JPH0319695A - トランス―４―シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドの製造法およびそれに用いる酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸ア旦ドの新規な製造方法に関する。

本発明の目的は、抗潰瘍作用を有するｌ・ランス４−ア
ミノメチルシク口ヘキサンカルボン酸ア多ドの製造原料
として有用な次式（Ｉ１）ＣＮ ＣＯＮＨ２ で示されるトランス−４−シアノシク口ヘキサンカルボ
ン酸ア２ドを工業的に、かつ、高収率で製造することに
ある。

（従来の技術） トランス−４−シアノシクロヘキサンカルポン酸アミド
については、特公昭５１−１４５０６号３ ４ 公報に次式（Ｉ） ＣＮ ＣＮ ＣＮ で示されるシス，トランス−１．４−ジシアノシク口ヘ
キサンをアンモニア水で加水分解して、次式（ＩＩＩ） ＣＮ ＣＮ で示すトランス−１，４−ジシアノシク口ヘキサンに微
生物を作用させることにより化合物（ＩＩ）を得ている
。（特願昭６３−１６７８２８号，特願昭６３−２７４
４２３号） （式中、Ｒは水酸基またはアミノ基を表す。）で示きれ
るシス．トランス−１．４−シアノシク口ヘキサンカル
ボン酸、シス，トランス−４−シアノシク口ヘキサンカ
ルポン酸アミドを含有する混合物を製造する方法が記載
されている。また、微生物を用いる方法として、本発明
者らは、次式（ＩＶ） （発明が解決しようとする課題） 上記の合成的手法は、高温高圧な反応条件を必要とする
。また、副生物が多く生或ずるので、目的物の単離精製
工程が極めて煩雑である。また、上記の微生物を用いる
方法においては、原料としてシス，トランス−１．４−
ジシアノシクロヘキサンから精製工程によってシス体を
除去したもの、すなわち、高純度のトランス−１．４−
ジシアノシクロヘキサンを用いる必要があった。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、」二記の課題を解決するため鋭意検討を
重ねた結果、常温常圧で、がっ、立体配置を選択、保持
させることができ、しかも、極めて効率の良い微生物の
生化学的作用を利用する新規な製造方法を見出した。す
なわち、次式（Ｉ）ＣＮ ＣＮ で示されるシス．トランス−１，４−ジシアノシク口ヘ
キサンから、ニトリルヒドラターゼあるいはニトリルヒ
ドラクーゼを保有する微生物菌体の作用により、次式（
ＩＩ） ＣＮ ＣＯＮＨ２ で示されるトランス−４−シアノシク口へ牛サンカルボ
ン酸アミドを製造する方法である。

本発明者らは、コリネバクテリウム属細菌が化金物（１
）の（Ｉｔ）への変換に際して、トランス体を優先的に
化合物（ＩＩ）に変換し、シス体の変換活性は極めて低
いことを見出すと同時に、菌体中より酵素の抽出単離に
或功し、本発明を完或するに至った。

次に、本発明の実施方法について説明する。

（１）使用菌株 本発明で使用される微生物は、例えば、コリネバクテリ
ウム属に属するものであり、これらの属に属する具体的
な菌株としては、例えば、コリ不ハクテリウム　エスビ
ー　０５株（微工研菌寄第８９３１号）、コリネバクテ
リウム　エスビーＡ６Ｂ株（微工研菌寄第１０２２４号
）である。

上記２株は微生物工業技術研究所に寄託されている。コ
リネパクテリウム　エスピー　０５株の菌学的性質は、
特開昭６３−１　２９９８８号公報に示すとおりである
。なお、コリ不バクテリウムエスピー　Ａ６８株の菌学
的性質は、以下に示すとおりである。

（ａ）形態 １．細胞の形および大きさ；桿菌、０．４〜０．６Ｘ２
．５〜６．０μｍ０ ２．ｔｉｌｌｌ胞の多形成の有無；長桿状（１日目）を
呈し、スナンピングを伴った発育をし、後（３日目）に
は短桿状（０．４〜０．　　６ＸＯ．　　６〜１．２μ
ｍ）に断裂する。

３．運動性の有無；無 ４．胞子の有無；無 ５．ダラム染色性；十 ６．抗酸性； （ｂ）各培地における使育状態 】．肉汁寒天平板培養；直径１．０〜２．２ｍｍ円形、
平滑で乾き気味、半球状、白ないし淡ピンク色。

２．肉汁寒天斜面培養；生育中程度、平滑、乾き気味、
白ないし淡ピンク色。

３．肉汁液体培養；生育旺盛、中程度の濁り、生育に伴
い沈澱生戒。

４．肉汁ゼラチン穿刺培養；表面によく生育、穿刺部に
そって生育、液化無。

８ ５，リトマス・ミルク，変化無。

（ｃ）生理的性質 】．硝酸塩の還元； ２，脱窒反応； ３．ＭＲテスト； ４．ＶＰテスト； ５．インドールの生或； ６．硫化水素の生或； ７，デンブンの加水分解； ８．クエン酸の利用 （イ）コーサーの培地； （口）クリステンセンの培地；→− ９．無機窒素源の利用 （イ）硝酸塩；十 （口）アンモニウム塩；十 １０６色素の生威 （イ）キングＡ培地；一 （ワ）キングＢ培地；一 １１．ウレアーゼ；＋ １２．オキシダーゼ； ９ １０ １３．カクラーゼ；＋ １４．生育の範囲 （イ）　　ｐ　Ｈ　；　６〜１０ （口）温度；１０〜３７゜Ｃ １５，酸素に対する態度；好気性 １６．０−Ｆテスト； １７．Ｉ！ＩＵから酸およびガスの生成と資化性１８．
１０％スキムミルク中、７２゜Ｃ、１５分間の耐熱性；
無 １９．オルニチン脱炭酸；＋ ２０．リジン脱炭酸； 以上の菌学的性質をハージーの細菌分類書（ＢＵＲＧＹ
’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ
ｅ　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版）および「マニ
ュアル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｍ
ａｎｕａｌ　ｏｆ　ＣＩｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏ１ｏｇｙ）第４版（１９８５年）』に基づいて分類し
た。

Ａ６８株は、好気性、ダラム陽性、カタラーゼ陽性の内
性胞子を生しない桿菌であり、鞭毛を着生せず、発育の
初期は長桿状でスナソピングを伴って発育し、後に短桿
状に断裂することにより、コリネ型細菌に属することは
明らかである。また、セルロース分離能を持たないこと
、１０％スキム嵩ルク、７２゜Ｃ、１５分間の耐熱性が
ないこと、さらに、絶対好気性でないこと、Ｏ−Ｆテス
トがであることより、Ａ６８株はコリネバクテリウ１１ ム属に属することは明らかである。

Ａ６８株の種については、３７゜Ｃで生育、酸素に対す
る態度として好気性ではあるが、通性嫌気ともいえ、Ｏ
−Ｆテストかー、グルコースの資化性が弱く、Ｄ−フラ
クトース、シヨ糖、Ｄ−マンニットおよびエタノールを
資化し、硝酸還元能がなく、硫化水素を生成せず、コー
サー培地でクエン酸を資化せず、ウレアーゼ活性および
カクラーゼ活性を持つことより、先に述べた分類書類か
ら判断ずると、該当する種がない。よって、Ａ６８株は
コリネバクテリウム属の新種と考えられる。

（２）培養方法 本発明で使用される微生物の培養は、公知の方法に準し
て行うことができる。使用する培地は、一般微生物の栄
養源として公知のものが利用でき、廃糖蜜、グルコース
、グリセリン、エタノール、シュークロース等の炭素源
、硫酸アンモニウムまたは尿素、塩化アンモニウム等の
窒素源、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ベプトン
等の有機１２ 栄養源、リン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、コバル
ト等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用
できる。また、微生物の式（１）の化合物から式（ＩＩ
）の化合物への変換活性を促進する物質として、イソプ
チロニトリル、ブロビオニトリル等のシアノ化合物また
はプチルアミド等のア某ド化合物を添加してもよい。培
地のｐＨは５〜１０の範囲で選べばよく、培養温度は１
８〜３８゜Ｃ、好ましくは２５〜３２゜Ｃである。培養
日数は１〜８日の範囲で活性が最大になるまで培養すれ
ばよい。

（３）酵素 前記コリネバクテリウム　エスビー　０５株およびＡ６
８株の菌体から式（１）の化合物のトランス体を優先的
に式（ＩＩ）の化合物に変換し、シス体の変換活性は極
めて低い酵素を抽出単離し、その酵素作用および基質特
異性から新規なニトリルヒドラターゼと認めた。このニ
トリルヒドラクーゼの理化学的性質について説明すると
、次のとおりである。

ｌ４ ■酵素作用 ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基をア
ミド基に水和転化させる反応の触媒としての機能を示す
。

■基質特異性 ニトリルヒドラターゼの基質特異性について検討した。

結果を表ｌに示す。

表 １ 表１より、本酵素はｎ−ブチロニトリル、ｎバレロニト
リル等の飽和脂肪族ニトリル、アクリロニトリルやメタ
アクリロニトリル等の不飽和脂肪族ニトリル、ペンゾニ
トリル等の芳香族二トリｌ５ ル、３−シアノピリジン等の複素環式ニトリル、さらに
、マロノニトリル、トランス−１，４−ジシアノシク口
ヘキサン等のジニトリル化合物に作用することが分かる
。

ニトリル基の水和速度が速い化合物という観点では、ｎ
−プチ口ニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｉｓｏ−バレ
ロニトリル等の炭素数が４から５の脂肪族ニトリル化合
物である。

また、１，４−ジシアノシクロヘキサンにおいては、ト
ランス体の水和速度がシス体に比べて著しく大きいこと
が特徴的である。

■分子量 液体クロマｌ・グラフ〔カラム；ＴＳＫ−ｇｅｌｃ；３
００−ＳＷ　（０．７５Ｘ６０ｃｍ））によって分子量
６１，４００と決定した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動の結果、単一バンドであり、サブユニットの分子量
は２６，９００であった。

■至適ｐＨ 至適ｐＨ検討の結果は第１図に示すが、至適ＰＨは８．
０〜８．５であった。

１６ ■温度安定性 ニトリルヒドラターゼを１０ｍＭリン酸カリウムバッフ
ァ一（ｐＨ７．５　（３ｍＭイソバレリアン酸Ｎａ塩を
含む）〕に溶解し、１０〜５０゜Ｃに１０分間放置した
後の残存活性を測定することにより求めた。その結果、
１０〜４０゜Ｃでは活性の低下は見られず、４５゜Ｃで
は残存活性は４０％であった。

■安定化剤 ニトリルヒドラターゼを各種安定化剤を含む１０ｍＭリ
ン酸カリウムバッファ一（ｐＨ７．５）中で３日間透析
した。透析後の残存活性（透析前の活性を１００％とす
る。）を表２に示す。

１７ ｌ８ 表２ アミト生成に関与するニトリルヒドラターゼ活性に及ば
ず影響を検討した。結果を表３に示す。

表　　３ イソバレリアン酸が最も良好な安定化剤であった。

■金属および阻害剤の影響 ニトリルヒドラターゼを１００ｍＭリン酸バッファ一（
ｐＨ７．５）に溶解した後、下記に示す物質を各々ｌｍ
Ｍずつ加えて酵素活性を測定し、トランス−４−シアノ
シク口ヘキサンカルボン酸ニトリルヒドラクーゼは、Ｈ
ｇ”、フエニルヒドラジンで強力に阻害された。

１９ ■ＰＱＱ（ビロロキノリンキノン）の存在ニトリルヒド
ラターゼ中のＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）の存在を
以下の方法で確認した。

ニトリルヒドラターゼ１５■を６Ｎ塩酸中で１２０゜Ｃ
、４８時間処理し加水分解した後、濃縮し、苛性ソーダ
水溶液で中和した。処理液を乾固した後、１０％メタノ
ール液に再溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一１　０　（
１．　　ＯＸＩ　２０ｃｍ）カラムに供し、通過液２．
１成を集めた。この液を用いて（ｉ）〜（ｉｖ）の検討
を行い、ＰＱＱの存在を確認できた。

（ｉ）膜結合性Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼアポ酵
素を再活性化したことによりＰＱＱの存在を確認した。

（ｉｉ）ＰＱＱに特徴的な２５２ｎｍ、３６０ｎｍに吸
収を認めた。

（　ｉｉｉ　）蛍光スペクトル（　｝ＩＩＴＡｃＩＩ１
　６５０−１０Ｓ型検出器使用）励起ピークｉ　３　７
　５　ｎ　ｍ、放出ピーク；４６０ｎｍでＰＱＱ標品と
一致した。

（ｉｖ）ＰＱＱ要求株であるＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　
ａｃｅｔｉ２０ を用いたパイオアンセイ法によりＰＱＱの存在を確認し
た。

（４）反応方法 本発明における式（１）の化合物を式（ＩＩ）の化合物
に変換する反応方法としては、具体的には前記微生物を
式（１）の化合物の存在下に培養する方法と、微生物培
養物、さらにそこから集めた菌体または菌体処理物（例
えば、菌体の破砕物、菌体の有機溶媒処理物、または菌
体より公知の方法によって分離抽出した酵素）と式（１
）の化合物とを接触させる方法の二つの方法がある。ま
た、菌体、菌体処理物または菌体から抽出された酵素を
公知の方法、例えばセライト、アルギン酸カルシウム、
カラギーナン等番こより固定化した後、式（１）の化合
物と反応させてもよい。

反応媒体としては、水、緩衝液等の水性媒体、あるいは
メタノール、クロロホルム、塩化メチレン等の有機溶媒
と水との混合物が使用できる。反応媒体中へは、式（１
）の化合物を粉末あるいはオイル状のままで、または適
当な溶媒に溶かして２２ 添加する。式（１）の化合物の添加濃度はＯ．Ｏ］〜６
０重量％程度、好ましくは１．０〜４０重量％である。

反応に菌体を使用する場合の菌体の濃度は、通常０．１
〜８重量％の範囲でよい。反応温度は４〜５０”Ｃ，望
ましくは１５〜３２’Ｃ，反応ｐ　Ｈは４〜１１、好ま
しくは６．５〜９．０である。反応時間は通常、０．５
〜１００時間の範囲で適当な時間を選べばよい。消費さ
れる式（１）の化合物は、連続的にまたは間歇的に補充
して、反応液中の濃度が」二記の範囲内に維持されるよ
うに添加してもよい。原料として使用する式（１）の化
合物中のシス体とトランス体の重量比は０．１：９．９
〜９．５：０．５であるが、好ましくはトランス体に冨
むものがよい。

（５）分離精製 生成された式（ＩＩ）の化合物は、反応終了液より菌体
等の不溶物を除去した後、公知の方法、例えば、溶媒抽
出あるいは晶析等により容易に高純度の結晶を得ること
ができる。また、未反応のシスー１．４−ジシアノシク
ロヘキザンも容易に回収でき、異性化することによって
再び酵素反応に供することもできる。

（６）　　シス，トランス−１　４−ジシアノシク口へ
ヘキサン〔化合物（Ｉ）］の製造 化合物（Ｉ）は、例えば、ジメチル−１４シクロヘキサ
ン力ルポキシレートとアンモニア供給源となりうる化合
物、例えば、アンモニア、尿素等を２００〜３　５　０
　’Ｃ、好まし《は２３０〜３００゜Ｃにおいて加熱す
ることにより製造できる。

また、この工程の反応速度を増すために、塩酸、リン酸
、硫酸等のＷ．酸、またはアルミナ、五酸化リン、酸化
スズ等の酸化物、あるいは酢酸、プロピオン酸、安息香
酸等の有機酸を触媒として用いてもよい。また、用いる
ジメチル−１，４−シクロヘキサン力ルポキシレートの
立体配置が、トランス、シス、またはトランス／シス混
合物のいずれであっても、生或する化合物（１）はトラ
ンス／シスの混合物を与える。本発明では、こうして製
造した化合物Ｎ）を単離精製せずに、このまま酵素反応
原料として用いることができる。

２３ （発明の効果） 本発明を利用することにより、トランス−４シアノシク
ロヘキサンカルボン酸アミドを常温常圧の反応条件下で
高濃度に生或させることができる。さらに、精製の不必
要なシス、トランス体混合の原料からトランス体を製造
することができるので、経済上極めて有用である。

（実施例） 次に、本発明を実施例をもって説明するが、この実施例
によって本発明が何ら限定されるものではない。

実施例１ ジメチル−１．４−シクロヘキサン力ルポキシレート１
００ｇ　（０．５モル）と酸化スズ１．０ｇを２６０〜
２８０゜Ｃで、アンモニアガスを０２５モル，／　Ｉｔ
　ｒの流速で導入し、１０時間反応を行った。反応終了
後、メタノール２，０００ｍを加え、メタノールに不溶
な物質を濾取した後、濾液２４ を濃縮・冷却してシス，トランス−１，４−ジシアノシ
クロヘキサン７０ｇ（純度９７．５％）を得た。本製品
はシス体４２％、トランス体５８％を含んでいた。

実施例２ 酵母エキス１．０ｇ、シュークロース１．０ｇ，塩化ナ
トリウム０．．１　ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、硫
酸鉄３ＩＩｌｇを含み、ｐＨを７．２とした殺菌培地１
００成に、あらかしめ同培地で培養したコリネバクテリ
ウム　エスビー　Ａ６８株を植菌し、２８゜Ｃで２日間
培養した。培養終了後、遠心分離にて菌体を集め、この
うち０．４ｇＤＣＷ（乾菌体重量）をＰＨ８．５の０．
１Ｍリン酸カリウム緩衝液１００ｄが入った三角フラス
コ中に懸濁した後、実施例１で製造したシス，トランス
−１．４−ジシアノシクロヘキサン（シス：トランス−
４２：５８）４０ｇを加え、３０゜Ｃで攪拌しながら反
応させた。３時間後に反応を終了し、メタノールを加え
て生戒物を溶解させた後に、遠心分離にて菌体を除いた
。この反応液を液クロ分２５一 ２６ 析した結果、トランス−４−シアノシクロヘキサンカル
ボン酸アくドが２６．０ｇ、シスー４−シアノシク口ヘ
キザンカルボン酸アミド０．６５ｇが生成し、シスー１
，４−ジシアノシク口ヘキサンが１６．１ｇ残存してい
た。次いで、抽出、濃縮、晶折の操作により、１一ラン
スー４−シアノシク口ヘキサンカルポン酸アミドの結晶
２１．６ｇを得た。

本製品は高速液体クロマト分析で単一ピークを示した。

融点、ＩＲ，ＮＭＲ、元素分析の結果を以下に示すが、
これは目的物の構造を指示する。

融点　１８９〜１９１゜Ｃ ＩＲ（ＫＢｒ） ３　３　５　５ａｎ−’　（ｒ＝ＮＨ）３　２　０　０
ｃ＋＋ｒ’　（ｒ　＝ＮＨ）２　２　２　０ｃｍ−’　
（ｒ　＝ＣＮ）１　６　６　５ｃ＋＋ｒ’　Ｃｒ　＝Ｃ
○）ＮＭＲ　（ＭｅＯＨ−ｄ’　，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ
；　１．２　〜３．０　（１　０Ｈ，ｍ）元素分析 理論値　　　　　分析値 Ｃ　　　６３．１６％　　６３．０２％Ｈ　　　　７．
８９％　　　７．９０％Ｎ　　　１８．４２％　　１８
．４５％０　　　１０．５３％　　１０．６３％なお、
高速液体クロマト分析は以下のようにして行った。分析
装置；ウォーターズ社製６０００Ａ型ポンプ、東ソー製
Ｒｌ−８型示差屈折計、カラム；ノハパックＣ−１８（
ウォーターズ社製）、溶媒；水／アセトニトリル−９５
／５（容量比）＋ＰＩＣ−８７　（ウォーターズ社製）
１．５容量％。

実施例３ グリセロール０．５ｇ，ポリベプトン０．３ｇ，リン酸
一カリウム０．０８ｇ、リン酸二カリウム０．１２ｇ、
塩化ナトリウム０．１ｇ，イソブチロニトリル０．０５
ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．０２ｇ、硫酸鉄７水塩
０，００４ｇ、ビオチン１００μｇ、チア１ン塩酸塩１
００μｇを含み、２７ ｐＨ７．０とした殺菌培地１００成に、あらかしめ同培
地で培養したコリネバクテリウム　エスピＣ５株を植菌
し、３０゜Ｃで４０時間培養した。

培養終了後、遠心分離にて菌体を集め、このうち０．４
ｇＤＣＷ（乾菌体重量）をｐＨ８．５の０．１Ｍリン酸
緩衝液１００成の入った三角フラスコ中に懸濁した後、
実施例１で製造したシス，トランス−１．４−ジシアノ
シクロヘキサン（シス：トランス−４２＝５８）を３０
ｇ加え、３０゜Ｃで振盪しながら反応させた。８時間後
に反応を終了し、高速液体クロマト分析を行ったところ
、トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸ア旦
ドが１３．０ｇ、シスー４−シアノシクロヘキサンカル
ボン酸アミドが０．４ｇ生威していた。

以下、実施例２と同様の操作を行い、１・ランスー４−
シアノシク口ヘキサンカルボン酸アミドの結晶１１．１
ｇを得た。

本製品の物性データは、実施例２と同じく目的物の構造
を指示した。

実施例４ ２８ コリネバクテリウム　エスピ一　０５株のニトリルヒド
ラターゼの単離精製 コリネバクテリウム　エスピー　０５株を実施例３と同
様の培地で培養した後、８．０００Ｘｇ，２０分間遠心
分離することによって菌体を得た。

菌体を洗浄した後、ダイノミルにより冷却しながら破砕
した。破砕液を遠心分離し、得られた上清液を無細胞抽
出液とした。

無細胞抽出液をＤＥＡＥ−セルロース〔１０ｍＭリン酸
バッファ一（ｐＨ７．５）に懸濁〕に加え、３０分間攪
拌した。ＤＥＡＥ−セルロースを除去した後、０．　　
４Ｍ　ＮａＣｊ２を含む１００ｍＭバンファーに再懸濁
し、３０分間ゆっくりと混合した。濾過した濾液中に硫
酸アンモニウムを加え、飽和度６０％にした後、ｐＨを
７．５に調整し、１時間攪拌した。次いで、遠心分離を
行い、析出したタンパク群を回収した。少量の１０ｍＭ
リン酸バッファーで回収タンパクを溶解した後、これを
セロファンチューブに入れ、４゜Ｃ１同上のパッファ一
中で１８時間放置し、タンパク群水溶液中一２９ ３０ の硫酸アンモニウムを透析除去した。

透析操作を終えたタンパク群水溶液をＤＥＡＥＳｅｐｈ
ａｃｅｌ　（　５　Ｘ　２　５　ｃｍ）によりクロマト
分則した。溶離液は１００ｍＭリン酸バッファ一（Ｎａ
Ｃ／！＠度０−０．３Ｍ）を用いた。各クｏ７１・溶離
フラクション液の一部を取得し、トランス１，４−ジシ
アノシクロヘキサンを添加し、ニトリル基の水和活性能
の有無を液体クロマト分析によって調べた。活性を示し
たフラクションを集め、硫酸アンモニウムを加え、タン
パクを析出させた後、遠心分離によって回収した。透析
した後、硫酸アンモニウムを加えて１５％飽和にした後
、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　Ｃ　Ｌ−４　
Ｂ　　カラム（２×１６ｃｍ）によりクロマト分離した
。活性を有するフラクションを集め、」二記と同様の方
法で回収した後、透析処理を行った。なお、本工程から
酵素の安定剤として３０ｍＭイソハレリアン酸を添加し
て用いた。

透析終了液を再びＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカ
ラムクロマトに供し、活性画分を集めた後、さらに、ｐ
ｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　Ｃ：　Ｉ−　−　
４　Ｂ　　カラムクロマト分離を行うことによってニト
リルヒドラターゼの精製を終了した。上記一連の操作に
より、比活性は約１３０倍に上昇した。また、分子量を
液体クロマトグラフ〔カラム；ＴＳＫ　−ｇｅｌ　Ｇ　
　３０００−ＳＷ　（０．７　５Ｘ６　０ｃｍ））によ
って、６１，４００と決定した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動の結果、単一バンドであり、サブユニットの
分子量は２６，９００であった。また、可視・紫外スペ
クトルを測定した結果、７１０ｎｍに最大吸収を有する
ブロードなピークがあり、４１０ｎｍにはショルダービ
ークがあった。

実施例５ 実施例４で調製したニトリルヒドラターゼｌ５ｍｇをＯ
．ＩＭリン酸バンフｙ−（ｐＨ８，Ｏ）１００ｍｆｌに
溶解した後、シス，トランス−１，４ジシアノシクロヘ
キサン（シス：トランス−４２＋５８）２０ｇを加え、
８時間３０“Ｃで反応を行った。トランス−４−シアノ
シクロヘキサンカルボン酸アミドが１３．１ｇ、シス−
４−シアノ３１ シクロヘキサンカルポン酸アミドが０．５５ｇ生威して
いた。以下、実施例２と同様の操作によって、トランス
−４−シアノシク口ヘキサンカルボン酸アミド１１．２
ｇを得た。

本製品の物性データは、実施例２と同しく目的物の構造
を指示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はニトリルヒドラターゼの至適ｐＨを求めた結果
を示すグラフである。 ３２ ３３

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ニトリルヒドラターゼあるいはニトリルヒドラタ
   ーゼを保有する微生物菌体の作用により、次式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で示されるシス、トランス−１，４−ジシアノシクロヘ
   キサンから次式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） で示されるトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
   ン酸アミドを得ることを特徴とするトランス−４−シア
   ノシクロヘキサンカルボン酸アミドの製造法。
2. （２）コリネバクテリウム属細菌から調製され、下記の
   理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼ。 〔１〕酵素作用 ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニ トリル基をアミド基に水和転化させる反応の触媒として
   の機能を示す。 〔２〕基質特異性 ｎ−ブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル 等の飽和脂肪族ニトリル、アクリロニトリル、メタアク
   リロニトリル等の不飽和脂肪族ニトリル、ベンゾニトリ
   ル等の芳香族ニトリル、３−シアノピリジン等の複素環
   式ニトリル、マロノニトリル、トランス−１，４−ジシ
   アノシクロヘキサン等のジニトリル化合物に作用する。 特に、ｎ−バレロニトリル、ｉｓｏ−バレロニトリルの
   水和速度が大きい。さらに、１，４−ジシアノシクロヘ
   キサンにおいては、トランス体の水和速度がシス体に比
   べて著しく大きい。 〔３〕分子量 分子量６１，４００（液クロ法）であり、サブユニット
   の分子量は２６，９００である。（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 〔４〕至適ｐＨ ｐＨ８．０〜８．５でニトリル基の水和作用は至適であ
   る。 〔５〕温度安定性 ｐＨ７．５で１０〜４００℃、１０分間処理しても水和
   活性は低下しない。 〔６〕安定化剤 イソバレリアン酸を加えることにより安定化される。 〔７〕阻害剤 Ｈｇ＾＋＾＋、フェニルヒドラジン等で阻害される。 〔８〕分子内にＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）を含む
   。