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DE3855714T2 - Verfahren und Zusammensetzung zum Nachweis von Natrium-Ionen in Flüssigkeiten - Google Patents

Verfahren und Zusammensetzung zum Nachweis von Natrium-Ionen in Flüssigkeiten

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DE3855714T2
DE3855714T2 DE3855714T DE3855714T DE3855714T2 DE 3855714 T2 DE3855714 T2 DE 3855714T2 DE 3855714 T DE3855714 T DE 3855714T DE 3855714 T DE3855714 T DE 3855714T DE 3855714 T2 DE3855714 T2 DE 3855714T2
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DE3855714T
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Uwe Dr. Rer. Nat. W-8122 Penzberg Herrmann
Georg-Burkhardt Dr. Rer. Nat. W-8122 Penzberg Kresse
Michael-Harold Dr. Phil. W-8125 Oberhausen Town
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Flinders University of South Australia
Boehringer Mannheim GmbH
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Description

  • Die Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung von Ionen, im folgenden auch Analyten genannt, in biologischen und nichtbiologischen Flüssigkeiten.
  • Die Erfindung beruht auf der Fähigkeit vieler Analyten, die Aktivität eines sensitiven Enzyms zu stimulieren oder zu hemmen. Die Analyten können Kationen oder Anionen sein, metallisch oder nichtmetallisch, einfach oder zusammengesetzt. In der Praxis ist es häufig so, daß der Analyt in der Probe in einer Konzentration vorliegt, die außerhalb des Empfindlichkeitsbereichs des betreffenden analytischen Indikatorenzyms liegt, oder daß durch die Gegenwart anderer Ionen, auf die das Enzym ebenfalls anspricht, eine Störung verursacht wird. Die Erfindung befaßt sich mit diesen Problemen und löst sie auf verschiedenartige Weise.
  • In der Praxis der klinischen Biochemie sind Messungen von Serumelektrolyten die gebräuchlichsten analytischen Tests, die in Krankenhäusern durchgeführt werden. Diese Messungen sind nicht nur für routinemäßige Untersuchungen erforderlich, sondern häufig bei Notfall- und lebensbedrohenden Situationen, wo die Geschwindigkeit der Analysen von grundlegender Bedeutung ist. Da eine der Hauptursachen für Verzögerungen in Krankenhäusern der Transport der Proben von den Krankenstationen zu den diagnostischen Laboratorien ist, wäre ein Verfahren, das sich in einfacher Weise in der Nähe des Krankenbetts durchführen ließe, in Notfallsituationen von besonderem Wert.
  • Ein gebräuchliches Verfahren zur Analyse von Kalium und Natrium in der Praxis der klinischen Biochemie ist die Flammenphotometrie. Dieses Verfahren beruht auf dem Prinzip, daß bestimmte Atome bei Energiezufuhr durch Wärme angeregt werden und Licht einer charakteristischen Wellenlänge emittieren, wenn sie in den Grundzustand zurückkehren. Die Intensität der charakteristischen Wellenlänge der durch die Atome in der Flamme erzeugten Strahlungsenergie ist direkt proportional zur Anzahl der in der Flamme angeregten Atome, die direkt proportional zur Konzentration der betreffenden Substanz in der Probe ist. Die dazu benötigten Geräte sind kompliziert und relativ aufwendig und erfordern die Verwendung brennbarer Gase.
  • Bei einem alternativen Verfahren, insbesondere für Natrium, Kalium und Chlorid, bedient man sich Ionenselektiver Elektroden. Im Idealfall besitzt jede Elektrode eindeutige ionenselektive Eigenschaften, die ein Ansprechen auf nur eine Ionensorte ermöglichen. In der Praxis ist das nicht der Fall, und für alle ionenselektiven Elektroden gibt es störende Ionen. Des weiteren sind Ionenspezifische Elektroden nicht absolut spezifisch, obwohl Korrekturen im allgemeinen möglich sind. Die Elektroden messen das Potential, das sich in Gegenwart des speziellen Ions entwickelt. Die Instrumentierung ist relativ aufwendig. Keines dieser Verfahren läßt sich spektrophotometrisch durchführen, und deshalb führt der klinische Bedarf an Ionenmessungen dazu, daß die im Handel erhältlichen klinischen Analysengeräte, von denen die meisten in erster Linie für spektrophotometrische Tests ausgelegt sind, erheblich komplizierter werden. Zur erfolgreichen Durchführung erfordern beide Verfahren ein erhebliches Maß an Können und Wissen.
  • Auch bei der routinemäßigen Bestimmung von Chlorid mit Hilfe coulometrischer Verfahren ist eine spezielle Instrumentierung erforderlich. Der Endpunkt bei diesem Titrationsvorgang wird durch eine Zunahme der Sättigung des elektrischen Stromflusses bei der Bildung des unlöslichen Silberchlorid-Produkts erfaßt. Alternativ kann die potentiometrische Bestimmung angewandt werden, die ebenfalls sehr zeitraubend ist und zusätzliche Instrumentierung umfaßt.
  • Für Chlorid gibt es darüber hinaus eine Reihe photometrischer und titrimetrischer Verfahren, zu denen beispielsweise gehören:
  • - die titrimetrische Bestimmung von freien Hg²&spplus;-Ionen über einen Diphenylcarbazon-Komplex;
  • - die kolorimetrische Bestimmung des Rhodanid-Komplexes von Eisen, der sich nach Dissoziation des Quecksilber- Komplexes nach Fällung von HgCl&sub2; bildet [Skeggs, Clin. Chem. 10, 1964, 918f; Schmidt, Zentralblatt Pharm. 124(9), 1985, 527f];
  • - die kolorimetrische Bestimmung von Chloranilsäure aus dem entsprechenden Quecksilber-Salz [Reuschler, Klin. Wochenschrift 40, 489 (1962)];
  • - die Bestimmung des gefärbten Cu²&spplus;-Komplexes von Diethyldithiocarbaminsäure aus dem farblosen Quecksilber- Salz (deutsche Offenlegungsschrift 21 37 146);
  • - das recht gebräuchliche TPTZ-Verfahren (Tripyridyl-s- triazin) (R. Fried, Zeitschr. Klm. Chem., Klm. Bioch. 10, 1972, 280f, Patentanmeldung DE 21 53 387), das ebenfalls auf der Bildung eines gefärbten Metallkomplexes nach Dissoziation eines Quecksilber-Komplexes beruht.
  • Ein großer Nachteil dieser Verfahren ist die Verwendung von Lösungen, die sehr giftige Substanzen enthalten. Einige dieser Verfahren sind komduziert und ungenau (z.B. das Titrationsverfahren). Viele der Reagenzien sind instabil, und die Kalibrierungskurven sind nichtlinear (z.B. beim Rhodanid-Verfahren). Bei einigen dieser Verfahren ist außerdem eine Vorbehandlung erforderlich, um Störungen durch den Proteingehalt der Probe zu beseitigen.
  • Ein verbessertes TPTZ-Verfahren ist in der PCT-Aumeldung WO 83/002670 beschrieben, doch ist die Verwendung von giftigen Quecksilber-Verbindungen immer noch ein Nachteil. Das einzige kolorimetrische Verfahren ohne Verwendung von Quecksilber-Ionen ist die Bestimmung von Hexachlorokomplexen von Fe(III) in Perchlorsäure-Lösung [F. Hoppe, Ther. Ggw. 110(4), 1971, 554f; H. Mahner, Zeitschr. Klin. Chem., Klin. Biochem. 11(11), 1973, 451f; W.T. Law, Clin. Chem. 26(13) 1980, 1874f; US-Patent 4 278 440]. Eine erhebliche Einschränkung dieses Verfahrens liegt in der Verwendung stark saurer Reagenzien, die korrodierend wirken und deshalb für mechanische Pipettiersysteme nicht geeignet sind. Ein weiterer Nachteil ist die Störung durch Bilirubin in den Proben.
  • Calcium ist ein weiteres Beispiel für einen Elektrolyten, der routinemäßig im klinischen Laboratorium bestimmt wird. Die Konzentration dieses Metall-Ions in Körperflüssigkeiten wird innerhalb eines engen Bereichs reguliert. Pathologisch hohe oder niedrige Konzentrationen können zu lebensbedrohenden Störungen wie etwa Niereninsuffizienz, Pankreatitis, Tetanie und Herzversagen durch Blutandrang führen.
  • Eines der frühesten Verfahren zur Bestimmung von Calcium war das von Tisdall (J. Biol. Chem. 63, 461-465, 1925) beschriebene, bei dem Calcium mit Oxalsäure gefällt wird, die wiederum kolorimetrisch bestimmt wird. Das Verfahren umfaßt einen Zentrifugationsschritt und ist deshalb sehr zeitraubend; es ist nicht für Calcium spezifisch und hängt von einer sorgfältigen Probenbehandlung ab. Vorläufer für dieses Verfahren in zahlreichen Laboratorien waren titrimetrische und direkte kolorimetrische Methoden. Bei der ersteren besteht auch der Nachteil, daß die Arbeitsweise kompliziert und mühselig ist und große Probenvolumina erforderlich sind. Bei letzterer Methode beeinflußt Calcium die Farbe eines Farbstoffs, beispielsweise o-Cresolphthalein-Komplexon, die in einem Photometer gemessen werden kann. Weil dieses Verfahren einfach ist, eignet es sich für die Automatisierung im klinischen Labor. Allerdings werden bei diesem Verfahren aggressive, stark alkalische Lösungen und giftige Substanzen verwendet. Es ist besonders störungsanfällig gegenüber einer Reihe von Serumbestandteilen wie etwa Lipiden, Proteinen, Phosphat und Bilirubin, und infolgedessen verträgt es sich nicht sonderlich gut mit Atomabsorptions- und flammenphotometrischen Vergleichsverfahren. Ein weiterer Nachteil der kolorimetrischen Methode ist, daß die Kalibrierungskurven nichtlinear sind und die Farbe stark temperaturabhängig ist.
  • Bei W.H. Outlaw und O.H. Lowry, Analytical Biochemistry 92, 370-374 (1979), ist ein enzymvermittelter Assay zur Messung von Kalium-Ionen in Geweben beschrieben. Bei diesem Verfahren wird Pyruvatkinase aus Kaninchenmuskeln verwendet, die durch Kalium-Ionen und Natrium-Ionen aktiviert wird, wobei erstere etwa vierzigmal wirksamer sind. Das Verfahren ist unspezifisch, daher kann es für Pflanzenmaterial geeignet sein, in welchem Kalium-Ionen die vorherrschenden Kationen sind, doch ist es ungeeignet für Messungen an Körperflüssigkeiten wie etwa Serum, das einen dreißigfachen Überschuß an Natrium-Ionen enthält. Daher bewirken Natrium-Ionen eine nicht tragbare Störung, wenn die von Outlaw et al. beschriebene enzymatische photometrische Technik zur Messung von Kalium in Plasma oder Serum angewandt wird. Ein weiteres Problem ist, daß Ammonium-Ionen eine ähnliche Aktivierung wie Kalium-Ionen ergeben. Weder geht die vorstehend erwähnte Veröffentlichung auf diese kritischen Probleme im Blick auf die Analyse von Kalium-Ionen in biologischen Flüssigkeiten wie etwa Serum ein oder löst sie, noch wird irgendein Verfahren zur Bestimmung von Natrium-Ionen vorgeschlagen.
  • In der Patentanmeldung EP 0 275 398 wird eine Bestimmung von Chlorid mit einer deaktivierten α-Amylase realisiert.
  • M.C. Wimmer et al., Clin Chem., Bd. 32, Nr. 4, 1986, beschreiben ein Verfahren zur Bestimmung von Magnesium. Allerdings lassen sich mit Hilfe dieses Verfahrens die Störungen durch andere Ionen nicht vermeiden.
  • Die europäische Patentanmeldung EP 207 392 offenbart ein anderes Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Ionen mit Hilfe einer Mehrschicht-Testanalyse. Weder wird die offenbarte Anordnung der Mehrschicht-Testanalyse bei der vorliegenden Erfindung angewandt, noch gibt EP 207 392 Hinweise auf die Verwendung von Enzymen zur Erzeugung erfaßbarer Signale.
  • In der Patentanmeldung DE 36 14 470 fehlt eine Offenbarung, aus der sich ein Verfahren zur Kalium-Bestimmung in Serum ohne signifikante Störung durch andere Ionen, z.B. Natrium- Ionen ergäbe. I.F. Dalmonova und N.N. Ugarova, J. Anal. Chem. der UDSSR (1980), Bd. 35, Nr. 8, Teil 2, 1042-1081, enthält eine allgemeine Erörterung über die Wirkung gewisser Ionen wie etwa Beryllium, Zink und Quecksilber-Ionen auf gewisse Enzyme, doch findet sich kein Hinweis darauf, daß es erreicht worden wäre, diese Verfahren ohne die Bestandteile der vorliegenden Erfindung funktionieren zu lassen.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren und ein Reagens bereitzustellen, wodurch die vorstehend genannten Probleme vermieden werden. Die Erfindung löst diese Probleme mit Hilfe eines Verfahrens zur Bestimmung von Natrium-Ionen (Analyten) in Flüssigkeiten, wobei der Einfluß dieser Natrium-Ionen auf die Aktivität eines Enzyms gemessen wird.
  • Ein zentrales Merkmal dieser Erfindung ist die Verwendung selektiv bindender Agenzien, um die freie Konzentration an Analyt in den optimalen Bereich für das analytische Enzym zu bringen, besonders dann, wenn eine Verdünnung der Flüssigkeit nicht durchführbar ist. Ein weiteres Kennzeichen der Erfindung ist die Verwendung kompetitiver Hemmstoffe für das betreffende analytische Enzym, um dessen Empfindlichkeit gegenüber dem Analyt herabzusetzen, wodurch es möglich wird, diesen in höherer Konzentration zu messen. Dies ist beispielsweise dann besonders nützlich, wenn selektiv bindende Agenzien nicht ohne weiteres verfügbar oder unannehmbar teuer sind.
  • Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Verwendung selektiv bindender Agenzien zur Verringerung der freien Konzentration an störenden Ionen auf Werte, bei denen die Störungen nicht mehr ins Gewicht fallen. Es kann sich dabei um die gleichen slektiv bindenden Agezien wie für die Erniedrigung der freien Konzentration handeln. Auch bedient man sich der Tatsache, daß ein kompetitiver Hemmstoff wirksamer mit störenden Ionen als mit dem Analyt konkurrieren kann, wodurch die Empfindlichkeit des Enzyms gegenüber dem Analyten in Relation zum störenden Ion gesteigert wird.
  • Ein wichtiger Faktor ist die Wahl der optimalen Reaktionsbedingungen, wozu auch die Auswahl eines geeigneten Isoenzyms gehört, so daß die stimulierende oder hemmende Wirkung des Analyten erheblich größer ist als die des störenden Ions. Außerdem sollte die Wirkung des Analyten und der störenden Ionen auf die Aktivität des analytischen Enzyms additiv sein, so daß bei bekannter Konzentration an störenden Ionen die Konzentration an Analyt ohne weiteres anhand der Differenz bestimmt werden kann. Wenn bekannt ist, daß ein störendes Ion mit einer relativ konstanten Konzentration in der zu analysierenden Flüssigkeit vorliegt, so läßt sich dies berücksichtigen, indem Standardlösungen (Eichlösungen) eine geeignete Konzentration an störendem Ion beigegeben wird. Ein weiteres Verfahren zur Prüfung auf derartige Analyten besteht in der Anwendung eines Assays mit kompetitiver Bindung, wobei der Analyt ein anderes Ion aus dem bindenden Agens verdrängt und die Wirkung des freigesetzten Ions auf die Aktivität eines geeigneten Enzyms bestimmt wird.
    • Geeignete Enzyme
  • Verwendbare Enzyme können zum Beispiel sein (H.J. Evans et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 17, 47; 1966; eine weitere Aufstellung geeigneter Enzyme findet sich in Biochemistry (1975) 2. Aufl., Lehninger, Worth Publishers, New York, S. 185) :
  • Transferasen wie phosphorhaltige Gruppen übertragende Transferasen. Eine derartige Transferase kann Pyruvatkinase sein. Anstelle von Pyruvatkinase können auch andere Kinasen wie etwa Adenylatkinase oder Hexokinase verwendet werden, die auf Magnesium-Ion oder Mangan(II)-Ion ansprechen. Eine weitere Transferase ist Acetatkinase (aus E. coli). Ein weiteres Beispiel ist Pyridoxalkinase aus Hirn, die auf Zink-Ionen anspricht.
  • Hydrolasen wie Glycosidasen, zum Beispiel α- oder β-D-Galactosidase (aus Escherichia coli), Carboxypeptidase A, (aus Rinderpankreas) Collagenase (aus dostridlum hystolicum), Amylase (aus Speichel oder Pankreas) oder Phosphoglycolatphosphatase.
  • Auch Peptidhydrolasen wie etwa die Cystein- oder Thiol-abhängigen Proteinasen, für welche spezielle Beispiele Calpain I und II sind (auch Calcium-aktivierte neutrale Protease genannt), sind bei Sasaki et al. in J. Biol. Chem. 259, 12489-12494 (1984) beschrieben. Letztere Enzyme lassen sich nach dem Verfahren von A. Kitahara et al., J. Biochem. 95, 1759-1766 (1984), aus einer Vielfalt von tierischen Geweben wie etwa Rattenleber und -nieren, Erythrocyten von Mensch und Schwein, Rinderhirn und Kaninchen-Skelettmuskeln isolieren und reinigen. Ein weiteres Beispiel ist die Dipeptidylaminopeptidase I (E.C. 3.4.14.1, Kathepsin C); J. Ken Mcdonald, Bioch. Biophys. Res. Communication 24(5), 66, 771f.
  • Oxidoreduktasen wie Glycerindehydrogenase (aus Enterobacter aerogenes), Acetaldehyddehydrogenase (aus Hefe) oder Tyrosinase (Catechinoxidase).
  • Andere geeignete Enzyme sind verschiedene Enzyme aus habphilen Organismen. Nicht alle Enzyme müssen aus natürlichen Quellen stammen, sondern können auch durch DNA-Rekombinationstechniken erhalten werden.
  • Selektiv bindende Agenzien: Für das Binden von Analyten oder störenden Ionen steht eine Fülle von bindenden Agenzien zur Verfügung. Diese bindenden oder maskierenden Substanzen sind Kryptanden, Coronanden, Kronenether, Podanden, Spheranden, Hemispheranden, Calixarene und Kombinationen derselben, natürlich vorkommende Ionophore, zum Beispiel Antibiotika, cyclische Peptide wie etwa Valinomycin, Komplexone und Chelatbildner, zum Beispiel Iminodiessigsäure, EDTA, Nitrilotriessigsäure und Derivate derselben. Derartige Verbindungen sind beschrieben in Kontakte (Merck), 1977, Nr. 1, S. 11ff und S. 29ff; Kontakte (Merck), 1977, Nr. 2, S. 16ff; Kontakte (Merck), 1977, Nr. 3, S. 36ff; Phase Transfer Catalysts, Properties and Applications (Merck-Schuchardt) 1987, Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction; R.M. Izatt et al., Chemical Reviews 85, 271-339 (1985); Data for Biochemical Research, 1986, R.M.C. Dawson et al., Hrsg., 3. Aufl., 399-415 (Clarendon Press) Oxford; F. Vögtle et al., Chem. Macrocycles, Springer Verlag, New York, 1985; G.W. Gokel et al., Hrsg., Macrocyclic Polyether Synthesis, Springer Verlag, New York, 1982; M. Hiraoka, Hrsg., Crown Compounds, Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1982; J.M. Lehn et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 6700-6707 (1975); G. Schwarzenbach et al., Helv. Chim. Acta 28, 828 (1945); S.F.A. Kettle, Koordinationsverbindungen, Taschentext 3, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1972; A.E. Martell et al., Die Chemie der Metallchelatverbindungen, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1958; M. Becke-Goehring et al., Komplexchemie, Springer-Verlag, 1970; F. Kober, Grundlagen der Komplexchemie, Otto-Salle-Verlag, Frankfurt/Main 1979; G. Schwarzenbach et al., Helv. Chim. Acta 31, 1029 (1948); R.G. Pearson et al., Science 151, 172 (1966).
  • Beispiele für Chelatbildner, die mehrwertige Ionen, insbesondere zweiwertige Kationen binden können, sind Ethylenglycolbis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (als EGTA bezeichnet) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
  • Es gibt viele bindende Agenzien, die mehrwertige Ionen binden können, z.B. EDTA und dessen Derivate, doch sind Agenzien, die einwertige Ionen binden, weniger üblich. Tetraphenylbor bindet Kalium-Ionen. Eine Gruppe von Verbindungen mit weitgefaßteren Möglichkeiten sind jedoch die Kryptanden, und sie sind Beispiele für Reagenzien, die einwertige Kationen in wäßrigen Lösungen selektiv binden können (R.M. Izatt et äl., Chem. Reviews 85, 271-339). Spezielle Beispiele für Kryptanden sind die Kryptofix -Verbindungen von Merck-Schuchardt, zum Beispiel:
  • 4,7,13,16,21-Pentaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.5]tricosan, Kryptofix 221, Seite 438, Merck-Schuchardt-Katalog von 1987/88, Nr. 810646 (K 221);
  • 4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan, Krypotfix 222, Seite 438, Merck-Schuchardt-Katalog von 1987/88, Nr. 810647 (K 222).
  • Als maskierende Verbindungen für die Beseitigung störender Anionen können die folgenden Substanzklassen möglicherweise verwendet werden: Anionkryptanden, Heterocyclophane, Katapinanden und anorganische Metallkomplexe oder unlösliche Salze. Spezielle Beispiele für Verbindungen, die Anionen komplexieren, sind in der Literatur beschrieben, z.B. Azamono- oder Azapolycyclen, makrocyclische quaternäre tetraedrische Verbindungen, makrocyclische Bismetall-Komplexe, Makrocyclen mit covalent eingebauten Lewis-Säure-Zentren, protonierte oder alkylierte quaternäre Kryptanden oder Katapinanden [F.P. Schmidtchen, Nachrichten Chem. Techn. Lab. 36(1), 1988, S. 8f; E. Graf, J. Amer. Chem. Soc. 98(20), 1976, 6403f; C.H. Park, J. Amer. Chem. Soc. 90(9), 1968, 2431f] sowie z.B. der Hexachlorokomplex von Fe(III) oder Silbernitrat.
  • Die analytische Anwendung von Kryptanden (z.B. Kryptofix 221, 222) zur volumetrischen Bestimmung von Li-, Na- und K- Ionen ist beschrieben in Chem. Abstr. 84: 25 385b. Es wird gezeigt, daß Li, K, Ca, Sr und Ba den Na-Nachweis stören.
  • Funktion der bindenden Agenzien: Die bindenden Agenzien werden für folgende Zwecke verwendet:
  • 1. Selektives Binden störender Ionen mit Hilfe eines ersten selektiv bindenden Agens.
  • 2. Zur Erniedrigung der Konzentration der Analyten auf optimales Meßniveau mit Hilfe eines zweiten selektiv bindenden Agens, falls eine Verdünnung der Probe nicht durchführbar ist. Die Verwendung eines selektiv bindenden Agens zur Erniedrigung der Konzentration des zu bestimmenden Analyten auf einen passenden Bereich für enzymatische Analysen dient zur Verdopplung der Empfindlichkeit des Verfahrens.
  • 3. Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren, wobei das zweite bindende Agens vorhanden ist und einen Komplex mit "Indikator"-Ionen bildet, aus dem die Indikator-Ionen stöchiometrisch durch die Analyt-Ionen verdrängt werden, und wobei der Einfluß der verdrängten Indikator-Ionen auf die Aktivität eines Enzyms geprüft wird, woraus sich ein indirektes Maß für die Konzentration der Analyt-Ionen ergibt. Bei einem solchen Verfahren ist beispielsweise das Enzym Pyruvatkinase, die Indikator-Ionen sind Kalium, das bindende Agens ist Kryptofix 221, und das zu bestimmende Ion ist Natrium; oder das Enzym ist eine Kinase, das Indikator-Ion ist Mg²&spplus;, das bindende Agens ist ein Chelatbildner, z.B. EDTA, und das Analyt-Ion ist ein Metall-Ion; oder das Enzym ist Pyridoxalkinase, das Indikator-Ion ist Zn²&spplus;, das bindende Agens ist Kryptofix 221, und das Analyt- Ion ist ein Schwermetall-Ion; oder das Enzym ist α-Amylase, das bindende Agens ist ein Metall aus der ersten und zweiten Nebengruppe (Nebengruppen Ib und IIb) des Periodensystems gemäß dem Periodensystem nach Mendelejew [Chemical Principles, von W.J. Masterton und E.J. Slowinski (3. Auflage); Saunders Golden Series, W.B. Saunders Company 1973], zum Beispiel Ag oder Hg, und das zu bestimmende Ion ist Chlorid; oder das Enzym ist Collagenase, das bindende Agens ist ein Chelatbildner wie z.B. EDTA, und das zu bestimmende Ion ist Calcium.
  • 4. Erstes und zweites bindendes Agens können die gleichen sein.
  • Flüssigkeiten für die Analyse: Die biologischen Flüssigkeiten, an denen die Messung von Analyten vorgenommen wird, sind zum Beispiel Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiß, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymph- oder Darmsekrete, Exsudate oder Transsudate. Nichtbiologische Flüssigkeiten sind Wasser oder wäßrige Extrakte oder Mischungen, wie Extrakte von Nahrungsmitteln oder Früchten, oder vergorene Flüssigkeiten wie etwa Wein.
    • Anwendung allgemeiner Prinzipien auf die Bestimmung von Natrium-Ionen
  • Anhand der Messung von Natrium-Ionen in Serum oder Plasma läßt sich am besten die Anwendung dieser Prinzipien bei der Regulierung der wirksamen Analyt-Konzentration erläutern. Eine Art der Messung von Natrium-Ionen, wie in dieser Erfindung ausgeführt, besteht in der Verwendung eines Enzyms, dessen Aktivität auf Natrium-Ionen anspricht. Ein Beispiel für ein derartiges Enzym ist β-Galactosidase (Kuby et al., J. Am. Chem. Soc. 75, 890, 1953; Lederberg, J. Bacteriology 60, 381, 1950). Allerdings liegt der Bereich der Natriumionen-Konzentration, gegenüber der dieses Enzym am empfindlichsten ist, weitaus niedriger als üblicherweise mit einer Plasmaprobe ohne einen Verdünnungsschritt erhalten werden kann.
  • Zur Einhaltung der in dieser Erfindung ausgeführten Prinzipien werden die folgenden Verfahrensweisen zur Erniedrigung der wirksamen Natriumionen-Konzentration auf optimales Niveau angewandt, wenn eine Verdünnung der Probe nicht durchführbar ist.
  • 1. Verwendung eines Natrium-Ionen bindenden Agens wie etwa Kryptofix 221.
  • 2. Verwendung von Lithium-Ionen als kompetitiver Hemmstoff für β-Galactosidase, wodurch die Empfindlichkeit des Enzyms gegenüber Natrium-Ionen herabgesetzt wird.
  • Durch Kombination der Verfahrensweisen 1 und 2 ist es ohne weiteres möglich, Natrium-Ionen in Plasma oder Serum unter Verwendung von β-Galactosidase zu bestimmen, und die Menge an bindendem Agens kann verändert werden, um das Signal für Natriumionen-Konzentrationen unter 110 mmol/l zu minimieren, während das Signal im normalen analytischen Bereich (110-170 mmol/l) verstärkt wird (Beispiel A).
  • Natrium-Ionen können auch mit Hilfe von Pyruvatkinase gemessen werden, vorausgesetzt, daß Bedingungen gewählt werden, durch welche die Stimulierung der Enzym-Aktivität durch Kalium-Ionen verringert wird, und der Reaktionsmischung ein Kalium-Ionen bindendes Agens, z.B. Kryptofix 222, beigegeben (Beispiel B) wird.
  • Bei einem anderen Verfahren zur Bestimmung der Natriumionen-Konzentration in Plasma läßt man die Natrium-Ionen Kalium-Ionen aus Kryptofix 221 verdrängen, wobei die freigesetzten Kalium-Ionen die Aktivität der Pyruvatkinase proportional zur Natriumionen-Konzentration im Plasma stimulieren (Beispiel C).
  • Weitere Ausführungsformen dieser Erfindung sind Zusammensetzungen und Reagenzien zur Bestimmung von Ionen in biologischen und nichtbiologischen Flüssigkeiten.
  • Das Reagens gemäß vorliegender Erfindung kann in gelöster oder trockener Form vorliegen. Es kann auf einem geeigneten Träger imprägniert vorliegen. Ein Diagnostikum in Form eines Teststreifens kann hergestellt werden durch Imprägnieren eines Trägermaterials, vorzugsweise Filterpapier, Cellulose oder synthetisches Faservues, mit Lösungen der erforderlichen, üblicherweise zur Herstellung von Teststreifen verwendeten Reagenzien in leicht flüchtigen Lösungsmitteln wie etwa Aceton. Dies kann in einem oder mehreren Imprägnierungsschritten erfolgen. Das fertige Testpapier kann als solches verwendet werden oder in bekannter Weise auf Halter aufgesteckt oder vorzugsweise luftdicht zwischen Kunstharzen und feinen Geweben eingeschlossen sein.
    • Bestimmung von Natrium-Ionen
  • In Prinzip ist das Messen von Natrium-Ionen unter Verwendung von PK ähnlich dem von Kalium-Ionen. Allerdings gibt es bestimmte zentrale Unterschiede. Im ersten Fall ist PK je nach den vorstehend beschriebenen Inkubationsbedingungen etwa 40-100mal empfindlicher gegenüber Kalium-Ionen als gegenüber Natrium-Ionen. Obwohl also die Natrium-Ionen im Plasma in einer Konzentration vorliegen, die etwa 30mal höher ist als die der Kalium-Ionen, können letztere die Messung der Natrium-Ionen stören.
  • Gemäß den in dieser Erfindung übernommenen allgemeinen Prinzipien werden Lithium-Ionen weggelassen, PK aus Kaninchenmuskeln wird gegenüber dem bakteriellen Enzym bevorzugt, und Mangan kann durch Magnesium-Ionen ersetzt werden. Bei einem Verfahren werden die Kalium-Ionen mit Kryptofix 222 spezifisch gebunden, und die Wirkung der Natrium-Ionen auf die PK-Aktivität wird direkt gemessen (Beispiel B).
  • Die typischen Konzentrationsbereiche der Hauptreagenzien für die enzymatische Bestimmung von Natrium-Ionen bei 37ºC unter Verwendung von Pyruvatkinase sind:
  • PK (Kaninchenmuskel) 50 E/l bis 10 000 E/l
  • PEP (neutralisiertes Tris-Salz) 0,3 mmol/l bis 30 mmol/l
  • Kryptofix 222 0,4 mmol/l bis 4 mmol/l
  • NADH 0,01 mmol/l bis 0,8 mmol/l
  • Puffer, pH 7 - 9 50 mmol/l bis 500 mmol/l
  • Mg²&spplus; 1 mmol/l bis 10 mmol/l
  • ADP (freie Säure) 0,5 mmol/l bis 10 mmol/l
  • LDH (Analysen bei 25ºC) 5000 E/l bis 100 000 E/l
  • Serumalbumin 0 g/l bis 5 g/l
  • GDH (analysiert bei 25ºC) 2500 E/l bis 20 000 E/l
  • KG (freie Säure) 1 mmol/l bis 10 mmol/l
  • Bei einem anderen Verfahren läßt man die Natrium-Ionen Kalium-Ionen aus Kryptofix 221 verdrängen, wobei die freigesetzten Kalium-Ionen die PK-Aktivität in einem Maß stimulieren, das abhängig von der Natriumionen-Konzentration ist (Beispiel C).
  • Die typischen Konzentrationsbereiche der Hauptreagenzien für die enzymatische Bestimmung von Natrium-Ionen bei 37ºC unter Verwendung von Pyruvatkinase zur Messung der Verdrängung von Kalium-Ionen aus Kryptofix 221 sind:
  • PK (Kaninchenmuskel) 50 E/l bis 10 000 E/l
  • PEP (neutralisiertes Tris-Salz) 0,3 mmol/l bis 30 mmol/l
  • Kryptofix 221 1 mmol/l bis 10 mmol/l
  • NADH 0,01 mmol/l bis 0,8 mmol/l
  • Puffer, pH 9 - 10 50 mmol/l bis 500 mmol/l
  • Mg²&spplus; 1 mmol/l bis 10 mmol/l
  • ADP (freie Säure) 0,5 mmol/l bis 10 mmol/l
  • LDH (Analysen bei 25ºC) 5000 E/L bis 100 000 E/l
  • KCl 2 mmol/l bis 10 mmol/l
  • Serumalbumin 0 g/l bis 5 g/l
  • GDH (analysiert bei 25ºC) 2500 E/l bis 20 000 E/l
  • KG (freie Säure) 1 mmol/l bis 10 mmol/l
  • Bei einer genaueren und präziseren Ausführungsform für die Bestimmung wird ein Natriumionen-abhängiges Enzym wie etwa β-Galactosidase verwendet (Beispiel D).
  • Blutplasma wird mit einer gepufferten Mischung inkubiert, die 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (NPG) und das Enzym β-D-Galactosidase enthält. Die durch β-D-Galactosidase katalysierte Reaktion ist von der Gegenwart von Natrium-Ionen abhängig, und der Aktivitätsgrad ist ein Maß für die Natriumionen-Konzentration. Ein zentrales Merkmal dieses Verfahrens ist die Verwendung einer geeigneten Menge eines Natriumion-selektiven bindenden Agens (z.B. Kryptofix 221) für Messungen in Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten, wo die Natriumionen-Konzentration 100 mmol/l übersteigen kann, um die Natriumionen-Konzentration abzusenken, damit das Enzym am empfindlichsten gegenüber geringfügigen Änderungen der Natriumionen-Konzentration im üblichen analytischen Bereich (110-170 mmol/l) wird. Unter den für die Analyse gewählten Bedingungen, wozu die Gegenwart mäßig hoher Konzentrationen an Magnesium- und Lithium-Ionen gehört, ist die Bildungsgeschwindigkeit von 2-Nitrophenol und Galactose praktisch proportional zur Konzentration der zu messenden Natrium-Ionen. Die Magnesium-Ionen sind für eine optimale β-Galactosidase-Aktivität erforderlich. Die Lithium-Ionen konkurrieren mit den Natrium-Ionen und erhöhen daher die Michaelis-Konstante Km des Enzyms für Natrium-Ionen.
  • Als Substrat für β-D-Galactosidase sind auch viele andere Verbindungen geeignet. Ganz allgemein wird die Galactosidase-haltige Probe mit einem geeigneten β-D-Galactosidase- Substrat gemischt, wobei das Substrat durch das Enzym gespalten wird und dann eines der Spaltprodukte in geeigneter Weise nachgewiesen wird. Es kann entweder das durch die Enzymwirkung freigesetzte Glykon oder das Aglykon gemessen werden. In der Regel wird letzteres bestimmt. Als Substrat kann das natürliche Substrat Lactose verwendet werden, doch ist die Verwendung eines chromogenen Galactosids besonders vorteilhaft. So werden in Biochem. Z. 333, 209 (1960), Phenyl-β-D-galactosid sowie einige weitere, am aromatischen Ring substituierte Derivate, zum Beispiel 2-Nitrophenyl-β-D-galactosid (NPG) und 3-Nitrophenyl-β-D-galactosid als Substrate für β-D-Galactosidase beschrieben. Die durch Hydrolyse freigesetzten Phenole werden photometrisch im UV- Bereich oder im Fall der Nitrophenole im kurzwelligen sichtbaren Wellenlängenbereich bestimmt. Als Indikatorreaktion kann sich auch eine oxidative Kupplung mit Aminoantipyrin anschließen [siehe Analytical Biochem. 40, 281 (1971)]. Weitere Substrate sind in der deutschen Offenlegungsschrift 33 45 748 und der deutschen Offenlegungsschrift 34 11 574 beschrieben.
  • Die typischen Konzentrationsbereiche der Hauptreagenzien für die enzymatische Bestimmung von Natrium-Ionen bei 37ºC unter Verwendung einer 10 µl-Plasma- oder Serumprobe sind:
  • β-D-Galactosidase 25 E/l bis 7500 E/l
  • NPG 0,25 mmol/l bis 5 mmol/l
  • Kryptofix 221 0 mmol/l bis 10 mmol/l
  • Puffer, pH 7 - 9,5 200 mmol/l bis 500 mmol/l
  • Mg²&spplus; 0,01 mmol/l bis 10 mmol/l
  • EGTA (Lithium-Salz) 0 mmol/l bis 20 mmol/l
  • Serumalbumin 0 g/l bis 5 g/l
  • EGTA bedeutet Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure. Möglich ist auch die enzymatische Durchführung der Analyse von Natrium- und Kalium-Ionen in der gleichen Küvette in Form eines Doppeltests (siehe Beispiel D).
    • Beispiel A
  • Messung der Natriumionen-Konzentration unter Verwendung von β-D-Galactosidase.
  • Variante a: Die fertige Inkubationsmischung enthält:
  • 300 mmol/l Tris-HCl, pH 8,7 (37ºC)
  • 4 mmol/l Dithiothreit
  • 7,5 mmol/l Magnesiumsulfat
  • 16 mmol/l Lithiumchlorid
  • 0,44 mmol/l EGTA (Lithiumsalz)
  • 460 mg/l Humanserumalbumin
  • 760 E/l β-Galactosidase
  • 1,5 mmol/l NPG
  • 1,25 µmol/Assay Kryptofix 221
  • Zur Bestimmung der Bildungsgeschwindigkeit des freien 2-Nitrophenols und damit der Konzentration an Natrium-Ionen in der ursprünglichen Probe wird die Reaktion bei einer Wellenlänge von 420 nm (oder nahe dabei) verfolgt.
  • Variante b: Ein alternativer Ansatz im Vergleich zu Variante a wäre die Verringerung der Probenkonzentration um das Zehnfache durch vorheriges Verdünnen oder die Verwendung eines kleinen Probenvolumens, wobei der Kryptand weggelassen werden kann.
  • Variante c: Messung in Flüssigkeiten mit niedrigem Gehalt an Natrium-Ionen (z.B. < 20 mmol/l), wobei der Kryptand weggelassen werden kann.
    • Beispiel B
  • Messung von Natrium-Ionen mit Pyruvatkinase (direkte Stimulierung der Enzym-Aktivität durch Natrium-Ionen) unter Bedingungen, bei denen die Empfindlichkeit für Kalium-Ionen herabgesetzt ist.
  • Variante a: Für eine 10 µl-Plasmaprobe enthält die Inkubationsmischung:
  • 300 mmol/l Tris-HCl, pH 8,7 (37ºC)
  • 5 mmol/l MgCl&sub2;
  • 2,6 mmol/l ADP (freie Säure)
  • 2,9 mmol/l PEP (neutralisiertes Tris-Salz)
  • 0,34 mmol/l NADH
  • 17 000 E/l LDH (analysiert bei 25ºC)
  • 2000 E/l PK (aus Kaninchenmuskeln, analysiert bei 37ºC)
  • 4 mmol/l KG
  • 8600 E/l GDH in Glycerin (analysiert bei 25ºC)
  • 1,25 µmol/Assay Kryptofix 222
  • Die Natriumion-Eichlösungen enthalten 4 mmol/l Kalium zur Kompensierung der aktivierenden Kalium-Wirkung der Serum- Kahumionen auf Pyruvatkinase.
    • Beispiel C
  • Messung von Natrium-Ionen mit Pyruvatkinase (Assay unter kompetitiver Bindung) - bekannte Kaliumionen-Konzentration.
  • Für eine 10 µl-Plasmaprobe enthält die fertige Inkubationsmischung:
  • 300 mmol/l Glycin, pH 9,8
  • 5 mmol/l MgCl&sub2;
  • 2,6 mmol/l ADP (freie Säure)
  • 2,9 mmol/l PEP (neutralisiertes Tris-Salz)
  • 0,34 mmol/l NADH
  • 17 000 E/l LDH (analysiert bei 25ºC)
  • 890 E/l PK (aus Kaninchenmuskeln, analysiert bei 37ºC)
  • 4 mmol/l KG
  • 8500 E/l GDH (analysiert bei 25ºC)
  • 5 mmol/l KCl
  • 2,5 µmol/Assay Kryptofix 221
  • Diesem Reagens wird Kaliumchlorid zugesetzt, welches stöchiometrisch durch Natrium-Ionen aus dem Kryptofix 221 verdrängt wird, was die Quantifizierung der Natriumionen- Konzentration der Probe ermöglicht.
    • Beispiel D
  • Messung der Kalium- und Natriumionen-Konzentration in der gleichen Küvette (Doppeltest)
  • Zunächst wird die Natriumionen-Konzentration wie in Beispiel D analysiert, außer daß die Probe zudem enthält:
  • 2,6 mmol/l ADP (freie Säure)
  • 2,9 mmol/l PEP (neutralisiertes Tris-Salz)
  • 0,4 mmol/l NADH
  • 4,0 mmol/l KG
  • 8600 E/l GDH
  • Nach Messen der Natrium-Ionen durch Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit wird der pH der Inkubationsmischung mit einem Aliquot Salzsäure auf pH 7,4 abgesenkt.
  • Dann werden die folgenden Bestandteil zugesetzt, um die angegebenen Endkonzentrationen zu ergeben:
  • 17 000 U//l LDH
  • 890 E/l PK aus Bacillus stearothermophilus
  • 3,0 mmol/l MnCl&sub2;
  • 20,0 mmol/l LiCl
  • Die Reaktionsgeschwindigkeit kann dann bei 340 nm überwacht werden, sie kann aber auch bei einer etwas höheren Wellenlänge gemessen werden, um eine mögliche Störung durch das bei der Natriumion-Indikatorreaktion freigesetzte 2-Nitrophenol zu minimieren.

Claims (27)

1. Verfahren zur Bestimmung von Natrium-Ionen in Flüssigkeiten, wobei der Einfluß der Ionen auf die Aktivität einer Transferase, einer Hydrolase oder einer Oxidoreduktase gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeit eine biologische oder nichtbiologische Flüssigkeit ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die biologische Flüssigkeit Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiß, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymph- oder Darmsekret, Exsudat oder Transsudat ist, und die nichtbiologische Flüssigkeit Wasser oder ein wäßriger Extrakt oder eine Mischung ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Transferase phosphorhaltige Gruppen überträgt und die Hydrolase eine Glycosidase ist oder auf Peptidbindungen einwirkt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Hydrolase &alpha;- oder &beta;-D-Galactosidase aus Escherichia coli, Carboxypeptidase A aus Rinderpankreas, Collagenase aus Clostridium hystolicum, Amylase aus Speichel oder Pankreas, Calpain I, Calpain II, Phosphoglycolatphosphatase, Dipeptidylaminopeptidase I (Kathepsin C) ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Transferase Pyruvatkinase, Hexokinase, Adenylatkinase, Pyridoxalkinase oder Acetatkinase ist und die Hydrolase &alpha;- oder &beta;-D-Galactosidase aus E. coli oder Carboxypeptidase aus Rinderpankreas ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Oxidoreduktase auf die Gruppe CH-OH von Donormolekülen oder auf die Aldehyd- oder Oxo-Gruppe von Donoren einwirkt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Oxidoreduktase Glycerindehydrogenase aus Enterobacter aerogenes, Acetaldehyddehydrogenase aus Hefe oder Tyrosinase (Catechinoxidase) ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Natrium-Ionen durch Verwendung des Enzyms Pyruvatkinase aus Kaninchenmuskeln oder &beta;-D-Galactosidase aus E. coli bestimmt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die störenden Ionen mit einem ersten bindenden Agens maskiert werden und wobei die Konzentration der zu bestimmenden Natrium-Ionen mit Hilfe eines zweiten bindenden Agens auf optimales Niveau für die Messung abgesenkt wird, wenn eine Verdünnung der Probe nicht durchführbar ist und/oder die Affinität des Enzyms gegenüber den zu bestimmenden Ionen verringert werden muß.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die störenden Ionen oder Analyten durch Kryptanden, Coronanden, Podanden, Kronenether, Spheranden, Hemispheranden, Calixarene und Kombinationen derselben, natürlich vorkommende Ionophore, cyclische Peptide, Komplexone und Chelatbildner und Derivate derselben gebunden werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die störenden Kalium-Ionen bei der Bestimmung der Natrium- Ionen mit Kryptofix 222 gebunden werden.
13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Konzentration an freien Natrium-Ionen bei der Bestimmung der Natrium- Ionen unter Verwendung von &beta;-Galactosidase mit einem zweiten bindenden Agens abgesenkt und/oder die Affinität des Enzyms gegenüber Natrium-Ionen mit Lithium- Ionen verringert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 und 13, wobei das zweite bindende Agens Kryptofix 221 ist.
15. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die zweiten bindenden Agenzien nach Anspruch 11 vorhanden sind und einen Komplex mit Indikator-Ionen bilden, aus dem die Indikator- Ionen stöchiometrisch durch die Natrium-Ionen verdrängt werden, welche die zu bestimmenden Analyten sind, und wobei der Einfluß der verdrängten Indikator-Ionen auf die Aktivität des Enzyms geprüft wird, woraus sich ein indirektes Maß für die Konzentration der Natrium-Ionen ergibt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Enzym Pyruvatkinase ist, die Indikator-Zonen Kalium sind, und das zweite bindende Agens Kryptofix 221 ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder 14 bis 16, wobei der Assay Ionen einschließt, die kompetitive Hemmstoffe für das sensitive Indikatorenzym sind.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der kompetitive Hemmstoff Lithium-Ion ist.
19. Zusammensetzung zur Bestimmung von Natrium-Ionen in Flüssigkeiten, umfassend eine Transferase, eine Hydrolase oder eine Oxidoreduktase, deren Aktivität durch die Natrium-Ionen beeinflußt wird, und ein erstes bindendes Agens, das die störenden Ionen in der Flüssigkeit bindet, und/oder ein zweites bindendes Agens, das die Konzentration der Natrium-Ionen auf ein optimales Niveau für die Messung absenkt.
20. Zusammensetzung nach Anspruch 19 zur Bestimmung von Natrium-Ionen, umfassend Pyruvatkinase und einen Kryptanden.
21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei der Kryptand Kryptofix 222 ist.
22. Zusammensetzung nach Anspruch 19 zur Bestimmung von Natrium-Ionen, umfassend &beta;-D-Galactosidase und einen Kryptanden.
23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der Kryptand Kryptofix 221 ist.
24. Zusammensetzung zur Bestimmung von Natrium-Ionen, umfassend:
&beta;-D-Galactosidase 25 E/l bis 7500 E/l
NPG 0,25 mmol/l bis 5 mmol/l
Kryptofix 221 0 mmol/l bis 10 mmol/l
Puffer, pH 7 - 9,5 200 mmol/l bis 500 mmol/l
Mg²&spplus; 0,01 mmol/l bis 10 mmol/l
EGTA (Lithium-Salz) 0 mmol/l bis 20 mmol/l
Serumalbumin 0 g/l bis 5 g/l
25. Zusammensetzung zur Bestimmung von Natrium-Ionen, die vorzugsweise bei 37ºC verwendet wird, umfassend:
PK (Kaninchenmuskel) 50 E/l bis 10 000 E/l
PEP (neutralisiertes Tris-Salz) 0,3 mmol/l bis 30 mmol/l
Kryptofix 221 1 mmol/l bis 10 mmol/l
NADH 0,01 mmol/l bis 0,8 mmol/l
Puffer, pH 9 - 10 50 mmol/l bis 500 mmol/l
Mg²&spplus; 1 mmol/l bis 10 mmol/l
ADP (freie Säure) 0,5 mmol/l bis 10 mmol/l
LDH (analysiert bei 25ºC) 5000 E/l bis 100 000 E/l
KCl 2 mmol/l bis 10 mmol/l
Serumalbumin 0 g/l bis 5 g/l
GDH (Analyse bei 25ºC) 2500 E/l bis 20 000 E/l
KG (freie Säure) 1 mmol/l bis 10 mmol/l
26. Messung der Kalium- und Natriumionen-Konzentration in der gleichen Küvette durch Analysieren der Natriumionen-Konzentration wie in Anspruch 17 mit Hilfe einer Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit, Absenken des pH der Inkubationsmischung und anschließendes Messen der Kaliumionen-Konzentration.
27. Messung der Kalium- und Natriumionen-Konzentration in der gleichen Küvette durch Analysieren der Natriumionen-Konzentration wie in Anspruch 20 mit Hilfe einer Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit, wobei der Assay
Tris-HCl, pH 8,7 (37ºC)
Dithiothreit
Magnesiumsulfat
Lithiumchlorid
EGTA (Lithiumsalz)
Humanserumalbumin
&beta;-Galactosidase
NPG
Kryptofix 221
AbF (freie Säure)
PEF (neutralisiertes Tris-Salz)
NADH
GDH
enthält, Absenken des pH der Inkubationsmischung und Zusetzen der Bestandteile
LDH
MnCl&sub2;
LiCl.
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