JP2830029B2

JP2830029B2 - フマラーゼ活性の除去方法

Info

Publication number: JP2830029B2
Application number: JP8826789A
Authority: JP
Inventors: 誠後藤; 昭一奈良; 真人寺沢; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1989-04-07
Filing date: 1989-04-07
Publication date: 1998-12-02
Anticipated expiration: 2013-12-02
Also published as: JPH02268691A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、微生物菌体又はその処理物内のフマラーゼ
活性を効果的に除去する方法に関するものである。

［従来の技術と課題］Ｌ−アラニンの工業的製法としては、主にＬ−アスパ
ラギン酸の酵素的脱炭酸により製造する方法（特公昭53
−27792号公報参照）、あるいはフマル酸とアンモニア
からアスパルターゼ及びアスパラギン酸脱炭酸酵素を作
用させて製造する方法（特開昭56−35991号公報参照）
等が提案されている。かしながら、前者の方法では、原
料となるＬ−アスパラギン酸が比較的高価なためアラニ
ンの製造費が高くつき、経済的な製造方法とは言えな
い。後者の方法では、該両酵素が働く反応液のpHが大き
く異なるため、反応槽を分離することが必要となる。ま
た、反応液のpHが中性域では該両酵素を同時に作用させ
ることができるが、その場合、微生物菌体又はその処理
物を該両酵素源として用いるに当たっては、共存するＬ
−アラニンをラセミ化する酵素をあらかじめ失効させる
処理が必要である（特開昭57−132882号公報、特開昭62
−87088号公報参照）。

このように、Ｌ−アラニンの工業的製法に関しては諸
種の問題が残されていた。

本発明者らは先に、ブレビバクテリウム（Brevibacte
rium）属に属する微生物又はその処理物とシュードモナ
ス（Pseudomonas）属に属する微生物又はその処理物と
の存在下に、フマル酸又はその塩とアンモニア又はアン
モニウム塩とを酵素反応させて、反応液中にＬ−アラニ
ンを効率良く製造する方法を提案した（特開昭63−2325
7号明細書参照）。

本発者らは、さらに効率良くＬ−アラニンを製造する
ことを目的として反応条件等を検討したところ、シュー
ドモナス（Pseudomonas）属細菌内に共存するフマラー
ゼの作用によって、原料であるフマル酸の一部がＬ−リ
ンゴ酸に変換され、結果的にＬ−アラニンの収率が低下
することが明らかになった。それ由、本発明者らはかか
る問題点を解決すべく鋭意検討したところ、シュードモ
ナス（Pseudomonas）属に属する微生物の菌体又はその
処理物をα−ケト酸又はその塩を含有する中性水性溶媒
中で加熱処理することにより、Ｌ−アスパラギン酸から
Ｌ−アラニンへの反応を触媒するアスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性を低下させることなく、フマラーゼ活性を
ほぼ完全に除去することを見い出し本発明を完成するに
到った。

［発明の構成及び効果］本発明は、シュードモナス（Pseudomonas）属に属す
るＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生
物又はその処理物を、α−ケト酸又はその塩を含有する
中性領域の水性溶媒中で、40℃を越え60℃以内の温度で
加熱処理することを特徴とするフマラーゼ活性の除去方
法を提供するものである。

本発明の方法は、フマル酸を原料基質として、微生物
又はその処理物による酵素反応によってＬ−アラニンを
製造する方法に応用可能である。これにより、共存する
フマラーゼの作用によって原料であるフマル酸の一部が
Ｌ−リンゴ酸に変換されることなく、すなわち原料の損
失をきたすことなく、効率良くＬ−アラニンを製造する
ことが可能となる。

［発明の具体的な説明］本発明に使用する微生物としては、Ｌ−アスパラギン
酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物であれば特に限定さ
れるものではないが、例えばシュードモナス・ダクネー
（Pseudomonas dacunhae）IAM 1152［I.Chibata et al,
Appl.Microbiol.,13,638（1965）］等が挙げられる。

本発明に用いられる上記微生物菌体は、菌体のまま用
いることも出来るし、その処理物すなわち菌体の破壊物
あるいは固定化物としても使用することが出来る。固定
化手法としては、公知の例えばL.Goldstein,Methods in
Enzymology 19,935（1970）に記載の方法が利用でき、
具体的には菌体をアクリルアミド等の重合性モノマーを
用いたり、アルギン酸塩あるいはカルギーナン等の適当
な担体に不溶化させる等の方法を用いることができる。

本発明の方法に使用される上記の微生物菌体の調製に
使用する培地は、特に限定されるものではなく一般の微
生物に使用されるものでよい。

Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
菌体の調製に使用する培地の炭素源は、特に限定される
ものではなく、例えばフマル酸、コハク酸、アスパラギ
ン酸等が使用できるが、その中でもフマル酸が好適に使
用される。培地の窒素源としては、アンモニア、硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿
素等の無機塩を用いることが出来るし、また、ペプト
ン、酵母エキス、コンスティープリカー、カザミノ酸等
の有機栄養源も使用することが出来る。無機塩として
は、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫
酸マグネシウム等が用いられる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養
温度は20℃〜40℃、好ましくは28℃〜32℃で行う。培養
途中のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行い、培
養中のpHの調整には、酸又はアルカリを添加して行う。
培養開始時の培地中の炭素源の濃度は0.05〜10重量％が
用いられ、具体例としてフマル酸を使用する場合、フマ
ル酸濃度は、好ましくは0.1〜５重量％、更に好ましく
は0.5〜２重量％が適する。培養期間は10時間〜４日
間、最適期間は１〜３日間である。

このようにして得られた培養物から各々菌体を集め
て、水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明のフマラーゼ
活性の除去方法を実施する。

本発明の方法においては、上記で調整された微生物菌
体又はその処理物を、α−ケト酸又はその塩を含有する
水又はリン酸緩衝液等の中性溶媒中に懸濁後、加熱処理
を実施することによりフマラーゼ活性を除去することが
できる。

水性溶媒中に含有しうるα−ケト酸又はその塩として
は、ピルビン酸若しくはその塩又はα−ケト酪酸若しく
はその塩等が挙げられる。ピンビン酸の塩としては、ピ
ルビン酸ナトリウム、ピルビン酸アンモニウム、ピルビ
ン酸カルシウム、ピルビン酸カリウム等があげられ、そ
れらの中でもピルビン酸ナトリウムが好適である。また
α−ケト酪酸の塩としては、α−ケト酪酸ナトリウム、
α−ケト酪酸アンモニウム、α−ケト酪酸カルシウム、
α−ケト酪酸カリウム等があげられ、それらの中でもα
−ケト酪酸ナトリウムが好適である。

該水性溶媒中に含有する上記のα−ケト酸又はその塩
の濃度は、0.1〜100mM、好ましくは0.5〜50mM、さらに
好ましくは１〜20mMである。水性溶媒のpHは6.5〜7.5の
中性領域が好適に用いられる。加熱処理温度は40℃を越
え60℃以内、とりわけ45〜50℃で実施するのが好まし
い。加熱処理時間は、処理温度により異るが、微生物が
遊離菌体の場合は、通常10分間〜24時間、好ましくは30
分間〜10時間、菌体の破壊物の場合は５分間〜12時間、
好ましくは20分間〜５時間、また固定化菌体の場合は30
分間〜48時間、好ましくは60分間〜24時間が適する。水
性溶媒中の微生物菌体又はその処理物の濃度は特に制限
されるものではないが通常0.1〜50重量％が用いられ
る。

以下に実施例を挙げてさらに具体的に説明する。

実施例１（１）微生物の調整培地（フマル酸ナトリウム0.5％、フマル酸アンモニ
ウム1.0％、酵母エキス0.5％、リン酸１カリウム0.05
％、MgSO₄・7H₂O 0.05％含有、pH7.0）100mlを500ml容
三角フラスコに分注、滅菌した後シュードモナス・ダク
ネー（Pseudomonas dacunhae）IAM 1152を植菌し、30℃
にて１日間振盪培養を行った（前培養）。次に、上記培
地と同様の培地１を２容通気攪拌槽に仕込み、滅菌
（120℃、20分間）後、前培養物の20mlを添加して、回
転数1000rpm、通気量1vvm、温度30℃、pH7.3にて１日間
培養を行った。

培養終了後、培養物100mlから遠心分離して集菌後、
該菌体をフマラーゼ活性の除去処理に用いた。

（２）実験方法上記で得られた菌体を、ピルビン酸ナトリウム5mMを
含有するpH7.5の10mMリン酸緩衝液10mlに加え、各種の
条件で加熱処理を行った。加熱処理菌体を遠心分離によ
り集菌し、該菌体のフマラーゼ活性及びＬ−アスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素活性を下記の方法で測定した。

フマラーゼ活性は、前記の加熱処理菌体を反応液（フ
マル酸830mM,CaCl₂・2H₂O 7.5mM,ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート0.1容量％及びアンモニア2M含
有、pH7.5）20mlに懸濁し、30℃にて２時間振盪した後
の生成リンゴ酸量を高速液体クロマトグラフィーにて測
定することによって求めた。

Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性は、同様に前
記の加熱処理菌体を反応液（アスパラギン酸1500mM、ピ
リドキサールリン酸0.04mM、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート0.1容量％及びアンモニア0.4m含
有、pH4.7）20mlに懸濁し、30℃にて１時間振盪した後
の生成アラニン量を、ペーパークロマトグラフィー又は
高速液体クロマトグラフィーにて測定することによって
求めた。

なお、各酵素活性値は、加熱処理しない菌体の活性を
100とする相対活性をもって表示した。

（３）結果結果は表１に示す通りであり、本発明の方法により、
Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を失効すること
なくフマラーゼ活性を除去できることが認められた。

実施例２実施例１の実験方法で使用したピルビン酸ナトリウム
の代わりにα−ケト酪酸ナトリウム（濃度5mM）を用い
た以外は実施例１と同様の実験を行った。その結果は表
２に示す通りであり、本発明の方法により、実施例１と
同様に、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を失効
することなくフマラーゼ活性を除去できることが認めら
れた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (56)参考文献Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．48，Ｎｏ．４（1984）ｐ．694−698 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 13/06 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】シュードモナス（Pseudomonas）に属する
Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物
又はその処理物を、α−ケト酸又はその塩を含有するpH
6.5〜7.5の水性溶媒中で、40℃を越え60℃以内の温度で
加熱処理することを特徴とするフマラーゼ活性の除去方
法。