JP2942995B2 - Ｌ―アラニンの製造法 - Google Patents
Ｌ―アラニンの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素法によるＬ−アラニンの製造法に関す
るものである。本発明によれば高収量で効率良くＬ−ア
ラニンを製造することが出来る。
るものである。本発明によれば高収量で効率良くＬ−ア
ラニンを製造することが出来る。
Ｌ−アラニンは周知の如く、医薬、食品又は化学工業
原料として重要なアミノ酸であり、その需要が近年急激
に増加しつつある。
原料として重要なアミノ酸であり、その需要が近年急激
に増加しつつある。
（従来の技術と課題） Ｌ−アラニンの工業的製造法としては、主にＬ−アス
パラギン酸の酵素的脱炭酸により製造する方法（特公昭
53−27792号）あるいは、フマル酸とアンモニアからア
スパルターゼ（EC.4.3.1.1）及びアスパラギン酸β−脱
炭酸酵素（EC.4.1.1.12）を作用させて製造する方法
（特開昭56−35991号公報）が提案されている。しかし
ながら前者では原料となるＬ−アスパラギン酸が比較的
高価な為アラニンの製造費が高くつくこと、又後者で
は、該両酵素が働く至適適条件が異なる為、反応槽を分
離するか、若しくは、該両酵素を同時に作用させる場合
には比較的低温で反応させるので、反応速度が低いとい
う問題を有していた。
パラギン酸の酵素的脱炭酸により製造する方法（特公昭
53−27792号）あるいは、フマル酸とアンモニアからア
スパルターゼ（EC.4.3.1.1）及びアスパラギン酸β−脱
炭酸酵素（EC.4.1.1.12）を作用させて製造する方法
（特開昭56−35991号公報）が提案されている。しかし
ながら前者では原料となるＬ−アスパラギン酸が比較的
高価な為アラニンの製造費が高くつくこと、又後者で
は、該両酵素が働く至適適条件が異なる為、反応槽を分
離するか、若しくは、該両酵素を同時に作用させる場合
には比較的低温で反応させるので、反応速度が低いとい
う問題を有していた。
本発明者らは、先にアスパラターゼを含有する微生物
菌体又はその処理物とアスパラギン酸β−脱炭素酵素を
含有する微生物菌体又はその処理物との存在下、単一の
反応槽でフマル酸又はその塩及びアンモニウム又はアン
モニウムイオンからＬ−アラニンを製造する方法を提案
している（特願昭63−232570号）。本発明者らはさらに
Ｌ−アラニン生成の反応速度を向上すべく鋭意検討した
結果、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素反応に於て、反応
液に少なくともα−ケト酸を添加することにより反応温
度40〜50℃で反応可能なことを見いだし、本発明を完成
するに到った。
菌体又はその処理物とアスパラギン酸β−脱炭素酵素を
含有する微生物菌体又はその処理物との存在下、単一の
反応槽でフマル酸又はその塩及びアンモニウム又はアン
モニウムイオンからＬ−アラニンを製造する方法を提案
している（特願昭63−232570号）。本発明者らはさらに
Ｌ−アラニン生成の反応速度を向上すべく鋭意検討した
結果、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素反応に於て、反応
液に少なくともα−ケト酸を添加することにより反応温
度40〜50℃で反応可能なことを見いだし、本発明を完成
するに到った。
（発明の構成及び効果） 本発明は、アスパルターゼを含有する微生物菌体又は
その処理物とアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する
微生物菌体又はその処理物の存在下、単一の反応槽でフ
マール酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウムイオ
ンとからＬ−アラニンを製造するに際し、反応液中に少
なくともα−ケト酸を含有する水溶液にて反応温度を40
〜50℃に維持することを特徴とするＬ−アラニンの製造
法を提供するものである。本発明によれば、α−ケト酸
を含有する反応液にて反応温度を40〜50℃に維持するこ
とにより高い反応速度で反応でき、Ｌ−アラニンを効率
よく製造することができる。
その処理物とアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する
微生物菌体又はその処理物の存在下、単一の反応槽でフ
マール酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウムイオ
ンとからＬ−アラニンを製造するに際し、反応液中に少
なくともα−ケト酸を含有する水溶液にて反応温度を40
〜50℃に維持することを特徴とするＬ−アラニンの製造
法を提供するものである。本発明によれば、α−ケト酸
を含有する反応液にて反応温度を40〜50℃に維持するこ
とにより高い反応速度で反応でき、Ｌ−アラニンを効率
よく製造することができる。
なお、本発明に使用するα−ケト酸は、ピルビン酸若
しくはその塩又はα−ケト酪酸若しくはその塩が好まし
い。
しくはその塩又はα−ケト酪酸若しくはその塩が好まし
い。
本発明に使用されるアスパルターゼを含有する微生物
としては、該酵素活性を有し、コリネ型細菌に属するも
のであればいずれの菌株をも用いうるが、例えば、ブレ
ビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）M
J−233（微工研条寄 第1497号）、ブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41
（微工研条寄 第1498号）、ブレビバクテリウム・アン
モニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 6
872、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacte
rium glutamicum）ATCC 31830等をあげることができ、
これらの菌が好適に用いられる。
としては、該酵素活性を有し、コリネ型細菌に属するも
のであればいずれの菌株をも用いうるが、例えば、ブレ
ビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）M
J−233（微工研条寄 第1497号）、ブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41
（微工研条寄 第1498号）、ブレビバクテリウム・アン
モニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 6
872、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacte
rium glutamicum）ATCC 31830等をあげることができ、
これらの菌が好適に用いられる。
一方アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
菌体としては、該酵素活性を有し、シュードモナス属に
属するものであればいずれの菌株をも用いうるが、例え
ば、シュードモナス・ダクネー（Pseudomonas dacunha
e）IAM 1152、同ATCC 21192、シュードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）ATCC 21812、同IAM 1506、シュ
ードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorese
ns）IFO 3081、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseu
domonas aeruginosa）IAM 1054等が挙げられ、これらの
菌体が好適に用いられる。
菌体としては、該酵素活性を有し、シュードモナス属に
属するものであればいずれの菌株をも用いうるが、例え
ば、シュードモナス・ダクネー（Pseudomonas dacunha
e）IAM 1152、同ATCC 21192、シュードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）ATCC 21812、同IAM 1506、シュ
ードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorese
ns）IFO 3081、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseu
domonas aeruginosa）IAM 1054等が挙げられ、これらの
菌体が好適に用いられる。
本発明に用いられる上記微生物菌体は菌体のまま用い
ることも出来るし、その処理物すなわち菌体の破壊物と
しても使用することができる。菌体の破壊は、それ自体
既知の、例えば、超音波処理、圧搾等の方法を用いて行
うことができる。
ることも出来るし、その処理物すなわち菌体の破壊物と
しても使用することができる。菌体の破壊は、それ自体
既知の、例えば、超音波処理、圧搾等の方法を用いて行
うことができる。
本発明の方法に使用される上記の微生物菌体の調製に
使用する培地は、特に限定されるものではなく一般の微
生物に使用されるものでよい。
使用する培地は、特に限定されるものではなく一般の微
生物に使用されるものでよい。
アスパルターゼを含有する微生物菌体の調製に使用す
る培地の炭素源は特に限定されるものではないが、例え
ば、グルコース、エタノール、酢酸やフマル酸等の有機
酸等を用いることができる。
る培地の炭素源は特に限定されるものではないが、例え
ば、グルコース、エタノール、酢酸やフマル酸等の有機
酸等を用いることができる。
培地の窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単
独若しくは混合して用いることができる。無機塩として
は、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫
酸マグネシウム等が用いられる。この他に菌の生育及び
Ｌ−アスパラギン酸生成に必要であれば、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用いる。
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単
独若しくは混合して用いることができる。無機塩として
は、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫
酸マグネシウム等が用いられる。この他に菌の生育及び
Ｌ−アスパラギン酸生成に必要であれば、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用いる。
アスパルターゼを含有する微生物菌体の培養は通気撹
拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温度は20〜40
℃、好ましくは25〜35℃で行う。培養途中のpHは５〜1
0、好ましくは７〜８付近にて行い、培養中のpHの調整
には酸、アルカリを添加して行う。培養時間は２〜９日
間、最適期間は４〜７日間である。
拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温度は20〜40
℃、好ましくは25〜35℃で行う。培養途中のpHは５〜1
0、好ましくは７〜８付近にて行い、培養中のpHの調整
には酸、アルカリを添加して行う。培養時間は２〜９日
間、最適期間は４〜７日間である。
一方、アスパルギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生
物菌体の調製に使用する培地の炭素源は特に限定される
ものはないが、例えば、フマル酸、コハク酸、アスパラ
ギン酸等を挙げることができ、それらの中でもフマル酸
が好適に使用される。培地の窒素源としてはアンモニ
ア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、尿素等の無機塩を用いることができるし、ま
た、ペプトン、酵母エキス、コンスティープリカー、カ
ザミノ酸等の有機栄養源も使用することができる。無機
塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリ
ウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。
物菌体の調製に使用する培地の炭素源は特に限定される
ものはないが、例えば、フマル酸、コハク酸、アスパラ
ギン酸等を挙げることができ、それらの中でもフマル酸
が好適に使用される。培地の窒素源としてはアンモニ
ア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、尿素等の無機塩を用いることができるし、ま
た、ペプトン、酵母エキス、コンスティープリカー、カ
ザミノ酸等の有機栄養源も使用することができる。無機
塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリ
ウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。
アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する菌体の培養
は、通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温度
は20〜40℃、好ましくは28℃〜32℃で行う。培養途中の
pHは５〜10好ましくは７〜８付近にて行い、培養中のpH
の調整には、酸アルカリを添加して行う。培養開始時の
フマル酸濃度は好ましくは0.1〜５重量％、更に好まし
くは0.5〜２重量％が適する。培養期間は10時間〜４日
間、最適期間は１〜３日間である。
は、通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温度
は20〜40℃、好ましくは28℃〜32℃で行う。培養途中の
pHは５〜10好ましくは７〜８付近にて行い、培養中のpH
の調整には、酸アルカリを添加して行う。培養開始時の
フマル酸濃度は好ましくは0.1〜５重量％、更に好まし
くは0.5〜２重量％が適する。培養期間は10時間〜４日
間、最適期間は１〜３日間である。
このようにして得られる培養物から各々菌体を集め
て、水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素
反応に使用する。
て、水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素
反応に使用する。
本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌
体又はその処理物の存在下、少なくともフマル酸又はそ
の塩とアンモニア又はアンモニウムイオンとα−ケト酸
を含有する水溶液にて酵素反応させる。ここで該水溶液
中に添加されるＬ−アラニン製造の反応原料となるフマ
ル酸又はその塩の濃度は、0.5〜30重量％、好ましくは
５〜15重量％である。アンモニア又はアンモニウムイオ
ンの添加濃度としては、0.1〜５モル、好ましくは0.5〜
3.5モルである。
体又はその処理物の存在下、少なくともフマル酸又はそ
の塩とアンモニア又はアンモニウムイオンとα−ケト酸
を含有する水溶液にて酵素反応させる。ここで該水溶液
中に添加されるＬ−アラニン製造の反応原料となるフマ
ル酸又はその塩の濃度は、0.5〜30重量％、好ましくは
５〜15重量％である。アンモニア又はアンモニウムイオ
ンの添加濃度としては、0.1〜５モル、好ましくは0.5〜
3.5モルである。
また、反応液に添加するα−ケト酸としてはピルビン
酸若しくはその塩、又はα−ケト酪酸若しくはその塩が
好適に用いられる。添加濃度は、0.0001〜0.5重量％、
好ましくは0.001〜0.2重量％が使用される。
酸若しくはその塩、又はα−ケト酪酸若しくはその塩が
好適に用いられる。添加濃度は、0.0001〜0.5重量％、
好ましくは0.001〜0.2重量％が使用される。
上記した水性反応液に添加することができるフマル酸
の塩としては、例えばアンモニウム塩、ナトリウム塩、
カリウム塩、カルシウム塩等が挙げられ、またピルビン
酸若しくはα−ケト酪酸の塩としては、例えばナトリウ
ム塩、カリウム塩等が挙げられる。さらにアンモニウム
イオン源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム等を添加することができる。
の塩としては、例えばアンモニウム塩、ナトリウム塩、
カリウム塩、カルシウム塩等が挙げられ、またピルビン
酸若しくはα−ケト酪酸の塩としては、例えばナトリウ
ム塩、カリウム塩等が挙げられる。さらにアンモニウム
イオン源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム等を添加することができる。
該水溶液には、さらにピリドキサール５′リン酸を0.
0005〜0.05重量％好ましくは、0.001〜0.01重量％添加
して用いることができる。さらに必要な場合には非イオ
ン性の界面活性剤、例えばポリオキシエチレン（９）オ
クチルフェニルエーテル（TritonX−100）、ポリオキシ
エチレン（20）ソルビタンモノラウレート（Tween20）
等を0.01〜0.5重量％、好ましくは0.03〜0.2重量％を添
加して用いることができる。本発明において、酵素反応
時のpHは6.0〜10.0、好ましくは、pH7.0〜8.5であり、
反応温度は約40〜約50℃、好ましくは約42〜約47℃であ
り、反応は通常約５〜約72時間行われる。
0005〜0.05重量％好ましくは、0.001〜0.01重量％添加
して用いることができる。さらに必要な場合には非イオ
ン性の界面活性剤、例えばポリオキシエチレン（９）オ
クチルフェニルエーテル（TritonX−100）、ポリオキシ
エチレン（20）ソルビタンモノラウレート（Tween20）
等を0.01〜0.5重量％、好ましくは0.03〜0.2重量％を添
加して用いることができる。本発明において、酵素反応
時のpHは6.0〜10.0、好ましくは、pH7.0〜8.5であり、
反応温度は約40〜約50℃、好ましくは約42〜約47℃であ
り、反応は通常約５〜約72時間行われる。
上記のような反応方法によって得られる反応液中に生
成したＬ−アラニンの分離・精製は、公知のイオン交換
樹脂処理等により行うことができる。
成したＬ−アラニンの分離・精製は、公知のイオン交換
樹脂処理等により行うことができる。
実験例 以下の実験例において、Ｌ−アラニンの定性は、ペー
パークロマトグラフのRf値と高速液体クロマトグラフの
保持時間及び精製物の比旋光度により確認した。定量は
高速液体クロマトグラフィー（島津LC−5A）を併用して
行った。また下記の実験例において％と表わしたのは重
量％を意味する。
パークロマトグラフのRf値と高速液体クロマトグラフの
保持時間及び精製物の比旋光度により確認した。定量は
高速液体クロマトグラフィー（島津LC−5A）を併用して
行った。また下記の実験例において％と表わしたのは重
量％を意味する。
実験例−１ アスパルターゼ含有菌体の調製（１） Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233菌体の培養 培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH2PO40.
05％、K2HPO40.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、CaCl2・2H
2O 2ppm、FeSO４・7H2O 2ppm、MnSO４・４〜6H2O 2p
pm、ZnSO4・7H2O 2ppm、NaCl・2ppm、ビオチン200μg/
、チアミン・HCl100μg/、カザミノ酸0.1％、酵母
エキス0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）MJ−233（微工研条寄 第
1497号）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、30
℃にて２日間振盪培養を行った。
05％、K2HPO40.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、CaCl2・2H
2O 2ppm、FeSO４・7H2O 2ppm、MnSO４・４〜6H2O 2p
pm、ZnSO4・7H2O 2ppm、NaCl・2ppm、ビオチン200μg/
、チアミン・HCl100μg/、カザミノ酸0.1％、酵母
エキス0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）MJ−233（微工研条寄 第
1497号）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、30
℃にて２日間振盪培養を行った。
次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH2PO
40.05％、K2HPO40.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、FeSO
４・7H2O 20ppm、MnSO４・４〜6H2O 20ppm、ビオチン
200μg/、チアミン・HCl100μg/、カザミノ酸0.3
％、酵母エキス0.3％）1000mlを２容通気撹拌槽に仕
込み、滅菌（120℃、20分間）後、エタノールの20mlと
前記培養物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1
vvm、温度33℃、pH7.6にて48時間培養を行った。
40.05％、K2HPO40.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、FeSO
４・7H2O 20ppm、MnSO４・４〜6H2O 20ppm、ビオチン
200μg/、チアミン・HCl100μg/、カザミノ酸0.3
％、酵母エキス0.3％）1000mlを２容通気撹拌槽に仕
込み、滅菌（120℃、20分間）後、エタノールの20mlと
前記培養物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1
vvm、温度33℃、pH7.6にて48時間培養を行った。
なお、エタノールは、培養中培値の濃度が２容量％を
こえないように、約１〜２時間ごと断続的に添加し、最
終的に100mlまで添加した。
こえないように、約１〜２時間ごと断続的に添加し、最
終的に100mlまで添加した。
培養終了後、培養物1000mlから遠心分離して集菌し
た。
た。
Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）項にて調製した微生物菌体内にはアスパルタ
ーゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存する為、原料と
なるフマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じる
ので、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を実施し
た。
ーゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存する為、原料と
なるフマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じる
ので、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を実施し
た。
上記Ａ）項にて調製した菌体を反応液［Ｌ−アスパラ
ギン酸100g,アンモニア（28％アンモニア含有水溶液）1
40ml、CaCl2・2H2O 1g,ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウレート0.8;蒸留水１中に含有］の１に懸濁
後45℃にて５時間加熱処理を行った。該処理物は遠心分
離により集菌後、該菌体をアスパルターゼ含有菌体とし
て使用した。
ギン酸100g,アンモニア（28％アンモニア含有水溶液）1
40ml、CaCl2・2H2O 1g,ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウレート0.8;蒸留水１中に含有］の１に懸濁
後45℃にて５時間加熱処理を行った。該処理物は遠心分
離により集菌後、該菌体をアスパルターゼ含有菌体とし
て使用した。
実験例−２ アスパルターゼ含有菌体の調製（２） Ａ）ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスATCC 6872
菌体の培養 実験例−１で用いたアルパルターゼ含有菌体の調製培
地100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後pH
7）した後、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（B
revibacterium ammoniagenes）ATCC 6872を植菌し、無
菌的に50％グルコース溶液を2ml加え、30℃で24hr振と
う培養を行った。
菌体の培養 実験例−１で用いたアルパルターゼ含有菌体の調製培
地100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後pH
7）した後、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（B
revibacterium ammoniagenes）ATCC 6872を植菌し、無
菌的に50％グルコース溶液を2ml加え、30℃で24hr振と
う培養を行った。
次に、同じく実験例１の本培養培地1000mlを２容通
気撹拌槽に仕込み、滅菌（120℃、20分間）後、50％グ
ルコース溶液の40mlと前記培養物の20mlを添加して、回
転数1,000rpm、通気量1vvm、温度33℃、pH7.6にて24時
間培養を行った。
気撹拌槽に仕込み、滅菌（120℃、20分間）後、50％グ
ルコース溶液の40mlと前記培養物の20mlを添加して、回
転数1,000rpm、通気量1vvm、温度33℃、pH7.6にて24時
間培養を行った。
なお、グルコースは、約１〜２時間ごとに5gずつ添加
し、最終的に70gまで添加した。培養終了後、培養物1,0
00mlから遠心分離して集菌した。
し、最終的に70gまで添加した。培養終了後、培養物1,0
00mlから遠心分離して集菌した。
Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）にて調製した菌体を実験例−１のＢ）項で用
いた反応液１に懸濁後、45℃にて２時間加熱処理を行
った。該処理物は遠心分離により集菌後、該菌体をアス
パルターゼ含有菌体として使用した。
いた反応液１に懸濁後、45℃にて２時間加熱処理を行
った。該処理物は遠心分離により集菌後、該菌体をアス
パルターゼ含有菌体として使用した。
実験例−３ アスパルターゼ含有菌体の調製（３） Ａ）コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 31830菌
体の培養 実験例−１のアスパルターゼ含有菌体の調製培地100m
lを500ml容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後pH7）し
た後、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebact
erium glutamicum）ATCC 31830を植菌し、無菌的に50
％グルコース溶液を2ml加え、30℃で24hr振とう培養を
行った。
体の培養 実験例−１のアスパルターゼ含有菌体の調製培地100m
lを500ml容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後pH7）し
た後、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebact
erium glutamicum）ATCC 31830を植菌し、無菌的に50
％グルコース溶液を2ml加え、30℃で24hr振とう培養を
行った。
次に、同じく実験例１の本培養培地1000mlを２容通
気撹拌槽に仕込み、滅菌（120℃、20分間）後、50％グ
ルコース溶液の40mlと前記培養物の20mlを添加して、回
転数1000rpm、通気量1vvm、温度33℃、pH7.6にて24時間
培養を行った。
気撹拌槽に仕込み、滅菌（120℃、20分間）後、50％グ
ルコース溶液の40mlと前記培養物の20mlを添加して、回
転数1000rpm、通気量1vvm、温度33℃、pH7.6にて24時間
培養を行った。
なお、グルコースは、約１〜２時間ごとに5gずつ添加
し、最終的には70g添加した。培養終了後、培養物1000m
lから遠心分離して集菌した。
し、最終的には70g添加した。培養終了後、培養物1000m
lから遠心分離して集菌した。
Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）項にて調製した菌体を実験例−１のＢ）項で
用いた反応液１に懸濁後、45℃にて２時間加熱処理を
行った。該処理物は遠心分離により集菌後該菌体をアス
パルターゼ含有菌体として使用した。
用いた反応液１に懸濁後、45℃にて２時間加熱処理を
行った。該処理物は遠心分離により集菌後該菌体をアス
パルターゼ含有菌体として使用した。
実験例−４ アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体の
調製 Ａ）シュードモナス・ダクネー IAM 1152菌体の培養 培地（フマル酸ナトリウム0.5％、フマル酸アンモニ
ウム1.0％、酵母エキス0.5％、リン酸一カリウム0.05
％、MgSO4・7H2O 0.05％、pH7.0）100mlを500ml容三角
フラスコに分注、滅菌した後シュードモナス・ダクネー
（Pseudomonas dacunhae）IAM1152を植菌し、30℃にて
１日間振盪培養を行った（前培養）。次に、上記培地と
同様の培地１を２容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（12
0℃、20分間）後、前培養物の20mlを添加して、回転数1
000rpm、通気量1vvm、温度30℃、pH7.3にて１日間培養
を行った。
調製 Ａ）シュードモナス・ダクネー IAM 1152菌体の培養 培地（フマル酸ナトリウム0.5％、フマル酸アンモニ
ウム1.0％、酵母エキス0.5％、リン酸一カリウム0.05
％、MgSO4・7H2O 0.05％、pH7.0）100mlを500ml容三角
フラスコに分注、滅菌した後シュードモナス・ダクネー
（Pseudomonas dacunhae）IAM1152を植菌し、30℃にて
１日間振盪培養を行った（前培養）。次に、上記培地と
同様の培地１を２容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（12
0℃、20分間）後、前培養物の20mlを添加して、回転数1
000rpm、通気量1vvm、温度30℃、pH7.3にて１日間培養
を行った。
培養終了後、培養物1000mlから遠心分離して集菌し
た。
た。
Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）項にて調製した微生物菌体内にはアスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素の他に副反応酵素フマラーゼが共存
する為、原料とフマル酸が一部リンゴ酸に変換される問
題が生じるので、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理
を実施した。
ン酸β−脱炭酸酵素の他に副反応酵素フマラーゼが共存
する為、原料とフマル酸が一部リンゴ酸に変換される問
題が生じるので、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理
を実施した。
上記Ａ）項にて調製した菌体を反応液（ピルビン酸ナ
トリウム0.11g、ピリドキサール５′−リン酸10mg;蒸留
水１中に含有）の１に懸濁後、50℃にて２時間加熱
処理を行った。該処理物は遠心分離により集菌後、該菌
体をアスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体として使用
した。
トリウム0.11g、ピリドキサール５′−リン酸10mg;蒸留
水１中に含有）の１に懸濁後、50℃にて２時間加熱
処理を行った。該処理物は遠心分離により集菌後、該菌
体をアスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体として使用
した。
実施例−１ 実験例−１のＢ）項と実験例−４のＢ）項にて調製し
た菌体の懸濁液200mlから遠心分離により集菌した各微
生物菌体を合併し、反応液［フマル酸アンモニウム １
モル、ピルビン酸ナトリウム５ミリモル、ピリドキサー
ル５′−リン酸0.04ミリモル、ポリオキシエチレン（2
0）ソルビタンモノラウレート 0.05％、pH7.5（28％ア
ンモニア水にて調製）］の200mlに懸濁後、１容通気
撹拌槽に仕込み、第１表の実施区の条件にて、撹拌回転
数300rpmにて20時間反応した。
た菌体の懸濁液200mlから遠心分離により集菌した各微
生物菌体を合併し、反応液［フマル酸アンモニウム １
モル、ピルビン酸ナトリウム５ミリモル、ピリドキサー
ル５′−リン酸0.04ミリモル、ポリオキシエチレン（2
0）ソルビタンモノラウレート 0.05％、pH7.5（28％ア
ンモニア水にて調製）］の200mlに懸濁後、１容通気
撹拌槽に仕込み、第１表の実施区の条件にて、撹拌回転
数300rpmにて20時間反応した。
反応終了後、反応液中の生成アラニンを定量した。結
果を第１表に示した。該反応液の100mlをpH4.0に調整
後、煮沸濾過し、該濾液をアンバーライトIRC−50（H+
型）に導通後、水洗し次いで4.5％アンモニア水で溶出
する。この溶出液を減圧濃縮後、冷エタノールにて結晶
を析出させた。Ｌ−アラニン回収量を第１表に示した。
さらに回収アラニンについて比旋光度を測定したところ
すべて▲［α］23 D▼14.3゜（Ｃ＝10,6N−HCl）であっ
た。
果を第１表に示した。該反応液の100mlをpH4.0に調整
後、煮沸濾過し、該濾液をアンバーライトIRC−50（H+
型）に導通後、水洗し次いで4.5％アンモニア水で溶出
する。この溶出液を減圧濃縮後、冷エタノールにて結晶
を析出させた。Ｌ−アラニン回収量を第１表に示した。
さらに回収アラニンについて比旋光度を測定したところ
すべて▲［α］23 D▼14.3゜（Ｃ＝10,6N−HCl）であっ
た。
なお、比較例として反応液にピルビン酸を添加しない
場合のＬ−アラニン生成量を第１表にあわせて示した。
場合のＬ−アラニン生成量を第１表にあわせて示した。
実施例−２ 実施例−１の反応液中のピルビン酸ナトリウムをα−
ケト酪酸５ミリモルに変えた以外は実施例−１と同様の
実験を行った。結果を第２表に示した。
ケト酪酸５ミリモルに変えた以外は実施例−１と同様の
実験を行った。結果を第２表に示した。
なお、回収されたＬ−アラニンの比旋光度は▲［α］
25 D▼＝＋14.3゜（Ｃ＝10,6N−HCl）であった。
25 D▼＝＋14.3゜（Ｃ＝10,6N−HCl）であった。
実施例−３ 実験例−２のＢ）項と実験例−４のＢ）項にて調製し
た菌体の懸濁液200mlから集菌した各微生物菌体を用
い、実施例−１と同様に反応、精製した。結果を第３表
に示した。さらに回収アラニンについて比旋光を測定し
たところ▲［α］25 D▼＝＋14.4゜（Ｃ＝10、6N−HCl）
であった。
た菌体の懸濁液200mlから集菌した各微生物菌体を用
い、実施例−１と同様に反応、精製した。結果を第３表
に示した。さらに回収アラニンについて比旋光を測定し
たところ▲［α］25 D▼＝＋14.4゜（Ｃ＝10、6N−HCl）
であった。
実施例−４ 実施例−３の反応液中のピルビン酸ナトリウムをα−
ケト酪酸ナトリウム５ミリモルに変えた以外は実施例−
３と同様の実験を行った。結果を第４表に示した。
ケト酪酸ナトリウム５ミリモルに変えた以外は実施例−
３と同様の実験を行った。結果を第４表に示した。
なお、回収されたＬ−アラニンの比旋光度は▲［α］
25 D▼＝＋14.4゜（Ｃ＝10、6N−HCl）であった。
25 D▼＝＋14.4゜（Ｃ＝10、6N−HCl）であった。
実施例−５ 実験例−３のＢ）項と実験例−４のＢ）項にて調製し
た菌体の懸濁液200mlから集菌した各微生物菌体を用
い、実施例−１と同様に反応、精製した。結果を第５表
に示した。さらに回収アラニンについて比旋光を測定し
たところ▲［α］25 D▼＝＋14.4゜（Ｃ＝10、6N−HCl）
であった。
た菌体の懸濁液200mlから集菌した各微生物菌体を用
い、実施例−１と同様に反応、精製した。結果を第５表
に示した。さらに回収アラニンについて比旋光を測定し
たところ▲［α］25 D▼＝＋14.4゜（Ｃ＝10、6N−HCl）
であった。
実施例−６ 実施例−５の反応液中のピルビン酸ナトリウムをα−
ケト酪酸ナトリウム５ミリモルに変えた以外は実施例−
５と同様の実験を行った。結果を第６表に示した。
ケト酪酸ナトリウム５ミリモルに変えた以外は実施例−
５と同様の実験を行った。結果を第６表に示した。
なお、回収されたＬ−アラニンの比旋光度は▲［α］
25 D▼＝＋14.3゜（Ｃ＝10、6N−HCl）であった。
25 D▼＝＋14.3゜（Ｃ＝10、6N−HCl）であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 内田 康一 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 13/06 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】アスパルターゼを含有する微生物菌体又は
その処理物とアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する
微生物菌体又はその処理物との存在下、水溶性溶媒中で
フマル酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウムイオ
ンとを単一の反応槽で反応させ、該反応液中にＬ−アラ
ニンを生成せしめるに際し、該反応液に少なくともα−
ケト酸を含有させて反応温度が40〜50℃で反応させるこ
とを特徴とするＬ−アラニンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32833089A JP2942995B2 (ja) | 1989-03-16 | 1989-12-20 | Ｌ―アラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-62089 | 1989-03-16 | ||
| JP6208989 | 1989-03-16 | ||
| JP32833089A JP2942995B2 (ja) | 1989-03-16 | 1989-12-20 | Ｌ―アラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH037590A JPH037590A (ja) | 1991-01-14 |
| JP2942995B2 true JP2942995B2 (ja) | 1999-08-30 |
Family
ID=26403149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32833089A Expired - Fee Related JP2942995B2 (ja) | 1989-03-16 | 1989-12-20 | Ｌ―アラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2942995B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2412822C2 (ru) * | 2005-06-14 | 2011-02-27 | Асахи Гласс Компани, Лимитед | Многослойный материал из фторсодержащей смолы |
| JP2012026524A (ja) * | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Kanaflex Corporation | 管路更生管 |
-
1989
- 1989-12-20 JP JP32833089A patent/JP2942995B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH037590A (ja) | 1991-01-14 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |