JP5010291B2 - 新規ウリカーゼの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規なウリカーゼの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、耐熱性に優れるセルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属に属する微生物由来の新規なウリカーゼの製造方法に関する。

ウリカーゼ（ＥＣ１．７．３．３）は、尿酸をアラントイン、過酸化水素、および炭酸ガスに分解する、即ち、尿酸＋Ｏ_２＋２Ｈ_２Ｏ→アラントイン＋ＣＯ_２＋Ｈ_２Ｏ_２の反応を触媒する、酸化的分解活性を有する酵素である。このウリカーゼは、種々の動物組織（例えば、肝臓、腎臓）中や微生物組織中に広く存在する。現在、ウリカーゼは、人体内の尿酸蓄積に起因する種々の疾患の臨床診断を目的とした、血液または尿中に存在する尿酸の測定用酵素として使用されている。

ウリカーゼの微生物による生産は広く行われている（例えば、特許文献１〜３参照）。特許文献１では、ウリカーゼを著量に生産するトルロプシス属に属する酵母が提案されている。特許文献２では、多量のウリカーゼを生産するミクロコッカス・ロゼウスが開示され、該微生物が生産するウリカーゼは、生理液のｐＨ値に近いことが見出されている。また、特許文献３では、バチルス・エスピー ＴＢ−９０菌株が、広い作用ｐＨ域を有する好熱性微生物由来のウリカーゼを生産することを開示している。
特開昭５６−１２４３８１号公報 特開昭５７−１１５１７７号公報 特開昭６１−２８０２７２号公報

しかしながら、上記特許文献１、および２で得られるウリカーゼは、いずれも高温（６０℃以上）では不安定である。また、特許文献３で得られるウリカーゼは好熱性微生物由来であるが、５０℃を超えると失活が起こり、６０℃付近では、活性は約５０％程度維持されるのみである（第４図参照）。これは、臨床診断において保存している酵素製品の品質低下の原因となり得る。

したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、耐熱性に優れた新規なウリカーゼの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、耐熱性に優れたウリカーゼ生産能を有する微生物について、広範囲にわたり検索を行なった。その結果、自然界（土壌）から分離したセルロシミクロビウム・フンケイに属する細菌（Ｕ−６４７株）の産生するウリカーゼが、既知のウリカーゼよりも耐熱性に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、上記目的は、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属に属し、ウリカーゼの生産能を有する微生物を培養する工程（１）と、前記工程（１）で得られた培養物からウリカーゼを採取する工程（２）と、を含む、ウリカーゼの製造方法によって達成される。

本発明のウリカーゼは、６０℃で２０分間熱処理しても失活せず、耐熱性に優れるため、酵素製品の保存安定性が良好となり、臨床診断における酵素製品の長期保存が可能である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に用いられるウリカーゼの生産能を有する微生物は、ウリカーゼを産生するセルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属（以降、括弧内は省略する）であれば、特に制限されないが、より好ましくはセルロシミクロビウム・フンケイ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｕｎｋｅｉ）（以降、括弧内は省略する）、さらに好ましくはセルロシミクロビウム・フンケイ Ｕ−６４７ ＦＥＲＭ−Ｐ２１０９８（以降、該菌株を「Ｕ−６４７株」と称する）菌株である。上記細菌は、ウリカーゼ生産能を有する限り、自然界に存在するものであっても、あるいは人為的な遺伝子操作などにより変異を受けたものであってもよい。上記細菌によって産生されたウリカーゼは、菌体内に蓄積されてもよく、あるいは菌体内または菌体外に分泌されてもよい。

ここで、Ｕ−６４７株について詳細に述べる。

Ｕ−６４７株は、本発明者らによって、岐阜県内の土壌から、尿酸を唯一の炭素源とした培地の集積培養により分離された菌種であり、平成１８年１１月１７日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ２１０９８として寄託されている。

Ｕ−６４７株は、以下の（a）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質、（ｄ）その他の性質を有する。下記表において、「＋」は、陽性を、「−」は、陰性を、および「ｗ」は、反応が弱いことを、それぞれ、示す。

ＢＬＡＳＴを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、Ｕ−６４７株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列はセルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）由来の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し高い相同性を示し、相同率９９．８％でセルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＤＳＭ４３８７９株の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索の結果においても、本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡはセルロシミクロビウム由来の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し高い相同性を示し、基準株ではセルロシミクロビウム・フンケイ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｕｎｋｅｉ） ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８８６株の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し相同率９９．９％の高い相同性を示した。本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡと細菌基準株データベースに対する相同性検索上位３０株の１６Ｓ ｒＤＮＡにセルロシミクロビウム・フンケイの１６Ｓ ｒＤＮＡを加えて行った簡易分子系統解析の結果、本菌株はセルロシミクロビウム・フンケイの１６Ｓ ｒＤＮＡとほぼ同一の系統枝を形成し、非常に近縁であることが示された。両者の１６Ｓ ｒＤＮＡ間には１塩基の相違点があるが、その相違点は混合塩基によるものであることから、ほぼ完全に一致すると考えられる。

本菌株は運動性を有するグラム陽性桿菌で、培養時間の経過に伴い形態が変化する「桿菌−球菌生活環」［ロッド コッカス サイクル（ｒｏｄ−ｃｏｃｃｕｓ ｃｙｃｌｅ）］」を示した。Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ平板培地上でのコロニー色は黄色を呈し、培養一週間後には基底菌糸を形成した。カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性を示し、硝酸塩を還元し、ゼラチンを加水分解し、グルコースおよびキシロースを発酵し、マンニトールを発酵しなかった。また、カゼインを加水分解し、Ｌ−アラビノース、グリセロールおよびマンノースを酸化し、Ｄ−ソルビト−ルを酸化しなかった。これらの性状は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析において近縁性が示唆されたセルロシミクロビウム・フンケイやセルロシミクロビウム・セルランスの性状と一致すると考えられ、特に運動性を示す点において、セルロシミクロビウム・セルランスよりもセルロシミクロビウム・フンケイを支持した。以上の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析の結果および諸性質から、本菌株をセルロシミクロビウム・フンケイと判定し、セルロシミクロビウム・フンケイ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｕｎｋｅｉ） Ｕ−６４７と命名した。

このＵ−６４７株は、平成１８年１１月１７日付で、日本国茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター（郵便番号３０５−８５６６） 中央第６独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ−Ｐ２１０９８として寄託されている。したがって、本発明の第二は、ウリカーゼ生産能を有するセルロシミクロビウム・フンケイ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｕｎｋｅｉ）ＦＥＲＭ−Ｐ２１０９８菌株を提供する。

（ウリカーゼの製造方法）
本発明のウリカーゼの製造方法は、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属に属し、ウリカーゼの生産能を有する微生物を培養する工程（１）と、前記工程（１）で得られた培養物からウリカーゼを採取する工程（２）と、を含む。

以下、セルロシミクロビウム属に属する細菌を用いたウリカーゼの製造方法の各工程について述べる。

（１）セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属に属し、ウリカーゼの生産能を有する微生物を培養する工程。

該製造方法に使用される培地は、セルロシミクロビウム属に属する細菌が生育する限り特に制限されず、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用可能である。また、上記培地は、固体または液体培地のいずれであってもよい。

炭素源としては、セルロシミクロビウム属に属する細菌が良好に生育でき、所望のウリカーゼを生産できるものであればいずれの炭素源であってもよい。具体的には、グルコース、シュークロース、ガラクトースなどの糖類；エタノール、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類；クエン酸、リンゴ酸、コハク酸などの有機酸；デンプンまたはその組成画分、焙焼デキストリン、加工デンプン、デンプン誘導体、物理処理デンプン及びα−デンプン等の炭水化物などが挙げられる。また、尿酸などを炭素源として使用してもよい。好ましくは、グルコース、シュークロース、ガラクトースなどの糖類、エタノール、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸などの有機酸、尿酸が使用される。これらの炭素源は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。

窒素源としては、一般的にセルロシミクロビウム属に属する細菌の培養に使用するのと同様のものが使用でき、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、あるいは尿酸などの無機あるいは有機の窒素化合物が使用できる。さらに、窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、コーンスティープリカー等の窒素含有天然物を使用してもよい。これらのうち、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、尿酸などの無機あるいは有機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなの窒素含有天然物が好ましい。これらの窒素源は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。

無機物としても、一般的にセルロシミクロビウム属に属する細菌の培養に使用するのと同様のものが使用でき、例えば、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム等の、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩などが用いられる。そのほか、チアミン、ビオチンなどのビタミン類、さらに必要に応じて、アデニン、ウラシルなどの核酸関連物質が使用されてもよい。これらの無機物は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。

セルロシミクロビウム属に属する細菌の培養は、好気的条件下、通常振盪培養あるいは通常撹拌培養で行なわれる。その際の培養条件は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本菌株が増殖し目的とする酵素であるウリカーゼが失活せずに効率よく産生できる条件であれば特に制限されない。通常は、培養温度は２５〜４５℃で行う。培地のｐＨは５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０の範囲である。培養時間は、通常２０〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間培養する。本発明では、ウリカーゼは、上記したようにして得られたセルロシミクロビウム属に属する細菌の培養液中および／または菌体中に生成・蓄積されるが、特に本発明の特に好ましい実施形態であるＵ−６４７株を使用する場合には、以下の実施例で詳述するように、Ｕ−６４７株の菌体中に生産されたウリカーゼが、耐熱性に優れるため、好ましい。

（２）前記工程（１）で得られた培養物からウリカーゼを採取する工程。

本発明のウリカーゼの単離方法を以下に記載する。

産生したウリカーゼが菌体内に蓄積または分泌される場合には、培養終了後、培養液から菌体を遠心分離などにより回収し、ついでこの菌体から適当な手段でウリカーゼを適当な溶媒（例えば、トリトン Ｘ−１００など）で抽出する。遠心分離などによってこの抽出液を処理して不溶性成分を除去した後、酸沈殿、有機溶媒沈殿（例えば、エタノール、アセトンなどによる溶媒沈澱）、塩析（例えば、硫安による塩析）、透析、各種クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、セファデックスクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなど）、限外濾過、凍結乾燥、電気泳動などの、当業者が通常用いる酵素精製方法によって精製することにより、純度の高いウリカーゼが得られる。なお、ウリカーゼの精製度合いは、得られたウリカーゼを電気泳動にかけることにより確認でき、電気泳動的に単一になるまで精製することにより、純度の高いウリカーゼが得られる。または、培養終了後、濾過または遠心分離などにより菌体を培養液から回収し、ついでこの菌体を適当な手段（例えば、超音波、自己消化法、ガラスビーズ等を用いた物理的破砕など）で破砕して、細胞破砕物を得、当該破砕物から遠心分離などにより上清液を得る。この上清液を、上記と同様の精製方法を使用することによって、純度の高いウリカーゼを得てもよい。

また、産生したウリカーゼが菌体外（培養物中）に分泌される場合は、培養液から濾過または遠心分離により菌体を除去し、濾液または上清を得る。こうして得られた濾液または上清に、直接上記と同様の精製方法を適用することによって、純度の高いウリカーゼが得られる。

本発明の製造方法によって得られるウリカーゼは、上述したように、人体内の尿酸蓄積に起因する種々の疾患の臨床診断を目的として、血液または尿中に存在する尿酸の測定用酵素として使用できる。この際、ウリカーゼを使用する尿酸の定量法としては下記の方法がある。

（ｉ）尿酸とウリカーゼとを反応させることにより生成する過酸化水素量を測定する方法。

この際、過酸化水素量の測定方法としては、例えば下記（ア）〜（ウ）の方法がある：
（ア）過酸化水素を４−アミノアンチピリンとフエノールあるいはその誘導体とパーオキシダーゼの存在下で反応させて、過酸化水素量に比例して生成する色素を吸光度から定量する（酵素比色法中ウリカーゼ・パーオシダーゼ法）方法；
（イ）酸化水素とアルコールとをカタラーゼの存在下で反応させ、生じたアルデヒドをアセチルアセトン及びアンモニアと縮合させて生成する色素を吸光度から定量する（酵素比色法中ウリカーゼ・カタラーゼ法）方法；および
（ウ）上記（イ）のカタラーゼによる反応生成物のアルデヒドと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とをアルコールデヒドロゲナーゼの存在下で反応させてＮＡＤを生成せしめ、その際、減少するＮＡＤＨを定量する（紫外部吸収法）方法。

（ｉｉ）尿酸をウリカーゼと反応させる際に消費される酸素あるいは生成する炭酸ガスを測定する方法（電極法）。

（ｉｉｉ）反応の前後における尿酸由来の紫外部吸収の差を測定する方法（紫外部吸収法）。

（ＩＶ）ウリカーゼ処理及び未処理の試料に化学的尿酸定量法（例えば、リンタングステン酸法）。

本発明の製造方法によって得られるウリカーゼは、上記方法のいずれも適用できるが、好ましくは（ｉ）（ア）の方法に使用できる。

以下に、実施例により本発明を詳細に説明するが、本実施例により本発明の範囲は制限されるものではない。

（実施例１）
（１）セルロシミクロビウム・フンケイ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｕｎｋｅｉ） Ｕ-６４７株の培養
下記組成；トリプトン（ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）社製）１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）社製）０．１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム（関東化学社製）０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム（関東化学社製）０．２％（ｗ／ｖ）、尿酸（和光純薬工業社製）０．２％（ｗ／ｖ）からなる培養液を調製した後、ｐＨをＮａＯＨで７．０に調整し、１２１℃で２０分間滅菌した。

次に、得られた培養液を、滅菌したＬ字試験管に５ｍｌずつ分注した。１．５％寒天を含有するブイヨン培地で予め培養しておいたＵ−６４７株を、上記Ｌ字試験管の培養液に接種し、３０℃で１２０ｒｐｍの速度で撹拌させながら、２４時間培養を行った。

（２）酵素の採取
上記（１）で得られた培養液を遠心分離し、得た菌体に、５ｍＬのリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）および３ｇのガラスビーズを加えて混合し、３分間振盪して、菌体を物理的に破砕した。この菌体破砕物を遠心分離により上清を回収し、この上清を酵素液（総ウリカーゼ活性 １．７Ｕ）とした。

なお、本実施例において、ウリカーゼの活性は、下記方法によって測定した。

（評価例１）ウリカーゼ活性の測定法
ウリカーゼ活性の測定は、ウリカーゼ・ペルオキシダーゼ法を用い、５５０ｎｍにおける４−アミノアンチピリンとＴＯＤＢ（Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン）の酸化縮合体のキノン色素を分光光度計により行なった。より具体的には、０．８３ｍＭ 尿酸溶液 １２０μｌ、７５ｍＭ ＴＯＤＢ ５μｌ、７５ｍＭ ４−アミノアンチピリン ５μｌ、８０Ｕ／ｍｌ ペルオシキダーゼ ５μｌ、および酵素液 ６５μｌを混合し、室温（２５℃）で１時間反応させた後、５５０ｎｍの吸光度を測定した。この際、ウリカーゼの単位は、上記試験条件下において毎分１マイクロモルの尿酸を分解する酵素の量（力価）を、「１Ｕ（ユニット）」と定義した。

（評価例２）酵素の温度安定性
標品としては、上記実施例１（２）で得られた酵素液を使用した。

本発明のウリカーゼ標品を、種々の温度（２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃）に２０分間保持した後、上記評価例１に記載の方法に従って、ウリカーゼ活性を測定した。２０℃で２０分間保持した後の活性を１００として、各温度における相対残存活性を算出し、その結果を図１に示す。図１から、本発明の製造方法によって得られたウリカーゼは、６０℃以下では２０分間の熱処理に対しても失活が認められず、６０℃でもウリカーゼ活性を９５％以上維持していた。

評価例２の結果を示す図である。

Claims (4)

1. セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属に属し、ウリカーゼの生産能を有する微生物を培養する工程（１）と、
   前記工程（１）で得られた培養物からウリカーゼを採取する工程（２）と、
   を含む、ウリカーゼの製造方法。
2. 前記ウリカーゼが、２０分間６０℃の熱処理に対して９５％以上の酵素活性を維持する、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属に属する微生物が、セルロシミクロビウム・フンケイ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｕｎｋｅｉ）Ｕ−６４７ ＦＥＲＭ−Ｐ２１０９８菌株である、請求項１または２に記載の製造方法。
4. ウリカーゼ生産能を有するセルロシミクロビウム・フンケイ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｕｎｋｅｉ）Ｕ−６４７ ＦＥＲＭ−Ｐ２１０９８菌株。

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