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DE3855715T2 - Verfahren und Zusammensetzung zum Nachweis von Chlorid-Ionen in Flüssigkeiten - Google Patents

Verfahren und Zusammensetzung zum Nachweis von Chlorid-Ionen in Flüssigkeiten

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DE3855715T2
DE3855715T2 DE3855715T DE3855715T DE3855715T2 DE 3855715 T2 DE3855715 T2 DE 3855715T2 DE 3855715 T DE3855715 T DE 3855715T DE 3855715 T DE3855715 T DE 3855715T DE 3855715 T2 DE3855715 T2 DE 3855715T2
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Georg-Burkhardt Dr. W-8122 Penzberg Kresse
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Flinders University of South Australia
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung von Ionen, im folgenden auch Analyten genannt, in biologischen und nichtbiologischen Flüssigkeiten.
  • Die Erfindung beruht auf der Fähigkeit vieler Analyten, die Aktivität eines sensitiven Enzyms zu stimulieren oder zu hemmen. Die Analyten können Kationen oder Anionen sein, metallisch oder nicht-metallisch, einfach oder zusammengesetzt. In der Praxis ist es häufig so, daß der Analyt in der Probe in einer Konzentration vorliegt, die außerhalb des Empfindlichkeitsbereichs des betreffenden analytischen Indikatorenzyms liegt, oder daß durch die Gegenwart anderer Ionen, auf die das Enzym ebenfalls anspricht, eine Störung verursacht wird. Die Erfindung befaßt sich mit diesen Problemen und löst sie auf verschiedenartige Weise.
  • In der Praxis der klinischen Biochemie sind Messungen von Serumelektrolyten die gebräuchlichsten analytischen Tests, die in Krankenhäusern durchgeführt werden. Diese Messungen sind nicht nur für routinemäßige Untersuchungen erforderlich, sondern häufig bei Notfall- und lebensbedrohenden Situationen, wo die Geschwindigkeit der Analysen von grundlegender Bedeutung ist. Da eine der Hauptursachen für Verzögerungen in Krankenhäusern der Transport der Proben von den Krankenstationen zu den diagnostischen Laboratorien ist, wäre ein Verfahren, das sich in einfacher Weise in der Nähe des Krankenbetts durchführen ließe, in Notfallsituationen von besonderem Wert.
  • Ein gebräuchliches Verfahren zur Analyse von Kalium und Natrium in der Praxis der klinischen Biochemie ist die Flammenphotometrie. Dieses Verfahren beruht auf dem Prinzip, daß bestimmte Atome bei Energiezufuhr durch Wärme angeregt werden und Licht einer charakteristischen Wellenlänge emittieren, wenn sie in den Grundzustand zurückkehren. Die Intensität der charakteristischen Wellenlänge der durch die Atome in der Flamme erzeugten Strahlungsenergie ist direkt proportional zur Anzahl der in der Flamme angeregten Atome, die direkt proportional zur Konzentration der betreffenden Substanz in der Probe ist. Die dazu benötigten Geräte sind kompliziert und relativ aufwendig und erfordern die Verwendung brennbarer Gase.
  • Bei einem alternativen Verfahren, insbesondere für Natrium, Kalium und Chlorid, bedient man sich ionenselektiver Elektroden. Im Idealfall besitzt jede Elektrode eindeutige ionenselektive Eigenschaften, die ein Ansprechen auf nur eine Ionensorte ermöglichen. In der Praxis ist das nicht der Fall, und für alle ionenselektiven Elektroden gibt es störende Ionen. Des weiteren sind ionenspezifische Elektroden nicht absolut spezifisch, obwohl Korrekturen im allgemeinen möglich sind. Die Elektroden messen das Potential, das sich in Gegenwart eines spezifischen Ions entwickelt. Die Instrumentierung ist relativ aufwendig. Keines dieser Verfahren läßt sich spektrophotometrisch durchführen, und deshalb führt der klinische Bedarf an Ionenmessungen dazu, daß die im Handel erhältlichen klinischen Analysengeräte, von denen die meisten in erster Linie für spektrophotometrische Tests ausgelegt sind, erheblich komplizierter werden. Zur erfolgreichen Durchführung erfordern beide Verfahren ein erhebliches Maß an Können und Wissen.
  • Auch bei der routinemäßigen Bestimmung von Chlorid mit Hilfe coulometrischer Verfahren ist eine spezielle Instrumentierung erforderlich. Der Endpunkt bei diesem Titrationsvorgang wird durch eine Zunahme der Sättigung des elektrischen Stromflusses bei der Bildung des unlöslichen Silberchlorid-Produkts erfaßt. Alternativ kann die potentiometrische Bestimmung angewandt werden, die ebenfalls sehr zeitraubend ist und zusätzliche Instrumentierung umfaßt.
  • Für Chlorid gibt es darüber hinaus eine Reihe photometrischer und titrimetrischer Verfahren, zu denen beispielsweise gehören:
  • - die titrimetrische Bestimmung von freien Hg²&spplus;-Ionen über einen Diphenylcarbazon-Komplex;
  • - die kolorimetrische Bestimmung des Rhodanid-Komplexes von Eisen, der sich nach Dissoziation des Quecksilber- Komplexes nach Fällung von HgCl&sub2; bildet [Skeggs, Clin. Chem. 10, 1964, 915f; Schmidt, Zentralblatt Pharm. 124(9), 1985, 527f);
  • - der kolorimetrische Grenzwerttest durch Entfärbung von Silberchromat mit Hilfe eines Überschusses von Chlorid- Ionen [A.J. Courey et al., Clin. Chem. 29, 1593 (1983)];
  • - die kolorimetrische Bestimmung von Chloranilsäure aus dem entsprechenden Quecksilber-Salz [Reuschler, Klm. Wochenschrift 40, 489 (1962)];
  • - die Bestimmung des gefärbten Cu²&spplus;-Komplexes von Diethyldithiocarbaminsäure aus dem farblosen Quecksilber- Salz (deutsche Offenlegungsschrift 21 37 146);
  • - das recht gebräuchliche TPTZ-Verfahren (Tripyridyl-s- triazin) (R. Fried, Zeitschr. Klm. Chem., Klm. Bioch. 10, 1972, 28ºC, Patentanmeldung DE 21 53 387), das ebenfalls auf der Bildung eines gefärbten Metallkomplexes nach Dissoziation eines Quecksilber-Komplexes beruht.
  • Ein großer Nachteil dieser Verfahren ist die Verwendung von Lösungen, die sehr giftige Substanzen enthalten. Einige dieser Verfahren sind kompliziert und ungenau (z.B. das Titrationsverfahren). Viele der Reagenzien sind instabil, und die Kalibrierungskurven sind nichtlinear (z.B. beim Rhodanid-Verfahren). Bei einigen dieser Verfahren ist außerdem eine Vorbehandlung erforderlich, um Störungen durch den Proteingehalt der Probe zu beseitigen.
  • Ein verbessertes TPTZ-Verfahren ist in der PCT-Anmeldung WO 83/002670 beschrieben, doch ist die Verwendung von giftigen Quecksilber-Verbindungen immer noch ein Nachteil. Das einzige kolorimetrische Verfahren ohne Verwendung von Quecksilber-Ionen ist die Bestimmung von Hexachlorokomplexen von Fe(III) in Perchlorsäure-Lösung [F. Hoppe, Ther. Ggw. 110(4), 1971. 554f; H. Mahner, Zeitschr. Klin. Chem., Klin. Biochem 11(11), 1973, 451f; W.T. Law, Clin. Chem. 26(13) 1980, 1874f; US-Patent 4 278 440]. Eine erhebliche Einschränkung dieses Verfahrens liegt in der Verwendung stark saurer Reagenzien, die korrodierend wirken und deshalb für mechanische Pipettiersysteme nicht geeignet sind. Ein weiterer Nachteil ist die Störung durch Bilirubin in den Proben.
  • EP 207 392 offenbart eine nichtenzymatische mehrschichtige Vorrichtung zur Prüfung auf Ionen, wobei die Ansprechreaktion mit Hilfe einer reflektierenden Schicht und gegebenenfalls einer deckenden Schicht erfaßt wird.
  • Calcium ist ein weiteres Beispiel für einen Elektrolyten, der routinemäßig im klinischen Laboratorium bestimmt wird. Die Konzentration dieses Metall-Ions in Körperflüssigkeiten wird innerhalb eines engen Bereichs reguliert. Pathologisch hohe oder niedrige Konzentrationen können zu lebensbedrohenden Störungen wie etwa Niereninsuffizienz, Pankreatitis, Tetanie und Herzversagen durch Blutandrang führen.
  • JP 611 51 460 offenbart eine nichtenzymatische polymere mehrschichtige Ionenprüfvorrichtung zur Messung von Ca- Ionen.
  • Eines der frühesten Verfahren zur Bestimmung von Calcium war das von Tisdall (J. Biol. Chem. 63, 461-465, 1925) beschriebene, bei dem Calcium mit Oxalsäure gefällt wird, die wiederum kolorimetrisch bestimmt wird. Das Verfahren umfaßt einen Zentrifugationsschritt und ist deshalb sehr zeitraubend; es ist nicht für Calcium spezifisch und hängt von einer sorgfältigen Probenbehandlung ab. Vorläufer für dieses Verfahren in zahlreichen Laboratorien waren titrimetrische und direkte kolorimetrische Methoden. Bei der ersteren besteht auch der Nachteil, daß die Arbeitsweise kompliziert und mühselig ist und große Probenvolumina erforderlich sind. Bei letzterer Methode beeinflußt Calcium die Farbe eines Farbstoffs, beispielsweise o-Cresolphthalein-Komplexon, die in einem Photometer gemessen werden kann. Weil dieses Verfahren einfach ist, eignet es sich für die Automatisierung im klinischen Labor. Allerdings werden bei diesem Verfahren aggressive, stark alkalische Lösungen und giftige Substanzen verwendet. Es ist besonders störungsanfällig gegenüber einer Reihe von Serumbestandteilen wie etwa Lipiden, Proteinen, Phosphat und Bilirubin, und infolgedessen verträgt es sich nicht sonderlich gut mit Atomabsorptions- und flammenphotometrischen Vergleichsverfahren. Ein weiterer Nachteil der kolorimetrischen Methode ist, daß die Kalibrierungskurven nichtlinear sind und die Farbe stark temperaturabhängig ist.
  • Bei W.H. Outlaw und O.H. Lowry, Analytical Biochemistry 92, 370-374 (1979), ist ein enzymvermittelter Assay zur Messung von Kalium-Ionen in Geweben beschrieben. Bei diesem Verfahren wird Pyruvatkinase aus Kaninchenmuskeln verwendet, die durch Kalium-Ionen und Natrium-Ionen aktiviert wird, wobei erstere etwa vierzigmal wirksamer sind. Das Verfahren ist unspezifisch, daher kann es für Pflanzenmaterial geeignet sein, in welchem Kalium-Ionen die vorherrschenden Kationen sind, doch ist es ungeeignet für Messungen an Körperflüssigkeiten wie etwa Serum, das einen dreißigfachen Überschuß an Natrium-Ionen enthält. Daher bewirken Natrium-Ionen eine nicht tragbare Störung, wenn die von Outlaw et al. beschriebene enzymatische photometrische Technik zur Messung von Kalium in Plasma oder Serum angewandt wird. Ein weiteres Problem ist, daß Ammonium-Ionen eine ähnliche Aktivierung wie Kalium-Ionen ergeben. Weder geht die vorstehend erwähnte Veröffentlichung auf diese kritischen Probleme im Blick auf die Analyse von Kalium-Ionen in biologischen Flüssigkeiten wie etwa Serum ein oder löst sie, noch wird irgendein Verfahren zur Bestimmung von Natrium-Ionen vorgeschlagen.
  • In der Patentanmeldung EP 0 275 398 wird eine Bestimmung von Chlorid mit einer deaktivierten α-Amylase realisiert.
  • Die EP 0 150 227 offenbart Dipeptid-Derivate für die kolorimetrische oder spektrophotometrische Messung der Aktivität von Carboxypeptidase A.
  • Die DD 0 236 114 offenbart ein Verfahren zum Nachweis bakterieller Verunreinigungen von Alkoholika mit Hilfe einer Peptidase.
  • M.C. Wimmer et al., Clin Chem., Bd. 32, Nr. 4, 1986, beschreiben ein Verfahren zur Bestimmung von Magnesium. Allerdings lassen sich mit Hilfe dieses Verfahrens die Störungen durch andere Ionen nicht vermeiden.
  • In der Patentanmeldung DE 36 14 470 fehlt eine Offenbarung, aus der sich ein Verfahren zur Kalium-Bestimmung in Serum ohne signifikante Störung durch andere Ionen, z.B. Natrium- Ionen ergäbe. I.F. Dalmonova und N.N. Ugarova, J. Anal. Chem. der UDSSR (1980), Bd. 35, Nr. 8, Teil 2, 1042-1081, enthält eine allgemeine Erörterung über die Wirkung gewisser Ionen wie etwa Beryllium, Zink und Quecksilber-Ionen auf gewisse Enzyme, doch findet sich kein Hinweis darauf, daß es erreicht worden wäre, diese Verfahren ohne die Bestandteile der vorliegenden Erfindung funktionieren zu lassen.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren und ein Reagens bereitzustellen, wodurch die vorstehend genannten Probleme vermieden werden. Die Erfindung löst diese Probleme mit Hilfe eines Verfahrens zur Bestimmung von Chlorid-Ionen (Analyten) in Flüssigkeiten, wobei der Einfluß dieser Ionen auf die Aktivität eines Enzyms gemessen wird.
  • Ein zentrales Merkmal dieser Erfindung ist die Verwendung selektiv bindender Agenzien, um die freie Konzentration an Analyt in den optimalen Bereich für das analytische Enzym zu bringen, besonders dann, wenn eine Verdünnung der Flüssigkeit nicht durchführbar ist. Ein weiteres Kennzeichen der Erfindung ist die Verwendung kompetitiver Hemmstoffe für das betreffende analytische Enzym, um dessen Empfindlichkeit gegenüber dem Analyt herabzusetzen, wodurch es möglich wird, diesen in höherer Konzentration zu messen. Dies ist beispielsweise dann besonders nützlich, wenn selektiv bindende Agenzien nicht verfügbar oder unannehmbar teuer sind.
  • Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Verwendung selektiv bindender Agenzien zur Verringerung der freien Konzentration an störenden Ionen auf Werte, bei denen die Störungen nicht mehr ins Gewicht fallen. Auch bedient man sich der Tatsache, daß ein kompetitiver Hemmstoff wirksamer mit störenden Ionen als mit dem Analyt konkurrieren kann, wodurch die Empfindlichkeit des Enzyms gegenüber dem Analyten in Relation zum störenden Ion gesteigert wird.
  • Ein wichtiger Faktor ist die Wahl der optimalen Reaktionsbedingungen, wozu auch die Auswahl eines geeigneten Isoenzyms gehört, so daß die stimulierende oder hemmende Wirkung des Analyten erheblich größer ist als die des störenden Ions. Außerdem sollte die Wirkung des Analyten und der störenden Ionen auf die Aktivität des analytischen Enzyms additiv sein, so daß bei bekannter Konzentration an störenden Ionen die Konzentration an Analyt ohne weiteres anhand der Differenz bestimmt werden kann. Wenn bekannt ist, daß ein störendes Ion mit einer relativ konstanten Konzentration in der zu analysierenden Flüssigkeit vorliegt, so läßt sich dies berücksichtigen, indem Standardlösungen (Eichlösungen) eine geeignete Konzentration an störendem Ion beigegeben wird. Ein weiteres Verfahren zur Prüfung auf derartige Analyten besteht in der Anwendung eines Assays mit kompetitiver Bindung, wobei der Analyt ein anderes Ion aus dem bindenden Agens verdrängt und die Wirkung des freigesetzten Ions auf die Aktivität eines geeigneten Enzyms bestimmt wird.
  • Am besten lassen sich diese allgemeinen Prinzipien anhand ihrer Anwendung auf die Bestimmung von Chlorid-Ionen in Plasma oder Serum ausführlich beschreiben. Sie sind jedoch auf ein breites Spektrum von Ionen anwendbar, zum Beispiel auf Kationen wie etwa Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium, Mangan, Lithium, Blei, Zink, Kupfer, Eisen oder andere Schwermetalle. Beispiele für nichtmetallische meßbare Ionen sind Protonen, Bicarbonat- oder Ammonium-Ionen oder Substanzen, die zur Bildung von Ammonium führen, etwa Harnstoff in Gegenwart von Urease oder Glutamin in Gegenwart von Glutaminase.
    • Geeignete Enzyme
  • Verwendbare Enzyme können zum Beispiel sein (H.J. Evans et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 17, 47; 1966):
  • Transferasen wie phosphorhaltige gruppenübertragende Transferasen. Eine derartige Transferase kann Pyruvatkinase sein. Anstelle von Pyruvatkinase können auch andere Kinasen wie etwa Adenylatkinase oder Hexokinase verwendet werden, die auf Magnesium-Ion oder Mangan(II)-Ion ansprechen. Eine weitere Transferase ist Acetatkinase (aus E. coli). Ein weiteres Beispiel ist Pyridoxalkinase aus Hirn, die auf Zink-Ionen anspricht.
  • Hydrolasen wie Glycosidasen, zum Beispiel α- oder β-D-Galactosidase (aus Escherichia coli), Carboxypeptidase A, (aus Rinderpankreas) Collagenase (aus Clostridium hystolicum), Amylase (aus Speichel oder Pankreas) oder Phosphoglycolatphosphatase.
  • Auch Peptidhydrolasen wie etwa die Cystein- oder Thiol-abhängigen Proteinasen, für welche spezielle Beispiele Calpain I und II sind (auch Calcium-aktivierte neutrale Protease genannt) sind bei Sasaki et al. in J. Biol. Chem. 259, 12489-12494 (1984) beschrieben. Letztere Enzyme lassen sich nach dem Verfahren von A. Kitahara et al., J. Biochem. 95, 1759-1766 (1984), aus einer Vielfalt von tierischen Geweben wie etwa Rattenleber und -nieren, Erythrocyten von Mensch und Schwein, Rinderhirn und Kaninchen-Skelettmuskeln isolieren und reinigen. Ein weiteres Beispiel ist die Dipeptidylaminopeptidase I (E.C. 3.4.14.1, Kathepsin C); J. Ken Mcdonald, Bioch. Biophys. Res. Communication 24(5), 66, 771f und Biosis Database&sub1; Biol. Abs. Acc. Nr. 74076433, beschreibt die Cl&supmin;-Abhängigkeit von Amylase.
  • Oxidoreduktasen wie Glycerindehydrogenase (aus Enterobacter aerogenes), Acetaldehyddehydrogenase (aus Hefe) oder Tyrosinase (Catechinoxidase).
  • Lyasen wie Aldolase (aus Hefe) oder Carbonatdehydrase (aus Rinder-Erythrocyten).
  • Andere geeignete Enzyme sind verschiedene Enzyme aus habphilen Organismen. Nicht alle Enzyme müssen aus natürlichen Quellen stammen, sondern können auch durch DNA-Rekombinationstechniken erhalten werden.
  • Selektiv bindende Agenzien: Für das Binden von Analyten oder störenden Ionen steht eine Fülle von bindenden Agenzien zur Verfügung. Diese bindenden oder maskierenden Substanzen sind Kryptanden, Coronanden, Kronenether, Podanden, Spheranden, Hemispheranden, Calixarene und Kombinationen derselben, natürlich vorkommende Ionophore, zum Beispiel Antibiotika, cyclische Peptide wie etwa Valinomycin, Kornplexone und Chelatbildner, zum Beispiel Iminodiessigsäure, EDTA, Nitrilotriessigsäure und Derivate derselben. Derartige Verbindungen sind beschrieben in Kontakte (Merck), 1977, Nr. 1, S. 11ff und S. 29ff; Kontakte (Merck), 1977, Nr. 2, S. 16ff; Kontakte (Merck), 1977, Nr. 3, S. 36ff; Phase Transfer Catalysts, Properties and Applications (Merck-Schuchardt) 1987, Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction; R.M. Izatt et al., Chemical Reviews 85, 271-339 (1985); Data for Biochemical Research, 1986, R.M.C. Dawson et al., Hrsg., 3. Aufl., 399-415 (Clarendon Press) Oxford; F. Vögtle et al., Chem. Macrocycles, Springer Verlag, New York, 1985; G.W. Gokel et al., Hrsg., Macrocyclic Polyether Synthesis, Springer Verlag, New York, 1982; M. Hiraoka, Hrsg., Crown Compounds, Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1982; J.M. Lehn et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 6700-6707 (1975); G. Schwarzenbach et al., Helv. Chim. Acta 28, 828 (1945); S.F.A. Kettle, Koordinationsverbindungen, Taschentext 3, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1972; A.E. Martell et al., Die Chemie der Metallchelatverbindungen, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1958; M. Becke-Goehring et al., Komplexchemie, Springer-Verlag, 1970; F. Kober, Grundlagen der Komplexchemie, Otto-Salle-Verlag, Frankfurt/Main 1979; G. Schwarzenbach et al., Helv. Chim. Acta 31, 1029 (1948); R.G. Pearson el al., Science 151, 172 (1966).
  • Beispiele für Chelatbildner, die mehrwertige Ionen, insbesondere zweiwertige Kationen binden können, sind Ethylenglycolbis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (als EGTA bezeichnet) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
  • Es gibt viele bindende Agenzien, die mehrwertige Ionen binden können, z.B. EDTA und dessen Derivate, doch sind Agenzien, die einwertige Ionen binden, weniger üblich. Tetraphenylbor bindet Kalium-Ionen. Eine Gruppe von Verbindungen mit weitgefaßteren Möglichkeiten sind jedoch die Kryptanden, und sie sind Beispiele für Reagenzien, die einwertige Kationen in wäßrigen Lösungen selektiv binden können (R.M. Izatt et al., Chem. Reviews 85, 271-339). Spezielle Beispiele für Kryptanden sind die Kryptofix -Verbindungen von Merck-Schuchardt, zum Beispiel:
  • 4,7,13,16,21-Pentaoxa-1,10-diazabicyclo[8.3.5]tricosan, Kryptofix 221, Seite 438, Merck-Schuchardt-Katalog von 1987/88, Nr. 810646 (K 221);
  • 4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan, Krypotfix 222, Seite 438, Merck-Schuchardt-Katalog von 1987/88, Nr. 810647 (K 222).
  • Als Verbindungen für die Beseitigung störender Anionen können die folgenden Substanzklassen möglicherweise verwendet werden: Anionkryptanden, Heterocyclophane, Katapinanden und anorganische Metallkomplexe oder unlösliche Salze. Spezielle Beispiele für Verbindungen, die Anionen komplexieren, sind in der Literatur beschrieben, z.B. Azamono- oder Azapolycyclen, makrocyclische quaternäre tetraedrische Verbindungen, makrocyclische Bismetall-Komplexe, Makrocyclen mit covalent eingebauten Lewis-Säure-Zentren, protonierte oder alkylierte quaternäre Kryptanden oder Katapinanden [F.P. Schmidtchen, Nachrichten Chem. Techn. Lab. 36(1), 1988. 5. 8f; E. Graf, J. Amer. Chem. Soc. 98(20), 1976, 6403f; C.H. Park, J. Amer. Chem. Soc. 90(9), 1968. 2431f] sowie z.B. der Hexachlorokomplex von Fe(III) oder Silbernitrat.
  • Funktion der bindenden Agenzien: Die bindenden Agenzien werden für folgende Zwecke verwendet:
  • 1. Selektives Binden störender Ionen.
  • 2. Zur Erniedrigung der Konzentration der Analyten auf optimales Meßniveau, falls eine Verdünnung der Probe nicht durchführbar ist. Die Verwendung eines bindenden Agens zur Erniedrigung der Konzentration des zu bestimmenden Analyten auf einen passenden Bereich für enzymatische Analysen dient zur Verdopplung der Empfindlichkeit des Verfahrens.
  • 3. Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren, wobei das bindende Agens vorhanden ist und einen Komplex mit "Indikator"-Ionen bildet, aus dem die Indikator-Ionen stöchiometrisch durch die Analyt-Ionen verdrängt werden, und wobei der Einfluß der verdrängten Indikator-Ionen auf die Aktivität eines Enzyms geprüft wird, woraus sich ein indirektes Maß für die Konzentration der Analyt-Ionen ergibt. Bei einem solchen Verfahren ist beispielsweise das Enzym Pyruvatkinase, die Indikator-Ionen sind Kalium, das bindende Agens ist Kryptofix 221, und das zu bestimmende Ion ist Natrium; oder das Enzym ist eine Kinase, das Indikator-Ion ist Mg²&spplus;, das bindende Agens ist ein Chelatbildner, z.B. EDTA, und das Analyt-Ion ist ein Metall-Ion; oder das Enzym ist Pyridoxalkinase, das Indikator-Ion ist Zn²&spplus;, das bindende Agens ist Kryptofix 221, und das Analyt- Ion ist ein Schwermetall-Ion; oder das Enzym ist α-Amylase, das bindende Agens ist ein Metall aus der ersten und zweiten Nebengruppe (Nebengruppen Ib und IIb) des Periodensystems gemäß dem Periodensystem nach Mendelejew [Chemical Principles, von W.J. Masterton und E.J. Slowinski (3. Auflage); Saunders Golden Series, W.B. Saunders Company 1973], zum Beispiel Ag oder Hg, und das zu bestimmende Ion ist Chlorid; oder das Enzym ist Collagenase, das bindende Agens ist ein Chelatbildner wie z.B. EDTA, und das zu bestimmende Ion ist Calcium.
  • Flüssigkeiten für die Analyse: Die biologischen Flüssigkeiten, an denen die Messung von Analyten vorgenommen wird, sind zum Beispiel Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiß, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymph- oder Darmsekrete, Exsudate oder Transsudate. Nichtbiologische Flüssigkeiten sind Wasser oder wäßrige Extrakte oder Mischungen, wie Extrakte von Nahrungsmitteln oder Früchten, oder vergorene Flüssigkeiten wie etwa Wein.
    • Bestimmung von Chlorid-Ionen
  • Für die Bestimmung von Chlorid in Blut wird Plasma mit einer gepufferten Mischung inkubiert, die 0,01 mol/l Cysteamin, 4 mmol/l Gly-Arg-p-Nitroanilid und 0,02 E/ml Kathepsin C enthält. Die Bildung von p-Nitroanilin ist ausschließlich von der Gegenwart der Chlorid-Anionen abhängig. Zusätzlich können selektiv bindende Agenzien zugegeben werden, um die Störung durch Bromid-Ionen zu beseitigen oder um die Aktivität der Chlorid-Ionen zu erniedrigen, um so deren Konzentration auf den optimalen Bereich des Enzyms einzustellen. Unter den für die Analyse gewählten Bedingungen (siehe Beispiel A) ist die Bildungsgeschwindigkeit von p-Nitroanilin Kathepsin C
  • proportional zur Konzentration der Chlorid-Ionen in der Probe. Bei diesem Beispiel wird die Reaktionsgeschwindigkeit durch Messen der Zunahme der Absorption bei 405 nm bestimmt.
  • Die Konzentrationsbereiche für die Verbindungen eines solchen Bestimmungsverfahrens sind:
  • Citrat-Puffer 0,01 - 0,2 mol/l
  • pH 4 - 7 (bevorzugt: 5,0 - 5,5)
  • Cysteamin 1 - 20 mmol/l
  • Gly-Arg-p-Nitroanilid 1 - 20 mmol/l
  • Kathepsin C 1 - 100 mE/ml
  • Bei diesem Assay kann jeder Puffer mit einem pK im erforderlichen pH-Bereich und einer vernachlässigbaren Chlorid- Konzentration verwendet werden. In der Literatur wurde gezeigt, daß Beispiele für Enzyme aus all den vorstehend zusammengestellten Klassen (Transferasen, Hydrolasen, Oxidoreduktasen und Lyasen) Chlorid-Abhängigkeit aufweisen, besonders dann, wenn die Enzyme aus halophilen Organismen stammen. Die Chlorid-Abhängigkeit der Enzyme vom Peptidase- Typ ist umfangreich beschrieben worden. Zum Beispiel Dipeptidylpeptidase I (Kathepsin C), EC 3.4.14.1 [J. Ken Mc-Donald, Bioch. Bioph. Res. Communication 24(5) 1966, 771f] oder Dipeptidylpeptidase III, EC 3.4.14.3 [J. Ken Mcdonald, Journal of Biol. Chem. 241(7) 1966, 1494f], die beide die Hydrolyse von Oligopeptid-Derivaten aus dem Amino-terminalen Ende katalysieren. Ein weiteres Beispiel ist das Enzym EC 3.4.15.1, das Angiotensin umwandelt und bei dem es sich um eine Dipeptidylcarboxypeptidase handelt, welche die hydrolytische Freisetzung von Dipeptiden aus dem Carboxyl- Terminus einer weiten Reihe von Oligopeptiden katalysiert (P. Bunning et al., Bioch. 26, 1987, 3374f; R. Shapiro et al., Bioch. 22, 1983, 3850f).
  • Anstelle von Gly-Arg-p-Nitroanilid können auch verschiedene andere Dipeptid- oder Oligopeptid-Substrate verwendet werden. Bevorzugte Peptidsubstrate lassen sich beschreiben durch die allgemeine Formel
  • R - P - X
  • wobei für die Dipeptidylpeptidase-Enzyme R = H ist und P eine Peptidkette mit wenigstens 2 Resten bedeutet. X bedeutet eine chromogene oder fluorogene Gruppe, die durch die Wirkung des Enzyms freigesetzt wird, um eine erfaßbare Anderung der Farbe oder der Fluoreszenz zu ergeben. X kann eine Nitrophenyl-, Naphthyl- oder Thiobenzylester-Gruppe sowie eine Nitroanilin-, Naphthylamin- oder Methylcumarin- Gruppe entweder mit oder ohne weitere Substituenten am aromatischen Ring sein. Im Falle der Dipeptidylcarboxypeptidase-Enzyme bedeutet X das Amino-terminale Ende der Peptidkette und R ist eine chromogene oder fluorogene Gruppe, die durch die Wirkung des Enzyms freigesetzt wird. R kann eine N-2-Furanacryloyl- oder Benzoyl-Gruppe entweder mit oder ohne weitere Substituenten sein (siehe Beispiel A).
  • Als weiteres Beispiel der enzymatischen Bestimmung von Chlorid-Ion (Beispiel B) wird Plasma mit einer gepufferten Mischung inkubiert, die 4,6-O-Benzyliden-α-4-nitrophenyl-α- D-maltoheptaosid (4,6-Ethyliden-G&sub7;PNP) (5 mmol/l), n-Amylase (0,60 E/ml) und α-Glucosidase (= 30 E/ml) enthält. Die Bildung von p-Nitrophenol ist ausschließlich von der Gegenwart der Chlorid-Anionen abhängig, wobei wiederum entweder die Vorverdünnung, kleine Probenvolumina oder die selektiv bindenden Agenzien angewandt werden, um die Chloridionen- Konzentration auf den optimalen Bereich des Enzyms einzustellen. Das Testprinzip ist nachstehend zusammengefaßt, und die Reaktionsgeschwindigkeit wird durch Messen der Zunahme der Absorption bei 405 nm bestimmt. Ethyliden-G&sub7;PNP α-Amylase Ethyliden-G&sub5; Ethyliden-G&sub4; Ethyliden-G&sub3; α-Glucosidase (PNP p-Nitrophenol; G = Glucose)
  • Die Konzentrationsbereiche der Verbindungen bei einer solchen Bestimmung sind:
  • HEPES oder alternativer Chloridfreier Puffer 0,01 - 0,05 mol/l
  • pH 6,5 - 7,5
  • α-Amylase 60 - 6000 E/l
  • α-Glucosidase 3000 - 300 000 E/l
  • 4,6-Ethyliden-G&sub7;PNP 0,5 - 10 mmol/l
  • Die vorstehend für Kathepsin C (Beispiel A) erörterten Testabweichungen gelten auch für Beispiel B.
    • Beispiel A Messung der Chloridionen-Konzentration unter Verwendung von Kathepsin C
  • Bei diesem Ausführungsbeispiel wird eine kleine Blutprobe zentrifugiert, um Plasma (5 µl) zu erhalten. Zur Messung der Chlorid-Ionen enthält die Inkubationsmischung 0,05 mol/l Citrat-Puffer pH 5,0; 10 mmol/l Cysteamin und 4 mmol/l Gly-Arg-p-Nitroanilid und 0,01 E/ml Kathepsin C. Letzteres wurde zur Abtrennung der Chlorid-Ionen gegen 10 mmol/l Natriumphosphat-Puffer (pH 6,8) und 43% (V/V)) Glycerin dialysiert.
    • Beispiel B Messung der Chloridionen-Konzentration unter Verwendung von α-Amylase
  • Die Inhibitionsmischung für eine 5 µl-Plasmaprobe enthält:
  • HEPES oder alternativer Chloridfreier Puffer 100 mmol/l
  • pH 7,1
  • α-Amylase 600 E/l
  • α-Glucosidase 30 000 E/l
  • 4,6-Ethyliden-G&sub7;PNP 5 mmol/l
  • Zur Bestimmung der Bildungsgeschwindigkeit des freien 4-Nitrophenols und damit der Konzentration an Chlorid-Ionen in der ursprünglichen Probe wird die Reaktion bei einer Wellenlänge von 405 nm (oder nahe dabei) verfolgt.

Claims (17)

1. Verfahren zur Bestimmung von Chlorid-Ionen in Flüssigkeiten, wobei der Einfluß der Ionen auf die Aktivität einer Hydrolase oder eines Enzyms, das aus einem habphilen Organismus stammt und eine Oxidoreduktase, eine Transferase oder eine Lyase ist, gemessen wird, wobei die Hydrolasen keine α-Amylase umfassen, die durch eine Calciumchelat-Verbindung deaktiviert wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeit eine biologische oder nichtbiologische Flüssigkeit ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die biologische Flüssigkeit Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiß, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymph- oder Darmsekret, Exsudat oder Transsudat ist, und die nichtbiologische Flüssigkeit Wasser oder ein wäßriger Extrakt oder eine Mischung ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Hydrolase eine Glycosidase ist oder auf Peptidbindungen einwirkt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Hydrolase eine α- oder β-D-Galactosidase aus Escherichia coli, Carboxypeptidase A aus Rinderpankreas, Collagenase aus Clostridium hystolicum, Amylase aus Speichel oder Pankreas, Calpain I, Calpain II, Phosphoglycolatphosphatase (Dipeptidylaminopeptidase I (Kathepsin C)), Dipeptidylpeptidase III (EC 3.4.14.4) oder Dipeptidylcarboxypeptidase (EC 3.4.15.1) ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei störende Ionen oder Analyten durch Anionkryptanden, Heterocyclophane, Katapinanden, anorganische Metallkomplexe oder unlösliche Salze, Metalle der ersten und zweiten Nebengruppe des Periodensystems, Fe(III)-Komplexe oder Silbernitrat gebunden werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die bindenden Agenzien gemäß Anspruch 6 vorhanden sind und einen Komplex mit Indikator-Ionen bilden, aus dem die Indikator-Ionen stöchiometrisch durch die Chlorid-Ionen verdrängt werden, welche die zu bestimmenden Analyten sind, und wobei der Einfluß der verdrängten Indikator-Ionen auf die Aktivität des Enzyms geprüft wird, woraus sich ein indirektes Maß für die Konzentration der Analyten ergibt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Chlorid-Ionen eine Anderung des pH-Werts bewirken, wodurch die Indikator- Ionen aus einem Komplex mit einem pH-empfindlichen bindenden Agens verdrängt werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Enzym α-Amylase oder Dipeptidylaminopeptidase I (Kathepsin C) ist und das bindende Agens Ag oder Hg ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Enzymsubstrat 4,6-O-Benzyliden-4-nitrophenyl-α-D-maltoheptaosid ist, wenn das Enzym α-Amylase ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Enzymsubstrat Gly-Arg-p-Nitroanilid ist, wenn das Enzym Dipeptidylarninopeptidase I (Kathepsin C) ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Enzymsubstrat ein Dipeptid oder ein Oligopeptid der Formel
R - P - X
ist, worin P eine Peptidkette mit wenigstens 2 Resten ist, R Wasserstoff, eine chromogene oder fluorogene Gruppe, die durch die Wirkung des Enzyms freigesetzt wird, eine N-2-Furanacryloyl- oder Benzoyl-Gruppe ist, und X eine Nitrophenyl-, Naphthyl- oder Thiobenzylester-Gruppe oder eine Nitroanilin-, Naphthylamin-, Methylcumarin-Gruppe oder eine Carboxyl-Gruppe ist, wenn das Enzym Dipeptidylaminopeptidase I (Kathepsin C), Dipeptidylpeptidase III (EC 3.4.14.4) oder Dipeptidylcarboxypeptidase (EC 3.4.15.1) ist, wobei X keine Carboxyl-Gruppe ist, wenn R Wasserstoff ist.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, wobei der Assay Ionen einschließt, die kompetitive Hemmstoffe für das sensitive Indikatorenzym sind.
14. Zusammensetzung zur Bestimmung von Chlorid-Ionen in Flüssigkeiten, umfassend eine Hydrolase oder ein Enzym aus einem halophilen Organismus, welches eine Oxidoreduktase, eine Transferase oder eine Lyase ist, wobei die Hydrolasen keine α-Amylase umfassen, die durch eine Calciumchelat-Verbindung deaktiviert wurde, und deren Aktivität durch die Chlorid-Ionen beeinflußt wird.
15. Zusammensetzung zur Bestimmung von Chlorid-Ionen in Flüssigkeiten nach Anspruch 14, umfassend ein Enzym, dessen Aktivität durch die Chlorid-Ionen und ein bindendes Agens beeinflußt wird.
16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 oder 15 zur Bestimmung von Chlorid-Ionen, umfassend:
HEPES oder alternativer Chloridfreier Puffer 0,01 - 0,5 mmol/l
pH 6,5 - 7,5
α-Amylase 60 - 6000 E/l
α-Glycosidase 3000 - 300 000 E/l
4,6-Ethyliden-G&sub7;PNP 0,5 - 10 mmol/l
17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 oder 15 zur Bestimmung von Chlorid-Ionen, umfassend:
Citrat-Puffer 0,01 - 0,2 mol/l
pH 4 - 7 (bevorzugt: 5,0 - 5,5)
Cysteamin 1 - 20 mmol/l
Gly-Arg-p-Nitroanilid 1 - 20 mmol/l
Kathepsin C 2 - 100 mE/ml
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