JP3437879B2 - 細菌の培養法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ニトリラーゼ酵素活性
の高い細菌菌体を培養により高収量で生産する方法に関
する。近年、微生物またはその酵素を種々の単位化学反
応や複合化学反応の触媒として利用しようとする動きが
盛んになってきている。ニトリラーゼはニトリル類を加
水分解して対応する酸類を生成させる酵素として知られ
ており、有機酸を製造する触媒として有用である。
の高い細菌菌体を培養により高収量で生産する方法に関
する。近年、微生物またはその酵素を種々の単位化学反
応や複合化学反応の触媒として利用しようとする動きが
盛んになってきている。ニトリラーゼはニトリル類を加
水分解して対応する酸類を生成させる酵素として知られ
ており、有機酸を製造する触媒として有用である。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ニト
リラーゼ酵素活性を有する微生物としては、例えば、バ
チルス(Bacillus)属、バクテリジウム(Bacteridium)
属、ミクロコッカス(Micrococcus) 属およびブレビバク
テリウム(Brevibacterium)属〔特公昭５８−１５１２０
号公報参照〕、アシネトバクター(Acinetobacter) 属
〔特公昭６３−２５９６号公報参照〕、コリネバクテリ
ウム(Corynebacterium) 属〔特公昭６３−５６８０号公
報参照〕およびアルカリゲネス(Alcaligenes) 属〔特開
平１−１３２３９２号公報参照〕、ロドコッカス(Rhodo
coccus) 属〔特開平３−２５１１９２号公報参照〕等に
属する細菌が知られている。
リラーゼ酵素活性を有する微生物としては、例えば、バ
チルス(Bacillus)属、バクテリジウム(Bacteridium)
属、ミクロコッカス(Micrococcus) 属およびブレビバク
テリウム(Brevibacterium)属〔特公昭５８−１５１２０
号公報参照〕、アシネトバクター(Acinetobacter) 属
〔特公昭６３−２５９６号公報参照〕、コリネバクテリ
ウム(Corynebacterium) 属〔特公昭６３−５６８０号公
報参照〕およびアルカリゲネス(Alcaligenes) 属〔特開
平１−１３２３９２号公報参照〕、ロドコッカス(Rhodo
coccus) 属〔特開平３−２５１１９２号公報参照〕等に
属する細菌が知られている。
【０００３】しかし、これらのうち、特公昭５８−１５
１２０号公報記載の方法では、その活性が低く実用的で
はない。そこで、微生物の触媒活性を高めるために、上
記特公昭６３−２５９６号公報等には、アセトニトリ
ル、イソブチロニトリルなどの、ニトリル化合物をニト
リラーゼ誘導物質として添加して微生物の培養を行う方
法が提案されている。しかしながら、このような方法で
は、微生物が培地中に添加されたこれらニトリル化合物
を培養中に資化するために、ニトリル化合物をその消費
に応じて培地に追加する必要があり、常に安定して高活
性の菌体を得ることは難しい。また、一部のニトリル化
合物は揮発性、引火性が強く、中には著しい悪臭を放つ
ものもあり、工業的培養において用いることは困難であ
る。上記特開平３−２５１１９２号公報では、ラクタム
化合物を添加した培地でロドコッカス属を培養すること
により、ニトリラーゼ酵素活性を有する菌体を製造する
方法が提案されている。この方法では、培養液中のラク
タム化合物はほとんど資化されず、一定濃度を保つため
にニトリラーゼ酵素の誘導効果が安定している点で優れ
ているが、その誘導効果は全てのロドコッカス属の細菌
にあるわけではない。そこで、ラクタム化合物以外の有
効なニトリラーゼ酵素誘導物質の開発が望まれていた。
１２０号公報記載の方法では、その活性が低く実用的で
はない。そこで、微生物の触媒活性を高めるために、上
記特公昭６３−２５９６号公報等には、アセトニトリ
ル、イソブチロニトリルなどの、ニトリル化合物をニト
リラーゼ誘導物質として添加して微生物の培養を行う方
法が提案されている。しかしながら、このような方法で
は、微生物が培地中に添加されたこれらニトリル化合物
を培養中に資化するために、ニトリル化合物をその消費
に応じて培地に追加する必要があり、常に安定して高活
性の菌体を得ることは難しい。また、一部のニトリル化
合物は揮発性、引火性が強く、中には著しい悪臭を放つ
ものもあり、工業的培養において用いることは困難であ
る。上記特開平３−２５１１９２号公報では、ラクタム
化合物を添加した培地でロドコッカス属を培養すること
により、ニトリラーゼ酵素活性を有する菌体を製造する
方法が提案されている。この方法では、培養液中のラク
タム化合物はほとんど資化されず、一定濃度を保つため
にニトリラーゼ酵素の誘導効果が安定している点で優れ
ているが、その誘導効果は全てのロドコッカス属の細菌
にあるわけではない。そこで、ラクタム化合物以外の有
効なニトリラーゼ酵素誘導物質の開発が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、細菌の培養
において、ニトリラーゼ酵素を誘導生成させる物質およ
び使用条件について鋭意検討を行った結果、エチレンシ
アンヒドリンを培地に添加して培養することによりニト
リラーゼ酵素活性を有する菌体を容易に取得することを
見い出し、本発明を完成するに至った。
において、ニトリラーゼ酵素を誘導生成させる物質およ
び使用条件について鋭意検討を行った結果、エチレンシ
アンヒドリンを培地に添加して培養することによりニト
リラーゼ酵素活性を有する菌体を容易に取得することを
見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、ニトリラーゼ産生能
を有する細菌を培養するに際し、培養液中にエチレンシ
アンヒドリンを存在させることを特徴とする細菌の培養
法、である。
を有する細菌を培養するに際し、培養液中にエチレンシ
アンヒドリンを存在させることを特徴とする細菌の培養
法、である。
【０００６】本発明において、エチレンシアンヒドリン
は誘導剤として使用するが、ニトリラーゼの誘導にエチ
レンシアンヒドリンが有効であることは、従来知られて
いなかったことである。
は誘導剤として使用するが、ニトリラーゼの誘導にエチ
レンシアンヒドリンが有効であることは、従来知られて
いなかったことである。
【０００７】
【発明の具体的説明】本発明の対象となる細菌は、ニト
リラーゼを有し、ニトリルを加水分解して対応する酸を
生成させることができる細菌であり、例えば、ロドコッ
カス属の細菌、具体的には、例えば、ロドコッカス(Rho
dococcus) sp. SK92〔微工研条寄第３３２４号〕、ロド
コッカス ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) AT
CC 33025、ロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus r
hodochrous) ATCC 33258等を挙げることができる。これ
らのうち、ロドコッカス sp. SK92 株は、本出願人によ
り見出されたものであり、その菌学的性質は、特開平５
−１９２１８９号公報に記載されている。
リラーゼを有し、ニトリルを加水分解して対応する酸を
生成させることができる細菌であり、例えば、ロドコッ
カス属の細菌、具体的には、例えば、ロドコッカス(Rho
dococcus) sp. SK92〔微工研条寄第３３２４号〕、ロド
コッカス ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) AT
CC 33025、ロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus r
hodochrous) ATCC 33258等を挙げることができる。これ
らのうち、ロドコッカス sp. SK92 株は、本出願人によ
り見出されたものであり、その菌学的性質は、特開平５
−１９２１８９号公報に記載されている。
【０００８】本発明の一般的実施態様は、次の通りであ
る。すなわち、炭素源として、例えば、グルコース、フ
ラクトース、シュークロース、グリセロールなど、有機
栄養源として、例えば、酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、ペプトンなど、無機塩として、例えば、リン酸
塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、その他微量
金属などを適宜含有する培地に、ニトリラーゼ活性を有
する細菌を接種し、これに酵素誘導剤としてエチレンシ
アンヒドリンを一括、あるいは分割添加して好気的条件
下に培養を行う。
る。すなわち、炭素源として、例えば、グルコース、フ
ラクトース、シュークロース、グリセロールなど、有機
栄養源として、例えば、酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、ペプトンなど、無機塩として、例えば、リン酸
塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、その他微量
金属などを適宜含有する培地に、ニトリラーゼ活性を有
する細菌を接種し、これに酵素誘導剤としてエチレンシ
アンヒドリンを一括、あるいは分割添加して好気的条件
下に培養を行う。
【０００９】培地のｐＨは通常５〜１０、好ましくは６
〜９、温度は通常１５〜３７℃、好ましくは２５〜３２
℃で好気的に１〜７日間培養する。培地へのエチレンシ
アンヒドリンの添加は０．０５％〜１０％(V/V) 、好ま
しくは０．５〜５％(V/V) である。
〜９、温度は通常１５〜３７℃、好ましくは２５〜３２
℃で好気的に１〜７日間培養する。培地へのエチレンシ
アンヒドリンの添加は０．０５％〜１０％(V/V) 、好ま
しくは０．５〜５％(V/V) である。
【００１０】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの例のみに限定されるものでは
ない。
するが、本発明はこれらの例のみに限定されるものでは
ない。
【００１１】実施例１
シュークロース２％(w/v) 、ポリペプトン０．５％(w/
v) 、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％(w/v) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．
１％(w/v) 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１％(w/v) か
らなる培地（ｐＨ７．２）を調製し、これを５００ml容
三角フラスコに１００ml分注して綿栓をし、１２０℃で
１５分間オートクレーブで滅菌した。この培地に、ロド
コッカス sp. 92 株を接種して３０℃で３日間振盪培養
した。この培養液１mlを同じ培地に接種し、同時にエチ
レンシアンヒドリン２mlを添加して３０℃で２０時間振
盪培養した後、エチレンシアンヒドリンを３ml添加して
さらに３日間培養を行った。この培養終了液から遠心分
離によって菌体を回収し、培養液と同量の５０mMＫＨ2
ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 緩衝液（ｐＨ７．７）に菌体を
懸濁した。
v) 、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％(w/v) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．
１％(w/v) 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１％(w/v) か
らなる培地（ｐＨ７．２）を調製し、これを５００ml容
三角フラスコに１００ml分注して綿栓をし、１２０℃で
１５分間オートクレーブで滅菌した。この培地に、ロド
コッカス sp. 92 株を接種して３０℃で３日間振盪培養
した。この培養液１mlを同じ培地に接種し、同時にエチ
レンシアンヒドリン２mlを添加して３０℃で２０時間振
盪培養した後、エチレンシアンヒドリンを３ml添加して
さらに３日間培養を行った。この培養終了液から遠心分
離によって菌体を回収し、培養液と同量の５０mMＫＨ2
ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 緩衝液（ｐＨ７．７）に菌体を
懸濁した。
【００１２】２００mMアクリロニトリル０．５ml、２０
０mMＫＨ２ＰＯ４ −Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．
７）０．２５ml、および蒸留水０．２２５mlからなる反
応液に上記菌体懸濁液０．０２５mlを添加して３０℃で
１５分間反応を行い、ニトリラーゼ活性を測定した。１
Ｎ塩酸０．２mlを添加して反応を止めた後、遠心分離で
菌体を取り除き、反応液中に生成したアクリル酸をＨＰ
ＬＣによって定量した（和光純薬工業社製Wakosil 5C8
カラム使用）。その結果、１mlの反応液中に６．４５μ
mol のアクリル酸が生成していた。なお、アクリルアミ
ドの生成は見られなかった。
０mMＫＨ２ＰＯ４ −Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．
７）０．２５ml、および蒸留水０．２２５mlからなる反
応液に上記菌体懸濁液０．０２５mlを添加して３０℃で
１５分間反応を行い、ニトリラーゼ活性を測定した。１
Ｎ塩酸０．２mlを添加して反応を止めた後、遠心分離で
菌体を取り除き、反応液中に生成したアクリル酸をＨＰ
ＬＣによって定量した（和光純薬工業社製Wakosil 5C8
カラム使用）。その結果、１mlの反応液中に６．４５μ
mol のアクリル酸が生成していた。なお、アクリルアミ
ドの生成は見られなかった。
【００１３】実施例２
表１に示した菌株を各々実施例１と同じ培地に接種し、
エチレンシアンヒドリンを２ml添加して３０℃で２日間
振盪培養を行った。実施例１と同様の方法で集菌して菌
体懸濁液を調製して、ニトリラーゼ活性を測定した。但
し、反応時間は２０分間とした。結果を表１に示す。
エチレンシアンヒドリンを２ml添加して３０℃で２日間
振盪培養を行った。実施例１と同様の方法で集菌して菌
体懸濁液を調製して、ニトリラーゼ活性を測定した。但
し、反応時間は２０分間とした。結果を表１に示す。
【００１４】
表１
────────────────────────────────
菌株名 反応液１ml当たりのアクリル酸生成量
（μmol)
────────────────────────────────
ロト゛コッカス ロト゛クロウス ATCC 33025 ０．１７
ロト゛コッカス ロト゛クロウス ATCC 33258 ０．１６
────────────────────────────────
【００１５】実施例３
シュークロース１％(w/v) 、味液０．７５％(w/v) 、酵
母エキス０．１％(w/v) 、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％(w/
v) 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．０５％(w/v) からなる
培地（ｐＨ７．２）を調製し、これを５００ml容三角フ
ラスコに１００ml分注して実施例１と同様に滅菌した。
この培地にエチレンシアンヒドリンを０．５ml添加して
実施例１と同様に前培養したロドコッカス sp. SK92 を
接種し、３０℃にて１日間培養した後、エチレンシアン
ヒドリンを１ml追添加してさらに１日間培養した。この
培養液から実施例１と同様に集菌してニトリラーゼ活性
を測定したところ、３０分の反応で反応液１ml中に２．
０７μmol のアクリル酸が生成していた。なお、上記培
養終了時の培養液中のエチレンシアンヒドリン濃度をガ
スクロマトグラフィーで定量したところ、１．４％（v/
v)（残存率約９３％）であった。
母エキス０．１％(w/v) 、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％(w/
v) 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．０５％(w/v) からなる
培地（ｐＨ７．２）を調製し、これを５００ml容三角フ
ラスコに１００ml分注して実施例１と同様に滅菌した。
この培地にエチレンシアンヒドリンを０．５ml添加して
実施例１と同様に前培養したロドコッカス sp. SK92 を
接種し、３０℃にて１日間培養した後、エチレンシアン
ヒドリンを１ml追添加してさらに１日間培養した。この
培養液から実施例１と同様に集菌してニトリラーゼ活性
を測定したところ、３０分の反応で反応液１ml中に２．
０７μmol のアクリル酸が生成していた。なお、上記培
養終了時の培養液中のエチレンシアンヒドリン濃度をガ
スクロマトグラフィーで定量したところ、１．４％（v/
v)（残存率約９３％）であった。
【００１６】
【発明の効果】エチレンシアンヒドリンは、培養中に資
化され難く、揮発性も低いので、ニトリラーゼ活性を有
する細菌の培養に際して、培養液中に、安定した濃度の
誘導剤であるエチレンシアンヒドリンを存在させること
ができ、結果として、高収量でニトリラーゼ活性を有す
る細菌菌体を得ることができる。
化され難く、揮発性も低いので、ニトリラーゼ活性を有
する細菌の培養に際して、培養液中に、安定した濃度の
誘導剤であるエチレンシアンヒドリンを存在させること
ができ、結果として、高収量でニトリラーゼ活性を有す
る細菌菌体を得ることができる。
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フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平３−251192（ＪＰ，Ａ)
特開 昭60−19496（ＪＰ，Ａ)
特開 昭53−29995（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 1/00 - 1/38
C12N 9/78
C12P 13/00 - 13/02
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (3)
- 【請求項１】 培養液中にエチレンシアンヒドリンを存
在させ、ロドコッカス ロドクロス（Rhodococcus rhod
ochrous）を培養することを含む細菌の培養方法。 - 【請求項２】 ロドコッカス ロドクロス（Rhodococcu
s rhodochrous）が、ロドコッカス ロドクロス（Rhodo
coccus rhodochrous）ATCC 33025株又はロドコッカス
ロドクロス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 33258株
である請求項１記載の培養方法。 - 【請求項３】 培養液中にエチレンシアンヒドリンを存
在させ、ロドコッカス（Rhodococcus）sp. SK92株を培
養することを含む細菌の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33687594A JP3437879B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | 細菌の培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33687594A JP3437879B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | 細菌の培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08173152A JPH08173152A (ja) | 1996-07-09 |
| JP3437879B2 true JP3437879B2 (ja) | 2003-08-18 |
Family
ID=18303464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33687594A Expired - Fee Related JP3437879B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | 細菌の培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3437879B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9525372D0 (en) * | 1995-12-12 | 1996-02-14 | Allied Colloids Ltd | Enzymes, their preparation and their use in the production of ammonium acrylate |
-
1994
- 1994-12-27 JP JP33687594A patent/JP3437879B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08173152A (ja) | 1996-07-09 |
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