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JPH0564599A - 液体中のイオンを測定する方法及びそのための組成物 - Google Patents

液体中のイオンを測定する方法及びそのための組成物

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JPH0564599A
JPH0564599A JP4041359A JP4135992A JPH0564599A JP H0564599 A JPH0564599 A JP H0564599A JP 4041359 A JP4041359 A JP 4041359A JP 4135992 A JP4135992 A JP 4135992A JP H0564599 A JPH0564599 A JP H0564599A
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ウーヴエ ヘルマン，
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FURINDAASU UNIV OF SAUSU AUSTR
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FURINDAASU UNIV OF SAUSU AUSTR
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 液体中のナトリウムイオンを測定する方法及
びそのための組成物。 【構成】 液体中のナトリウムイオンを測定するため
に、酵素活性に対するこのイオンの影響を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物学的及び非生物学
的液体中のイオン（以後これを分析質とも称する）を測
定する方法及び試薬に関する。
【０００２】本発明は、多くの分析質（Ａｎａｌｙｔ
ｅ）が感受性酵素の活性を促進又は阻害する能力に基づ
く。この分析質は、カチオン、アニオン、金属又は非金
属の元素又は化合物であってよい。実際に、この分析質
は、関連分析インジケータ酵素の感受性の範囲の外の濃
度で、又は、酵素が敏感である他のイオンの存在で干渉
（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）が惹起される濃度で試料
中に存在することが屡々認められている。本発明は、こ
れらの問題を、種々の方法で対応しかつ解決する。
【０００３】
【従来の技術】臨床生化学の実際において、血清電解質
の測定は、病院で実施されている最も一般的な分析試験
である。これらの測定は、通常の研究のためのみならず
屡々、分析の速度が重要である緊急及び救急処置のため
にも必要である。病院での遅延の主要原因は、病室から
診断研究室までの検体の移送であり、病床近くで容易に
実施しうる方法は、緊急時には特に有効である。
【０００４】臨床生化学の実際におけるカリウムおよび
ナトリウムを分析する一般的方法は、炎光光度法であ
る。この方法は、特定の原子に熱エネルギーを与える
と、これが励起され、基底状態に戻る際に特徴的な光を
発する原理に基づく。炎内での原子により生ぜしめられ
る放射エネルギーの特性波長の強度は、炎内で励起され
る原子の数に正比例し、これは、試料中の当該物質の濃
度に正比例する。必要な装置は複雑であり、かなり高価
であり、可燃性ガスの使用を必要とする。
【０００５】殊に、ナトリウム、カリウム及び塩素に関
する択一的方法は、イオン選択性電極を使用させる。理
想的には、各電極は、１種のイオンに対してのみ感応す
る特異的なイオン選択性を有すべきである。実際には、
このような場合はなく、すべてのイオン選択性電極に対
して干渉イオンが存在する。更に、イオン特異性電極
は、一般に補正は可能であるが、絶対的に特異的ではな
い。電極は、特殊イオンの存在時に生ぜしめられる電圧
を測定する。この装置はかなり高価である。従って、分
光光度法で実施することもできず、イオン測定用の臨床
的要求も、市場で入手しうる臨床アナライザー（その大
抵は、分光光度分析のために設計されている）の複雑さ
を実質的に増す。双方の方法は、その実施の成巧のため
にかなりの程度の熟練と知識を要求する。
【０００６】同様に、熱量測定法によるクロリドの慣用
測定も、特殊な装置を必要とする。この滴定法の終点
は、不溶の塩化銀生成物の形成の完結に基づく電気流動
率の増大により探知される。電圧測定法も使用でき、こ
れは非常に時間もかかり、付加的な装置を包含する。
【０００７】更に、クロリドに関しては、多くの光電法
及び滴定法があり、例えばそれには次のものが包含され
る： −ジフエニルカルバゾン錯体を経る遊離Ｈｇ2+イオンの
滴定 −水銀錯体の解離後にＨｇＣｌ2の沈殿により形成され
る鉄のローダニド錯体の比色測定(Ｓｋｅｇｇｓ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｃｈｅｍ．１０，１９６４，９１８ｆ；Ｓｃｈｍ
ｉｄｔ，Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ Ｐｈａｒｍ１２４
（９），１９８５．５２７ｆ） −相応する水銀塩からのクロラニル酸の比色測定（Ｒｅ
ｎｓｃｈｌｅｒ） −無色水銀塩からのジエチルジチオカルバミン酸の着色
Ｃｕ2+錯体の測定（西ドイツ特許出願公開第２１３７１
４６号） −同様に、水銀錯体の解離による着色金属錯体の形成に
基づく、より一般的なＴＰＴＺ−法（トリピリジル−ｓ
−トリアジン；Ｒ．Ｆｒｉｅｄ．Ｚｅｉｔｓｈｒ．Ｋｌ
ｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｋｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈ．１０，１９７
２，２８０ｆ；西ドイツ特許出願公開第２１５３３８７
号）。
【０００８】これら方法の主要欠点は、高い毒性の物質
を含有する溶液の使用である。これら方法のいくつか
は、煩雑であり、かつ不正確である（例えば滴定法）。
多くの試薬は不安定であり、較正曲線は非直線性である
（例えばローダニド法）。更に、これらの方法のいくつ
かは、試料の蛋白質含分による干渉を除くために、前処
理が必要である。
【０００９】改良ＴＰＴＺ法は、世界知的所有権機構
（ＷＯ）８３／００２６７０号明細書中に記載されてい
るが、毒性水銀化合物の使用がなお欠点である。水銀イ
オンを使用しない比色法のみが、過塩素酸溶液中のＦｅ
（III）のヘキサクロロ錯体を測定する（Ｆ．Ｈｏｐｐ
ｅ，Ｔｈｅｒ．Ｇｇｗ．１１０（４），１９７１，５５
４ｆ；Ｈ．Ｍａｈｎｅｒ，Ｚｅｉｔｓｃｈｒ．Ｋｌｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ．Ｋｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１（１
１），１９７３，４５１ｆ；Ｗ．Ｔ．Ｌａｗ，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ．２６（１３），１９８０，１８７４ｆ；
ＵＳ−４２７８４４０）。この方法のかなりの限定は、
腐蝕性であり、機械的ピペット系とは許容し得ない強酸
性試薬の使用である。もう１つの欠点は、試料中のビリ
ルビンによる干渉である。
【００１０】カルシウムは、臨床研究室で通例測定され
るもう１つの例である。体液中のこの金属イオンの濃度
は、狭い範囲で調節される。病理学的に高い又は低い濃
度は腎不全、膵炎、テタニー及びうつ血性心不全等の疾
患の長期間処理疾病をもたらすことができる。
【００１１】カルシウム測定の最も初期の方法の１つ
は、テイスダル（Ｔｉｓｄａｌｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．６３，４６１〜４６５，１９２５）により文献に
記載されており、ここでは、カルシウムを蓚酸（それ自
体は比色法で評価される）で沈殿させている。この方法
は、遠心分離工程を包含し、従って、非常に時間を要
し、カルシウムに対して特異的ではなく、試料の注意深
い取扱いに依存する。この方法は、滴定による及び直接
の非色法により多くの研究室で成巧している。前者は、
複雑かつ煩雑な方法の欠点をも有し、多大の試料量を必
要とする。後者の方法では、カルシウムは色素例えば光
度計中で測定できるオルトクレゾールフタレイン・コン
プレキソンの色に悪影響を及ぼす。この方法の簡単性に
基づき、これ自体、臨床研究室での自動化をもたらす。
しかしながら、この方法は、攻撃的な高アルカリ性溶液
及び毒性物質の使用を包含している。これは、特に多く
の血清成分例えば脂質、蛋白質、燐酸塩及びビリルビン
により干渉される傾向があり、結果として原子吸収及び
炎比色法とは良好に適合しない。この比色法のもう１つ
の欠点は、較正曲線が非直線性であり、色がかなり温度
に依存することである。
【００１２】Ｗ．Ｈ．アウトロウ（Ｏｕｔｌａｗ）及び
Ｏ．Ｈ．ローリィ（Ｌｏｗｒｙ）によるアナリテイカル
・ビオケミストリィ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）９２，３７０〜３７４（１９７９）
には、組織中のカリウムイオンを測定するための酵素介
在検定が記載されている。この方法では、カリウムイオ
ン及びナトリウムイオンにより活性化される（前者は４
０倍以上も有効）ウサギ筋肉からのビルベートキナーゼ
を使用する。この非特異性に基づき、この方法は、カリ
ウムが主要カチオンである植物物質には好適であるが、
３０倍過剰のナトリウムイオンを含有する血清のような
体液中での測定には不適当である。従って、ナトリウム
イオンは、ローリイ（Ｌｏｗｒｙ）等による酵素的比色
法を血漿又は血清中のカリウムを測定するために使用す
る際には、認容できない干渉を起こさせる。もう１つの
問題は、アンモニウムイオンがカリウムイオンに類似の
活性化を与えることである。前記文献は、生物学的液体
例えば血清中のカリウムイオンの分析に関連するこれら
の臨床的問題を処理又は解決をせず、ナトリウムイオン
の測定のための何の方法も提供しない。
【００１３】
【発明が解決しょうとする課題】従って、本発明の課題
は、前記の問題をさける方法及び試薬を提供することで
ある。本発明は、酵素の活性へのイオンの影響を測定す
る方法による液体中のイオン（分析質）の測定法により
この問題を解決している。
【００１４】
【課題を解決するための手段】この発明の主要態様は、
特に液体の稀釈が実施不能な場合に分析質の自由濃度を
分析酵素にとって至適の範囲にする選択的結合剤を使用
することである。本発明の付加的要素は、分析酵素の分
析質に対する感度を低めて、高濃度での分析質の測定を
許容するようにするために、当該分析酵素の競争的阻害
剤を使用することである。これは、選択的結合剤が容易
に利用できないか又は認容できない程度に高価である場
合に殊に有用である。
【００１５】本発明のもう１つの態様は、干渉イオンの
自由濃度を、もはや干渉が問題でない程度まで低下させ
るために、選択的結合剤を使用することである。競争的
阻害剤は、分析質とよりも干渉イオンとより有効に競争
し、この際、干渉イオンに関連して分析質への酵素の感
度を増大する事実も使用される。
【００１６】重要な要素は、適当な補酵素の選択を包含
する至適条件を、分析質の促進性又は阻害性作用が実質
的に干渉イオンのそれより実質的に大きいように選ぶこ
とである。更に、分析酵素の活性への分析質及び干渉イ
オンの作用が付加的であり、従って干渉イオンの濃度が
公知の場合には、分析質の濃度が差によって容易に測定
できる。干渉イオンが分析液体中に相対的に一定の濃度
で生じる場合には、標準（較正）液中の干渉イオンの適
当な濃度を包含することにより、これは酌量できる。こ
のような分析質を検定するための他の方法は、分析質が
結合剤からの他のイオンを置換し適当な酵素の活性への
放出イオンの作用が測定される所での競争的結合剤の使
用である。
【００１７】これらの一般的原理は、血漿又は血清中の
カリウム、ナトリウム、カルシウム、クロリド及び重炭
酸イオンの測定への適用を示すことにより最も良好に説
明することができる。しかしながら、これらは広い種類
のイオン例えばカチオン例えばマグネシウム、マンガ
ン、リチウム、鉛、亜鉛、銅、鉄又は他の重金属に適用
可能である。測定可能な非金属イオンの例は、プロトン
又はアンモニウムである。アンモニウムを生じさせる尿
素等の物質も測定されうる。
【００１８】好適な酵素 使用できる酵素は、例えば次のものであってよい（Ｈ．
Ｊ．Ｅｖａｎｓ ｅｔａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７，４７，１９６６）：トランスフェラーゼ 、例えば燐含有基移送性トランスフ
ェラーゼ。このようなトランスフェラーゼは、ピルベー
トキナーゼであってよい。ピルベートキナーゼの代り
に、他のキナーゼ例えばマグネシウムイオン又はマンガ
ンイオンに対して敏感であるアデニレートキナーゼ又は
ヘキソキナーゼを使用することができる。他のトランス
フェラーゼはアセテートキナーゼである（Ｅ．コリーか
らの）。他の例は、亜鉛イオンに対して敏感な脳からの
ピリドキサールキナーゼである。
【００１９】ヒドロラーゼ、例えばグリコシダーゼ、例
えばα−又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｅ．コリーか
ら）、カルボキシペプチダーゼＡ（牛膵臓から）、コラ
ゲナーゼ（クロストリジウム・ヒストリクムから）、ア
ミラーゼ（唾液又は膵液から）又はホスホグリコレート
ホスファターゼ。
【００２０】ペプチドヒドラーゼ、例えばシスティン又
はチオール依存性プロティナーゼ〔その詳細な例は、カ
ルパイン（Ｃａｌｐａｉｎ）Ｉ及びII（即ち、カルシウ
ム活性化中性プロテアーゼと称される）である〕は、サ
サキ（Ｓａｓａｋｉ）等によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５９，１２４８９〜１２４９４（１９８４）に記
載されている。後者の酵素は、種々の動物組織例えばラ
ッテの肝臓及び腎臓、ヒト及び豚の赤血球、牛の脳及び
ウサギの骨格筋から、Ａ．キタハラ（Ｋｉｔａｈａｒ
ａ）等によるＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，１７５９〜１
７６６（１９８４）に記載の方法により単離かつ精製す
ることができる。他の例は、ジペプチジルアミノペプチ
ダーゼＩである（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１，カテプシ
ンＣ；Ｊ．Ｋｅｎ Ｍｃ Ｄｏｎａｌｄ，Ｂｉｏｃｈ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ
２４（５），６６，７７１ｆ）。この酵素の他の起源
は、遺伝子組換え技術により得られる。
【００２１】オキシドレダクターゼ、例えばグリセロー
ル・デヒドロゲナーゼ（エンテロバクター・アエロゲネ
スから）アセタールデヒドロゲナーゼ（酵母から）又は
チロシナーゼ（カテコール・オキシダーゼ）。
【００２２】リアーゼ、例えばアルドラーゼ（酵母か
ら）又はカルボニック・アンヒドラーゼ（牛赤血球か
ら）。
【００２３】他の好適な酵素は、好塩性組織からの種々
の酵素である。他の酵素源は、遺伝子組換え技術で得ら
れる。
【００２４】選択的結合剤：広範な種々の結合剤が分析
質又は干渉イオンの結合のために利用できる。このよう
な結合物質又はマスキング物質は次のものである：クリ
プタンド（Ｃｒｙｐｔａｎｄｓ）、コロナンド（Ｃｏｒ
ｏｎａｎｄｓ）、クラウンエーテル（Ｃｒｏｗｎ ｅｔ
ｈｅｒｓ）、ポダンド（Ｐｏｄａｎｄｓ）、スフエラン
ド（ｓｐｈｅｒａｎｄｓ）、ヘミスフエランド（ｈｅｍ
ｉｓｐｈｅｒａｎｄｓ）、カリキサレン（ｃａｌｉｘａ
ｒｅｎｓ）及びこれらの組合せ、天然産のイオノフオレ
（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅｓ）例えば抗生物質、環状ペプチ
ド例えばバリノマイシン（ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）、
コンプレクソン（Ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅｓ）及びキレー
ト化剤例えばイミノジ酢酸、ＥＤＴＡ、ニトロ三酢酸及
びこれらの誘導体。このような化合物は、次の文献に記
載されている：Ｋｏｎｔａｋｔｅ（Ｍｅｒｃｋ）１９７
７，Ｎｏ１．１１頁以降及び２９頁以降；Ｋｏｎｔａｋ
ｔｅ（Ｍｅｒｃｋ）１９７７，Ｎｏ．２，１６頁以降；
Ｋｏｎｔａｋｔｅ（Ｍｅｒｃｋ）、１９７７，Ｎｏ．
３，３６頁以降；Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃａ
ｔａｌｙｓｔｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍｅｒｃｋ−Ｓｃｈｕｃｈａｒｄ
ｔ）１９８７，Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｎｄ Ｋ
ｉｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ ｆｏｒＣａｔｉｏｎ Ｍａｃ
ｒｏｃｙｃｌｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ；Ｒ．Ｍ．Ｉ
ｚａｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ８５，２７１〜３９９（１９８５）；Ｄａｔａ ｆ
ｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１
９８６，Ｒ．Ｍ．Ｃ．Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．第３
１版、３９９〜４１５頁（Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｆ．Ｖｏｅｇｔｌｅ等によるＣｈ
ｅｍ．Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖ
ｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５；Ｇ．Ｗ．Ｇ
ｏｋｅｌ等によるＥｄｓ．，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ
Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒＶｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９８２；Ｊ．
Ｍ．Ｌｅｈｎ等によるＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９
７，６７００〜６７０７（１９７５）；Ｇ．Ｓｃｈｗａ
ｒｚｅｎｂａｃｈ等によるＨｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ．２８，８２８（１９４５）；Ｓ．Ｆ．Ａ．Ｋｅｔｔ
ｌｅ，Ｋｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎｓｖｅｒｂｉｎｄｕｎ
ｇｅｎ，Ｔａｓｃｈｅｎｔｅｘｔ３，Ｖｅｒｌａｇ Ｃ
ｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｂｅｒｇｓｔｒ．１９
７２；Ａ．Ｅ．Ｍａｒｔｅｌｌ等によるＤｉｅ Ｃｈｅ
ｍｉｅ ｄｅｒＭｅｔａｌｌｃｈｅｌａｔｖｅｒｂｉｎ
ｄｕｎｇｅｎ，Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎ
ｈｅｉｍ／Ｂｅｒｇｓｔｒ．１９５８；Ｍ．Ｂｅｃｋｅ
−Ｇｏｅｈｒｉｎｇ等によるＫｏｍｐｌｅｘｃｈｅｍｉ
ｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９７０；Ｆ．
Ｋｏｂｅｒ，Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎｄｅｒ Ｋｏｍｐｌ
ｅｘｃｈｅｍｉｅ，Ｏｔｔｏ Ｓａｌｌｅ Ｖｅｒｌａ
ｇ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ １９７９；Ｇ．Ｓ
ｃｈｗａｒｚｅｎｄａｃｈ ｅｔａｌ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ ３１，１０２９（１９４８）；Ｒ．
Ｇ．Ｐｅａｒｓｏｎ等によるＳｃｉｅｎｃｅ １５１，
１７２（１９６６）。
【００２５】多価イオン殊に２価カチオンを結合するこ
とのできるキレート化剤の例は、エチレングリコール−
ビス−（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，
Ｎ′−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）及び（エチレンジニトリ
ロ）テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【００２６】多価イオンと結合することのできる多くの
試薬、例えばＥＤＴＡ及びその誘導体が存在するが、１
価イオンと結合する試薬は、あまり一般的でない。テト
ラフェニルボロンはカリウムイオンと結合する。しかし
ながら、広い可能性を有する化合物群は、水溶液中の１
価のカチオンと選択的に結合することのできる試薬の例
であるクリプタンドである（Ｒ．Ｍ．Ｉｚａｔｔ等によ
るＣｈｅｍ．Ｒｅｖｉｗｓ８５，２７１〜３３９）。ク
リプタンドの詳細な例は、メルク・シューハルト（Ｍｅ
ｒｃｋ−Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ）のクリプトフイックス
（Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ：登録商標）化合物、例えば４，
７，１３，１６，２１−ペンタオキサ−１，１０−ジア
ザビシクロ〔８．８．１５〕−トリコサン〔Ｋｒｙｐｔ
ｏｆｉｘ２２１；登録商標Ｍｅｒｃｋ−Ｓｃｈｕｃｈａ
ｒｄｔカタログ（１９８９／８８）４３８頁、Ｎｏ．８
１０６４６（Ｋ２２１）〕、４，７，１３，１６，２
１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ
〔８．８．５〕−ヘキサコサン〔Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ２
２２；登録商標Ｍｅｒｃｋ−Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔカタ
ログ（１９８７／８８）４３８頁、Ｎｏ．８１０６４７
（Ｋ２２２）〕である。
【００２７】干渉アニオンを除去するためのマスキング
剤として次の群の化合物も使用することができる：アニ
オンクリプタンド（ａｎｉｏｎｃｒｙｐｔａｎｄｓ）、
ヘテロサイクロフアン（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏｐｈａ
ｎｅｓ）、カタピナンド（ｃａｔａｐｉｎａｎｄｓ）及
び無機金属錯体又は不溶性塩。アニオン錯形成性化合物
の詳細な例は、文献中に記載されており、例えばアザモ
ノ−（ａｚａｍｏｎｏ−）又はアザポリサイクル類（ａ
ｚａｐｏｌｙｃｙｃｌｅｓ）、マイクロサイクル性４級
テトラヘドロン化合物、マクロサイクル性ビス−金属−
錯体、共有結合したルイス酸中心を有するマクロサイク
ル類（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ）、プロトン化又はアル
キル化された４級クリプタンタンド類又はカタピナンド
類（Ｆ．Ｐ．Ｓｃｈｍｉｄｔｃｈｅｎ，Ｎａｃｈｒｉｃ
ｈｔｅｎ Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．ｌａｂ．３６（１），
１９８８，８．８ｆ；Ｅ．Ｇｒａｆ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．９８（２０），１９７６，６４０３
ｆ；Ｃ．Ｈ．Ｐａｒｋ Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．９０（９），１９６８，２４３１ｆ）並びに例えば
Ｆｅ（III）のヘキサクロロ錯体又は硝酸銀である。
【００２８】結合剤の機能：これら結合剤は次の目的の
ために使用される： 1. 干渉イオンの選択的結合 2. 試料の稀釈が不可能な場合、分析質の濃度を最適測
定レベルまで低下させる 。3. 本発明の態様は、結合剤が存在し、インジケータ
イオン（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｏｎｓ）と錯体を形成
し（この錯体からインジケータイオンは化学量論的に分
析質イオンで換えられる）、酵素活性へのこの換えられ
たインジケータイオンの影響を検定し、この際、分析質
イオンの濃度の直接測定法が得られる。例えば、このよ
うな方法において、酵素はピルベートキナーゼであり、
インジケータイオンはカリウムであり、結合剤はクリプ
トフイクス（ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ）２２１であり、被測
定イオンはナトリウムであるか又は酵素はキナーゼであ
りインジケータイオンはＭｇ2+であり、結合剤はキレー
ト化剤例えばＥＤＴＡであり、イオンは金属であるか又
は酵素はピリドキサルキナーゼであり、インジケータイ
オンはＺｎ2+であり、結合剤はクリプトフイクス２２１
であり、イオンは重金属であるか又は酵素はα−アミラ
ーゼであり、結合剤はＡｇ又はＨｇであり、被測定イオ
ンはクロリドであるか又は酵素はコラゲナーゼ、結合剤
はキレート化剤例えばＥＤＴＡであり被測定イオンはカ
ルシウムである。
【００２９】分析用液体：分析質の測定が行なわれる生
物学的液体の例は、血液、血清、血漿、汗、滲出液又は
浸出液又は尿である。他の液体の例は水道水又は食料品
又は果物の抽出物又は醗酵液例えばワインである。
【００３０】カリウム及びナトリウ ムイオンの測定のた
めの一 般的原理の適用 カリウムイオンに対するピルベートキナーゼの敏感性に
基づく血清又は血漿中のカリウムイオンの満足しうる測
定を得るための重要要件は、ナトリウム及びアンモニウ
ムイオンによる干渉の克服である。本発明に包含される
一般的原理によれば、これは次の１以上の方法で達成さ
れる： 1. ナトリウムイオンと適当な結合剤例えばクリプトフ
イックス２２１との選択的結合 2. ピルベートキナーゼ原としてのウサギ筋肉よりもバ
シルス・ステアロテルモフイルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を選択する。
それというのも、この細菌酵素は、ナトリウムイオンと
の関連でカリウムイオンに対する敏感度が筋肉酵素より
も２倍大きいからである。
【００３１】3. 検定における敏感なインジケータ酵素
の競争的阻害剤であるイオンの包含、例えばリチウムイ
オンをナトリウムイオン及びカリウムイオンと競争する
ために使用する。
【００３２】4. アンモニウムイオンの酵素的除去。
【００３３】リチウムイオンは、カリウムイオンに対す
る競争体（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）として有効性が低い
ので、真の効果は、カリウムイオンに対するピルベート
キナーゼの相対的敏感度がナトリウムに比べて更に５０
％増大することである。更に、リチウムイオンの存在
で、ピルベートキナーゼの作用へのカリウム及びナトリ
ウムイオンの作用効果は、共同性というよりも相加的に
なる。他のイオンの濃度が公知であることを前提とし
て、カリウム又はナトリウムイオンの濃度測定が可能と
なる。
【００３４】結合剤の不存在下での方法２及び３の使用
により、ピルベートキナーゼのカリウムイオン対ナトリ
ウムイオンの相対的敏感度１００：１を得ることができ
る。このことは、極めて異常な１１０又は１７０ｍモル
／ｌのナトリウムイオン濃度でも、測定されるカリウム
イオン濃度の誤差が正常血漿ナトリウムイオン濃度１４
０ｍモル／ｌ（例Ａ）に比べて０．３ｍモル／ｌを超え
ないことを意味する。これは、多くの臨床目的のために
充分な正確性であるとは見なされない。しかしながら、
血漿中のナトリウムイオンの真の濃度が公知であるな
ら、±０．０５ｍモル／ｌまでの正確なカリウムイオン
の測定は実施できる（例Ｂ）。方法１〜３を一緒にし、
結合剤例えばクリプトフイックス２２１を包含する場合
は、ナトリウムイオンに対するカリウムイオンへのピル
ベートキナーゼの相対的敏感度は＞５００：１まで高め
ることができる。このような状況下では、０．０５ｍモ
ル／ｌまでの血漿カリウムイオンを測定するために、ナ
トリウムイオン濃度を知る必要はない（例Ｃ）。
【００３５】カリウムイオン測定のためのこれら方法
は、干渉の低減を考慮して本発明に包含される一般的原
理の適用性を示している。他方、血清又は血漿中のナト
リウムイオンの測定は、有効な分析質濃度の調整へのこ
の原理の適用を最良に説明している。本発明に包含され
るようなナトリウムイオン測定の１手段は、ナトリウム
イオンに対して敏感である活性を有する酵素を使用する
ことである。このような酵素の例は、β−ガラクトシダ
ーゼである（ｋｕｂｙ等によるＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．７５，８９０，１９５３）。しかしながら、この
酵素が最も敏感であるナトリウムイオン濃度の範囲は、
通例血漿試料中で、稀釈工程なしに得られるよりも低
い。
【００３６】試料の稀釈が不可能な場合に、本発明に包
含される原理を保持して、次の方法を有効なナトリウム
イオン濃度を最適レベルまで低めるために使用する。
【００３７】1. ナトリウムイオン結合剤例えばクリプ
トフイックス２２１の使用 2. β−ガラクトシダーゼの競争的阻害剤としてのリチ
ウムイオンの使用（この際、ナトリウムイオンに対する
この酵素の敏感度は低下）。
【００３８】方法１及び２の組み合せは、容易にβ−ガ
ラクトシダーゼを用いる血漿又は血清中のナトリウムイ
オンの測定を許容し、結合剤の量は、１１０ｍモル／ｌ
を下まわるナトリウムイオン濃度に関する信号を最低に
するために使用することができ、他方通常の分析範囲
（１１０〜１７０ｍモル／ｌ）の信号を高める（例
Ｄ）。
【００３９】カリウムイオンによる酵素活性の刺激が低
下され、カリウムイオン結合剤例えばクリプトフイクス
２２２が反応混合物中に包含されるような条件を選択す
ることを前提として、ピルベートキナーゼを用いてナト
リウムイオンを測定することもできる（例Ｅ）。
【００４０】血漿ナトリウムイオン濃度を測定するもう
１つの方法では、ナトリウムイオンをクリプトフイクス
２２１からのカリウムイオンに換えることができ、放出
されるカリウムは、血漿ナトリウムイオン濃度に比例し
てピルべートキナーゼの活性を刺激する（例Ｆ）。
【００４１】本発明の他の態様は、生物学的及び非生物
学的液体中のイオン測定用の組成物及び試薬である。
【００４２】本発明による試薬は、溶解された形又は乾
燥形で存在しうる。これは、適当な担持材上に含浸され
て存在してもよい。試験片の形の診断剤は、担持材有利
に濾紙、セルロース又は合成繊維フリースに、易揮発性
溶剤例えばアセトン中の試験片の製造に有利に使用する
のに必要な溶液で含浸することにより製造することがで
きる。これは、１以上の含浸工程で行なうことができ
る。仕上げられた試験紙は、そのもの自体として又は公
知方法で把手に押込んで又は合成樹脂と微細メッシュと
の間でシールして使用することができる。
【００４３】次に、本発明の実施態様を詳細に記載する
が、本発明は、記載の詳細の１つ又は組合せに限定され
るものではなく、特にこれら態様に記載のほかにも機械
的又は化学的変更法を使用することができる。
【００４４】カリウムイオンの分析 法の詳細な記載（参
考） ここでは、本発明に記載の原理を包含するカリウムイオ
ン測定法をより詳細に記載する。カリウムイオンの測定
のために、液体例えば血漿をアデノシン二燐酸（ＡＤ
Ｐ）、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、還元ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ピル
ベートキナーゼ（ＰＫ）及びラクテートデヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）を含有する緩衝された混合物と共に恒温保
持する。反応時にこの混合物中のＰＫ及びＬＤＨにより
触媒作用をうけるピルビベート及び引続くラクテートの
形成は、まったく、適当なカチオンの存在に依存し、そ
の不在時には、ＰＫはまったく不活性である。ＮＡＤＨ
は、３４０ｎｍで強く吸収し、ＮＡＤは吸収しない。
【００４５】細菌ＰＫにより要求されるマンガンイオン
の存在を包含する分析のために選ばれた条件下で、ＮＡ
ＤＨ酸化の速度は、カリウムイオンの濃度に比例する
（例Ａ〜Ｃ参照）。
【００４６】このような条件下では次の反応が起る：
【００４７】
【化１】
【００４８】反応（１）の速度は、系中のカリウムイオ
ン濃度により測定され、これは反応（２）の速度も制限
する。これらの反応の速度を測定することのできる方法
はいくつもある。標準的な方法は、反応（２）における
ＮＡＤＨの消失速度の分光光度測定である。ＮＡＤＨは
３４０ｎｍで強く吸収し、ＮＡＤは吸収しない。従っ
て、３４０ｎｍ（又は代りの波長）での反応混合物の吸
収の低落は、反応の速度の直接測定を提供し、これから
混合物中に存在するカリウムイオンの濃度を引き出すこ
とができる。双方の反応（１）及び（２）Ｈ+を消費
し、従って、反応混合物のプロトン濃度を低下する事実
も採用できる。プロトン濃度の低下速度はｐＨメーター
を用いて又は、滴定法を用いて測定することができる。
後者の場合に、使用緩衝液の濃度は、分光光度法におけ
るよりも低い。他の装置例えば蛍光光度計又は発光光度
計も、ピルベートキナーゼの活性を検査するために使用
することができる。
【００４９】ＰＫ活性と関連しているピルベートの蓄積
を測定する他の多くの方法が存在する。これには、無機
燐酸塩又は消費された酸素又は過酸化水素；燐酸アセチ
ル又はピルベートオキシダーゼの酵素作用により発生す
る二酸化炭素を測定する方法、２，４−ジニトロフエニ
ルヒドラジンでのヒドラゾンの形；ピルベートカルボキ
シラーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ又はピルベー
トデヒドゲナーゼの酵素作用の反応成分又は生成物の測
定、フラビン結合系の使用及び基質の微小な濃度を測定
するためのアイソトープ的方法〔Ｍ．Ｎ．Ｂｅｒｒｙ等
によるＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１
８，３４４〜３５２（１９８１）〕が包含される。
【００５０】他の方法例えば炎光光度測定又はイオン選
択性電極測定法を用いても、血清試料２００の検査で良
好な一致が得られた。この方法での重大な干渉は、血清
中に一般に存在するか又は放置時に蓄積するアンモニウ
ムイオンである。アンモニウムイオン干渉の可能性は、
反応混合物中のα−ケトグルタレート（ＫＧ）及びグル
タメートデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の包含により完全
にさけることができる。アンモニウムイオンは、前イン
キュベーション（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）で、次
の反応式により除かれる： ＮＨ4 +＋ＫＧ＋ＮＡＤＨ→グルタメート＋ＮＡＤ+ 溶液中、例えばアンモニウムイオン含分が高い尿中で
は、連結された反応を使用することができる： ＮＨ4 +＋ＫＧ＋ＮＡＤＰ→グルタメート＋ＮＡＤＰ グルコース−６−Ｐ＋ＮＡＤＰ→６−ホスホグルコネー
ト＋ＮＡＤＰＨ この連結された方法は、グルコース−６−ホスフエート
デヒドロゲナーゼを使用する。添加されたグルコース−
６−Ｐ及び−ＫＧを、任意のアンモニウムイオンの過剰
の中に存在させると、すべてのアンモニウムイオンは除
かれ、他方試薬中にＮＡＤＨを保持する。
【００５１】血漿又は血清試料１０μｌを用いて、３７
℃でカリウムイオンを酵素的に測定する主試薬の典型的
濃度範囲は、次のとおりである： ＰＫ（Ｂ．ステアロテルモフイルス） ５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） ０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．０１ｍモル／ｌ〜０．８ｍモル／ｌ 緩衝剤ｐＨ７〜８ ５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ Ｍｎ2+又はＭｇ2+ １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＬｉＣｌ ２ｍモル／ｌ〜１００ｍモル／ｌ ＡＤＰ（遊離酸） ０．５ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＬＤＨ（２５℃で検定） ５０００Ｕ／ｌ〜１０００００Ｕ／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ カリウムイオンに対して敏感な他の例は、グリセロール
デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ等によるＢ．２
３５、１８２０、１９６０）である。グリセロールデヒ
ドロゲナーゼを用いる３７℃でのカリウムイオンの酵素
的測定のための主試薬の典型的濃度範囲は次のとおりで
ある： グリセロールデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌ グリセロール ０．３モル／ｌ〜３モル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ ＮＡＤ ０．１ｍモル／ｌ〜５．０ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ９ ２０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ カリウムイオンに対して敏感な他の酵素はアセトアルデ
ヒドロゲーゼである（Ｓ．Ｂｌａｃｋ，Ａｒｃｈ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３４，８６，１９５
１）。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて３７
℃でカリウムイオンを酵素的に測定するための主試薬の
典型的な濃度範囲は次のとおりである： アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ グリコールアルデヒド ０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ ＮＡＤ ０．０５ｍモル／ｌ〜２．０ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７〜８ ５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ ジチオスレイトール ０．１ｍモル／ｌ〜２ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ アセトアルデヒド（０．０２ｍモル／ｌ〜１ｍモル／
ｌ）をグリコールアルデヒドに換えることもできる。
【００５２】アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、エ
ステラーゼ活性をも示し、従ってカリウムイオン濃度
は、酢酸４−ニトロフエニルからの４−ニトロフエノー
ルの放出をモニターすることにより測定できる。アセト
アルデヒドデヒドロゲナーゼのエステラーゼ活性に基づ
く３７℃でのカリウムイオンの酵素的測定のための主試
薬の典型的濃度範囲は次のとおりである： アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ ４−ニトロフエニルアセテート ０．１ｍモル／ｌ〜２ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．００１ｍモル／ｌ〜０．１ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７〜８ ５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌナトリウムイオンの測定 原理的に、ＰＫを用いるナトリウムイオンの測定は、カ
リウムイオンのそれと同じであるが、特定の重要な差異
が存在する。第１に、ＰＫは、前記のようなインキュベ
ーション条件に応じて、ナトリウムイオンに対するより
もカリウムイオンに対して４０〜１００倍も敏感であ
る。ナトリウムイオンは、血漿中でカリウムイオンの濃
度の約３０倍の濃度で生じるが、後者は、ナトリウムイ
オン測定と干渉することができる。
【００５３】本発明で採用されている一般的な原理によ
れば、リチウムイオンは無視され、ウサギ筋肉からのＰ
Ｋが細菌酵素よりも優れており、マグネシウムイオン
は、マンガンの代りになりうる。１方法では、カリウム
イオンを殊にクリプトフイクス222と結合させＰＫ活性
上へのナトリウムイオンの効果を直接測定する(例Ｅ)。
【００５４】ピルベートキナーゼを用いる３７℃でのナ
トリウムイオンの酵素的測定のための主試薬の典型的な
濃度範囲は次のとおりである： ＰＫ（ウサギ筋肉） ５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） ０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２２ ０．４ｍモル／ｌ〜４ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．０１ ｍモル／ｌ〜０．８ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７〜８ ５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ Ｍｇ2+ １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＡＤＰ（遊離酸） ０．５ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＬＤＨ（２５℃で検定） ５００Ｕ／ｌ〜１０００００Ｕ／ｌ 血清アルブミン １ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ もう１つの方法では、ナトリウムイオンはクリプトフイ
クス２２１からのカリウムイオンで換えられ、放出カリ
ウムイオンは、ＰＫの活性を、ナトリウムイオン濃度に
依存する程度に刺激する（例Ｆ）。
【００５５】クリプトフイクス２２１からのカリウムイ
オンの交換を測定するための、ピルベートキナーゼを用
いる３７℃でのナトリウムイオンの酵素的測定のための
主試薬の典型的な濃度範囲は次のとおりである： ＰＫ（ウサギ筋肉） ５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） ０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．０１ ｍモル／ｌ〜０．８ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ９〜１０ ５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ Ｍｇ2+ １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＬＤＨ（２５℃で測定） ５０００Ｕ／ｌ〜１０００００Ｕ／ｌ ＫＣｌ ２ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ 測定のためのさらに正確で精密な態様は、ナトリウムイ
オン依存性酵素例えばβ−ガラクトシダーゼの使用であ
る（例Ｄ）。
【００５６】血漿を、２−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（ＮＰＧ）と酵素β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼを含有する緩衝混合物と共にインキュベートす
る。β−Ｄ−ガラクトシダーゼによって触媒作用を受け
る反応は、ナトリウムイオンの存在に依存し、活性率
は、ナトリウムイオン濃度の尺度である。この方法の主
要特徴は、ナトリウムイオン濃度が１００ｍモル／ｌを
越える血清または他の生物学的液体中の測定のために、
ナトリウムイオン濃度を減少させ、酵素は通常の分析範
囲（１１０〜１７０ｍモル／ｌ）にあるナトリウムイオ
ン濃度での小さい変化に対して最も敏感になるように適
当量のナトリウムイオン選択性結合剤（例えばクリプト
フイクス２２１）を使用することである。適度に高い濃
度のマグネシウムおよびリチウムイオンの存在を包含す
る分析のために選択された条件下で、２−ニトロフエノ
ールおよびガラクトースの形成率は、実質的に測定され
るナトリウムイオンの濃度に比例する。最適β−ガラク
トシダーゼ活性を得るためにマグネシウムイオンが要求
される。リチウムイオンは、ナトリウムイオンと競争的
であり、それゆえにナトリウムイオンに関する酵素のＫ
ｍを高める。
【００５７】β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対する基質と
しては、多くの他の化合物が好適である。全く一般に
は、ガラクトシダーゼ含有試料を適当なβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ基質と混合し、この基質を酵素によって切断
し、次いで分裂生成物のひとつを適当な方法で検出す
る。酵素の作用により遊離されたグリコンまたはアグリ
コンは測定可能である。大抵、後者を測定する。基質と
して、天然の基質ラクトースを使用できるが、色原性ガ
ラクトシドの使用が特に有利である。このように、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２．，３３３，２０９（１９６０）にはフ
エニル−β−Ｄ−ガラクトシド、同様に、芳香環上で置
換されたさらに別の誘導体、例えばβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの基質としての２−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（ＮＰＧ）および３−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトシドが記載されている。加水分解によって
遊離されるフエノールを、ＵＶ範囲で、またはニトロフ
エノールの場合には短波可視波長範囲で測光法で測定す
る。アミノアンチピリンとの酸化的結合も、指示反応と
して続けることができる（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．４０，２８１（１９７１）参照）。他の基
質は、西ドイツ特許出願公開第３３４５７５８号明細書
及び同第３４１１５７４号明細書に記載されている。
【００５８】血漿または血清の試料１０μｌを使用し、
３７℃におけるナトリウムイオンを酵素的に測定するた
めの主試薬の典型的な濃度範囲は次のとおりである： β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ２５Ｕ／ｌ〜７５００Ｕ／ｌ ＮＰＧ ０．２５ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７〜９．５ ２００ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ Ｍｇ2+ ０．０１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＥＧＴＡ（リチウム塩） ０ｍモル／ｌ〜２０ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＥＧＴＡは、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）
−四酢酸を意味する。従って、ナトリウムとカリウムイ
オンの分析を、酵素的に同じキュベット中で対試験（ｔ
ｗｉｎ ｔｅｓｔ）の形で実施することも可能である
（例Ｇ参照）。
【００５９】カルシウムイオンの測 定 カルシウムイオンの測定のために、血漿試料（または他
の体液）を、ペプチド基質スクシニル−ロイシン−メチ
オニン−ｐ−ニトロアニリドおよび酵素カルパインＩを
含有する緩衝混合物と共にインキュベートする。カルパ
インＩによって触媒作用を受ける反応は、カルシウムイ
オンの存在に左右され、活性度は、カルシウムイオン濃
度の尺度である。この方法の主要特徴は、カルシウムイ
オンの濃度を酵素が最も敏感である範囲まで低下させる
ために特異的にカルシウムイオンと結合することのでき
るキレート化剤の使用である。Ｌ−システインと２−メ
ルカプトエタノールの存在を包含する分析のために選択
された条件下で、ｐ−ニトロアニリン形成率は、実質的
に測定されるカルシウムの濃度に比例する。
【００６０】有利なペプチド基質は、一般式： Ｒ−Ｐｎ−Ｐ2−Ｐ1−Ｘ 〔式中、Ｒはアセチル、ベンゾイル、カルボベンゾキ
シ、スクシニル、ｔ−ブトキシカルボニルまたは３−
（２−フリル）アクリロイルを表わし、Ｐｎ-Ｐ2-Ｐ1は
有利にはＰ1位のＴｙｒ、Ｍｅｔ、ＬｙｓまたはＡｒｇ
およびＰ2位のＬｅｕまたはＶａｌ残基を有する少なく
とも２個の残基のペプチド鎖を表わし、Ｘは酵素の作用
で遊離されて、色及び蛍光の検出可能な変化を生じる色
原性または蛍光原性の基を表わす〕によって記載でき
る。Ｘはニトロフエニル、ナフチルまたはチオベンジル
エステル、同様に芳香族環上にさらに置換基を有するか
または有さないニトロアニリン、ナフチルアミンまたは
メチルクマリン基であってよい。数種の好適なペプチド
誘導体は、Ｔ．ササキ（Ｔ．Ｓａｓａｋｉ）等によっ
て、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５９巻、１２４８９
−１２４９４頁に記載されており、その例はスクシニル
−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＭＣＡ（ＭＣＡ＝４−メチルクマリ
ン−７−アミド）、スクシニル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＭＣ
Ａ、スクシニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｙ−Ｍ
ＣＡおよびｔ−ブトキシカルボニル−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｌｙｓ−ＭＣＡである。さらに合成基質は、ベルグマイ
ヤーＨＵ（Ｅｄ）メソード・オブ・エンザイマテイック
・アナリシス（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ ＨＵ（Ｅｄ）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ）第３版、第５巻、８４〜８５頁（１９８４）に記
載されている。
【００６１】このような測定法および試薬のための化合
物の濃度範囲は次のとおりである： カルパインＩ １０００Ｕ／ｌ〜４００００Ｕ／ｌ＊ Ｓｕｃ-Ｌｅｕ-Ｍｅｔ−ｐ−ニトロアニリド １ｍモル／ｌ〜２０ｍモル／ｌ キレート化剤 ０．０１ｍモル／ｌ〜１ｍモル／ｌ Ｌ−システイン １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ２−メルカプトエタノール １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ 緩衝剤イミダゾール−ＨＣｌ １０ｍモル／ｌ〜１００ｍモル／ｌ ｐＨ ６〜８（有利な範囲７〜７．５） 星印＊は、この単位が基質としてのカゼインと共に３０
℃で３０分間インキュベートした後、７５０ｎｍでの吸
光度を１．０だけ上昇させる酵素量として定義されてい
ることを意味する（Ｎ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａ
ｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，８８８３〜８８
８９，（１９８３）参照）。
【００６２】カルシウムに対する無視しうる結合能力を
有する、要求されるｐＨ範囲にｐｋを有する数種の緩衝
剤を検定に用いることができる。多くのグッド−タイプ
緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｇｏｏｄ ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．５，４６７〜４７７（１９６６））例えばトリス
（Ｔｒｉｓ）、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）、モプソ（ＭＯＰ
ＳＯ）、ベス（ＢＥＳ）、テス（ＴＥＳ）およびイミダ
ゾールがこれらの要求を満たす（例Ｈ参照）。カルパイ
ンＩの代わりにコラーゲナーゼを使用することができ、
ｐＨ６．５〜７．５でＬ−イソロイシル−Ｌ−アナリル
グリシルエチルエステル０．０２ｍモル／ｌ〜０．２ｍ
モル／ｌを用いて蛍光度測定で検定することができる。
【００６３】クロリドイオンの測定 血中のクロリドを測定するために、血漿をシステアミン
０．０１モル／ｌ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ニトロアニリド４
ｍモル／ｌおよびカテプシンＣ０．０２Ｕ／ｍｌを含有
する緩衝混合物と共にインキュベートする。ｐ−ニトロ
アニリンの形成は、完全にクロリドアニオンの存在に依
存する。さらに、ブロミドイオンによる干渉を除去する
ために、または酵素の最適範囲にクロリドイオンの濃度
を合わせるようにクロリドイオンの活性を低下させるた
めに、選択的結合剤を添加することができる。分析のた
めに選択された条件下（例５参照）で、ｐ−ニトロアニ
リンの形成率：
【００６４】
【化２】
【００６５】は、試料中のクロリドイオンの濃度に比例
する。この例では、反応率を４０５ｎｍにおける吸光度
の増加の測定によって測定する。
【００６６】このような測定法の化合物の濃度範囲は次
のとおりである： クエン酸緩衝剤 ０．０１〜０．２モル／ｌ ｐＨ ４〜７（有利に５．０〜５．５） システアミン １〜２０ｍモル／ｌ Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド １〜２０ｍモル／ｌ カテプシンＣ ２〜１００ｍＵ／ｍｌ 所望ｐＨ−範囲内にｐｋを有し、無視しうるクロリド濃
度を有する任意の緩衝剤をこの検定に使用することがで
きる。前記記載の全カテゴリーからの酵素の例（トラン
スフェラーゼ、ヒドラーゼ、オキシドレダクターゼおよ
びリアーゼ）は、特にこれらの酵素源が好塩性生物から
である場合、クロリド依存性を有することが文献中に示
されている。ペプチドタイプの酵素のクロリド依存性
は、広く記載されている。例えばジペプチジルペプチダ
ーゼＩ（カテプシンＣ）、ＥＣ３．４．１４．１（Ｊ．
Ｋｅｎ Ｍｃ Ｄｏｎａｌｄ，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐ
ｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２４（５）
１９６６，７７１ｆ）またはジペプチジルペプチダーゼ
IIIＥＣ．３．４．１４．３（Ｊ．Ｋｅｎ Ｍｃ Ｄｏ
ｎａｌｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２４１（７）１９６６，１４９４ｆ）は、双方と
も、アミノ末端位からのオリゴペプチド誘導体の加水分
解に触媒作用をする。もう一つの例は、アンギオテンシ
ンを変換させる酵素ＥＣ３．４．１５．１であり、これ
は広範囲のオリゴペプチドのカルボキシル末端からジペ
プチドの加水分解的放出に触媒作用をする（Ｐ．Ｂｕｎ
ｎｉｎｇ ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈ．２６，１９８７，
３３７４ｆ；Ｒ．Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈ．２２，１９８３，３８５０ｆ）。
【００６７】Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドの代
わりに、異なる他のジペプチド−またはオリゴペプチド
基質を使用することができる。有利なペプチド基質は、
一般式： Ｒ−Ｐｎ−Ｐ1−Ｘ 〔式中、ジペプチジルペプチダーゼ酵素にはＲ＝Ｈ、お
よびＰｎ−Ｐ1は少なくとも２個の残基のペプチド鎖を
表わす〕で記載される。Ｘは色原性または蛍光原性の基
を表わし、これは色素または蛍光色素での検出可能な変
化をもたらすように酵素作用によって遊離される。Ｘは
ニトロフエニル−、ナフチル−またはチオベンジルエス
テル、同様に芳香族環上にさらに置換基を有するかまた
は有さないニトロアニリン、ナフチルアミンまたはメチ
ルクマリン基であってよい。ジペチジルカルボキシペプ
チダーゼ酵素の場合、Ｘはアミノ末端を表わし、ペプチ
ド鎖の場合はＲは色原性または蛍光原性の基であり、こ
れは酵素の作用によって遊離される。Ｒは、さらに別の
置換基を有するかまたは有さないＮ−２−フランアクリ
ロイル−またはベンゾイル−基であってよい（例１参
照）。
【００６８】クロリドイオンの酵素的測定のもう１つの
例（例Ｊ）として、血漿を４，６−エチリデン（Ｇ7）
−ｐ−ニトロフエニル（Ｇ7）−、Ｄ−マルトヘプタオ
キシド（４，６−エチリデン−Ｇ7ＰＮＰ）（５ｍモル
／ｌ）、α−アミラーゼ（０．６０Ｕ／ｍｌ）およびα
−グルコシダーゼ（＝３０Ｕ／ｍｌ）を含有する緩衝混
合物と共にインキュベートする。ｐ−ニトロフエノール
の形成は、完全にクロリドアニオンの存在に依存し、再
び前稀釈、少量の試料または酵素の最適範囲までクロリ
ドイオン濃度を調整するための選択的結合剤を使用す
る。この試験原理を次にまとめ、反応率は、４０５ｎｍ
における吸光度の上昇の測定によって測定する。
【００６９】
【化３】
【００７０】このような測定のために使用される化合物
の濃度範囲は次のとおりである。
【００７１】 ヘペスまたはクロリド不含緩衝剤 ０．０１〜０．５ｍモル／ｌ ｐＨ ６．５〜７．５ α−アミラーゼ ６０〜６０００Ｕ／ｌ α−グルコシダーゼ ３０００〜３０００００Ｕ／ｌ ４，６−エチリデン−Ｇ7ＰＮＰ ０．５〜１０ｍモル／ｌ カテプシンＣに関する前記記載の検定変法（例１）を例
Ｊにも適用する。
【００７２】重金属イオンの測定 これらの金属は、クリプタンド例えばクリプトフイクス
２２１およびクリプトフイクス２２２に強く結合する。
従ってこれらは、より弱く結合されている他の金属と置
換する。容易に置換される金属イオンの一例は亜鉛であ
る。亜鉛イオンは血漿中に非常に低い濃度で存在する。
従って、Ｋ２２１に錯結合した亜鉛イオンを緩衝血清混
合物に添加することは可能である。もし重金属が存在す
るならば、亜鉛イオンは遊離され、それらの存在は、亜
鉛イオンに対して高い感受性の酵素ピリドキサールキナ
ーゼ（羊の脳から）の刺激によって検出できる。多くの
他の同様な競争的な結合検定も可能であり、これらを実
施例に記載するが、これらのみに限定されるものではな
い。
【００７３】重炭酸イオンの測定 重炭酸イオンは、本発明に包含される原理の変法を用い
て測定することができる。多くの配位子、例えばクリプ
タンドはｐＨ感受性で、この特性は、重炭酸塩を測定す
るのに利用できる。本質的な利点としてプロトンを中和
する重炭酸塩の能力が挙げられる。塩酸を添加され、非
常に弱く緩衝された血清試料のｐＨは、重炭酸塩濃度の
関数として変化することが認められる。最終ｐＨ値は、
ｐＨ−感受性イオン結合剤、例えばクリプトフイクス２
２１の存在下に存在遊離ナトリウムイオン（β−ガラク
トシダーゼで検出されるものとして）の量で検出され、
これは本来の重炭酸塩濃度の関数である。本質的に、全
重炭酸塩をヒドロキシルイオンに変換するために等しい
量のＨＣｌ（７５ｍモル／ｌ）で血清を約ｐＨ４．５ま
で酸性にし、次いでイオン選択性酵素例えばβ−ガラク
トシダーゼおよび適当なｐＨ−感受性イオン結合剤を加
えた希トリス緩衝液を用いて、ｐＨ７．５〜７．８で検
定系と反応させる。試料中のナトリウムイオンの量に応
じて補正が必要であるので、正確な結果を得るために試
料のナトリウムイオン濃度を知るべきである。この方法
は、ｐＨ検出薬としての色原体指示薬を用いる方法より
も実質的にさらに敏感である（例Ｋ）。
【００７４】血漿または血清の試料１０μｌを用いる、
３７℃における重炭酸塩の酵素的測定のための主試薬の
典型的濃度範囲は次のとおりである： β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ２５０Ｕ／ｌ〜７５００Ｕ／ｌ ＮＰＧ ０．２５ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０．２ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７．５〜７．８ １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ Ｍｇ2+ ０．０１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＥＧＴＡ（Ｌｉ塩） ０．１ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ナトリウムイオン濃度を補正する必要性は、血漿中にマ
イクロモル濃度で通常存在する微量金属（例えば亜鉛イ
オン）に対して敏感な酵素（例えばピリドキサールキナ
ーゼ）の使用によって避けることができる。微量金属の
結合剤への結合がｐＨ感受性で、クリプトフイクス２２
１に対するナトリウムイオンと同様の親和性を有する場
合、重炭酸イオンは、血漿中に見い出されえる濃度より
十分に過剰で反応混合物中に亜鉛イオンを包含すること
により測定できる。従って内在性亜鉛イオンは干渉しな
い。
【００７５】前記記載の方法は、簡単、非常に迅速、正
確かつ精密であり、高価でない機器を用いて実施でき
る。引火性ガスの実験室的危険性は避けられ、イオン選
択性電極と関係する多くの問題も避けることができる。
この方法は多角的分析を実施する大きい装置を使用する
ように適合させることができるが、なお病床近くでの緊
急用の、高価でない単独装置と共に使用することもでき
る。キットの形にこの方法をおさめることは簡単であ
る。さらに、カリウムおよびナトリウムイオン濃度の測
定を引き続き同一キュベット内で実施することができる
（例Ｇ）。この方法が乾燥化学薬品を使用する機械を備
えた医院にとって有用であることも予期される。これら
の方法は自動分光計を用いて開発されたが、これらは自
動または手動の実験室装置、例えば蛍光光度計、ルミノ
メーター、同位元素カウンター等に容易に適合しうる。
【００７６】
【実施例】次いで、本発明を、血清または血漿試料１０
μｌを基礎とする次の例によりさらに詳述する。これら
の例は説明のために挙げられているのであり、本発明は
これらのみに限定されるものではない。
【００７７】次の例で、少量の試料（血清または血漿の
場合、特に記載のない限り１０μｌ）を緩衝された基質
および特定の共因子を含有する試薬１と混合し、一般に
０．１〜５分間インキュベートする。吸光度の読み取り
は、通常、このインキュベーションの期間中一定の間隔
で行なう。次いでインジケータ酵素を含有する試験２を
添加し、反応を監視する。いくつかの例では、試薬１が
インジケータ酵素を含有し、試薬２が適当な基質を含有
する。例は、試料、試薬１および試薬２を混合した後の
最終反応混合物を示している。
【００７８】例Ａ（参考）ピルベートキナーゼを用い るカリウムイオン濃度の測 定
（ナトリウムイオン結合 剤なし、ナトリウムイオン 濃度
未知） 最終インキュベーション混合物は次のものを含有する： トリス−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．４ １７５ｍモル／ｌ Ｌｉ+〔ＬｉＯＨ１７ｍモル／ｌ、ＬｉＣｌ ３ｍモル／ｌ〕 ２０ｍモル／ｌ ＭｎＣｌ2 ３．０ｍモル／ｌ ＡＤＰ（遊離酸） ２．６ｍモル／ｌ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） ２．９ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．４ｍモル／ｌ ＬＤＨ（２５℃で検定） １７０００Ｕ／ｌ バチルス・ステアロサーモフイルスからのＰＫ ８９０Ｕ／ｌ ＫＧ ４．０ｍモル／ｌ ＧＤＨ（グリセリン中：２５℃で検定） ８６００Ｕ／ｌ ヒト血清アルブミン １４０ｍｇ／ｌ カリウムイオン標準（較正溶液）は、血漿中に存在する
ナトリウムイオンのピルベートキナーゼ上への刺激的作
用を調整するために、ナトリウムイオン１４０ｍモル／
ｌを含有する。
【００７９】例Ｂ（参考）ピルベートキナーゼを使用 するカリウムイオン濃度の 測
定（ナトリウムイオン結 合剤不含、ナトリウムイオ ン濃
度既知） インキュベーション混合物および較正溶液は例Ａと同じ
である。
【００８０】ナトリウムイオンが１４０ｍモル／ｌを下
まわる（又は上まわる）場合には、ナトリウムイオン濃
度１０ｍモル／ｌにつきカリウム０．１ｍモル／ｌを添
加（または減ずる）することによって混合物のナトリウ
ムイオンに関して補正することができる。しかしなが
ら、この補正は既知のナトリウムおよびカルシウム濃度
を含有する水溶液を分析することによって変えられるべ
きである。
【００８１】例Ｃ（参考）ナトリウムイオン結合剤の 存在下にピルベートキナー ゼ
を用いるカリウムイオン 濃度の測定 例Ｂと同様であるが、ヒト血清アルブミンを除き、媒体
は、付加的に１回の検定当りクリプトフイクス２２１
６μモルを含有する。個々の試料のカリウムイオン含有
量の違いによるクリプトフイクス２２１からのナトリウ
ムイオンの置換の変動を最小限にするために７．８のｐ
Ｈを選択する。
【００８２】例Ｄ β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いるナトリウムイオン濃
度の測定 変法ａ ：最終インキュベーション混合物は次のものを含
有する： トリスＨＣｌ、ｐＨ８．７（３７℃） ３００ｍモル／ｌ ジチオスレイトール ４ｍモル／ｌ 硫酸マグネシウム ７．５ｍモル／ｌ 塩化リチウム １６ｍモル／ｌ ＥＧＴＡ（リチウム塩） ０．４４ｍモル／ｌ ヒト血清アルブミン ４６０ｍモル／ｌ β−ガラクトシダーゼ ７６０Ｕ／ｌ ＮＰＧ １．５ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ １．２５μモル／検定 反応を波長４２０ｎｍ（またはその付近）で監視し遊離
２−ニトロフエノールの形成率および当初試料中のナト
リウムイオンの濃度を測定する。
【００８３】変法ｂ：変法ａと比較したもう１つの方法
は、前稀釈によって試料濃度を１０倍低下させるか、ま
たは少量の試料を用い、この場合はクリプタンドを除去
することができる。
【００８４】変法ｃ：ナトリウムイオン低含有量（例＜
２０ｍモル／ｌ）（この場合にはクリプタンドを排除で
きる）の液体での測定。
【００８５】例Ｅ ピルベートキナーゼを用いるナトリウムイオンの測定
（カリウムイオン感受性を低下させる条件下で、ナトリ
ウムイオンによる酵素活性の直接刺激） 変法ａ ：血漿試料１０μｌに対し、インキュベーション
混合物は次のものを含有する： トリスＨＣｌ、ｐＨ８．７（３７℃） ３００ｍモル／ｌ ＭｇＣｌ2 ５ｍモル／ｌ ＡＤＰ（遊離酸） ２．６ｍモル／ｌ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） ２．９ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．３４ｍモル／ｌ ＬＤＨ（２５℃で検定） １７０００Ｕ／ｌ ＰＫ（ウサギの筋肉から、３７℃で検定） ２０００Ｕ／ｌ ＫＧ ４ｍモル／ｌ グリセリン中のＧＤＨ（２５℃で検定） ８６００Ｕ／ｌ クリプトフイクス２２２ １．２５μモル／検定 ナトリウムイオン較正溶液は、血清カリウムイオンのピ
ルベートキナーゼへのカリウム活性化作用を補償するた
めに、カリウム４ｍモル／ｌを含有する。
【００８６】例Ｆ ピルベートキナーゼを用いるナトリウムイオンの測定
（競争的結合検定）−カリウムイオン既知 血漿試料１０μｌに対し、最終インキュベーション混合
物は次のものを含有する： グリシンｐＨ９．８ ３００ｍモル／ｌ ＭｇＣｌ2 ５ｍモル／ｌ ＡＤＰ（遊離酸） ２．６ｍモル／ｌ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） ２．９ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．３４ｍモル／ｌ ＬＤＨ（２５℃で検定） １７０００Ｕ／ｌ ウサギの筋肉からのＰＫ（３７℃で検定） ８９０Ｕ／ｌ ＫＧ ４ｍモル／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ８５００Ｕ／ｌ ＫＣｌ ５ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ２．５μモル／検定 塩化カリウムをこの試薬に添加し、クリプトフイクス２
２１から化学量論的にナトリウムイオンによって置換
し、こうして、試料のナトリウムイオン濃度を、定量さ
れるようにする。
【００８７】例Ｇ 同一キュベット中でのカリウムおよびナトリウムイオン
濃度の測定（対試験） 検定試薬か次のものを含有する以外、まず、ナトリウム
イオン濃度を例Ｄと同様に検定する： ＡＤＰ（遊離酸） ２．６ｍモル／ｌ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） ２．９ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．４ｍモル／ｌ ＫＧ ４．０ｍモル／ｌ ＧＤＨ ８６００Ｕ／ｌ 反応率の測定によるナトリウムイオンの測定に引続き、
インキュベーション混合物のｐＨを少量の塩酸でｐＨ
７．４に低下させる。
【００８８】次いで、指示最終濃度を達成するために次
の成分を添加する： ＬＤＨ １７０００Ｕ／ｌ バチルス・ステアロサーモフイルスからのＰＫ ８９０Ｕ／ｌ ＭｎＣｌ2 ３．０ｍモル／ｌ ＬｉＣｌ ２０．０ｍモル／ｌ その後、反応率を３４０ｎｍで監視することができる
が、ナトリウムイオン指示反応で遊離される２−ニトロ
フエノールによる可能な干渉を最小にするために少し高
い波長で測定することもできる。
【００８９】例Ｈ カルパインＩを用いるカルシウムイオン濃度の測定 この実験では、血漿を得るために少量の血液を遠心分離
する。カルシウムイオンの測定のために、試料をイミダ
ゾール−ＨＣｌ緩衝剤（ｐＨ７．３）５０ｍモル／ｌ、
Ｌ−システイン５ｍモル／ｌ、２−メルカプトエタノー
ル２．５ｍモル／ｌ、ＥＧＴＡ０．１ｍモル／ｌ、Ｓｕ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ｐ−ニトロアニリド５ｍモル／ｌ
を含有する混合物と共に３０℃でインキュベートする。
４０５ｎｍでの吸光度の増加を、５分間隔で監視した。
この率は試料のカルシウムイオン濃度に比例する。
【００９０】例Ｉ カテプシンＣを用いるクロリドイオン濃度の測定 この実験では、血漿（５μｌ）を得るために少量の血液
試料を遠心分離する。クロリドイオンの測定のために、
インキュベーション混合物はクエン酸緩衝液（ｐＨ５．
０）０．０５モル／ｌ、システアミン１０ｍモル／ｌ、
Ｇｌｙ−ＡｒＧ−ｐ−ニトロアニリド４ｍモル／ｌおよ
びカテプシンＣ０．０１Ｕ／ｍｌを含有する。後者はク
ロリドイオンを除去するために、リン酸ナトリウム緩衝
剤（ｐＨ６．８）１０ｍモル／ｌおよび４３％（ｖ／
ｖ）のグリセリンに対して透析されている。この方法で
得られた典型的な較正曲線を第１図に示す。
【００９１】例Ｊ α−アミラーゼを用いるクロリドイオン濃度の測定 血漿試料５μｌに対して阻害混合物は次のものを含有す
る： ヘペスまたは択一的クロリド不含緩衝液 １００ｍモル／ｌ ｐＨ ７．１ α−アミラーゼ ６００Ｕ／ｌ α−グルコシダーゼ ３００００Ｕ／ｌ ４，６−エチリデン−Ｇ7ＰＮＰ ５ｍモル／ｌ 反応を波長４０５ｎｍ（またはその付近）で監視し、遊
離４−ニトロフエノールの形成率およびこれに伴う当初
試料中のクロリドイオン濃度を測定する。
【００９２】例Ｋ β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる重炭酸イオン濃度の
測定 変法ａ ：最終インキュベーション混合物は次のものを含
有する： トリスＨＣｌ、ｐＨ７．８（３７℃） ５ｍモル／ｌ ジチオスレイトール ４ｍモル／ｌ 硫酸マグネシウム ７．５ｍモル／ｌ 塩化リチウム １６ｍモル／ｌ ＥＧＴＡ（リチウム塩） ０．４４ｍモル／ｌ ヒト血清アルブミン ４６０ｍｇ／ｌ β−ガラクトシダーゼ １５００Ｕ／ｌ ＮＰＧ １．５ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ２．０μモル／検定 ＥＧＴＡはエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四
酢酸を意味する。試料を、そのｐＨ値を４．５に低下す
るために当量のＨＣｌ（血漿に対し７５ｍモル／ｌ）と
共に予めインキュベートする。その後、反応を波長４２
０ｎｍ（またはその付近）で監視し、遊離２−ニトロフ
エノールの形成率、およびそれに伴う当初試料中の重炭
酸イオン濃度を測定する。当初試料中のナトリウムイオ
ン濃度に関して補正を行なった。
【００９３】変法ｂ：ピリドキサールキナーゼ、ピリド
キサールおよび亜鉛イオンをβ−ガラクトシダーゼおよ
びＮＧＰに換える。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年５月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 液体中のナトリウムイオンを測定する
方法及びそのための組成物
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物学的及び非生物学
的液体中のナトリウムイオン（以後これを分析質とも称
する）を測定する方法及び試薬に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】更に、クロリドに関しては、多くの光電法
及び滴定法があり、例えばそれには次のものが包含され
る： −ジフエニルカルバゾン錯体を経る遊離Ｈｇ２＋イオン
の滴定 −水銀錯体の解離後にＨｇＣｌ２の沈殿により形成され
る鉄のローダニド錯体の比色測定（Ｓｋｅｇｇｓ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｃｈｅｍ．１０，１９６４，９１８ｆ；Ｓｃｈｍ
ｉｄｔ，Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ Ｐｈａｒｍ１２４
（９），１９８５．５２７ｆ） −相応する水銀塩からのクロラニル酸の比色測定［Ｒｅ
ｕｓｃｈｌｅｒ；Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆ
ｔ ４０，４８９（１９６２）］ −無色水銀塩からのジエチルジチオカルバミン酸の着色
Ｃｕ２＋錯体の測定（西ドイツ特許出願公開第２１３７
１４６号） −同様に、水銀錯体の解離による着色金属錯体の形成に
基づく、より一般的なＴＰＴＺ−法（トリピリジル−ｓ
−トリアジン；Ｒ．Ｆｒｉｅｄ．Ｚｅｉｔｓｈｒ．Ｋｌ
ｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｋｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈ．１０，１９７
２，２８０ｆ；西ドイツ特許出願公開第２１５３３８７
号）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】カルシウム測定の最も初期の方法の１つ
は、テイスダル（Ｔｉｓｄａｌｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．６３，４６１〜４６５，１９２５）により文献に
記載されており、ここでは、カルシウムを蓚酸（それ自
体は比色法で評価される）で沈殿させている。この方法
は、遠心分離工程を包含し、従って、非常に時間を要
し、カルシウムに対して特異的ではなく、試料の注意深
い取扱いに依存する。この方法は、滴定による及び直接
の比色法により多くの研究室で成巧している。前者は、
複雑かつ煩雑な方法の欠点をも有し、多大の試料量を必
要とする。後者の方法では、カルシウムは色素例えば光
度計中で測定できるオルトクレゾールフタレイン・コン
プレキソンの色に悪影響を及ぼす。この方法の簡単性に
基づき、これ自体、臨床研究室での自動化をもたらす。
しかしながら、この方法は、攻撃的な高アルカリ性溶液
及び毒性物質の使用を包含している。これは、特に多く
の血清成分例えば脂質、蛋白質、燐酸塩及びビリルビン
により干渉される傾向があり、結果として原子吸収及び
炎比色法とは良好に適合しない。この比色法のもう１つ
の欠点は、較正曲線が非直線性であり、色がかなり温度
に依存することである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】Ｗ．Ｈ．アウトロウ（Ｏｕｔｌａｗ）及び
Ｏ．Ｈ．ローリィ（Ｌｏｗｒｙ）によるアナリテイカル
・ビオケミストリィ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）９２，３７０〜３７４（１９７９）
には、組織中のカリウムイオンを測定するための酵素介
在検定が記載されている。この方法では、カリウムイオ
ン及びナトリウムイオンにより活性化される（前者は４
０倍以上も有効）ウサギ筋肉からのビルベートキナーゼ
を使用する。この非特異性に基づき、この方法は、カリ
ウムが主要カチオンである植物物質には好適であるが、
３０倍過剰のナトリウムイオンを含有する血清のような
体液中での測定には不適当である。従って、ナトリウム
イオンは、ローリイ（Ｌｏｗｒｙ）等による酵素的比色
法を血漿又は血清中のカリウムを測定するために使用す
る際には、認容できない干渉を起こさせる。もう１つの
問題は、アンモニウムイオンがカリウムイオンに類似の
活性化を与えることである。前記文献は、生物学的液体
例えば血清中のカリウムイオンの分析に関連するこれら
の臨床的問題を処理又は解決をせず、ナトリウムイオン
の測定のための何の方法も提供しない。欧州特許出願
（ＥＰ）第０２７５３９８号によれば、失活されたα−
アミラーゼを用いるクロリドの測定が達成されている。
Ｍ．Ｃ．Ｗｉｍｍｅｒ等のＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３２
巻、Ｎｏ．４（１９８６）には、マグネシウムの測定法
が記載されている。しかしながら、この方法では他のイ
オンによる妨害をさけることはできない。西ドイツ特許
出願（ＤＥ）第３６１４４７０号明細書中には、他のイ
オン例えばナトリウムイオンによる重大な妨害なしに血
清中のカリウムを測定する方法に関する記載は欠けてい
る。Ｉ．Ｆ．Ｄａｌｍｏｎｏｖａ及びＮ．Ｎ．Ｕｇａｒ
ｏｖａによるＪ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．ｏｆ ＵＳＳＲ
（１９８０）３５巻、Ｎｏ．８、第２部１０４２〜１０
８１には、ベリリウム、亜鉛及び水銀等のいくつかのイ
オンの酵素に対する一般的記載が包含されているが、こ
れらのどの方法も、実際に作動したかは明示されてはい
ない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】重要な要素は、適当な補酵素の選択を包含
する至適条件を、分析質の促進性又は阻害性作用が実質
的に干渉イオンのそれより実質的に大きいように選ぶこ
とである。更に、分析酵素の活性への分析質及び干渉イ
オンの作用が付加的であり、従って干渉イオンの濃度が
公知の場合には、分析質の濃度が差によって容易に測定
できる。干渉イオンが分析液体中に相対的に一定の濃度
で生じる場合には、標準（較正）液中の干渉イオンの適
当な濃度を包含することにより、これは酌量できる。こ
のような分析質を検定するための他の方法は、分析質が
結合剤から他のイオンを置換し、その放出イオンの適当
な酵素の活性への作用を測定する、競争的結合検定の使
用である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】ペプチドヒドロラーゼ、例えばシスティン
又はチオール依存性プロティナーゼ〔その詳細な例は、
カルパイン（Ｃａｌｐａｉｎ）Ｉ及びＩＩ（即ち、カル
シウム活性化中性プロテアーゼと称される）である〕
も、ササキ（Ｓａｓａｋｉ）等によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５９，１２４８９〜１２４９４（１９８４）
に記載されている。後者の酵素は、種々の動物組織例え
ばラッテの肝臓及び腎臓、ヒト及び豚の赤血球、牛の脳
及びウサギの骨格筋から、Ａ．キタハラ（Ｋｉｔａｈａ
ｒａ）等によるＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，１７５９〜
１７６６（１９８４）に記載の方法により単離かつ精製
することができる。他の例は、ジペプチジルアミノペプ
チダーゼＩである（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１，カテプ
シンＣ；Ｊ．Ｋｅｎ Ｍｃ Ｄｏｎａｌｄ，Ｂｉｏｃ
ｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎ２４（５），６６，７７１ｆ）。この酵素の他の起
源は、遺伝子組換え技術により得られる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】干渉アニオンを除去するためのマスキング
剤として次の群の化合物も使用することができる：アニ
オンクリプタンド（ａｎｉｏｎｃｒｙｐｔａｎｄｓ）、
ヘテロサイクロフアン（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏｐｈａ
ｎｅｓ）、カタピナンド（ｃａｔａｐｉｎａｎｄｓ）及
び無機金属錯体又は不溶性塩。アニオン錯形成性化合物
の詳細な例は、文献中に記載されており、例えばアザモ
ノ−（ａｚａｍｏｎｏ−）又はアザポリサイクル類（ａ
ｚａｐｏｌｙｃｙｃｌｅｓ）、マクロサイクル性４級テ
トラヘドロン化合物、マクロサイクル性ビス−金属−錯
体、共有結合したルイス酸中心を有するマクロサイクル
類（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ）、プロトン化又はアルキ
ル化された４級クリプタンタンド類又はカタピナンド類
（Ｆ．Ｐ．Ｓｃｈｍｉｄｔｃｈｅｎ，Ｎａｃｈｒｉｃｈ
ｔｅｎ Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．ｌａｂ．３６（１），１
９８８，８．８ｆ；Ｅ．Ｇｒａｆ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．９８（２０），１９７６，６４０３ｆ；
Ｃ．Ｈ．Ｐａｒｋ Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ・Ｓｏｃ．
９０（９），１９６８，２４３１ｆ）並びに例えばＦｅ
（ＩＩＩ）のヘキサクロロ錯体又は硝酸銀である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】結合剤の機能：これら結合剤は次の目的の
ために使用される： １． 干渉イオンの選択的結合 ２． 試料の稀釈が不可能な場合、分析質の濃度を最適
測定レベルまで低下させる ３． 本発明の態様は、結合剤が存在し、インジケータ
イオン（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｏｎｓ）と錯体を形成
し（この錯体からインジケータイオンは化学量論的に分
析質イオンで換えられる）、この置換されたインジケー
タイオンの酵素活性への影響を検定し、この際、分析質
イオンの濃度の間接測定法が得られる。例えば、このよ
うな方法において、酵素はピルベートキナーゼであり、
インジケータイオンはカリウムであり、結合剤はクリプ
トフイクス（ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ）２２１であり、被測
定イオンはナトリウムであるか又は酵素はキナーゼであ
り、インジケータイオンはＭｇ２＋であり、結合剤はキ
レート化剤例えばＥＤＴＡであり、イオンは金属である
か又は酵素はピリドキサルキナーゼであり、インジケー
タイオンはＺｎ２＋であり、結合剤はクリプトフイクス
２２１であり、イオンは重金属であるか又は酵素はα−
アミラーゼであり、結合剤はＡｇ又はＨｇであり、被測
定イオンはクロリドであるか又は酵素はコラゲナーゼ、
結合剤はキレート化剤例えばＥＤＴＡであり被測定イオ
ンはカルシウムである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】血漿ナトリウムイオン濃度を測定するもう
１つの方法では、ナトリウムイオンがクリプトフイクス
２２１からのカリウムイオンを置換することができ、放
出されたカリウムは、血漿ナトリウムイオン濃度に比例
してピルベートキナーゼの活性を刺激する（例Ｆ）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５９】カルシウムイオンの測定（参考） カルシウムイオンの測定のために、血漿試料（または他
の体液）を、ペプチド基質スクシニル−ロイシン−メチ
オニン−ｐ−ニトロアニリドおよび酵素カルパインＩを
含有する緩衝混合物と共にインキュベートする。カルパ
インＩによって触媒作用を受ける反応は、カルシウムイ
オンの存在に左右され、活性度は、カルシウムイオン濃
度の尺度である。この方法の主要特徴は、カルシウムイ
オンの濃度を酵素が最も敏感である範囲まで低下させる
ために特異的にカルシウムイオンと結合することのでき
るキレート化剤の使用である。Ｌ−システインと２−メ
ルカプトエタノールの存在を包含する分析のために選択
された条件下で、ｐ−ニトロアニリン形成率は、実質的
に測定されるカルシウムの濃度に比例する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６３】クロリドイオンの測定（参考） 血中のクロリドを測定するために、血漿をシステアミン
０．０１モル／ｌ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ニトロアニリド４
ｍモル／ｌおよびカテプシンＣ０．０２Ｕ／ｍｌを含有
する緩衝混合物と共にインキュベートする。ｐ−ニトロ
アニリンの形成は、完全にクロリドアニオンの存在に依
存する。さらに、プロミドイオンによる干渉を除去する
ために、または酵素の最適範囲にクロリドイオンの濃度
を合わせるようにクロリドイオンの活性を低下させるた
めに、選択的結合剤を添加することができる。分析のた
めに選択された条件下（例５参照）で、ｐ−ニトロアニ
リンの形成率：
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７２】重金属イオンの測定（参考） これらの金属は、クリプタンド例えばクリプトフイクス
２２１およびクリプトフイクス２２２に強く結合する。
従ってこれらは、より弱く結合されている他の金属と置
換する。容易に置換される金属イオンの一例は亜鉛であ
る。亜鉛イオンは血漿中に非常に低い濃度で存在する。
従って、Ｋ２２１に錯結合した亜鉛イオンを緩衝血清混
合物に添加することは可能である。もし重金属が存在す
るならば、亜鉛イオンは遊離され、それらの存在は、亜
鉛イオンに対して高い感受性の酵素ピリドキサールキナ
ーゼ（羊の脳から）の刺激によって検出できる。多くの
他の同様な競争的な結合検定も可能であり、これらを実
施例に記載するが、これらのみに限定されるものではな
い。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７３】重炭酸イオンの測定（参考） 重炭酸イオンは、本発明に包含される原理の変法を用い
て測定することができる。多くの配位子、例えばクリプ
タンドはｐＨ感受性で、この特性は、重炭酸塩を測定す
るのに利用できる。本質的な利点としてプロトンを中和
する重炭酸塩の能力が挙げられる。塩酸を添加され、非
常に弱く緩衝された血清試料のｐＨは、重炭酸塩濃度の
関数として変化することが認められる。最終ｐＨ値は、
ｐＨ−感受性イオン結合剤、例えばクリプトフイクス２
２１の存在下に存在遊離ナトリウムイオン（β−ガラク
トシダーゼで検出されるものとして）の量で検出され、
これは本来の重炭酸塩濃度の関数である。本質的に、全
重炭酸塩をヒドロキシルイオンに変換するために等しい
量のＨＣｌ（７５ｍモル／ｌ）で血清を約ｐＨ４．５ま
で酸性にし、次いでイオン選択性酵素例えばβ−ガラク
トシダーゼおよび適当なｐＨ−感受性イオン結合剤を加
えた希トリス緩衝液を用いて、ｐＨ７．５〜７．８で検
定系と反応させる。試料中のナトリウムイオンの量に応
じて補正が必要であるので、正確な結果を得るために試
料のナトリウムイオン濃度を知るべきである。この方法
は、ｐＨ検出薬としての色原体指示薬を用いる方法より
も実質的にさらに敏感である（例Ｋ）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７７】次の例で、少量の試料（血清または血漿の
場合、特に記載のない限り１０μｌ）を緩衝された基質
および特定の共因子を含有する試薬１と混合し、一般に
０．１〜５分間インキュベートする。吸光度の読み取り
は、通常、このインキュベーションの期間中一定の間隔
で行なう。次いでインジケータ酵素を含有する試薬２を
添加し、反応を監視する。いくつかの例では、試薬１が
インジケータ酵素を含有し、試薬２が適当な基質を含有
する。例は、試料、試薬１および試薬２を混合した後の
最終反応混合物を示している。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８９】例Ｈ（参考） カルバインＩを用いるカルシウムイオン濃度の測定 この実験では、血漿を得るために少量の血液を遠心分離
する。カルシウムイオンの測定のために、試料をイミダ
ゾールーＨＣｌ緩衝剤（ｐＨ７．３）５０ｍモル／ｌ、
Ｌ−システイン５ｍモル／ｌ、２−メルカプトエタノー
ル２．５ｍモル／ｌ、ＥＧＴＡ０．１ｍモル／ｌ、Ｓｕ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ｐ−ニトロアニリド５ｍモル／１
を含有する混合物と共に３０℃でインキュベートする。
４０５ｎｍでの吸光度の増加を、５分間隔で監視した。
この率は試料のカルシウムイオン濃度に比例する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９０】例Ｉ（参考） カテプシンＣを用いるクロリドイオン濃度の測定 この実験では、血漿（５μｌ）を得るために少量の血液
試料を遠心分離する。クロリドイオンの測定のために、
インキュベーション混合物はクエン酸緩衝液（ｐＨ５．
０）０．０５モル／ｌ、システアミン１０ｍモル／ｌ、
Ｇｌｙ−ＡｒＧ−ｐ−ニトロアニリド４ｍモル／１およ
びカテプシンＣ０．０１Ｕ／ｍｌを含有する。後者はク
ロリドイオンを除去するために、リン酸ナトリウム緩衝
剤（ｐＨ６．８）１０ｍモル／ｌおよび４３％（ｖ／
ｖ）のグリセリンに対して透析されている。この方法で
得られた典型的な較正曲線を第１図に示す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９１】例Ｊ（参考） α−アミラーゼを用いるクロリドイオン濃度の測定 血漿試料５μｌに対して阻害混合物は次のものを含有す
る： ヘペスまたは択一的クロリド不含緩衝液 １００ｍモル／ｌ ｐＨ ７．１ α−アミラーゼ ６００Ｕ／ｌ α−グルコシダーゼ ３００００Ｕ／ｌ ４，６−エチリデン−Ｇ７ＰＮＰ ５ｍモル／ｌ 反応を波長４０５ｎｍ（またはその付近）で監視し、遊
離４−ニトロフエノールの形成率およびこれに伴う当初
試料中のクロリドイオン濃度を測定する。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９２】例Ｋ（参考） β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる重炭酸イオン濃度の
測定 変法ａ：最終インキュベーション混合物は次のものを含
有する： トリスＨＣｌ、ｐＨ７．８（３７℃） ５ｍモル／ｌ ジチオスレイトール ４ｍモル／ｌ 硫酸マグネシウム ７．５ｍモル／ｌ 塩化リチウム １６ｍモル／ｌ ＥＧＴＡ（リチウム塩） ０．４４ｍモル／ｌ ヒト血清アルブミン ４６０ｍｇ／ｌ β−ガラクトシダーゼ １５００Ｕ／ｌ ＮＰＧ １．５ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ２．０μモル／検定 ＥＧＴＡはエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四
酢酸を意味する。試料を、そのｐＨ値を４．５に低下す
るために当量のＨＣｌ（血漿に対し７５ｍモル／ｌ）と
共に予めインキュベートする。その後、反応を波長４２
０ｎｍ（またはその付近）で監視し、遊離２−ニトロフ
エノールの形成率、およびそれに伴う当初試料中の重炭
酸イオン濃度を測定する。当初試料中のナトリウムイオ
ン濃度に関して補正を行なった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 6807−4Ｂ 1/527 6807−4Ｂ (71)出願人 390009450 ベーリンガー マンハイム ゲゼルシヤフ ト ミツト ベシユレンクテル ハフツン グ ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ ＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ ＭＩＴ Ｂ ＥＳＣＨＲＡＮＫＴＥＲ ＨＡＦＴＵＮＧ ドイツ連邦共和国 マンハイム 31 ザン トホーフエルストラーセ 116 (72)発明者 ベリー， マイクル ナサニール オーストラリア国 エス． エイ． 5050， エデン ヒルズ， ウイーローラ ロード 30 (72)発明者 タウン， マイクル−ハロルド ドイツ連邦共和国 Ｄ−8125 オーベルハ ウゼン ヴアルトシユトラーセ 45 (72)発明者 クレツセ， ゲーオルク−ブルクハルト ドイツ連邦共和国 Ｄ−8122 ペンツベル ク アルプスピツツシユトラーセ ６ (72)発明者 ヘルマン， ウーヴエ ドイツ連邦共和国 Ｄ−8139 ベルンリー ト ヴエターシユタインシユトラーセ ４

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 液体中のイオンを測定するために、酵素
    活性へのこれらイオンの影響を測定することを特徴とす
    る、液体中のイオンの測定法。
  2. 【請求項２】 液体は、生物学的又は非生物学的液体で
    ある、請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】 生物学的液体は血液、血清、血漿、尿、
    汗、脳髄液、リンパ又は腸分泌液、滲出液又は浸出液で
    あり、非生物学的液体は水又は水性抽出液又は混合物で
    ある、請求の範囲第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 酵素はトランスフェラーゼ、ヒドロラー
    ゼ、オキシドレダクターゼ又はリアーゼである、請求の
    範囲第１項から第３項までのいずれか１項に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 トランスフェラーゼは、移送性燐含有群
    であり、ヒドラーゼはグリコシダーゼであるか又はペプ
    チド結合への作用物である、請求の範囲第４項記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 ヒドラーゼはα−又はβ−Ｄ−ガラクト
    シダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、コラゲナーゼ、
    アミラーゼ、カルパインＩ、カルパインII、ジペプチジ
    ルアミノペプチダーゼＩ（カテプシンＣ）又はホスホグ
    リコレートホスファターゼである、請求の範囲第５項記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 トランスフェラーゼはピルベートキナー
    ゼ、ヘキソキナーゼ、アデニレートキナーゼ、ピリドキ
    サールキナーゼ又はアセテートキナーゼであり、ヒドロ
    ラーゼはα−又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ又はカルボ
    キシペプチダーゼＡである、請求の範囲第５項に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 オキシドレダクターゼは、ドナー分子の
    ＣＨ−ＯＨ基又はドナーのアルデヒド又はオキソ基への
    作用物である、請求の範囲第７項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 オキシドレダクターゼはグリセロールデ
    ヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ又
    はチロシナーゼ（カテコールオキシダーゼ）である、請
    求の範囲第７項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 リアーゼは炭素−炭素リアーゼ又は炭
    素−酸素リアーゼである、請求の範囲第４項に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 リアーゼは、アルドラーゼ又はカルボ
    ニックアンヒドラーゼである、請求の範囲第９項に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 イオンは、ナトリウム、カルシウム、
    マグネシウム、マンガン、リチウム、鉛、亜鉛、銅、鉄
    又は他の重金属イオン又は陽子、重炭酸、クロリド、ア
    ンモニウム又はアンモニウムになりうる物質よりなる非
    金属イオンである、請求の範囲第１項から第１１項まで
    のいずれか１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 干渉イオンを結合剤でマスキングす
    る、請求の範囲第１項から第１１項のいずれか１項に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 試料の稀釈が可能でない場合には、被
    測定イオンを結合剤を用いて測定に最適のレベルまで濃
    度を低下させる、請求の範囲第１項から第１２項までの
    いずれか１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 酵素ピルベートキナーゼ又はβ−Ｄ−
    ガラクトシダーゼを用いて、ナトリウムイオンを測定す
    る、請求の範囲第１項から第１４項までのいずれか１項
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】 干渉イオン又は分析質をクリプタン
    ド、コロナンド、ポタンド、クラウンエーテル、スフェ
    ランド、ヘミスフェランド、カリキサレンおよびこれら
    の組合せ物、天然産イオノフオレ、環状ペプチド、コン
    プレクソンおよびキレート化剤およびそれらの誘導体、
    周期律表第１ｂ族および第２ｂ族の金属と結合させる、
    請求の範囲第１３項又は第１４項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ナトリウムイオンの測定の際には、干
    渉カリウムイオンをクリプトフイクス２２２と結合させ
    る、請求の範囲第１１から第１６項までのいずれか１項
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】 β-ガラクトシダーゼを用いるナトリ
    ウムイオンの測定時に、遊離ナトリウムイオンの濃度を
    結合剤を用いて低下させる、請求の範囲第１４項記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 結合剤はクリプトフイクス２２１であ
    る、請求の範囲第１４項記載の方法。
  20. 【請求項２０】 インジケータイオンと錯体を形成し、
    これからインジケータイオンが被測定分析質であるイオ
    ンにより化学量論的に換えられる請求項１６による結合
    剤を存在させ、酵素活性に対する換えられたインジケー
    タイオンの影響を検定し、この際、分析質の濃度を間接
    的に測定する、請求の範囲第１４項記載の方法。
  21. 【請求項２１】 酵素はピルベートキナーゼであり、イ
    ンジケータイオンはカリウムであり、結合剤はクリプト
    フイクス２２１であり、被測定イオンはナトリウムであ
    る、請求の範囲第２０項記載の方法。
  22. 【請求項２２】 酵素はキナーゼであり、インジケータ
    イオンはＭｇ2+であり、結合剤はキレート化剤であり、
    イオンは金属である、請求の範囲第２０項記載の方法。
  23. 【請求項２３】 酵素はピリドキサールキナーゼであ
    り、インジケータイオンはＺ2+であり、結合剤はクリプ
    トフイクス２２１であり、イオンは重金属である、請求
    の範囲第２２項記載の方法。
  24. 【請求項２４】 被測定イオンが、ｐＨ値で変化を起こ
    し、これが錯体からのインジケータイオンをｐＨ−感受
    性結合剤で換える、請求の範囲第２０項記載の方法。
  25. 【請求項２５】 酵素はβ−ガラクトシダーゼであり、
    ｐＨ−感受性結合剤はクリプトフイクス２２１であり、
    インジケータイオンはナトリウムであり、被測定イオン
    は重炭酸イオンである、請求の範囲第２４項記載の方
    法。
  26. 【請求項２６】 酵素はα−アミラーゼ又はカテプシン
    Ｃであり結合剤はＡｇ又はＨｇであり、被測定イオンは
    クロリドである、請求の範囲第１４項及び第１６項のい
    ずれか１項記載の方法。
  27. 【請求項２７】 酵素はコラゲナーゼ又はカルパインＩ
    又はカルパインIIであり、結合剤はキレート化剤であ
    り、被測定イオンはカルシウムである、請求の範囲第１
    ４項及び第１６項のいずれか１項記載の方法。
  28. 【請求項２８】 感受性インジケータ酵素の競争的阻害
    剤であるイオンを検定に包含する、請求の範囲第１項か
    ら第１３項までのいずれか１項記載の方法。
  29. 【請求項２９】 被測定イオンはナトリウムであり競争
    的阻害剤はリチウムイオンである、請求の範囲第２８項
    記載の方法。
  30. 【請求項３０】 活性がイオンによって影響される酵素
    よりなる液体中のイオンを測定するための組成物。
  31. 【請求項３１】 活性がイオンにより影響される酵素、
    液体中の干渉イオンを結合するか又は、分析質イオンの
    濃度を測定に最適のレベルまで低める結合剤より成る、
    請求の範囲第３０項記載の液体中のイオンを測定するた
    めの組成物。
  32. 【請求項３２】 ピルベートキナーゼ及びクリプタンド
    よりなるナトリウムイオン測定のための、請求の範囲第
    ３１項記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 クリプタンドはクリプトフイクス２２
    ２である、請求の範囲第３２項記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 β−Ｄ−ガラクトシダーゼ及びクリプ
    タンドよりなる、ナトリウムイオン測定のための、請求
    の範囲第３１項記載の組成物。
  35. 【請求項３５】 クリプタントはクリプトフイクス２２
    １である、請求の範囲第３４項記載の組成物。
  36. 【請求項３６】 ＰＫ（Ｂ．ステアロテルモフイルス） ５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） ０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．０１ｍモル／ｌ〜０．８ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７−８ ５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ Ｍｎ2+又はＭｇ2+ １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＬｉＣｌ ２ｍモル／ｌ〜１００ｍモル／ｌ ＡＤＰ（遊離酸） ０．５ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＬＤＨ（２５℃で検定） ５０００Ｕ／ｌ〜１０００００Ｕ／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
  37. 【請求項３７】 グリセロールデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌ グリセロール ０．３ｍモル／ｌ〜３ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ ＮＡＤ ０．１ｍモル／ｌ〜５．０ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ９ ２０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
  38. 【請求項３８】 アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ グリコールアルデヒド ０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ ＮＡＤ ０．０５ｍモル／ｌ〜２．０ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７−８ ５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ ジチオスレイトール ０．１ｍモル／ｌ〜２ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
  39. 【請求項３９】 アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ ４−ニトロフエニルアセテート ０．１ｍモル／ｌ〜２ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．００１ｍモル／ｌ〜０．１ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７−８ ５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ ジチオスレイトール ０．１ｍモル／ｌ〜２．０ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
  40. 【請求項４０】 β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ２５Ｕ／ｌ〜７５００Ｕ／ｌ ＮＰＧ ０．２５ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７−９．５ ２００ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ Ｍｇ2+ ０．０１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＥＧＴＡ（リチウム塩） ０ｍモル／ｌ〜２０ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
  41. 【請求項４１】 ＰＫ（ウサギ筋肉） ５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） ０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＮＡＤＨ ０．０１ｍモル／ｌ〜０．８ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７−１０ ５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌ Ｍｇ2+ １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＡＤＰ（遊離酸） ０．５ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＬＤＨ（２５℃で検定） ５０００ｍモル／ｌ〜１０００００Ｕ／ｌ ＫＣｌ ２ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
  42. 【請求項４２】 カルパインＩ １０００Ｕ／ｌ〜４００００Ｕ／ｌ Ｓｕｃ-Ｌｅｕ-Ｍｅｔ-ｐ-ニトロアニリド １ｍモル／ｌ〜２０ｍモル／ｌ キレート化剤 ０．０１ｍモル／ｌ〜１ｍモル／ｌ Ｌ−システイン １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ２−メルカプトエタノール １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ 緩衝剤、イミダゾール−ＨＣｌ １０ｍモル／ｌ〜１００ｍモル／ｌ ｐＨ ６−８（有利な範囲７−７．５） より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
  43. 【請求項４３】 ヘペス又はクロリド不含の緩衝剤 ０．０１ｍモル／ｌ〜０．５ｍモル／ｌ ｐＨ ６．５〜７．５ α−アミラーゼ ６０Ｕ／ｌ〜６０００Ｕ／ｌ α−グルコシダーゼ ３０００Ｕ／ｌ〜３０００００Ｕ／ｌ ４，６−エチリデン−Ｇ7ＰＮＰ ０．５ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 クエン酸塩緩衝剤 ０．０１ｍモル／ｌ〜０．２ｍモル／ｌ ｐＨ ４−７（有利に：５．０−５．５） システアミン １ｍモル／ｌ〜２０ｍモル／ｌ ｇｌｙ−ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド １ｍモル／ｌ〜２０ｍモル／ｌ カテプシンＣ ２ｍＵ／ｍｌ〜１００ｍＵ／ｍｌ より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
  45. 【請求項４５】 β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ２５０Ｕ／ｌ〜７５００Ｕ／ｌ ＮＰＧ ０．２５ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ クリプトフイクス２２１ ０．２ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ 緩衝剤、ｐＨ７．５−７．８ １ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ Ｍｇ2+ ０．０１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ ＥＧＴＡ（Ｌｉ塩） ０．１ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ 血清アルブミン ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ より成る、請求の範囲第３０項記載の組成物。
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