JP4884863B2

JP4884863B2 - ニトリラーゼおよびニトリラーゼを用いるカルボン酸の製造方法

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Publication number: JP4884863B2
Application number: JP2006195014A
Authority: JP
Inventors: 透長澤; 豊和吉田; 彰収松山
Original assignee: Daicel Corp; Gifu University
Current assignee: Daicel Corp; Gifu University
Priority date: 2006-07-18
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2026-07-18
Also published as: JP2008022706A

Description

本発明は、特定の理化学的性質を有するニトリラーゼおよび当該ニトリラーゼを利用するニトリル化合物からカルボン酸を製造する方法に関する。

カルボン酸の製造方法として、ニトリラーゼ酵素を用いてニトリルを加水分解して製造する方法がある。ニトリラーゼはニトリルからカルボン酸に変換し得る有用な酵素である。

従来、ニトリラーゼとしては、たとえば、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓＪ１由来のニトリラーゼ（非特許文献１）、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓＫ２２由来の酵素（非特許文献２）、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓＪＭ３由来の酵素（非特許文献３）、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓＡＴＣＣ８７５０由来の酵素（特許文献１）、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＤＳＭ１１３８７（非特許文献４）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．ＰＣＣ６８０３（非特許文献５）などが報告されている。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の酵素（非特許文献６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓｓｐ．由来の酵素（非特許文献７）なども報告されている。

Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの酵素（非特許文献１、２、３、特許文献１）に関しては、有機溶媒耐性が知られていないか、あるいは低いので、有機溶媒を添加するような反応液を用いてニトリルを変換してカルボン酸を生産する等に商業的に利用するには改善の余地を残していた。公知のニトリラーゼは有機溶媒に対する感受性が比較的高い。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの酵素（非特許文献４）はＣ６−Ｃ１６のアルカンに対して耐性がある、あるいはＣ６−Ｃ１１のアルカノールに対して耐性があるという報告はあるが、親水性の高い有機溶媒に対する耐性について報告はない。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓの酵素（非特許文献５）は精製酵素を用いて各種有機溶媒中での反応を比較しているが、有機溶媒に曝した場合の活性の低下は不明であり、有機溶媒耐性という観点では不明である。また、アリル基を持つアセトニトリルに対し活性の高いニトリラーゼとして、前記非特許文献３、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７が知られているが、非特許文献３、６は分子量、非特許文献５、７は分子量およびｐＨ安定性で本発明酵素と異なっている。

さらに、各種ニトリラーゼ酵素を、メタノール、イソプロパノール、トルエンまたはヘキサンを含有する反応液（メタノールは１０％、２５％、イソプロパノールは１０％、トルエンは４０％、ヘキサンは７０％）中で反応をさせた結果が開示されているが、反応性の比較は開示されてはいない（特許文献２）。

また例えば、ニトリラーゼ活性物質を産生する微生物として、アースロバクター属に属する微生物が報告されている（特許文献３、４）。
一般に酵素反応は水溶液中で高活性を示すが、有機溶媒存在下では活性が著しく低下するか活性を全く示さないことがある。実際に、水溶性の低いニトリルを原料とする場合、予め有機溶媒を用いて溶解することが望ましいが、上述したアースロバクター属由来のニトリラーゼは有機溶媒に対する耐性を有しない。したがって、既知のアースロバクター属微生物由来のニトリラーゼ酵素は、水溶性の低いニトリルを原料としたカルボン酸の製造手段として適していなかった。

以上、従来、ニトリラーゼの有機溶媒耐性は不明である。しかしながら、水に溶解しないニトリル化合物の加水分解には必ず有機溶媒の添加が必要なので、有機溶媒に耐性のあるニトリラーゼの提供が望まれていた。
特開平４−３４１１８５号公報米国公開特許２００４０００２１４７号公報特開平１１−３４１９７９号公報特開２００３−２７４９３３号公報Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８２，３４９−３５６（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，４８０７−４８１５（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９４，７６５−７７２（１９９０）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２０（４），３２９−３３１（１９９８）ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６９（８），４３５９−４３６６（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ．，５，４６７−４７４（１９９８）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８４，４０７−４１８（２００６）

本発明は、ニトリル加水分解活性とともに高い有機溶媒耐性を持つニトリラーゼの提供および当該ニトリラーゼを用いてカルボン酸を製造する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは鋭意検討した結果、アースロバクターエスピーＦ−７３株に由来し、特定の理化学的性質を有する新規な酵素、好ましくは精製酵素が、極めて高い有機溶媒耐性と、ニトリル加水分解活性を示すことを見出した。また、該酵素が有機溶媒存在下で高いニトリラーゼ活性を維持し、水溶性の低いニトリルからカルボン酸を製造する手段として有用であることを見出し、本発明に至った。具体的には本発明は以下に示す通りである。

〔１〕アースロバクターエスピーＦ−７３株に由来し、下記の理化学的性質を有するニトリラーゼ；
［１］作用：
ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を酸化してカルボキシル基にする、
［２］基質特異性：
２−チオフェンアセトニトリルに作用するが、アセトニトリル、ベンゾニトリルに作用しない、
［３］至適ｐＨ：
ｐＨ６．０〜８．０（反応温度３０℃）でニトリラーゼの酸化活性が至適である、
［４］至適温度：
４０〜４５℃でニトリル基の酸化作用が最大活性を示す、
［５］ｐＨ安定性：
ｐＨ５．０−１１．０が安定領域である、および
［６］分子量：
ゲルろ過法による分子量が約５３０ｋＤａ、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量約４４ｋＤａのサブユニットに分離される、
［７］有機溶媒耐性：
メタノール、エタノール、アセトン、ＤＭＳＯおよび２−プロパノールからなる群から選択されたいずれかの有機溶媒を２０％（Ｖ／Ｖ）含む水溶液で、２０℃で６０分間処理して５０％以上の残存活性を示す。
〔２〕前記ニトリラーゼが精製酵素である、〔１〕に記載のニトリラーゼ。
〔３〕前記精製酵素が、下記段階を含む精製工程を経て得られたものである、〔２〕に記載のニトリラーゼ；
（１）アースロバクターエスピーＦ−７３株に由来する無細胞抽出液を、還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、さらに酵素が含まれる溶液の温度が５℃以下の条件下で調製する工程；
（２）還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、酵素が含まれる溶液のｐＨを７．０±０．３の条件下で、無細胞抽出液を硫安分画する工程；
（３）還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、酵素濃度が１００μｇ／ｍｌ以下にならない条件下で、陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程；および
（４）還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、酵素濃度が１００μｇ／ｍｌ以下にならない条件下で、疎水クロマトグラフィーを行う工程。
〔４〕有機溶媒を含む水溶液中で、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のニトリラーゼをニトリル化合物に接触させ、生成されるカルボン酸を回収する工程を含む、カルボン酸の製造方法。
〔５〕有機溶媒が、水溶性アルコール、水溶性ケトン、アミド類、ジメチルスルホキシド、エステル類、ハロゲンで置換されていてもよい炭化水素類、高級アルコール類およびエーテル類からなる群から選択される少なくとも１種である、〔４〕に記載の製造方法。
〔６〕ニトリル化合物が、アリールアセトニトリルである、〔４〕または〔５〕に記載の製造方法。
〔７〕有機溶媒の含有量が、９０％（Ｖ／Ｖ（有機溶媒の耐性／溶液の全体積））以下である、〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の製造方法。

本発明によれば、水溶性ニトリルを原料としてカルボン酸を効率的に製造できるだけでなく、水溶性が低く従来酵素反応に適さなかったニトリルをも効率的に加水分解し、対応するカルボン酸を製造することが可能となる。また本発明の酵素は、好ましくは精製酵素である。このような精製酵素は、極めて高い有機溶媒耐性と、ニトリル加水分解活性を示しつつ、保存安定性に優れ、副反応の生成を抑制し工業的利用に有利である。

［発明の実施の形態］
本発明は、アースロバクターエスピーＦ−７３株に由来し、特定の理化学的性質を有するニトリラーゼを提供する。本発明のニトリラーゼは優れた有機溶媒耐性を示す。

アースロバクターエスピーＦ−７３株
本発明のニトリラーゼを含有する「アースロバクターエスピーＦ−７３株」は岐阜大学の構内から採取された土壌より分離した微生物株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて「ＦＥＲＭＰ−２０３４９」として寄託されている。本菌株は本アクセッション番号をもとに前記受託機関より入手することができる。

あるいは、アースロバクター属の株の単離は、たとえば、先ず、アースロバクター属微生物を含む被験試料をニトリル含有培地で培養し、培養物に蓄積するカルボン酸を測定することによって、目的とするニトリラーゼ活性を有する微生物の存在を同定し得る。被験試料は土壌、河川、あるいは湖沼などから採取の材料とすることができる。アースロバクター属に属する微生物を単離・同定する方法は、たとえば、「Ｂｅｒｇｅｙ'ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，９ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ」（ＥｄｉｔｅｄｂｙＪｏｈｎＧ．Ｈｏｌｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ & Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）を参照することができる。

上記微生物は、細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養される。前記微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖しうるものであれば特に制限はない。例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能な任意の炭素源を使用することができる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類、ソルビトール、グリセロールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、トルエン、クレゾール、安息香酸などあるいはこれらの混合物を使用することができる。

窒素源としては例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、尿素、などの無機有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物を使用することができる。他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類など、通常の培養に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。また、必要に応じて微生物の増殖を促進する因子、本発明の目的化合物の生成能力を高める因子、あるいは培地のｐＨ保持に有効なＣａＣＯ_３などの物質も添加できる。

培養方法としては、培地ｐＨは３〜１１、好ましくは４〜８、培養温度は１５〜６０℃、好ましくは２０〜４５℃で、嫌気的あるいは好気的に、その微生物の生育に適した条件下５〜２４０時間、好ましくは１２〜１２０時間程度培養する。

ニトリラーゼ
本発明のニトリラーゼは、アースロバクターエスピーＦ−７３株に由来し、下記の理化学的性質を有するニトリラーゼである。
［１］作用：
ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を酸化してカルボキシル基にする、
［２］基質特異性：
２−チオフェンアセトニトリルに作用するが、アセトニトリル、ベンゾニトリルに作用しない、
［３］至適ｐＨ：
ｐＨ６．０〜８．０（反応温度３０℃）でニトリラーゼの酸化活性が至適である、
［４］至適温度：
４０〜４５℃でニトリル基の酸化作用が最大活性を示す、
［５］ｐＨ安定性：
ｐＨ５．０−１１．０が安定領域である、および
［６］分子量：
ゲルろ過法による分子量が約５３０ｋＤａ、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量約４４ｋＤａのサブユニットに分離される、
［７］有機溶媒耐性：
メタノール、エタノール、アセトン、ＤＭＳＯおよび２−プロパノールからなる群から選択されたいずれかの有機溶媒を２０％（Ｖ／Ｖ）（有機溶媒の体積／溶液の全体積）含む水溶液で、２０℃で６０分間処理して５０％以上の残存活性を示す。

本発明において「ニトリラーゼ」とは、ニトリル化合物を加水分解してカルボン酸に変換する酵素である。本発明の特定の理化学的性質を有するニトリラーゼは、従来のニトリラーゼでは見られない水溶性有機溶媒を含めた有機溶媒に対して耐性を示す。そのため、水に難溶なニトリルを基質として効率よく対応するカルボン酸に変換し得る。したがって、本発明のニトリラーゼのニトリラーゼ活性を利用すれば、水溶性のニトリルから水に難溶なニトリルという広範囲な基質化合物を原料として、対応するカルボン酸を工業的に製造することが可能となる。本発明のニトリラーゼは、アースロバクターエスピーＦ−７３株に由来する。

本発明における「ニトリラーゼ活性」は、次のようにして確認することができる。酵素活性の測定は、２０℃で、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭジチオスレイトール（以下「ＤＴＴ」と略す。）適当量の酵素液を加えた反応液（２ｍｌ）に１０ｍＭの基質を加えることにより反応を開始させる（基質が２−チオフェンアセトニトリルの場合、標準反応条件）。反応は３ＮＨＣｌを０．２ｍｌの添加により停止する。反応時間は６０分として行う。
反応液を遠心分離して上清液を得る。ＨＰＬＣにより基質を定量分析する。ＨＰＬＣ分析は、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩＣ１８ＴＳ（４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いて、展開溶媒として１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４／Ｈ_３ＰＯ_４（ｐＨ２．８）／ＣＨ_３ＣＮ（基質が２−チオフェンアセトニトリルの場合、１３／７（Ｖ／Ｖ））を用い（流速１ｍｌ／ｍｉｎ）、２３５ｎｍで検出する。
標準反応条件下で１分間に１マイクロモル（１μｍｏｌ）の２−チオフェン酢酸の生成を触媒する酵素量を１ユニットと定義する。
タンパク質の定量は、たとえばＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４．）により、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のタンパク定量キットを用いて行うことができる。
基質特異性の検討においては、生成したアンモニアをインドフェノール法（Ｆａｗｃｅｔｔ，Ｊ．Ｋ．&Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｅ．（１９６０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３，１５６−１５９．）によって比色定量することができる。

本発明における「有機溶媒耐性」とは、有機溶媒で処理した後に、酵素活性が維持されることをいう。本発明のニトリラーゼは、たとえば２０％（Ｖ／Ｖ）のアセトンで２０℃で６０分間処理したときに、酵素活性は実質的に低下しない。本発明において「酵素活性が実質的に低下しない」とは、有機溶媒の無い状態で同じ条件で処理した場合と比較して、酵素の残存活性が１０％以上である場合を意味する。

本発明のニトリラーゼは、アセトンのほか、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタノール、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン、ｎ−ヘキサデカン、ｔ−酪酸メチル、ジイソプロピルアルコール、酢酸エチルなどの有機溶媒に対する耐性を有する。
本発明のニトリラーゼは、これらの有機溶媒のうち、メタノール、エタノール、アセトン、ＤＭＳＯおよび２−プロパノールからなる群から選択されたいずれかの有機溶媒に対しては、これらを２０％（Ｖ／Ｖ）（有機溶媒の体積／溶液の全体積）含む水溶液で２０℃で６０分間処理して、５０％以上、好ましくは５０％−１００％、さらに好ましくは６５％−１００％の残存活性を有する。

本発明で用いるニトリラーゼは、精製酵素であることが好ましい。本発明において「精製酵素」とは、電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製した酵素を意味し、分画やクロマトグラフィーなどを実施していない単なる抽出後の粗精製酵素は含まない。このような精製酵素は粗酵素と比較して、保存安定性に優れるとともに、副生成物の生成が抑制されるので、工業的に有利である。

本発明のアースロバクターエスピーＦ−７３株に由来するニトリラーゼは、サブユニットの１２量体であると推定され、かつ得られる酵素量が微量であったため、通常のタンパク質精製方法では酵素を安定的に得ることが困難である。このため、酵素の安定的取得のため、各種の精製手段を組み合わせる必要がある。
たとえば該酵素を産生する微生物を、まず十分に増殖させた後に菌体を回収し、適当な緩衝液中で、破砕して無細胞抽出液とする。緩衝液には、２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＦＳ）のようなプロテアーゼ阻害剤を加えることができる。

アースロバクターエスピーＦ−７３株からの酵素の調製においては、無細胞抽出液の調製に当たり、還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、さらに酵素が含まれる溶液の温度が５℃以下の条件下であることが好ましい。このような条件であると、１２量体である酵素を安定に得ることができる。

得られた無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画および各種のクロマトグラフィーを組み合わせることにより、ニトリラーゼを精製する必要がある。

蛋白質の溶解度による分画方法としては、例えばアセトンやジメチルスルホキシドのような有機溶媒による沈澱や硫安による塩析等を利用することができる。一方クロマトグラフィーには、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いた多くのアフィニティクロマトグラフィーが公知である。より具体的には、例えば、フェニル-トヨパールを用いた疎水クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ-セファロースを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチル-トヨパールを用いた疎水クロマトグラフィー、ブルー-セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、スーパーデックス２００を用いたゲルろ過等を経て、本発明のニトリラーゼを電気泳動的にほぼ単一バンドまで安定に精製することができる。

たとえば、酵素の精製方法としては次のステップを含むことが好ましい。
（１）無細胞抽出液を硫安分画する工程、
（２）陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程、および
（３）疎水クロマトグラフィーを行う工程。

この場合、無細胞抽出液を硫安分画する工程は、還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、酵素が含まれる溶液のｐＨを７．０±０．３の条件下で行うことが好ましい。
陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程は、還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、カラムから溶出させる緩衝液中の酵素濃度が１００μｇ／ｍｌ以下にならないように濃度調製して行うことが好ましい。
疎水クロマトグラフィーを行う工程は、還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、カラムから溶出させる緩衝液中の酵素濃度が１００μｇ／ｍｌ以下にならないように濃度調製して行うことが好ましい。
このような条件であると、１２量体である酵素を安定に得ることができる。

本発明のニトリラーゼ活性を有する前記酵素は、実質的に純粋なタンパク質とすることができる。本発明において、実質的に純粋なタンパク質とは、他の生物学的な分子を実質的に含まないことをいう。より具体的には、実質的に純粋なタンパク質とは、乾燥重量で、通常７５％以上、あるいは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の純度を有する。タンパク質の純度を決定する方法は公知である。具体的には、各種カラムクロマトグラフィー、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動分析によって、タンパク質の純度を知ることができる。

ニトリラーゼを用いるカルボン酸の製造方法
本発明は、前記ニトリラーゼを利用して、ニトリルからカルボン酸を製造する方法を提供する。

本発明のカルボン酸の製造方法では、上述した微生物に由来する、またはそれと同一の理化学的性質を有するニトリラーゼを使用するが、ニトリラーゼの精製酵素であることが好ましい。また精製したニトリラーゼを不溶性の担体や水溶性の担体分子に結合したもの、酵素分子を包括固定することによって得られる固定化酵素等も本発明のニトリラーゼに含まれる。

本発明の製造方法において、原料となるニトリルは、好ましくはアリールアセトニトリル、シアノヒドリン類、飽和ニトリル、不飽和ニトリルであり、さらに好ましくはアリールアセトニトリルである。

本発明において「アリールアセトニトリル」とは、Ｃ_6-10アリール環または５〜１０員ヘテロアリール環にアセトニトリル基が結合した化合物を意味する。Ｃ_6-10アリール環とは炭素数６〜１０の芳香族性の炭化水素環をいい、具体的には、ベンゼン、トルエン、ナフタレンなどが挙げられる。５〜１０員ヘテロアリール環とは、環を構成する原子の数が５〜１０、好ましくは５または６であり、環を構成する原子中に１〜２個（好ましくは１個）のヘテロ原子（硫黄原子、酸素原子または窒素原子、好ましくは窒素原子）を含有する芳香族性の環を意味し、具体的にはたとえば、ピリジン環、チオフェン環などが挙げられる。

アリールアセトニトリルとしては、たとえば、好ましくは２−チオフェンアセトニトリル、３−チオフェンアセトニトリル、３−ピリジンアセトニトリル、２−ピリジンアセトニトリル、２−トリルアセトニトリル、３−トリルアセトニトリル、４−トリルアセトニトリル、ベンジルシアナイド、ナフチルアセトニトリルなどが挙げられる。これらのうちでは、２−チオフェンアセトニトリル、３−チオフェンアセトニトリル、３−ピリジンアセトニトリル、２−ピリジンアセトニトリル、４−トリルアセトニトリルなどがさらに好ましい。

シアノビドリン類としては、マンデロニトリル、２−クロロマンデロニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルなどが挙げられる。

飽和ニトリルとしては、プロピロニトリル、ブチロニトリル、バレロニトリル、２−フルオロニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル、３−シアノ−２−メチルプロパノールなどが挙げられる。

不飽和ニトリルとしては、アクリロニトリルなどが挙げられる。

本発明のカルボン酸の製造方法を実施するための反応液は、水や緩衝液などの水系反応であっても、有機溶媒が添加された水系反応液であってもよい。上述の通り、本発明のニトリラーゼは、ニトリラーゼ活性を有し、かつこのニトリラーゼは有機溶媒耐性である。したがって、水または緩衝液のような水系反応液を用いて製造を実施することも、有機溶媒が添加された水系反応液で実施することもできる。したがって、基質となるニトリルが水系反応液に溶けにくい場合には、有機溶媒が添加されて水系反応液を用いて基質の溶解度を高めた状態で反応させることが可能となる。このことにより従来の微生物のニトリラーゼを用いた方法では、製造が困難あるいは不効率であった水に難溶なニトリルを原料とするカルボン酸も工業的に製造することが可能となる。

水系反応液に添加し得る有機溶媒としては、以下に具体的に例示する水溶性アルコール類、水溶性ケトン類、アミド類、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
前記水溶性アルコール類としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタノール、１，３−プロパンジオール、エチレングリコールなどが挙げられ、これらのうち、メタノール、エタノール、プロパノールが好ましく、メタノール、エタノールがさらに好ましい。
前記水溶性ケトン類としては、アセトンなどが挙げられる。前記アミド類としては、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。

あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒を添加し有機溶媒と水系反応液との二層系を用いてもよい。水に溶解しにくい有機溶媒としては、以下に例示するエステル類、ハロゲンで置換されていてもよい炭化水素類、高級アルコール類、エーテル類等が挙げられる。
エステル類としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、ｔ−酪酸メチルなどが挙げられる。
ハロゲンで置換されていてもよい炭化水素類としては、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン、ｎ−ヘキサデカン、シクロヘキサン、またはクロロホルムなどが挙げられる。
高級アルコール類としては、１−オクタノールなどが挙げられる。
エーテル類としては、ジイソプロピルエーテル、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフランなどが挙げられる。

有機溶媒は本発明の加水分解反応を損なわない範囲で適宜添加すればよいが、通常、水系反応液に対して、好ましくは９０％（Ｖ／Ｖ）（有機溶媒の体積／溶液の全体積）以下、さらに好ましくは８０％（Ｖ／Ｖ）以下、より好ましくは６０％（Ｖ／Ｖ）以下の量を添加できる。添加量の下限値は、好ましくは１％、さらに好ましくて５％程度である。

例えば、アセトン、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ヘキサン等の場合は１０〜５０％（Ｖ／Ｖ）以下、好ましくは２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）が添加できる。ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、１，３−プロパンジオール等の場合は５〜３０％（Ｖ／Ｖ）以下、好ましくは１０〜２０％以下の量が添加できる。酢酸エチルの場合は、５〜９０％（Ｖ／Ｖ）以下、好ましくは１０〜８０％以下の量が添加できる。

また、これらの有機溶媒は、酵素活性を損なわない範囲で適宜２種以上を混合して添加しても差し支えない。

反応液中の基質化合物の濃度は、特に制限されないが、たとえば通常、０．１〜１０重量％、好ましくは０．２〜５．０重量％とすることができる。基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。

さらに本発明の加水分解反応において、反応液中に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤としては、０．１〜５．０重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、あるいはＴｗｅｅｎ６０などが用いられる。

この基質濃度に対して、本発明のニトリラーゼは、たとえば１ｍＵ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１００ｍＵ／ｍＬ以上の酵素活性量とすることにより、酵素反応を効率的に進めることができる。酵素は、反応液に溶解あるいは分散させることにより、基質と接触させることができる。あるいは、化学結合や包括などの手法によって固定化した酵素を用いることもできる。更に、基質は透過できるが、酵素分子や菌体の透過を制限する多孔質膜で基質溶液と酵素を隔てた状態で反応させることもできる。

反応は、通常、氷点〜５０℃、好ましくは１０〜３０℃で０．１〜１００時間行うことができる。反応液のｐＨは、酵素活性を維持できれば特に限定されないが、通常、５〜１０、好ましくは６〜９の範囲で適宜設定すればよい。

反応液中でニトリルと本発明の酵素が接触することにより、ニトリルが加水分解されて対応するカルボン酸が生成し反応液に蓄積する。ここで蓄積したカルボン酸は、反応液から公知の方法によって回収し、精製することができる。具体的には、たとえば、限外ろ過、濃縮、カラムクロマトグラフィー、抽出、活性炭処理、蒸留など通常の方法を組み合せることで回収、精製できる。

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

［実施例１］
培養：
アースロバクターエスピーＦ−７３株の前培養（４ｍｌ）はペプトン、酵母エキスを含む栄養培地を用いて２８℃で２４時間振とう培養を行った。本培養は０．４％（ｗ／ｖ）Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、０．１５％酵母エキス、０．１％リン酸第一カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム（７水和物）からなる培地（４０ｍｌ，ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容の肩つき振とうフラスコに入れ、滅菌処理を行った。これに、前培養（４ｍｌ）を植菌し、同時に０．３％（Ｖ／Ｖ）イソバレロニトリルをニトリラーゼ生成のインデユーサーとして添加して、２８℃で７２時間、振とう培養した。このようにして高活性のニトリラーゼを含む菌体を調製した。

無細胞抽出液の調製：
菌株を５℃で１５，０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して集菌した。培養液（２Ｌ）から得られた菌体（乾燥菌体量として５．２ｇ）を、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌに懸濁して遠心分離をする操作を２度繰り返して、菌体を十分に洗浄した。この菌体を１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の５０ｍｌに５℃以下で懸濁した。５℃以下で超音波発生装置（Ｍｏｄｅｌ２０１久保田製作所）を用いて１００Ｗ、２０分間の破砕操作を行い、細胞抽出液を調製した。これを１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体を除去し、無細胞抽出液を得た。

酵素の精製：
本発明の酵素の精製にあたっては、酵素を安定かつ純度よく精製するために各種の精製手段を組み合わせた。
（１）硫安分画
無細胞抽出液に硫酸アンモニウムを４０％飽和になるように添加した。この時、１０％（ｗ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨ７．０に保った。４時間攪拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分間）を行い、沈殿画分を１ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（ＢｕｆｆｅｒＡ）に懸濁した。この懸濁液をＢｕｆｆｅｒＡで十分に透析して硫酸アンモニウムを除いた。透析後、遠心分離して、沈殿物を除去して上清液を得た。

（２）ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムクロマトグラフィー（陰イオン交換クロマトグラフィー）
ＢｕｆｆｅｒＡで十分に平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（Φ３０×２５０ｍｍ）に酵素液をのせ、同緩衝液を流して洗浄した。その後０．２５ＭＫＣｌを含むＢｕｆｆｅｒＡで洗浄したが活性は溶出しなかった。次に０．３５ＭＫＣｌを含むＢｕｆｆｅｒＡを流したところ、目的とするニトリラーゼ活性が溶出した。この画分に硫酸アンモニウムを２０％飽和となるように添加した。この間、カラムから溶出された緩衝液中の酵素濃度が、１０９μｇ／ｍｌとなるように、溶液量を調整した。

（３）Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）
２０％飽和硫酸アンモニウムを含むＢｕｆｆｅｒＡで十分に平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（Φ２０×２００ｍｍ）に活性画分をのせ、同緩衝液で十分に洗浄した。次に１０％飽和硫酸アンモニウムを含むＢｕｆｆｅｒＡで洗浄した後、５％飽和硫安アンモニウムを含むＢｕｆｆｅｒＡで目的とするニトリラーゼ活性が溶出した。本活性画分を集めて１５％飽和硫酸アンモニウムを含むＢｕｆｆｅｒＡで十分に透析した。この間、カラムから溶出された緩衝液中の酵素濃度が、３７６μｇ／ｍｌとなるように、溶液量を調整した。

（４）Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー
１５％飽和硫酸アンモニウムを含むＢｕｆｆｅｒＡで十分に平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Φ２０×１０ｍｍ）に活性画分をのせ、同Ｂｕｆｆｅｒを流して洗浄した。その後ＢｕｆｆｅｒＡで洗浄した後、１０％（Ｖ／Ｖ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌを含むＢｕｆｆｅｒＡを流すことにより、目的とするニトリラーゼ活性が溶出した。活性画分を集めて、ＢｕｆｆｅｒＡで十分に透析を行った。

表１にアースロバクターエスピーＦ−７３株のニトリラーゼを精製した結果を示す。このように精製した酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示し、高度に精製されていることを確認した。
本アースロバクターエスピーＦ−７３株のニトリラーゼの最終精製標品は総タンパク質４．６ｍｇ、標準反応条件下での比活性６１．１ｕｎｉｔ／ｍｇ、精製収率１３．８％であった。

得られた酵素の諸性質：
（１）分子量、サブユニット分子量
ＳＤＳゲル電気泳動から、本ニトリラーゼのサブユニットは約４４ｋＤａ、ゲル濾過クロマトグラフィーから分子量は約５３０ｋＤａと算出され、同じ大きさのサブユニットの１２量体と考えられた。

（２）至適ｐＨ、温度、熱安定性
本酵素反応を３０℃で１５分行い反応の至適ｐＨを検討したところ、ｐＨ６．０−８．０にあり、ｐＨ５．０以下、ｐＨ９．０以上で急激に活性が低下した。各種ｐＨ条件下で酵素溶液を３０分間保った後、ｐＨ７．０で１０分間反応させｐＨ安定性を検討したところ、ｐＨ５．０−１１．０の範囲で安定であった。
本酵素を１５分あるいは３０分間、各種温度に保った後、３０℃で１０分間反応させたところ、４０−４５℃で安定であったが、５０℃を超えると失活が認められた。また２０−６０℃で１０分間反応させた反応の至適温度を検討したところ、４０−４５℃で最大活性を示した。

［実施例２］
基質特異性：
実施例において、酵素活性の測定は、２０℃で、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭＤＴＴと適当量の酵素液を加えた反応液（２ｍｌ）に表２の基質１０ｍＭを加えることにより反応を開始させて実施した。反応は３ＮＨＣｌを０．２ｍｌの添加により停止した。反応時間は６０分とした。反応液を遠心分離して上清液を得た。

反応によって生成した有機酸を高速液体クロマトグラフィーあるいはガスクロマトグラフィーで定量分析した。

ＨＰＬＣ分析は、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＴＳ（４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いて、１０ｍＭ、ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｈ_３ＰＯ_４（ｐＨ２．８）／ＣＨ_３ＣＮの系で、リン酸緩衝液とアセトニトリルの溶媒の量比を基質によって変化させた。

たとえば、マンデル酸は１７／３（ｖ／ｖ）で２３５ｎｍで検出、２−クロロマンデル酸は１３／７（ｖ／ｖ）で２２０ｎｍで検出、２−，３−チオフェン酢酸は６５：３５（ｖ／ｖ）で２３５ｎｍで検出、３−トリルアセトニトリル、ベンジルシアナイド、ナフトアセトニトリルは、１：１（ｖ／ｖ）で２３０ｎｍで検出、２−トリルアセトニトリル、２−，３−ピリジンアセトニトリルは、２／１（ｖ／ｖ）で２３０ｎｍで検出、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルと２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸は９／１（ｖ／ｖ）で２１０ｎｍで検出、２−フランカルボン酸は９／１（ｖ／ｖ）で、２３０ｎｍで検出、アクリル酸は４／１（ｖ／ｖ）で２１０ｎｍで検出した。

ＧＣ分析は、ガスクロマトグラフィー（島津モデルＧＣ−１４Ａ）を用いて、Ｔｈｅｒｍｏｎ３０００（５％ｏｎＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂＷ）８０／１００メッシュ）をパックしたガラスカラムを用いて、インジェクター、検出器、カラムの温度をそれぞれ２３０、２３０、１５０℃にセットして行った。

各種基質に対する本ニトリラーゼの基質特異性（相対活性）の結果を表２に示す。本酵素は、２−チオフェンアセトニトリルをもっとも良好な基質とし、これに対する活性（４３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質）を１００とした相対活性で示した。３−チオフェンアセトニトリル、３−ピリジンアセトニトリル、２−ピリジンアセトニトリル、４−トリルアセトニトリル、３−トリルアセトニトリル、ベンジルシアナイドなどアリールアセトニトリル類を良好な基質とし、アンモニア及び対応するカルボン酸を生成した。

他にマンデロニトリル、２−クロロマンデロニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルなどのα−シアノヒドリン類にも作用した。アクリロニトリル、ｎ−バレロニトリルにも作用したが、ベンゾニトリル、ｐ−シアノフェノール、ｏ−シアノフェノール、ｏ、ｍあるいはｐ−トルニトリル、３-シアノピリジン、シアノピラジン、２-シアノチオフェン、３-インドールアセトニトリル、メタアクリロニトリル、イソバレロニトリル、イソブチロニトリル、クロトンニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリルなどには作用しなかった。よって本ニトリラーゼはアリルアセトニトリラーゼの範疇に入ると判断された。なお２−チオフェンアセトニトリルに対するＫｍ値は、１５μＭ以下の小さい値を示し、値が小さすぎるために正確なＫｍ値の測定ができなかった。

タンパク質の定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４．）により、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のタンパク定量キットを用いて行った。
基質特異性の検討においては、生成したアンモニアをインドフェノール法（Ｆａｗｃｅｔｔ，Ｊ．Ｋ．&Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｅ．（１９６０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３，１５６−１５９．）によって比色定量した。

［実施例３］
阻害剤の効果：
各種阻害剤を添加して本ニトリラーゼ活性を測定したところ、１ｍＭのＣｕ^２＋、Ｈｇ^２＋、Ａｇ^＋、０．１ｍＭｐ−クロロ水銀安息香酸（ｐ−ＣＭＢ）などのＳＨ阻害剤の添加によって大きく阻害を受けた。これらの阻害は５ｍＭＤＴＴを添加することで回復した。

［実施例４］
有機溶媒の添加効果：
有機溶媒添加条件下、活性を検討した。結果を表３に示す。菌体に比べて精製酵素の有機溶媒に対する耐性は減少したが、表３に示した水に可溶性の有機溶媒添加条件下では、溶媒耐性を示し活性を示した。

ｎ−ブタノールと水の混合液（１：９、Ｖ／Ｖ）、トルエンと水との混合液（１：９、Ｖ／Ｖ）に対しては強い阻害を受け、ほぼ完全に失活した。しかし、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタノール、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン、ｎ−ヘキサデカン、ｔ-酪酸メチル、ジイソプロピルエーテルと水の混合液（１：１、Ｖ／Ｖ）については、全く阻害を受けなかった。酢酸エチルと水との混合液（９：１、８：２）に対しては、無添加に比べて、それぞれ７５％、３８％の活性を示した。

このような精製したニトリラーゼが、優れた有機溶媒耐性を有することは、本発明において初めて見出された極めて驚くべき性質である。たとえば、菌体では細胞膜によるバリヤーが存在し、無細胞粗酵素では、不純物および安定化を促す夾雑物の存在により、菌体反応および無細胞反応(粗酵素)に一定の有機溶媒耐性があることはあり得る。しかし精製したニトリラーゼが優れた有機溶媒耐性を有するかどうかは、予測不可能であり、今回、単離精製して初めて確認された。

［実施例５］
有機溶媒存在下の水溶液中における精製ニトリラーゼを用いる各種カルボン酸の生産：
実施例１で得られた精製酵素０．１ｍｇを反応液２ｍｌ（表４に列挙した基質２０ｍＭを含む、リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＭメタノール５％（ｖ／ｖ））を含む試験管中で、２５℃で、２時間反応させた後、さらに基質２０ｍＭを追加添加して、さらに２時間、２５℃で反応させた。計４時間の反応のあと、生成したカルボン酸を定量した。結果を表４に示す。基質として用いた２−チオフェンアセトニトリル、３−チオフェンアセトニトリル、３−ピリジンアセトニトリル、２−ピリジンアセトニトリル、４−トリルアセトニトリル、３−トリルアセトニトリル、ベンジルシアナイド、（Ｒ，Ｓ）−マンデロニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルにおいて、高い収率で、対応するカルボン酸が得られた。結果を表４に示す。

本発明の有機溶媒耐性のニトリラーゼを利用することにより、反応に使用し得る反応液が、水系反応液、水溶性有機溶媒を添加した水系反応液、水系反応液に溶解しない有機溶媒を添加したニ層系などと広がり、これにより基質として使用し得るニトリルも水溶性ニトリルから、水に難溶なニトリルまで広範囲に対応することが可能となった。そのため、本発明の酵素を用いることにより、従来、ニトリラーゼを利用した製造では困難であったカルボン酸を含むより多くのカルボン酸を工業的に製造することが可能となる。

Claims

有機溶媒を含む水溶液中で、受託番号FERM P-20349で表されるアースロバクターエスピーＦ−７３株に由来し下記［１］〜［７］の理化学的性質を有する精製したニトリラーゼを、ニトリル化合物に接触させ、生成されるカルボン酸を回収する工程を含む、カルボン酸の製造方法であって、
該ニトリル化合物が、２−チオフェンアセトニトリル、３−チオフェンアセトニトリル、３−ピリジンアセトニトリル、２−ピリジンアセトニトリル、４−トリルアセトニトリル、３−トリルアセトニトリル、ベンジルシアナイド、マンデロニトリル、および２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルからなる群から選択され、
該有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタノール、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン、ｎ−ヘキサデカン、ｔ-酪酸メチル、ジイソプロピルエーテル、および酢酸エチルからなる群から選択される、方法；
［１］作用：
ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を酸化してカルボキシル基にする、
［２］基質特異性：
２−チオフェンアセトニトリルに作用するが、アセトニトリル、ベンゾニトリルに作用しない、
［３］至適ｐＨ：
ｐＨ６．０〜８．０（反応温度３０℃）でニトリラーゼの酸化活性が至適である、
［４］至適温度：
４０〜４５℃でニトリル基の酸化作用が最大活性を示す、
［５］ｐＨ安定性：
ｐＨ５．０−１１．０が安定領域である、および
［６］分子量：
ゲルろ過法による分子量が約５３０ｋＤａ、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量約４４ｋＤａのサブユニットに分離される、
［７］有機溶媒耐性：
メタノール、エタノール、アセトン、ＤＭＳＯおよび２−プロパノールからなる群から選択されたいずれかの有機溶媒を２０％（Ｖ／Ｖ）含む水溶液で、２０℃で６０分間処理して５０％以上の残存活性を示す。
ニトリル化合物が、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルである、請求項１に記載の製造方法。
有機溶媒の含有量が、９０％（Ｖ／Ｖ（有機溶媒の耐性／溶液の全体積））以下である、請求項１または２に記載の製造方法。
前記精製したニトリラーゼが、下記段階を含む精製工程を経て得られたものである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法；
（１）アースロバクターエスピーＦ−７３株に由来する無細胞抽出液を、還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、さらに酵素が含まれる溶液の温度が５℃以下の条件下で調製する工程；
（２）還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、酵素が含まれる溶液のｐＨを７．０±０．３の条件下で、無細胞抽出液を硫安分画する工程；
（３）還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、酵素濃度が１００μｇ／ｍｌ以下にならない条件下で、陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程；および
（４）還元剤としてジチオスレイトールを存在させ、酵素濃度が１００μｇ／ｍｌ以下にならない条件下で、疎水クロマトグラフィーを行う工程。