝液および硼酸緩衝液で
あることが好ましい。また、塩の種類としては、ナトリ
ウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等である。
【０００８】本発明の無機塩類水溶液の濃度は、１００
ｍＭから飽和濃度の高濃度水溶液である。飽和濃度は塩
の種類および温度によって異なるが、通常３００〜５０
０ｍＭの濃度範囲とすることが好ましい。
ｍＭから飽和濃度の高濃度水溶液である。飽和濃度は塩
の種類および温度によって異なるが、通常３００〜５０
０ｍＭの濃度範囲とすることが好ましい。
【０００９】また、無機塩類水溶液のｐＨとしては７〜
１０であるが、好ましくは７．５〜９．５に調整する。
１０であるが、好ましくは７．５〜９．５に調整する。
【００１０】本発明の対象となる酵素活性および該酵素
活性を有する微生物は、ニトリルヒドラターゼ活性また
はニトリラーゼ活性を持つ微生物が挙げられる。
活性を有する微生物は、ニトリルヒドラターゼ活性また
はニトリラーゼ活性を持つ微生物が挙げられる。
【００１１】ニトリルヒドラターゼ、ニトリラ−ゼを産
生する微生物としては、多くのものが知られているが、
高い酵素活性を有するロドコッカス属、ゴルドナ属等の
微生物が好適である。
生する微生物としては、多くのものが知られているが、
高い酵素活性を有するロドコッカス属、ゴルドナ属等の
微生物が好適である。
【００１２】具体的には、ロドコッカス ｓｐ．ＨＴ４
０−６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１７７４）、ロドコッカス
ロドクロウス ＡＴＣＣ３３２７８株、ロドコッカス
ロドクロウス Ｊ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７
８）およびゴルドナ テラエＭＡ−１株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５３５）等を挙げることができる。
０−６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１７７４）、ロドコッカス
ロドクロウス ＡＴＣＣ３３２７８株、ロドコッカス
ロドクロウス Ｊ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７
８）およびゴルドナ テラエＭＡ−１株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５３５）等を挙げることができる。
【００１３】これらの菌株のうち、ロドコッカス ロド
クロウス ＡＴＣＣ３３２７８株は公知であり、アメリ
カンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より容
易に入手することができる。また、ロドコッカス ｓ
ｐ．ＨＴ４０−６株およびロドコッカス ロドクロウス
Ｊ−１株も公知であり、上記番号にて工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されており、菌学的性質はそ
れぞれ特開平４−２２２５９１号公報および特公平６−
５５１４８号公報に記載されている。
クロウス ＡＴＣＣ３３２７８株は公知であり、アメリ
カンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より容
易に入手することができる。また、ロドコッカス ｓ
ｐ．ＨＴ４０−６株およびロドコッカス ロドクロウス
Ｊ−１株も公知であり、上記番号にて工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されており、菌学的性質はそ
れぞれ特開平４−２２２５９１号公報および特公平６−
５５１４８号公報に記載されている。
【００１４】ゴルドナ テラエ ＭＡ−１株は本発明者
の一部らにより土壌より見い出され、同様に工業技術院
生命工学工業技術研究所に上記番号にて寄託されてい
る。本菌の菌学的性質は以下に示すとおりである。
の一部らにより土壌より見い出され、同様に工業技術院
生命工学工業技術研究所に上記番号にて寄託されてい
る。本菌の菌学的性質は以下に示すとおりである。
【００１５】 ＭＡ−１株 形 態 多形性桿菌 グラム染色性 ＋ 芽 胞 − 運 動 性 − オキシダーゼ − カタラーゼ ＋ 集落の色調 ピンクないしオレンジ rod-coccus cycle ＋ 集落周辺細胞の伸長 認める 気菌糸の形成 認めず 酸素に対する態度 好気性 細胞壁のジアミノ酸 meso-ジアミノピメリン酸 グリコリル試験 ＋（グリコリル型） 細胞壁の糖組成 アラビノース ＋ ガラクトース ＋ キノン系 MK-9(H2 ) アデニン分解 − チロシン分解 − 尿素分解 ＋ 資化性 イノシトール − マルトース − マンニトール ＋ ラムノース ＋ ソルビトール ＋ m-ヒドロキシ−安息香酸ナトリウム − 安息香酸ナトリウム ＋ クエン酸ナトリウム ＋ 乳酸ナトリウム ＋ テストステロン ＋ アセトアミド − ピルビン酸ナトリウム ＋ 0.02% アゾ化ナトリウム存在下での生育 ＋ 10℃での生育 ＋ 40℃での生育 ＋ 0.001%クリスタルバイオレット存在下での生育 ＋ 0.3%フェニルエタノール存在下での生育 ＋ 5%NaCl存在下での生育 ＋ 7%NaCl存在下での生育 ＋
【００１６】以上の菌学的性質をバージェーの細菌分類
書〔Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (19
86) 〕、J. Gen. appl. Microbiol., 34, 341-348 (198
8)および Int. J. Syst. Bacteriol. 39, 371 (1989)に
基づいて分類すると、ＭＡ−１株はゴルドナ属テラエ種
(Gordona terrae)に属する細菌と同定された。
書〔Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (19
86) 〕、J. Gen. appl. Microbiol., 34, 341-348 (198
8)および Int. J. Syst. Bacteriol. 39, 371 (1989)に
基づいて分類すると、ＭＡ−１株はゴルドナ属テラエ種
(Gordona terrae)に属する細菌と同定された。
【００１７】次に、本発明の一般的実施態様について説
明する。本発明に使用される微生物の培養は、資化し得
る炭素源（グルコース、フラクトース等）、窒素源（酵
母エキス、ペプトン、硫酸アンモニウム等）、無機塩
（塩化マグネシウム、塩化第二鉄、リン酸二ナトリウム
等）、またニトリルヒドラターゼやニトリラーゼの活性
誘導を行うために酵素の補欠分子族となる金属塩（塩化
コバルト、硫酸第二鉄等）、誘導剤としてのニトリル類
（ベンゾニトリル、イソブチロニトリル、サクシノニト
リル等）、アミド類（ε−カプロラクタム、イソブチル
アミド、プロピオンアミド等）、等を添加して行う。培
養液のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは６〜９の範
囲、培養の温度は２０〜４０℃の範囲、好ましくは２５
〜３５℃の範囲で、１〜７日間好気的に行い、活性が最
大となるまで培養すればよい。
明する。本発明に使用される微生物の培養は、資化し得
る炭素源（グルコース、フラクトース等）、窒素源（酵
母エキス、ペプトン、硫酸アンモニウム等）、無機塩
（塩化マグネシウム、塩化第二鉄、リン酸二ナトリウム
等）、またニトリルヒドラターゼやニトリラーゼの活性
誘導を行うために酵素の補欠分子族となる金属塩（塩化
コバルト、硫酸第二鉄等）、誘導剤としてのニトリル類
（ベンゾニトリル、イソブチロニトリル、サクシノニト
リル等）、アミド類（ε−カプロラクタム、イソブチル
アミド、プロピオンアミド等）、等を添加して行う。培
養液のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは６〜９の範
囲、培養の温度は２０〜４０℃の範囲、好ましくは２５
〜３５℃の範囲で、１〜７日間好気的に行い、活性が最
大となるまで培養すればよい。
【００１８】遠心集菌した菌は硼酸緩衝液、燐酸緩衝液
等で１〜２回洗浄する。次いで、終濃度が目的の濃度と
なるように菌体懸濁液と前記無機塩類水溶液とを混合す
る。
等で１〜２回洗浄する。次いで、終濃度が目的の濃度と
なるように菌体懸濁液と前記無機塩類水溶液とを混合す
る。
【００１９】菌体を固定化して用いる場合は、通常、洗
浄した菌体の懸濁液を以下の処方により固定化後、造粒
する。すなわち、洗浄菌体の懸濁液に、アクリル系のモ
ノマー（例えば、アクリルアミド、アクリル酸、メタク
リルアミド、メタクリル酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリル
アミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ジメチルア
ミノプロピルアクリレート、ジメチルアミノプロピルメ
タアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミ
ド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、ジエチ
ルアミノプロピルアクリルアミド、ジエチルアミノプロ
ピルメタクリルアミド等）の１種もしくは２種類以上と
架橋剤（例えば、メチレンビスアクリルアミド、メチレ
ンビスメタアクリルアミド、１，２−ジヒドロキシエチ
レンビスアクリルアミド、ビスアクリルアミド酢酸等）
の混合液を添加し、これに通常用いられている重合開始
剤および促進剤、例えば、過硫酸アンモニウムおよび
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを
加えて重合、ゲル化させる。これを粒子状に切断し、硼
酸緩衝液、燐酸緩衝液等で再洗浄した後、菌体の場合と
同様に、無機塩類水溶液と混合する。
浄した菌体の懸濁液を以下の処方により固定化後、造粒
する。すなわち、洗浄菌体の懸濁液に、アクリル系のモ
ノマー（例えば、アクリルアミド、アクリル酸、メタク
リルアミド、メタクリル酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリル
アミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ジメチルア
ミノプロピルアクリレート、ジメチルアミノプロピルメ
タアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミ
ド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、ジエチ
ルアミノプロピルアクリルアミド、ジエチルアミノプロ
ピルメタクリルアミド等）の１種もしくは２種類以上と
架橋剤（例えば、メチレンビスアクリルアミド、メチレ
ンビスメタアクリルアミド、１，２−ジヒドロキシエチ
レンビスアクリルアミド、ビスアクリルアミド酢酸等）
の混合液を添加し、これに通常用いられている重合開始
剤および促進剤、例えば、過硫酸アンモニウムおよび
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを
加えて重合、ゲル化させる。これを粒子状に切断し、硼
酸緩衝液、燐酸緩衝液等で再洗浄した後、菌体の場合と
同様に、無機塩類水溶液と混合する。
【００２０】なお、固定化における、菌体およびモノマ
ー混合液の量的関係は、菌体が乾燥重量換算、通常０．
１〜４０重量％、好ましくは１〜２０重量％であり、モ
ノマー混合液が、通常２〜３０重量％、好ましくは５〜
１５重量％である。
ー混合液の量的関係は、菌体が乾燥重量換算、通常０．
１〜４０重量％、好ましくは１〜２０重量％であり、モ
ノマー混合液が、通常２〜３０重量％、好ましくは５〜
１５重量％である。
【００２１】保存時の菌体濃度および固定化菌体粒子濃
度は特に制限は無いが、乾燥菌体換算、０．１〜３０重
量％の範囲とすればよい。また、保存温度は通常０〜４
０℃、好ましくは０〜３５℃である。
度は特に制限は無いが、乾燥菌体換算、０．１〜３０重
量％の範囲とすればよい。また、保存温度は通常０〜４
０℃、好ましくは０〜３５℃である。
【００２２】なお、さらに保存時の腐敗等を防止するた
め、保存液に防菌または防黴効果のある薬剤やエチレン
ジアミン四酢酸等の上記以外の塩類を添加することも可
能である。
め、保存液に防菌または防黴効果のある薬剤やエチレン
ジアミン四酢酸等の上記以外の塩類を添加することも可
能である。
【００２３】保存菌体、固定化菌体粒子を変換反応触媒
として生産反応に使用する場合は、これらの懸濁液を反
応液中に直接投入するか、もしくは必要に応じてこれら
を洗浄した後に使用すればよい。
として生産反応に使用する場合は、これらの懸濁液を反
応液中に直接投入するか、もしくは必要に応じてこれら
を洗浄した後に使用すればよい。
【００２４】
【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明す
る。
る。
【００２５】実施例１ （１）培養 ニトリラ−ゼ活性を有するゴルドナ テラエ ＭＡ−１
株を、酵素活性誘導剤として１ーシクロヘキセニルアセ
トニトリルを添加した下記の培地にて、３０℃、７２時
間好気的に培養した。 培地組成（ｐＨ７．５） グルコース ３０ｇ グルタミン酸ナトリウム １５ｇ 酵母エキス ８ｇ 燐酸二ナトリウム ７．１ｇ 燐酸一カリウム ６．８ｇ 硫酸ナトリウム ２．８ｇ 塩化マグネシウム ０．４ｇ 塩化カルシウム ０．０４ｇ 硫酸マンガン ０．０３ｇ 塩化鉄 ０．００６ｇ 硫酸亜鉛 ０．００３ｇ １−シクロヘキセニルアセトニトリル ０．５ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ
株を、酵素活性誘導剤として１ーシクロヘキセニルアセ
トニトリルを添加した下記の培地にて、３０℃、７２時
間好気的に培養した。 培地組成（ｐＨ７．５） グルコース ３０ｇ グルタミン酸ナトリウム １５ｇ 酵母エキス ８ｇ 燐酸二ナトリウム ７．１ｇ 燐酸一カリウム ６．８ｇ 硫酸ナトリウム ２．８ｇ 塩化マグネシウム ０．４ｇ 塩化カルシウム ０．０４ｇ 硫酸マンガン ０．０３ｇ 塩化鉄 ０．００６ｇ 硫酸亜鉛 ０．００３ｇ １−シクロヘキセニルアセトニトリル ０．５ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ
【００２６】（２）保存用菌体懸濁液の作製 培養終了液を４５ｍｌずつ５本に分け、遠心集菌（１
０，０００ｒｐｍ、１５分、１０℃）し、それぞれ４５
ｍｌの５０（比較例）、１００、３００、５００および
７００ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ８．０、Ｋ2 ＨＰＯ4 −
ＫＨ2 ＰＯ4 ）で１回菌体を洗浄した後、洗浄に用いた
各濃度の燐酸緩衝液４５ｍｌに再懸濁した。菌体懸濁液
は１５ｍｌずつ３本の蓋付きガラス容器に小分けして
５、２０、３０℃の暗所に保存した。保存０、１２０、
３００日後に菌体懸濁液の一部を取り出して活性測定を
行った。
０，０００ｒｐｍ、１５分、１０℃）し、それぞれ４５
ｍｌの５０（比較例）、１００、３００、５００および
７００ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ８．０、Ｋ2 ＨＰＯ4 −
ＫＨ2 ＰＯ4 ）で１回菌体を洗浄した後、洗浄に用いた
各濃度の燐酸緩衝液４５ｍｌに再懸濁した。菌体懸濁液
は１５ｍｌずつ３本の蓋付きガラス容器に小分けして
５、２０、３０℃の暗所に保存した。保存０、１２０、
３００日後に菌体懸濁液の一部を取り出して活性測定を
行った。
【００２７】（３）ニトリラーゼ活性の測定 菌体保存液を少量取り、遠心集菌（１，５０００ｒｐ
ｍ、５分、１０℃）し、２倍量の５０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ８．０、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −ＫＨ2 ＰＯ4 ）で菌体
を２回洗浄後、１００ｍＭ亜硫酸ナトリウムを含む同様
の燐酸緩衝液に懸濁した。ニトリラーゼ活性の測定は、
基質のマンデロニトリルの菌体懸濁液への添加にて反応
を開始し（マンデロニトリル２０ｍＭ）、３０℃、３０
分の振とうの後に、遠心除菌（１，５０００ｒｐｍ、５
分、１０℃）して反応を停止した。遠心上清中に含まれ
るＲ−マンデル酸生成量は、液体クロマトグラフィー
（カラム；Ｗａｋｏｓｉｌ ０ＤＳ ５Ｃ１８，溶離
液；０．１Ｍ燐酸：アセトニトリル＝３：１，検出波
長；２５４ｎｍ）で分析した。
ｍ、５分、１０℃）し、２倍量の５０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ８．０、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −ＫＨ2 ＰＯ4 ）で菌体
を２回洗浄後、１００ｍＭ亜硫酸ナトリウムを含む同様
の燐酸緩衝液に懸濁した。ニトリラーゼ活性の測定は、
基質のマンデロニトリルの菌体懸濁液への添加にて反応
を開始し（マンデロニトリル２０ｍＭ）、３０℃、３０
分の振とうの後に、遠心除菌（１，５０００ｒｐｍ、５
分、１０℃）して反応を停止した。遠心上清中に含まれ
るＲ−マンデル酸生成量は、液体クロマトグラフィー
（カラム；Ｗａｋｏｓｉｌ ０ＤＳ ５Ｃ１８，溶離
液；０．１Ｍ燐酸：アセトニトリル＝３：１，検出波
長；２５４ｎｍ）で分析した。
【００２８】活性は１ｍｇ乾燥菌体が１分間に反応液１
ｍｌ中で１μｍｏｌのマンデル酸を生成する能力を１ユ
ニット（１Ｕ）と定義した。また、保存液１ｍｌの活性
量は１ｍｇ乾燥菌体の活性と保存液１ｍｌ中に存在する
乾燥菌体量（ｍｇ）を乗じることにより求めた。
ｍｌ中で１μｍｏｌのマンデル酸を生成する能力を１ユ
ニット（１Ｕ）と定義した。また、保存液１ｍｌの活性
量は１ｍｇ乾燥菌体の活性と保存液１ｍｌ中に存在する
乾燥菌体量（ｍｇ）を乗じることにより求めた。
【００２９】（４）結果 表−１に、０日目の保存液１ｍｌの活性量を１．０とし
たときの相対値を示した。
たときの相対値を示した。
【００３０】
【００３１】実施例２ 実施例１の培養終了液２０ｍｌずつを６本の遠心管に取
り集菌（１０，０００ｒｐｍ、１５分、１０℃）し、そ
れぞれ同量の５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０、Ｋ2 Ｈ
ＰＯ4 −ＫＨ2 ＰＯ4 ）で１回菌体を洗浄した後、３０
０ｍＭ硫酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、３
００ｍＭ塩化カリウムまたは１００ｍＭ亜硫酸ナトリウ
ムを含む上記５０ｍＭ燐酸緩衝液２０ｍｌに再懸濁し
た。また、塩類無添加の再懸濁液（比較例）も用意し
た。これらの菌体懸濁液は２０℃、６０日間暗所にて保
存した。実施例１と同様に保存液１ｍｌの活性量を測定
し、０日目の活性を１．０としたときの相対値を表−２
に示した。
り集菌（１０，０００ｒｐｍ、１５分、１０℃）し、そ
れぞれ同量の５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０、Ｋ2 Ｈ
ＰＯ4 −ＫＨ2 ＰＯ4 ）で１回菌体を洗浄した後、３０
０ｍＭ硫酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、３
００ｍＭ塩化カリウムまたは１００ｍＭ亜硫酸ナトリウ
ムを含む上記５０ｍＭ燐酸緩衝液２０ｍｌに再懸濁し
た。また、塩類無添加の再懸濁液（比較例）も用意し
た。これらの菌体懸濁液は２０℃、６０日間暗所にて保
存した。実施例１と同様に保存液１ｍｌの活性量を測定
し、０日目の活性を１．０としたときの相対値を表−２
に示した。
【００３２】
【００３３】実施例３ 実施例１の培養終了液２０ｍｌずつを３本の遠心管に取
り集菌（１０，０００ｒｐｍ、１５分、１０゜Ｃ）し、
それぞれｐＨ６．０（比較例）、７．０および８．０の
３００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −
ＫＨ2 ＰＯ4 ）２０ｍｌで１回菌体を洗浄した後、洗浄
に用いた各ｐＨの燐酸緩衝液２０ｍｌに再懸濁した。こ
れらの菌体懸濁液は２０℃、６０日間暗所にて保存し
た。実施例１と同様に保存液１ｍｌの活性量を測定し、
０日目の活性を１．０としたときの相対値を表−３に示
した。
り集菌（１０，０００ｒｐｍ、１５分、１０゜Ｃ）し、
それぞれｐＨ６．０（比較例）、７．０および８．０の
３００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −
ＫＨ2 ＰＯ4 ）２０ｍｌで１回菌体を洗浄した後、洗浄
に用いた各ｐＨの燐酸緩衝液２０ｍｌに再懸濁した。こ
れらの菌体懸濁液は２０℃、６０日間暗所にて保存し
た。実施例１と同様に保存液１ｍｌの活性量を測定し、
０日目の活性を１．０としたときの相対値を表−３に示
した。
【００３４】
【００３５】実施例４ （１）培養 ニトリルヒドラタ−ゼ活性を有するロドコッカス ｓ
ｐ．ＨＴ４０−６株を、酵素活性誘導剤としてε−カプ
ロラクタムを含む下記の培地にて、３０℃、９６時間好
気的に培養した。 培地組成（ｐＨ７．５） グルコース ２７ｇ ポリペプトン ４ｇ 酵母エキス ２ｇ 燐酸二ナトリウム ７．１ｇ 燐酸一カリウム ６．８ｇ 硝酸アンモニウム ２ｇ 塩化マグネシウム ０．４ｇ 硫酸アンモニウム ０．２ｇ 塩化カルシウム ０．０４ｇ 硫酸マンガン ０．０３ｇ 塩化コバルト・６水塩 ０．０３ｇ 塩化鉄 ０．００６ｇ 硫酸亜鉛 ０．００３ｇ ε−カプロラクタム ４ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ
ｐ．ＨＴ４０−６株を、酵素活性誘導剤としてε−カプ
ロラクタムを含む下記の培地にて、３０℃、９６時間好
気的に培養した。 培地組成（ｐＨ７．５） グルコース ２７ｇ ポリペプトン ４ｇ 酵母エキス ２ｇ 燐酸二ナトリウム ７．１ｇ 燐酸一カリウム ６．８ｇ 硝酸アンモニウム ２ｇ 塩化マグネシウム ０．４ｇ 硫酸アンモニウム ０．２ｇ 塩化カルシウム ０．０４ｇ 硫酸マンガン ０．０３ｇ 塩化コバルト・６水塩 ０．０３ｇ 塩化鉄 ０．００６ｇ 硫酸亜鉛 ０．００３ｇ ε−カプロラクタム ４ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ
【００３６】（２）保存用菌体懸濁液の作製 培養終了液を４５ｍｌずつ５本に分け、遠心集菌（１
０，０００ｒｐｍ、１５分、１０゜Ｃ）し、それぞれ４
５ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０、Ｋ2ＨＰＯ
4 −ＫＨ2 ＰＯ4 ）（比較例）および３００ｍＭの燐酸
緩衝液（ｐＨ８．０、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −ＫＨ2 ＰＯ4 ）
で１回菌体を洗浄した後、洗浄に用いた各濃度の燐酸緩
衝液２０ｍｌに再懸濁した。これらの菌体懸濁液を２０
℃、１２０日間、暗所に保存し、０日目と１２０日目に
菌体懸濁液の一部を取り出して活性測定を行った。
０，０００ｒｐｍ、１５分、１０゜Ｃ）し、それぞれ４
５ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０、Ｋ2ＨＰＯ
4 −ＫＨ2 ＰＯ4 ）（比較例）および３００ｍＭの燐酸
緩衝液（ｐＨ８．０、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −ＫＨ2 ＰＯ4 ）
で１回菌体を洗浄した後、洗浄に用いた各濃度の燐酸緩
衝液２０ｍｌに再懸濁した。これらの菌体懸濁液を２０
℃、１２０日間、暗所に保存し、０日目と１２０日目に
菌体懸濁液の一部を取り出して活性測定を行った。
【００３７】（３）ニトリルヒドラターゼ活性の測定 実施例１に示したニトリラーゼ活性の測定法と同じ条件
および手法にて反応を行い生成物（マンデルアミド）を
実施例１と同じ条件で、液体クロマトグラフィーを用い
て定量した。
および手法にて反応を行い生成物（マンデルアミド）を
実施例１と同じ条件で、液体クロマトグラフィーを用い
て定量した。
【００３８】（４）結果 表−４に０日目の保存液１ｍｌの活性量を１．０とした
ときの相対値を示した。
ときの相対値を示した。
【００３９】実施例５ ゴルドナ テラエ ＭＡ−１株およびロドコッカス ｓ
ｐ．ＨＴ４０−６株をそれぞれ実施例１および実施例４
の方法により培養した。培養終了液をそれぞれ２０ｍｌ
取り遠心集菌（１０，０００ｒｐｍ、１５分、１０゜
Ｃ）し、菌体を同量の１００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ
９．０、Ｎａ2 Ｂ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 Ｏ−ＨＣｌ）で１回
洗浄した後、２０ｍｌの同緩衝液に再懸濁した。これら
の菌体懸濁液を２０℃、２００日間暗所にて保存し、０
日目と２００日目の保存液１ｍｌの活性量をそれぞれ実
施例１および実施例４に示した手法により求め、０日目
の保存液１ｍｌの活性量を１．０としたときの相対値を
表−５に示した。
ｐ．ＨＴ４０−６株をそれぞれ実施例１および実施例４
の方法により培養した。培養終了液をそれぞれ２０ｍｌ
取り遠心集菌（１０，０００ｒｐｍ、１５分、１０゜
Ｃ）し、菌体を同量の１００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ
９．０、Ｎａ2 Ｂ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 Ｏ−ＨＣｌ）で１回
洗浄した後、２０ｍｌの同緩衝液に再懸濁した。これら
の菌体懸濁液を２０℃、２００日間暗所にて保存し、０
日目と２００日目の保存液１ｍｌの活性量をそれぞれ実
施例１および実施例４に示した手法により求め、０日目
の保存液１ｍｌの活性量を１．０としたときの相対値を
表−５に示した。
【００４０】
【００4 １】実施例６ （１）固定化菌体粒子調製 ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロド
クロスＪ−１株を、グルコース２％、尿素１％、ペプト
ン０．５％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０
５％（何れも重量％）を含む培地（ｐＨ７．０）によ
り、好気的に培養した。これを５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）にて洗浄して得た菌体懸濁液（乾燥菌体２０
重量％）５００ｇに、アクリルアミド、メチレンビスア
クリルアミドおよび２−ジメチルアミノプロピルメタク
リルアミドが、それぞれ２０、２および２重量％濃度の
モノマー混合液５００ｇを加え、よく懸濁した。これに
５０重量％過硫酸アンモニウム２ｇ、５０重量％のＮ，
Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン２ｇを加
え、重合、ゲル化させた。これを、約１ｍｍ角の立方体
に切断後、２０ｍＭの硫酸ナトリウム１０００ｍｌで５
回洗浄し、固定化菌体粒子を得た。
クロスＪ−１株を、グルコース２％、尿素１％、ペプト
ン０．５％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０
５％（何れも重量％）を含む培地（ｐＨ７．０）によ
り、好気的に培養した。これを５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）にて洗浄して得た菌体懸濁液（乾燥菌体２０
重量％）５００ｇに、アクリルアミド、メチレンビスア
クリルアミドおよび２−ジメチルアミノプロピルメタク
リルアミドが、それぞれ２０、２および２重量％濃度の
モノマー混合液５００ｇを加え、よく懸濁した。これに
５０重量％過硫酸アンモニウム２ｇ、５０重量％のＮ，
Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン２ｇを加
え、重合、ゲル化させた。これを、約１ｍｍ角の立方体
に切断後、２０ｍＭの硫酸ナトリウム１０００ｍｌで５
回洗浄し、固定化菌体粒子を得た。
【００４２】（２）保存用固定化菌体粒子懸濁液の作製 静置沈降させた固定化菌体粒子を５００ｍｌのポリ容器
に２００ｍｌとり、それに４０％の硫酸アンモニウム溶
液（ｐＨ７．０に調製）を２００ｍｌ添加し、３０℃に
て１００日間保存した。なお、２０ｍＭの硫酸ナトリウ
ムを添加したもの（比較例）についても同様の操作を行
った。
に２００ｍｌとり、それに４０％の硫酸アンモニウム溶
液（ｐＨ７．０に調製）を２００ｍｌ添加し、３０℃に
て１００日間保存した。なお、２０ｍＭの硫酸ナトリウ
ムを添加したもの（比較例）についても同様の操作を行
った。
【００４３】（３）ニトリルヒドラターゼ活性の測定 固定化菌体粒子保存液を少量取り、５倍量の５０ｍＭの
燐酸緩衝液（ｐＨ７．０、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −ＫＨ2 ＰＯ
4 ）で洗浄した。これをガーゼに包んで遠心脱水したの
ち、約１ｇ分取し、同じ燐酸緩衝液１００ｍｌに懸濁し
た。これに５％のアクリロニトリルの上記燐酸緩衝液溶
液を添加して反応を開始し、０℃、２０分の振とうの後
に、０．４５μｍのフィルターにて反応液を濾過して反
応を停止させた。ろ液中に含まれるアクリルアミド生成
量は、ガスクロマトグラフィーで分析した。
燐酸緩衝液（ｐＨ７．０、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −ＫＨ2 ＰＯ
4 ）で洗浄した。これをガーゼに包んで遠心脱水したの
ち、約１ｇ分取し、同じ燐酸緩衝液１００ｍｌに懸濁し
た。これに５％のアクリロニトリルの上記燐酸緩衝液溶
液を添加して反応を開始し、０℃、２０分の振とうの後
に、０．４５μｍのフィルターにて反応液を濾過して反
応を停止させた。ろ液中に含まれるアクリルアミド生成
量は、ガスクロマトグラフィーで分析した。
【００４４】（４）結果 表−６に０日目の固定化菌体粒子１ｇの活性量を１．０
としたときの相対値を示した。
としたときの相対値を示した。
【００４５】
【効果】本発明によれば、ニトリルヒドラターゼ、ニト
リラーゼ等の酵素活性を有する多量の菌体、あるいは固
定化菌体粒子を、室温下でも溶菌や酵素の劣化なしに長
期間（例えば、３００日間）保存することが可能とな
り、これまでに保存上必要とされてきた労力や冷却コス
トを大幅に軽減することができ、工業的に満足し得る重
要な手法が提供される。
リラーゼ等の酵素活性を有する多量の菌体、あるいは固
定化菌体粒子を、室温下でも溶菌や酵素の劣化なしに長
期間（例えば、３００日間）保存することが可能とな
り、これまでに保存上必要とされてきた労力や冷却コス
トを大幅に軽減することができ、工業的に満足し得る重
要な手法が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村尾 耕三 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 日東化学工業株式会社 中央研究所内 審査官 六笠 紀子 (56)参考文献 特開 平３−139278（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−8791（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−170478（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−52683（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−68566（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−227069（ＪＰ，Ａ) 特開 昭50−4293（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，1969，Ｖ ｏｌ．52，ｐ．1453−1455 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/00 - 7/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ニトリルヒドラターゼ活性またはニトリ
ラーゼ活性を有する微生物菌体またはその固定化物を水
性媒体に懸濁した状態で、該酵素活性および菌体細胞を
長期間安定に保存する方法において、該水性媒体がｐＨ
７〜１０で且つ１００ｍＭ乃至飽和濃度の無機塩類水溶
液であることを特徴とする菌体または固定化菌体の懸濁
液の保存方法。 - 【請求項２】 無機塩類水溶液が、燐酸塩、硼酸塩、硫
酸塩、亜硫酸塩および塩酸塩から選ばれた少なくとも１
種の塩の水溶液である請求項１記載の菌体または固定化
菌体の懸濁液の保存方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27424194A JP3163224B2 (ja) | 1994-10-14 | 1994-10-14 | 菌体または固定化菌体の懸濁液の保存方法 |
| DE69518378T DE69518378T2 (de) | 1994-10-14 | 1995-10-11 | Verfahren zum Konservieren von ein Suspension von Zellen oder immobilisierten Zellen |
| EP95307188A EP0707061B1 (en) | 1994-10-14 | 1995-10-11 | Method for preserving a suspension of cells or immobilized cells |
| US08/542,291 US5705382A (en) | 1994-10-14 | 1995-10-12 | Method for preserving nitrile hydratase or nitrilase activity of microbial cells with inorganic salts |
| CNB951199781A CN1214104C (zh) | 1994-10-14 | 1995-10-14 | 保存细胞或固定的细胞悬浮体的方法 |
| KR1019950035432A KR100395275B1 (ko) | 1994-10-14 | 1995-10-14 | 세포또는고정화세포현탁액의보존방법 |
| TW084110798A TW408179B (en) | 1994-10-14 | 1995-10-14 | Method for preserving a suspension of cells or immobilized cells having nitrile hydratase or nitrilase enzyme activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27424194A JP3163224B2 (ja) | 1994-10-14 | 1994-10-14 | 菌体または固定化菌体の懸濁液の保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08112089A JPH08112089A (ja) | 1996-05-07 |
| JP3163224B2 true JP3163224B2 (ja) | 2001-05-08 |
Family
ID=17538974
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27424194A Expired - Lifetime JP3163224B2 (ja) | 1994-10-14 | 1994-10-14 | 菌体または固定化菌体の懸濁液の保存方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5705382A (ja) |
| EP (1) | EP0707061B1 (ja) |
| JP (1) | JP3163224B2 (ja) |
| KR (1) | KR100395275B1 (ja) |
| CN (1) | CN1214104C (ja) |
| DE (1) | DE69518378T2 (ja) |
| TW (1) | TW408179B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013129179A1 (ja) | 2012-02-28 | 2013-09-06 | 三菱レイヨン株式会社 | 酵素の保存方法 |
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| US6060265A (en) * | 1996-12-18 | 2000-05-09 | Cytec Technology Corporation | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
| US5863750A (en) * | 1996-12-18 | 1999-01-26 | Cytec Tech Corp | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
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| US6677149B2 (en) | 1999-07-12 | 2004-01-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells with carbamate salts |
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| EP1283256B1 (en) | 2000-03-21 | 2007-07-25 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Method of culturing microorganisms |
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| WO2004063357A1 (de) | 2003-01-08 | 2004-07-29 | Basf Aktiengesellschaft | Verfahren zur konservierung und/oder lagerung von zellen mit nitrilase oder nitrilhydratase-aktivität |
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| GB0327906D0 (en) * | 2003-12-02 | 2004-01-07 | Ciba Spec Chem Water Treat Ltd | Biocatalyst composition |
| EP1689875B2 (en) * | 2003-12-02 | 2017-02-22 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Manufacture of amides |
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| KR20130143677A (ko) | 2004-11-05 | 2013-12-31 | 퀴아젠 노쓰 아메리칸 홀딩즈, 인크. | 안정화 시약으로부터 핵산을 정제하기 위한 조성물 및 방법 |
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- 1994-10-14 JP JP27424194A patent/JP3163224B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-11 EP EP95307188A patent/EP0707061B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-11 DE DE69518378T patent/DE69518378T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 US US08/542,291 patent/US5705382A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1995-10-14 CN CNB951199781A patent/CN1214104C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-14 KR KR1019950035432A patent/KR100395275B1/ko active IP Right Grant
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