JPS6236199A - カルシウムイオンの定量法 - Google Patents
カルシウムイオンの定量法Info
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- JPS6236199A JPS6236199A JP17378385A JP17378385A JPS6236199A JP S6236199 A JPS6236199 A JP S6236199A JP 17378385 A JP17378385 A JP 17378385A JP 17378385 A JP17378385 A JP 17378385A JP S6236199 A JPS6236199 A JP S6236199A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はカルシウムイオンの定量法に関し、さらに詳し
くはカルシウム・カルモジュリン複合体を形成させ、こ
れによってカルモジュリン依存性酵素を活性化させ、そ
の活性を測定することによってカルシウムイオンを定量
する方法に関する。
くはカルシウム・カルモジュリン複合体を形成させ、こ
れによってカルモジュリン依存性酵素を活性化させ、そ
の活性を測定することによってカルシウムイオンを定量
する方法に関する。
従来の技術および問題点
カルシウムは生体内金属の１つで骨、歯、硬組織に存在
しているが、血清中には１０ｍｇ／ｃｌｊ！前後、尿中
には４〜１２■／ａ前後含まれている。カルシウムイオ
ンは細胞内での情報伝達物質で、神経の伝達や筋収縮・
弛援及び分泌系の調節を行っている。従ってカルシウム
イオンの定量は副甲状腺機能亢進症、ビタミンＤ欠乏症
、腎不全等の診断に有用である。血中あるいは尿中のカ
ルシウムイオンは濃度が比較的高いにもかかわらず、従
来の測定法は操作が繁雑である。すなわち、カルシウム
イオンの測定に関しては化学的比色法（Ｏｒｔｈｏｃｒ
ｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ法
Ｃ０ＣＰＣ法） 、 Ｃｏｎｎｅｒｙ。
しているが、血清中には１０ｍｇ／ｃｌｊ！前後、尿中
には４〜１２■／ａ前後含まれている。カルシウムイオ
ンは細胞内での情報伝達物質で、神経の伝達や筋収縮・
弛援及び分泌系の調節を行っている。従ってカルシウム
イオンの定量は副甲状腺機能亢進症、ビタミンＤ欠乏症
、腎不全等の診断に有用である。血中あるいは尿中のカ
ルシウムイオンは濃度が比較的高いにもかかわらず、従
来の測定法は操作が繁雑である。すなわち、カルシウム
イオンの測定に関しては化学的比色法（Ｏｒｔｈｏｃｒ
ｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ法
Ｃ０ＣＰＣ法） 、 Ｃｏｎｎｅｒｙ。
）１． Ｖ、 ＆ Ｂｒ１ｇｇ５．＾、 Ｒ，； Ａｍ
、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｐａｔｈ、。
、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｐａｔｈ、。
４５ 、２９０．１９６６ ）原子吸光法（Ｚｅｌｔｎ
ｅｒ、 Ａ、＆Ｓｅ１１ｇ５ｏｎ、 Ｄ、 ： Ｃ１１
ｎ、 Ｃｈｅｍｏ、 １０ 、８６９．１９６４）イオ
ン電極法（Ａｒｎｏｌｄ、口、 Ｂ、：Ａｍｅｒ、Ｊ、
Ｃｌ１ｎ。
ｅｒ、 Ａ、＆Ｓｅ１１ｇ５ｏｎ、 Ｄ、 ： Ｃ１１
ｎ、 Ｃｈｅｍｏ、 １０ 、８６９．１９６４）イオ
ン電極法（Ａｒｎｏｌｄ、口、 Ｂ、：Ａｍｅｒ、Ｊ、
Ｃｌ１ｎ。
Ｐａｔｈ、 、 ４９． ６２７．１９６８）などが知
られているがいずれも操作が複雑で他物質の影響を受け
やすい。
られているがいずれも操作が複雑で他物質の影響を受け
やすい。
問題点を解決するための手段
本発明によれば試料中のカルシウムイオンと蛋白カルモ
ジュリンとを結合させてカルシウム・カルモジュリン複
合体を生成させ、この複合体によってカルモジュリン依
存性酵素を活性化させ、この酵素活性を測定することに
よってカルシウムイオンを定量することができる。
ジュリンとを結合させてカルシウム・カルモジュリン複
合体を生成させ、この複合体によってカルモジュリン依
存性酵素を活性化させ、この酵素活性を測定することに
よってカルシウムイオンを定量することができる。
本発明の原理は次のとおりである。
カルシウムイオンは不活性型のカルモジュリンと反応し
て活性型のカルシウム・カルモジュリン複合体を生成す
る。この複合体に不活性型のカルモジュリン依存性酵素
例えばホスホジェステラーゼを作用させるとこの酵素が
活性化される。この活性化された酵素の酵素活性を測定
することによって試料中のカルシウムイオンを定量する
ことができる。本発明方法を実施するに際してはまずカ
ルシュラムイオンを含有する試料の一定量とカルモジュ
リン含有緩衝液とを混合して反応を行わせる。反応液に
カルモジュリン依存性酵素及びその基質を加えて反応さ
せ反応生成物の検出できる変化の割合を定量する。予め
求めておいた検量線から該変化の割合に対応するカルシ
ウムイオンを求めることができる。
て活性型のカルシウム・カルモジュリン複合体を生成す
る。この複合体に不活性型のカルモジュリン依存性酵素
例えばホスホジェステラーゼを作用させるとこの酵素が
活性化される。この活性化された酵素の酵素活性を測定
することによって試料中のカルシウムイオンを定量する
ことができる。本発明方法を実施するに際してはまずカ
ルシュラムイオンを含有する試料の一定量とカルモジュ
リン含有緩衝液とを混合して反応を行わせる。反応液に
カルモジュリン依存性酵素及びその基質を加えて反応さ
せ反応生成物の検出できる変化の割合を定量する。予め
求めておいた検量線から該変化の割合に対応するカルシ
ウムイオンを求めることができる。
カルシウムイオンを含有する試料としては通常血液（特
に血清）、尿等が例示される。
に血清）、尿等が例示される。
カルモジュリンは哺乳動物各組織、植物、原生動物、腔
腸動物、微生物にューロスポラ・クラップ、エシェリヒ
ア・コリ等）などから抽出したものが用いられるが、好
適な例として牛の脳由来のものがあげられる。牛脳カル
モジ５’Ｊンは牛脳大脳皮質を破砕後、遠心分離の上清
をＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけ、濃度勾配法で溶
出すると、カルモジュリンとカルモジュリン依存性ホス
ホジェステラーゼがそれぞれ分別して得られる。これら
を更に一般的な蛋白質精製手段を用いて精製することに
より、高度に精製されたカルモジュリンとカルモジュリ
ン依存性ホスホジェステラーゼが得られる。
腸動物、微生物にューロスポラ・クラップ、エシェリヒ
ア・コリ等）などから抽出したものが用いられるが、好
適な例として牛の脳由来のものがあげられる。牛脳カル
モジ５’Ｊンは牛脳大脳皮質を破砕後、遠心分離の上清
をＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけ、濃度勾配法で溶
出すると、カルモジュリンとカルモジュリン依存性ホス
ホジェステラーゼがそれぞれ分別して得られる。これら
を更に一般的な蛋白質精製手段を用いて精製することに
より、高度に精製されたカルモジュリンとカルモジュリ
ン依存性ホスホジェステラーゼが得られる。
カルシウム含有試料に対するカルモジュリン含有緩衝液
の使用比率は検出操作が正確に行なえる域内で各試料に
つき適切な量を設定する。例えば試料が血清の場合は緩
衝液で１００〜５０００倍に希釈し、希釈液１４〜ｌ＋
ｎｌに対し、カルモジュリン含有緩衝液１４〜１ｍ１（
カルモジュリン０．１〜５０ｕ含有）の割合で使用する
。
の使用比率は検出操作が正確に行なえる域内で各試料に
つき適切な量を設定する。例えば試料が血清の場合は緩
衝液で１００〜５０００倍に希釈し、希釈液１４〜ｌ＋
ｎｌに対し、カルモジュリン含有緩衝液１４〜１ｍ１（
カルモジュリン０．１〜５０ｕ含有）の割合で使用する
。
カルシウムイオンとカルモジュリンとの混合溶液は５〜
５０℃、ｐＨ４〜１０で３０秒〜１０分間インキニベー
トすること１こより、カルモジュリン・カルシウム複合
体溶液を得ることができる。
５０℃、ｐＨ４〜１０で３０秒〜１０分間インキニベー
トすること１こより、カルモジュリン・カルシウム複合
体溶液を得ることができる。
用いられる緩衝剤としては後述の酵素反応で用いられる
例がいずれも使用できる。
例がいずれも使用できる。
カルモジュリン依存性酵素としては、カルシウム・カル
モジュリン複合体によって活性化される酵素であればい
ずれのものでもよく、例えばホスホジェステラーゼ、ア
デニル酸シクラーゼ、ＮＡＤキナーゼ、プロティンキナ
ーゼ、トリプトファン水酸化酵素、ＡＴＰアーゼ、タン
パク質リン酸化酵素などが使用される。好適な酵素の例
としては牛の脳より得られるホスホジェステラーゼがあ
げられる。
モジュリン複合体によって活性化される酵素であればい
ずれのものでもよく、例えばホスホジェステラーゼ、ア
デニル酸シクラーゼ、ＮＡＤキナーゼ、プロティンキナ
ーゼ、トリプトファン水酸化酵素、ＡＴＰアーゼ、タン
パク質リン酸化酵素などが使用される。好適な酵素の例
としては牛の脳より得られるホスホジェステラーゼがあ
げられる。
これらのカルモジュリン依存性酵素はいずれも公知の酵
素であり、それぞれ対応する基質がいずれも知られてい
るので、用いる酵素に対応した基質を用いればよい。
素であり、それぞれ対応する基質がいずれも知られてい
るので、用いる酵素に対応した基質を用いればよい。
これらの酵素反応をカルシウム・カルモジュリン腹合体
の存在下に行うことによって検出できる変化としては基
質の減少あるいは生成物があげられる。これらの変化が
直接定量できるときは公知の手法に従って定量すればよ
い。
の存在下に行うことによって検出できる変化としては基
質の減少あるいは生成物があげられる。これらの変化が
直接定量できるときは公知の手法に従って定量すればよ
い。
生成物を直接定量できないときは簡単に定量できる化合
物に変換して定量することが望ましい。
物に変換して定量することが望ましい。
例えば生成物が過酸化水素である場合もしくは生成物を
分解するオキシダーゼを作用させて化学量論的に過酸化
水素を生成させることができる場合には過酸化水素を色
原体の存在下パーオキシダーゼの作用によって色素に変
換させ、生成色素による反応液の着色による吸収を色素
の極大吸収波長で測定することによって生成物を定量で
き結果としてカルシウムイオンを定量できる。
分解するオキシダーゼを作用させて化学量論的に過酸化
水素を生成させることができる場合には過酸化水素を色
原体の存在下パーオキシダーゼの作用によって色素に変
換させ、生成色素による反応液の着色による吸収を色素
の極大吸収波長で測定することによって生成物を定量で
き結果としてカルシウムイオンを定量できる。
これらの反応は順次行っても良いが、好ましくは酵素反
応に必要な基質、酵素１色源体を加えて一段階で反応を
行わせ反応液の吸収を測定することによっても目的は達
せられる。
応に必要な基質、酵素１色源体を加えて一段階で反応を
行わせ反応液の吸収を測定することによっても目的は達
せられる。
生成物の定量は上記以外に多くの手法が知られているの
でこれらを適宜組合せて行うことができる。
でこれらを適宜組合せて行うことができる。
酵素反応を一段階で行う際には試薬液として酵素反応に
必要な酵素、基質９色源体等を含有する緩衝液を調製す
る。それぞれの成分は反応を行わせるに充分な量を含有
させればよいが通常試薬１ｍｌ中に各酵素を０．０ｌ−
１０Ｕ、基質を０．１〜１０μｍｏｌ 、及び生成物定
量システムを含有させた試薬液を調製する。
必要な酵素、基質９色源体等を含有する緩衝液を調製す
る。それぞれの成分は反応を行わせるに充分な量を含有
させればよいが通常試薬１ｍｌ中に各酵素を０．０ｌ−
１０Ｕ、基質を０．１〜１０μｍｏｌ 、及び生成物定
量システムを含有させた試薬液を調製する。
生成物定量システムは生成物の定量法に応じて必要な酵
素１色源体等を必要量、通常かなり過剰量含有させた組
成物からなる。
素１色源体等を必要量、通常かなり過剰量含有させた組
成物からなる。
前述のカルシウム・カルモジュリン複合体溶液にこれら
と１〜２５倍容の試薬液を加える。
と１〜２５倍容の試薬液を加える。
反応は５〜５０℃、ｐＨ４〜１０で３０秒〜６０分間反
応させる。反応後選択した生成物定量システムに従って
生成物を定量する。
応させる。反応後選択した生成物定量システムに従って
生成物を定量する。
１例としてカルモジュリン依存性酵素としてホスホジェ
ステラーゼ、その基質としてｃ Ａ Ｍ Ｐを用いた場
合における酵素反応系について詳しく説明する。ｃＡＭ
Ｐはホスホジェステラーゼにより５’−ＡＭＰに変換さ
れるが、この５’−ＡＭＰを定量する方法として、５’
−ＡＭＰを５′−ヌクレオテダーゼでアデノシンとリン
酸にし、リン酸を化学的又は酵素的に測定する方法やア
デノンンをヌクレオンドオキンダーゼで酸化して測定す
る方法、５’−／ＩＩＰをアデニル酸キナーゼ、ピルビ
ン酸キナーゼ、ホスホエノールピリビン酸（ＰＥＰ）、
ピルビン酸オキシダーゼを用いて生ずる過酸化水素を測
定する方法や、ピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用
いてＮＡＤＨの変化量で測定する方法、５ ’−ＡＭＰ
をアデニンホスホリボンルトランスフエラーゼ、アデニ
ンデアミナーゼ、キサンチンオキシダーゼを用いて反応
させ、生成する過酸化水素を測定する方法などあげられ
る。
ステラーゼ、その基質としてｃ Ａ Ｍ Ｐを用いた場
合における酵素反応系について詳しく説明する。ｃＡＭ
Ｐはホスホジェステラーゼにより５’−ＡＭＰに変換さ
れるが、この５’−ＡＭＰを定量する方法として、５’
−ＡＭＰを５′−ヌクレオテダーゼでアデノシンとリン
酸にし、リン酸を化学的又は酵素的に測定する方法やア
デノンンをヌクレオンドオキンダーゼで酸化して測定す
る方法、５’−／ＩＩＰをアデニル酸キナーゼ、ピルビ
ン酸キナーゼ、ホスホエノールピリビン酸（ＰＥＰ）、
ピルビン酸オキシダーゼを用いて生ずる過酸化水素を測
定する方法や、ピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用
いてＮＡＤＨの変化量で測定する方法、５ ’−ＡＭＰ
をアデニンホスホリボンルトランスフエラーゼ、アデニ
ンデアミナーゼ、キサンチンオキシダーゼを用いて反応
させ、生成する過酸化水素を測定する方法などあげられ
る。
上記した酵素反応は以下の式で示される。
ホスホジェステラーゼの活性化
Ｃａ２＋−カルモジｌリン （活性型） ＋ホスホジェ
ステラーゼ （不活性型）ホスホジェステラーゼ （活
（ｆｔ［＞５’−／ＭＰの生成 ５’−ＡＭＰの定量 ５′−ヌクレオチダーゼ ■５’−ＡＭＰ ＋ Ｈ，Ｏアデノシン ＋
リン 酸１１．酸。イ）’ｉ”ｔ ”柊酩４で±−林ゴ
ｅｉ＋’ｊ’ｒｆ”ｒ。１１ｇ−ｘ−１−’Ｊｙヤ↓ 検出 ２（アセチルリン酸） ＋２ＣＯ２＋２８２０２検出 ↓ 検出 次に上記■の場合を例にとり具体的操作を説明する。ま
ずホスホ−ジェステラーゼ、ｃＡＭＰ。
ステラーゼ （不活性型）ホスホジェステラーゼ （活
（ｆｔ［＞５’−／ＭＰの生成 ５’−ＡＭＰの定量 ５′−ヌクレオチダーゼ ■５’−ＡＭＰ ＋ Ｈ，Ｏアデノシン ＋
リン 酸１１．酸。イ）’ｉ”ｔ ”柊酩４で±−林ゴ
ｅｉ＋’ｊ’ｒｆ”ｒ。１１ｇ−ｘ−１−’Ｊｙヤ↓ 検出 ２（アセチルリン酸） ＋２ＣＯ２＋２８２０２検出 ↓ 検出 次に上記■の場合を例にとり具体的操作を説明する。ま
ずホスホ−ジェステラーゼ、ｃＡＭＰ。
５′−ヌクレオチダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ、キサンヤーキシダーゼ、イノシン、生成した過
酸化水素定量システム例えば、色素に導くためのパーオ
キシダーゼ、電子供与体、フェノール系化合物及び必要
に応じて金属イオン、界面活性剤等を緩衝液に含有させ
た試薬液を調製する。試薬液中の各成分の濃度としては
ホスホジェステラーゼ１〜１００ｍｕ／ｍＬ ｃＡＭＰ
ｏ、１〜５μｍｏｌ ７〜Ｉ、５′−ヌクレオチダーゼ
０．１〜２０ｕ ７〜Ｉ、プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ１〜１００ｍｕ／ｍｌ、キサンチンオキシダーゼ
１〜１００ｍｕ／ｍｌ、イノシフ０．１〜Ｉ Ｑ μｍ
ｏｌ、ホスホジ、ｌｒ−ステラーゼが反応するのに必要
なＭｇ２ゝ０．１〜５μｍｏｌ ７〜Ｉ、５′−ヌクレ
オチダーゼ活性発現に要なＭｎ”０．１〜２０ μｍｏ
ｌ ７〜Ｉ、パーオキシダーゼ１〜１００ ｕ／ｍｌ、
電子供与体Ｑ、１〜ｌ Ｏａ＋ ｍｏｌ／１、フェノー
ル系化合物０．１〜１００ｍ ｍｏ＋／βがそれぞれ適
当である。電子供与体としては４−アミノアンチピリン
（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾロヒドラ
チン（ＭＢＴＨ）、２−ヒドラジノベンゾチアゾール（
ＨＢＴ）、２−アミノベンゾチアゾール（ＡＢＩ）等が
用いられる。フェノール系化合物としてはフェノール、
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセ
チルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、３．５−キシレノ
ーノペＮ、Ｎ−ジメチルアニリン、ジエチルアニリン、
０−クマリンｅ、８−アミノキノリン酸、１−アミノ−
８−ナフトール−２，４−ジスルホニックアシッド（Ｓ
Ｓ酸）、Ｎ（β−ハイドロキシ−γ−スルフォプロビル
）＝３．５−ジエチルアニリン（Ｈ３ＤΔ）等カルいら
れる。金属イオンとしては上記したごとくＭｇ”、Ｍｎ
”が必要であるが、これらのイオンを与える化合物とし
ては硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マンガ
ン、塩化マンガン等が用いられる。界面活性剤としては
トライトンＸ−１００等が用いられる。
ラーゼ、キサンヤーキシダーゼ、イノシン、生成した過
酸化水素定量システム例えば、色素に導くためのパーオ
キシダーゼ、電子供与体、フェノール系化合物及び必要
に応じて金属イオン、界面活性剤等を緩衝液に含有させ
た試薬液を調製する。試薬液中の各成分の濃度としては
ホスホジェステラーゼ１〜１００ｍｕ／ｍＬ ｃＡＭＰ
ｏ、１〜５μｍｏｌ ７〜Ｉ、５′−ヌクレオチダーゼ
０．１〜２０ｕ ７〜Ｉ、プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ１〜１００ｍｕ／ｍｌ、キサンチンオキシダーゼ
１〜１００ｍｕ／ｍｌ、イノシフ０．１〜Ｉ Ｑ μｍ
ｏｌ、ホスホジ、ｌｒ−ステラーゼが反応するのに必要
なＭｇ２ゝ０．１〜５μｍｏｌ ７〜Ｉ、５′−ヌクレ
オチダーゼ活性発現に要なＭｎ”０．１〜２０ μｍｏ
ｌ ７〜Ｉ、パーオキシダーゼ１〜１００ ｕ／ｍｌ、
電子供与体Ｑ、１〜ｌ Ｏａ＋ ｍｏｌ／１、フェノー
ル系化合物０．１〜１００ｍ ｍｏ＋／βがそれぞれ適
当である。電子供与体としては４−アミノアンチピリン
（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾロヒドラ
チン（ＭＢＴＨ）、２−ヒドラジノベンゾチアゾール（
ＨＢＴ）、２−アミノベンゾチアゾール（ＡＢＩ）等が
用いられる。フェノール系化合物としてはフェノール、
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセ
チルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、３．５−キシレノ
ーノペＮ、Ｎ−ジメチルアニリン、ジエチルアニリン、
０−クマリンｅ、８−アミノキノリン酸、１−アミノ−
８−ナフトール−２，４−ジスルホニックアシッド（Ｓ
Ｓ酸）、Ｎ（β−ハイドロキシ−γ−スルフォプロビル
）＝３．５−ジエチルアニリン（Ｈ３ＤΔ）等カルいら
れる。金属イオンとしては上記したごとくＭｇ”、Ｍｎ
”が必要であるが、これらのイオンを与える化合物とし
ては硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マンガ
ン、塩化マンガン等が用いられる。界面活性剤としては
トライトンＸ−１００等が用いられる。
緩衝液としてはリン酸バッファー、イミダゾールバッフ
ァー、トリスバッファー、コハク酸バッファー、クエン
酸バッファ―、ホウ酸バッファー、酢酸バッファー、グ
リシルグリシンバッファーなどが用いられる。試薬液中
の緩衝剤の濃度としては０．０１〜ｌ ｍｏｌ ／βが
好適である。
ァー、トリスバッファー、コハク酸バッファー、クエン
酸バッファ―、ホウ酸バッファー、酢酸バッファー、グ
リシルグリシンバッファーなどが用いられる。試薬液中
の緩衝剤の濃度としては０．０１〜ｌ ｍｏｌ ／βが
好適である。
カルシウム・カルモジュリン複合体溶液とこれに対し１
〜２５倍容量の試薬液とを混合し、５〜４５℃、好まし
くは２０〜４０℃、ｐＨ４〜１０で３０秒〜６０分間酵
素反応を行わせる。
〜２５倍容量の試薬液とを混合し、５〜４５℃、好まし
くは２０〜４０℃、ｐＨ４〜１０で３０秒〜６０分間酵
素反応を行わせる。
上記■の酵素反応を使用する場合には該当する■の酵素
反応系に代えヌクレオシドオキシダーゼ０、Ｏ１〜１０
ｕ ７ｍＭを用いる以外は■の場合と同様に操作すれ
ばよい。■の酵素反応を使用する場合はアデニル酸キナ
ーゼ、及びピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダ
ーゼをそれぞれ０．０１〜１０ｕ／ｍ＋、ＡＴＰｏ、１
〜１０μｍｏｌ／ｍｌ。
反応系に代えヌクレオシドオキシダーゼ０、Ｏ１〜１０
ｕ ７ｍＭを用いる以外は■の場合と同様に操作すれ
ばよい。■の酵素反応を使用する場合はアデニル酸キナ
ーゼ、及びピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダ
ーゼをそれぞれ０．０１〜１０ｕ／ｍ＋、ＡＴＰｏ、１
〜１０μｍｏｌ／ｍｌ。
Ｐ Ｅ Ｐ Ｏ，１〜１０ μｍｏｌ ７ｍＭ、 リ
ン酸０．１〜１０μｍｏｌ ７ｍＭ、パーオキシダーゼ
、電子供与体、フェノール系化合物を含有する試薬液を
調製し、■の場合と同様に反応させる。上記でパーオキ
シダーゼ、電子供与体、フェノール系化合物の濃度は■
の場合と同様でよく、又電子供与体、フェノール系化合
物としては■の場合と同様のものが使用できる。■の酵
素反応を使用する場合はアデニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ、アデニンデアミナーゼ及びキサンチンオ
キシダーゼを０．Ｏ１〜１０ｕ／ｍ１、ピロリン酸０．
１〜１０ μｍｏｌ ７ｍＭ。
ン酸０．１〜１０μｍｏｌ ７ｍＭ、パーオキシダーゼ
、電子供与体、フェノール系化合物を含有する試薬液を
調製し、■の場合と同様に反応させる。上記でパーオキ
シダーゼ、電子供与体、フェノール系化合物の濃度は■
の場合と同様でよく、又電子供与体、フェノール系化合
物としては■の場合と同様のものが使用できる。■の酵
素反応を使用する場合はアデニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ、アデニンデアミナーゼ及びキサンチンオ
キシダーゼを０．Ｏ１〜１０ｕ／ｍ１、ピロリン酸０．
１〜１０ μｍｏｌ ７ｍＭ。
パーオキシダーゼ、電子供与体、フェノール系化合物を
含有する試薬液を調製し、■の場合と同様に反応させる
。上記でパーオキシダーゼ、電子供与体、フェノール系
化合物の濃度は■の場合と同様でよく、又電子供与体、
フェノール系化合物としては■の場合と同様のものが使
用できる。
含有する試薬液を調製し、■の場合と同様に反応させる
。上記でパーオキシダーゼ、電子供与体、フェノール系
化合物の濃度は■の場合と同様でよく、又電子供与体、
フェノール系化合物としては■の場合と同様のものが使
用できる。
酵素反応後、反応液の可視部吸収を４００〜７８０ｎｍ
、好ましくは５００〜６００ｎｍの波長域で分光光度計
などを用いて測定し、一定濃度のＣａ”イオン含有溶液
に上記一連の操作を適用して予め作成した検量線より試
料中のカルシウムイオンを定量する。
、好ましくは５００〜６００ｎｍの波長域で分光光度計
などを用いて測定し、一定濃度のＣａ”イオン含有溶液
に上記一連の操作を適用して予め作成した検量線より試
料中のカルシウムイオンを定量する。
以下に本発明の態様を実施例によって説明する。
実施例１
牛脳カルモジュリンと牛脳カルモジュリン依存性ホスホ
ジェステラーゼを用いてカルシウムイオンの検量曲線を
求める。
ジェステラーゼを用いてカルシウムイオンの検量曲線を
求める。
０〜１０μＭのカルシウムイオンを含有する１０Ｊｌ！
ｌの試料に０．２０＃ｌ力ルモジニリン溶液１０ｍを加
えて３７℃で５分間反応させる。この反応液（２０ｄ）
に下記２種の方法により成分をそれぞれに示す量（もし
くは濃度）含有する試薬溶液及び水（合計２９８０ＪＩ
ｉ）を加えて３７℃で５分間インキュベーションした後
反応液の５００ｎｍにおける吸収を測定し検量曲線を得
た。
ｌの試料に０．２０＃ｌ力ルモジニリン溶液１０ｍを加
えて３７℃で５分間反応させる。この反応液（２０ｄ）
に下記２種の方法により成分をそれぞれに示す量（もし
くは濃度）含有する試薬溶液及び水（合計２９８０ＪＩ
ｉ）を加えて３７℃で５分間インキュベーションした後
反応液の５００ｎｍにおける吸収を測定し検量曲線を得
た。
カルシウムイオン２〜１０μＭの範囲で直線的比例関係
が得られている。
が得られている。
Δ）５’−ＡＭＰを５′−ヌクレオチダーゼで分解し、
生成したリン酸を酵素法で測定する。
生成したリン酸を酵素法で測定する。
試薬溶液
ホスホジェステラーゼ １２ｍＭ １０戚１０ｍＭ
Ｍｇ５Ｏ＜ ・５８２０ ５０ ”６
０ｍＭ ｕｎｉ ２ ５ Ｑ ／１
５′−ヌクレオチダーゼ １０ｍＭ １０ 〃１０
ｍＭイノシン ４０〃ブリンヌクレ
オシドホスホリラー’ｌ １０ｍＭ
１０／／キサンチンオキシダーゼ
１０ｍＭ １０ 〃パー
オキシダーゼ（２ｍｇ／ｍｌ） １００ 〃４２ｍＭ
フェノール ５００〃２．４ｄ４−ア
ミノアンチピリン ５００〃リン酸緩衝液（Ｉ）８７
．５） １０００ ”６ｍＭ ｃ−ＡＭＰ
５０ ／／”２０
６５０ 〃計２９８０〃 検量線が第１図に示される。
Ｍｇ５Ｏ＜ ・５８２０ ５０ ”６
０ｍＭ ｕｎｉ ２ ５ Ｑ ／１
５′−ヌクレオチダーゼ １０ｍＭ １０ 〃１０
ｍＭイノシン ４０〃ブリンヌクレ
オシドホスホリラー’ｌ １０ｍＭ
１０／／キサンチンオキシダーゼ
１０ｍＭ １０ 〃パー
オキシダーゼ（２ｍｇ／ｍｌ） １００ 〃４２ｍＭ
フェノール ５００〃２．４ｄ４−ア
ミノアンチピリン ５００〃リン酸緩衝液（Ｉ）８７
．５） １０００ ”６ｍＭ ｃ−ＡＭＰ
５０ ／／”２０
６５０ 〃計２９８０〃 検量線が第１図に示される。
Ｂ）５’−ＡＭＰをアデニル酸キナーゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを用いて反応させ生成
した過酸化水素を測定 試薬溶液 ホスホジェステラーゼ １２ｍＭ １０顔１０ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ４・５１（２０５０ＩＩ５′−ヌクレオチ
ダーゼ ｌＱｍｕ １ ｏ ７６０ｍＭ ＬｌｎＣ
ｊ２２ ５０ 〃アデニル酸キナー
ゼ １０ｍＭ ５０〃１０ｍＭ ＡＴＰ
１
０ ０ ”ピルビン酸キナ−ｆ
ｌ（１ｍＭ ５０１／１０ｍＭ
ＰＥＰ（ホスホエノール ピルビン 酸）
１００ 〃１０ｍＭ リン酸
１００〃ピルビン酸オキシダーゼ
ｌＱｍｕ ５ ０ 〃パーオキシ
ダーゼ（２■／ｍ＋） １００〃４２ｍＭ フェノ
ール ５００〃２．４ｍＭ４−アミノアン
チピリン ５００〃リン酸緩衝液（ｐｆ１７．５）
１０００ 〃６１ＴＩＭ Ｃ−ＡＭＰ
５０ ”Ｈ２Ｏ２６０” 計２９８０〃 検量線が第２図に示される。
ナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを用いて反応させ生成
した過酸化水素を測定 試薬溶液 ホスホジェステラーゼ １２ｍＭ １０顔１０ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ４・５１（２０５０ＩＩ５′−ヌクレオチ
ダーゼ ｌＱｍｕ １ ｏ ７６０ｍＭ ＬｌｎＣ
ｊ２２ ５０ 〃アデニル酸キナー
ゼ １０ｍＭ ５０〃１０ｍＭ ＡＴＰ
１
０ ０ ”ピルビン酸キナ−ｆ
ｌ（１ｍＭ ５０１／１０ｍＭ
ＰＥＰ（ホスホエノール ピルビン 酸）
１００ 〃１０ｍＭ リン酸
１００〃ピルビン酸オキシダーゼ
ｌＱｍｕ ５ ０ 〃パーオキシ
ダーゼ（２■／ｍ＋） １００〃４２ｍＭ フェノ
ール ５００〃２．４ｍＭ４−アミノアン
チピリン ５００〃リン酸緩衝液（ｐｆ１７．５）
１０００ 〃６１ＴＩＭ Ｃ−ＡＭＰ
５０ ”Ｈ２Ｏ２６０” 計２９８０〃 検量線が第２図に示される。
実施例２
血清中のカルシウムイオンの定量
血清１０ρそリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で５００倍希
釈し、希釈液１０ＪＩ！ｌに０．２Ｕ／ｍのカルモジュ
リン溶液１０頭を加え、３７℃、５分間インキニペーシ
ョン後、実施例１の２）の方法と同様に処理して検量線
よりカルシウムイオン濃度を求めた。その結果を第１表
に示す。同一の試料についてＥＤＴＡ滴定法［：Ｊ、Ｌ
ａｂ、Ｃｌ１ｎ、 Ｍｅｄ、 ６１１０２９（１９６３
） ）より求めた結果を第１表に示す。
釈し、希釈液１０ＪＩ！ｌに０．２Ｕ／ｍのカルモジュ
リン溶液１０頭を加え、３７℃、５分間インキニペーシ
ョン後、実施例１の２）の方法と同様に処理して検量線
よりカルシウムイオン濃度を求めた。その結果を第１表
に示す。同一の試料についてＥＤＴＡ滴定法［：Ｊ、Ｌ
ａｂ、Ｃｌ１ｎ、 Ｍｅｄ、 ６１１０２９（１９６３
） ）より求めた結果を第１表に示す。
第 １ 表
本発明によればカルシウムイオンを迅速かつ簡便に定量
することができる。
することができる。
第１図及び第２図は牛脳カルモジュリンと牛脳カルモジ
ュリン依存性ホスホジェステラーゼを用いて求めたカル
シウムイオンの検量線を示す。 第１図は５’−ＡＭＰを５′−ヌクレオチダーゼで分解
し生成したリン酸を酵素法で測定した場合を、第２図は
、５’−ＡＭＰをアデニル酸キナーゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを用いる酵素法で測定し
た場合を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社纂 １ 囚 （Ｃａ”］（μ間） 第 ２ 口 ［Ｃα２＋］（ＡＭ〕
ュリン依存性ホスホジェステラーゼを用いて求めたカル
シウムイオンの検量線を示す。 第１図は５’−ＡＭＰを５′−ヌクレオチダーゼで分解
し生成したリン酸を酵素法で測定した場合を、第２図は
、５’−ＡＭＰをアデニル酸キナーゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを用いる酵素法で測定し
た場合を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社纂 １ 囚 （Ｃａ”］（μ間） 第 ２ 口 ［Ｃα２＋］（ＡＭ〕
Claims (1)
- 試料中のカルシウムイオンとカルモジュリンとを反応さ
せてカルシウム・カルモジュリン複合体を形成させ、生
成したカルシウム・カルモジュリン複合体によってカル
モジュリン依存性酵素を活性化させ、該酵素活性を測定
することを特徴とするカルシウムイオンの定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17378385A JPS6236199A (ja) | 1985-08-07 | 1985-08-07 | カルシウムイオンの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17378385A JPS6236199A (ja) | 1985-08-07 | 1985-08-07 | カルシウムイオンの定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6236199A true JPS6236199A (ja) | 1987-02-17 |
Family
ID=15967068
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17378385A Pending JPS6236199A (ja) | 1985-08-07 | 1985-08-07 | カルシウムイオンの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6236199A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05276993A (ja) * | 1987-04-10 | 1993-10-26 | Flinders Univ Of South Asutralia | 液体中のカルシウムイオンを測定する方法及びそのための組成物 |
| US5369219A (en) * | 1991-06-18 | 1994-11-29 | Multimedia Design, Inc. | Multi-layer printed circuit board apparatus and method for making same |
| US5618684A (en) * | 1992-02-07 | 1997-04-08 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method of determination of calcium |
| EP0776979A1 (en) | 1995-11-28 | 1997-06-04 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method and reagent for measuring an ion by using maltose derivatives |
| US6387646B1 (en) | 1998-12-11 | 2002-05-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Reagent compositions for measuring electrolyte |
-
1985
- 1985-08-07 JP JP17378385A patent/JPS6236199A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05276993A (ja) * | 1987-04-10 | 1993-10-26 | Flinders Univ Of South Asutralia | 液体中のカルシウムイオンを測定する方法及びそのための組成物 |
| US5369219A (en) * | 1991-06-18 | 1994-11-29 | Multimedia Design, Inc. | Multi-layer printed circuit board apparatus and method for making same |
| US5618684A (en) * | 1992-02-07 | 1997-04-08 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method of determination of calcium |
| EP0776979A1 (en) | 1995-11-28 | 1997-06-04 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method and reagent for measuring an ion by using maltose derivatives |
| US5948632A (en) * | 1995-11-28 | 1999-09-07 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method and reagent for measuring chlorine and calcium ions using a maltose derivative |
| US6387646B1 (en) | 1998-12-11 | 2002-05-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Reagent compositions for measuring electrolyte |
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