JPH04218385A - Ｒ（−）−マンデル酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＲ（−）−マンデル酸の
製造法に関する。更に詳しくは、マンデロニトリルに対
して不斉加水分解能を有する微生物を用いて、Ｒ（−）
−マンデル酸を製造する方法に関する。Ｒ（−）−マン
デル酸は、セフェム系抗生物質の合成原料として、また
、多種の医農薬品の合成原料として工業的に重要である
。

【０００２】

【従来の技術とその問題点】Ｒ（−）−マンデル酸の製
造法として公知のものに化学的に合成したＲ，Ｓ−マン
デル酸（ラセミ体）を、（１）　分別結晶によるラセミ
分割〔特開昭５８−１７７９３３　号公報参照〕、（２
）　クロマトグラフィーによるラセミ分割〔ＥＰ　９８
７０７号公報参照〕、（３）　ラセミ体エステルと成し
酵素的不斉加水分解によるラセミ分割〔Ｋ．　Ｍｏｒｉ
　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　３６，　
９１　（１９８０）　参照〕するなどのラセミ分割法、
（４）　キラル試薬を用いた化学的不斉合成法〔Ｄ．　
Ａ．　Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃ
ｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　　１０７，　４３４６　（１９８
５）　参照〕などが有る。また、生物学的方法としては
、上記のエステル不斉加水分解法のほかに、（５）　ベ
ンゾイルギ酸の微生物的不斉還元〔特開昭５７−１９８
０９６　号公報参照〕、（６）　Ｄ−オキシニトリラー
ゼにより不斉合成したＲ（−）−マンデロニトリルの加
水分解〔特開昭６３−２１９３８８　号公報参照〕、（
７）　アルカリゲネス属、シュウドモナス属、ロドシュ
ウドモナス属、コリネバクテリウム属、アシネトバクタ
ー属、バチルス属、マイコバクテリウム属、ロドコッカ
ス属またはキャンディダ属の微生物によるラセミ体のマ
ンデロニトリルまたはマンデルアミドの不斉加水分解に
よるＲ（−）−マンデル酸の製造法〔特開平２−８４１
９８　号公報参照〕などが知られている。

【０００３】しかし、ラセミ分割による方法はいずれの
方法においてもプロセスの複雑化と各段階での収率の低
下を引き起こすこと、キラル試薬を触媒とした不斉合成
法ではキラル試薬が高価である上に高い光学純度の生成
物が得にくいという問題がある。生物学的方法であるベ
ンゾイルギ酸の不斉還元法においては基質の合成とＮＡ
ＤＨ再成系の維持に難点が有り、またＤ−オキシニトリ
ラーゼ法は未だ充分な工業化研究が行なわれていない。 ラセミ体のマンデロニトリルまたはマンデルアミドから
のＲ（−）−マンデル酸の生産に関しては、ラセミ体の
原料から直接優位量の光学活性体を得るものではなく、
残存する他方の光学活性を有する未反応のニトリルもし
くはアミドは回収され、酸を用いた加水分解により他方
の光学活性な有機酸に変換されるか、アルカリ処理によ
りラセミ体となし、再び原料として使用され、Ｒ（−）
−マンデル酸の生産に利用されている。この方法におい
ても残存する他方の光学活性なマンデロニトリルまたは
マンデルアミドの分離とアルカリ処理によるラセミ化反
応のプロセスは複雑となり、収率の低下も引き起こされ
ることになる。このように従来の方法は種々の問題点を
含み、いずれも工業的に有利なＲ（−）−マンデル酸の
製造法とはなり難い。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、Ｒ（−
）−マンデル酸の工業的に有利な製造方法の開発を目的
に検討を進めた結果、Ｒ，Ｓ−マンデロニトリル、また
はベンズアルデヒドと青酸の混合系に、中性付近ないし
は塩基性の水性媒体中で、該ニトリルに対して加水分解
能を有する微生物を作用させることにより、定量的にＲ
，Ｓ−マンデロニトリル、またはベンズアルデヒドと青
酸をＲ（−）−マンデル酸に変換し得ることを見出し本
発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、シュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　属、アルカリゲネス（Ａｌ−
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ）　属またはカセオバクター（Ｃａ
−ｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、Ｒ，Ｓ−マンデロニ
トリルのニトリル基を立体選択的に加水分解する能力を
有する微生物または該処理物を、中性付近ないし塩基性
の水性媒体中で、Ｒ，Ｓ−マンデロニトリルまたはベン
ズアルデヒドと青酸の混合物に作用させることにより、
原料のＲ，Ｓ−マンデロニトリルまたはベンズアルデヒ
ドと青酸から直接優位量のＲ（−）−マンデル酸を生成
せしめることを特徴とするＲ（−）−マンデル酸の製造
法、である。

【０００６】上記したところを要旨とする本発明は、Ｒ
，Ｓ−マンデロニトリルが、中性付近ないしは塩基性の
水性媒体中で、ベンズアルデヒドと青酸との間で解離平
衡することによりマンデロニトリルが容易にラセミ化す
るという性質を利用し、このラセミ化反応の系とマンデ
ロニトリルの不斉加水分解活性を有する微生物とを共役
させることにより、Ｒ，Ｓ−マンデロニトリルを直接Ｒ
−体優位にＲ（−）−マンデル酸に変換し得るとの本発
明者らにより見出された知見に基づくものである。

【０００７】本発明に用いられる微生物は、シュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　属、アルカリゲネス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　属、アシネトバクター（
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）　属またはカセオバクタ
ー（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）　属に属するＲ（−）−
マンデル酸生産菌であり、具体的には、シュードモナス
　ｓｐ．　ＢＣ１３−２　（微工研条寄第３３１９号）
、シュードモナス　ｓｐ．　ＢＣ１５−２　（微工研条
寄第３３２０号）、アルカリゲネス　ｓｐ．　ＢＣ１２
−２　（微工研菌寄第１１２６３　号）、アルカリゲネ
ス　ｓｐ．　ＢＣ２０　（微工研菌寄第１１２６４　号
）、アルカリゲネスｓｐ．　ＢＣ３５−２（微工研条寄
第３３１８号）、アルカリゲネス　ｓｐ．　ＢＣ２４　
（微工研菌寄第１２０６３　号）、アシネトバクター　
　ｓｐ．　ＢＣ９−２　（微工研条寄第３３１７号）、
カセオバクター　ｓｐ．　ＢＣ４（微工研条寄第３３１
６号）およびカセオバクター　ｓｐ．　ＢＣ２３　（微
工研菌寄第１１２６１　号）の菌株を挙げることができ
る。これらの微生物は、いずれも本発明者により見出さ
れ工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に上記番
号にて寄託されており、それぞれの菌学的性質は以下に
示すとおりである。

【表１】

【表２】

【０００８】以上の菌学的性質をバージェーズ　　マニ
ュアルオブ　　システマティック　　バクテリオロジー
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ
ｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１９８６）
に従って分類すると、ＢＣ１３−２およびＢＣ１５−２
菌株はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　属
、ＢＣ１２−２、ＢＣ２０、ＢＣ３５−２およびＢＣ２
４菌株はアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　
属、ＢＣ９−２　菌株はアシネトバクター（Ａｃｉｎｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ）　属、ＢＣ４　およびＢＣ２３菌株
はカセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）　属に属
する細菌と同定された。

【０００９】次に本発明の実施態様について説明する。 本発明に使用される微生物の培養は、資化し得る炭素源
（グリセロール、グルコース、サッカロース、カザミノ
酸、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ラクトース、
フルクトースなど）、窒素源（酵母エキスなど）、各微
生物に必須の無機塩（塩化マグネシウム、硫酸ナトリウ
ム、塩化カルシウム、硫酸マンガン、塩化鉄、硫酸亜鉛
など）等を含有した通常の培地を用いて行われる。

【００１０】培養初期または中期に生育を大きく阻害し
ない濃度のニトリル類（ケイ皮酸ニトリル、ベンジルシ
アニド、イソブチロニトリル、β−フェニルプロピオニ
トリル、ベンゾニトリル、２−シアノピリジン、３−シ
アノピリジン、４−シアノピリジン、フェニルスルフォ
ニルアセトニトリル、ε−カプロラクタム、γ−ブチロ
ニトリル、Ｎ（２−シアノエチル）モルホリン、アミド
類（イソブチルアミド、４−ピリジンカルボン酸アミド
、フェニルアセトアミドなど）の添加は、高い酵素活性
が得られるので好ましい。培養液のｐＨは４〜１０の範
囲で、培養は温度２０〜５０℃で、１〜７日程度好気的
に行われる。

【００１１】マンデロニトリルの不斉加水分解は、上記
の様にして培養した微生物の培養液から分離した菌体ま
たは菌体処理物（増殖後の菌体の破砕物、乾燥菌体ある
いは分離精製されたマンデロニトリル不斉加水分解酵素
など）等を水または緩衝液に懸濁し、これにマンデロニ
トリルまたはベンズアルデヒドと青酸を共存させればよ
い。本発明においては、前述のようにマンデロニトリル
をラセミ化するために、反応中、系を中性付近ないしは
塩基性に保つことが必須であり、ｐＨを４〜１１、好ま
しくは６〜１０に調整する。その他、本発明における反
応条件は、ベンズアルデヒドや青酸に対する酵素の感受
性により一概に特定し得ないが、通常、反応液中のマン
デロニトリルは　０．１〜２．０　重量％、好ましくは
　０．５〜１．０　重量％、ベンズアルデヒドは　０．
１〜１．０　重量％、好ましくは　０．１〜０．５重量
％、青酸は　０．１〜０．５　重量％、好ましくは　０
．１〜０．２　重量％であり、マンデロニトリルに対す
る微生物の使用量は、乾燥菌体として０．０１〜５．０
　重量％、反応温度は０〜５０℃、好ましくは１０〜３
０℃で　０．１〜２４時間反応させればよい。

【００１２】加水分解反応で生成したＲ（−）−マンデ
ル酸は公知の方法、例えば遠心分離により微生物を除き
、さらに必要であれば限外ろ過などにより顆粒成分と蛋
白、多糖成分の除去を行ない、また必要であれば活性炭
処理を施した後、減圧濃縮、または酸性下での有機溶媒
による抽出を行ない、酢酸エチルエステルなどを用いて
再結晶をくり返すことにより高純度結晶を得ることがで
きる。

【００１３】

【発明の効果】本発明によれば、光学純度がほぼ　１０
０％ｅｅでＲ（−）−マンデル酸酸への選択性がほぼ定
量的であり、ラセミ体のＲ，Ｓ−マンデロニトリルまた
はベンズアルデヒドと青酸から光学分割することなく直
接優位量（５０〜１００％）のＲ（−）−マンデル酸が
製造でき、化学量論的に全ての原料をＲ（−）−マンデ
ル酸に変換することも可能であり、極めて効率のよいＲ
（−）−マンデル酸の製造法を提供し得る。

【００１４】

【実施例】次に、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではな
い。

【００１５】実施例１ （１）　培養 表１に示す菌株を下記の条件で培養した。 ｉ）　培地 グリセロール　　　　　　　　　　　　　２．０　　％
（Ｗ／Ｖ）酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　　
０．３０　％（Ｗ／Ｖ）リン酸一カリウム　　　　　　
　　　０．６８　％（Ｗ／Ｖ）リン酸二ナトリウム　　
　　　　　０．７１　％（Ｗ／Ｖ）硫酸ナトリウム　　
　　　　　　　　　０．２８　％（Ｗ／Ｖ）塩化マグネ
シウム　　　　　　　　　０．０４　％（Ｗ／Ｖ）塩化
カルシウム　　　　　　　　　　０．００４　％（Ｗ／
Ｖ）硫酸マンガン　　　　　　　　　　４×１０−４％
（Ｗ／Ｖ）塩化鉄　　　　　　　　　　　　　　　　６
×１０−５％（Ｗ／Ｖ）硫酸亜鉛　　　　　　　　　　
　　　　３×１０−５％（Ｗ／Ｖ）寒天　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１．８０　％（Ｗ／Ｖ）
ベンジルシアニド　　　　　　　　　０．０２　％（Ｗ
／Ｖ）ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　７．５ｉｉ）培養条件 上記平板培地にて３０℃、７２時間培養した。

【００１６】（２）　マンデロニトリルの不斉加水分解
平板培地から菌体を採集し５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
　７．５）で洗浄し、同リン酸緩衝液１０ｍｌに懸濁し
、ＯＤ６３０　＝１〜５０となる様な菌体濃度の休止菌
体反応液を調整した。この液にマンデロニトリルを　０
．２％（Ｗ／Ｖ）となる様に添加し、３０℃で１６〜２
４時間反応を行った。反応終了液を液体クロマトグラフ
ィー（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ　ＯＤＳｃｏｌｕｍｎ）　によ
り分析を行ったところ、マンデル酸とアンモニアが生成
していた。また、光学分割用キラルセル（ＣＨＩＲＡＬ
ＰＡＫ　ＷＨ　ｃｏｌｕｍｎ）により光学純度を分析し
たところ、高い光学純度のＲ（−）−マンデル酸を生成
していた。結果を表１に示す。

【表３】

【００１７】実施例２ （１）　培養 アルカリげネス　ｓｐ．　ＢＣ１２−２　株を下記の条
件で養した。 ｉ）　培地 （Ａ培地） グリセロール　　　　　　　　　　　　　２．０　　％
（Ｗ／Ｖ）酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　　
０．３０　％（Ｗ／Ｖ）リン酸一カリウム　　　　　　
　　　０．６８　％（Ｗ／Ｖ）リン酸二ナトリウム　　
　　　　　０．７１　％（Ｗ／Ｖ）硫酸ナトリウム　　
　　　　　　　　　０．２８　％（Ｗ／Ｖ）塩化マグネ
シウム　　　　　　　　　０．０４　％（Ｗ／Ｖ）塩化
カルシウム　　　　　　　　　　０．００４　％（Ｗ／
Ｖ）硫酸マンガン　　　　　　　　　　４×１０−４％
（Ｗ／Ｖ）塩化鉄　　　　　　　　　　　　　　　　６
×１０−５％（Ｗ／Ｖ）硫酸亜鉛　　　　　　　　　　
　　　　３×１０−５％（Ｗ／Ｖ）ｐＨ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　７．５　（Ｂ培地） Ａ培地に０．０２％（Ｗ／Ｖ）のベンジルシアニドを添
加したものをＢ培地とする ｉｉ）培養条件 Ａ培地にて３０℃、７２時間培養後、得られた菌体を更
にＢ培地にて３０℃、４８時間培養した。

【００１８】（２）　マンデロニトリルの不斉加水分解
得られた培養液から菌体を分離して５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ　７．５）で洗浄し、同リン酸緩衝液１００ｍ
ｌ　に懸濁し、休止菌体反応液を調整した（ＯＤ６３０
　＝５０．４８）。この液にマンデロニトリルを　０．
２ｇ添加し、３０℃で反応を行った。 反応開始後１時間でマンデロニトリルが完全に消失し、
Ｒ（−）−マンデル酸とアンモニアがほぼ定量的に生成
していた。さらにマンデロニトリルを　０．２ｇを１時
間毎に逐次添加しながら反応を続け都合１４時間反応を
行った。液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｓｅｉ−ｄｏ
　ＯＤＳ　ｃｏｌｕｍｎ）により分析を行ったところ、
反応開始後１４時間で２．７３％（Ｗ／Ｖ）（転換収率
；　８８．９３％）のＲ（−）−マンデル酸アンモニウ
ムが蓄積した。反応終了液は遠心除菌後、酸処理により
ｐＨ　２とし酢酸エチルエステルにてマンデル酸を抽出
した。得られたマンデル酸溶液は無水硫酸ナトリウムで
乾燥した後、有機溶媒を溜去することにより粗結晶を得
た。得られた結晶は酢酸エチルエステルにより再結晶を
行い白色粉末結晶を得た。尚、得られた結晶と標準のマ
ンデル酸は６Ｎアンモニア水に溶解後、　１．０％（Ｗ
／Ｖ）の濃度となる様に蒸留水でメスアップしてマンデ
ル酸アンモニウムとなし、表２にその分析結果を示す。

【表４】

【００１９】実施例３ （１）　培養 アルカリゲネス　ｓｐ．　ＢＣ３５−２　株を実施例２
と同様の培養条件で培養した。 （２）　マンデロニトリルの不斉加水分解得られた培養
液から実施例１と同様の方法で菌体を取得し、菌体濃度
ＯＤ６３０　＝５９．５０　にて実施例１と同一の反応
条件で反応を開始し、蓄積試験を行った。反応開始後１
４時間までは、基質は完全に消失し、反応開始後、４２
時間で反応液中のマンデル酸アンモニウム含量は３．７
９％（Ｗ／Ｖ）（転換収率；８９．０９　％）まで蓄積
した。以下、実施例２と同様の操作を行い、表３に示す
結果を得た。

【表５】

【００２０】実施例４ （１）　培養 シュ−ドモナス　ｓｐ．　ＢＣ１２−２　株を実施例２
と同様の培養条件で培養した。 （２）　ベンズアルデヒドと青酸からのＲ（−）−マン
デル酸の生産 得られた培養液から、実施例１と同様の方法で菌体を取
得し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）１００ｍ
ｌ　に懸濁し、休止菌体反応液を調整した（ＯＤ６３０
　＝５０．５）　。この液にベンズアルデヒドと青酸を
各々について終濃度１５ｍＭとなる様な濃度に添加し、
３０℃で反応を開始した。反応開始後１時間で解離平衡
により生成したマンデロニトリルおよびベンズアルデヒ
ドが完全に消失しＲ（−）−マンデル酸とアンモニアが
定量的に生成していた。さらにベンズアルデヒドと青酸
各１５ｍＭを１時間毎に逐次添加したところ反応開始後
１４時間で　２．６％（Ｗ／Ｖ）のＲ（−）−マンデル
酸アンモニウムが蓄積した（転換収率；８４．７％）。 また、実施例２と同様の操作を行ったところ、光学純度
は　１００％ｅｅであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　属、アル
   カリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　属、アシネト
   バクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）　属またはカ
   セオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）　属に属し、
   Ｒ，Ｓ−マンデロニトリルのニトリル基を立体選択的に
   加水分解する能力を有する微生物または該処理物を、中
   性付近ないし塩基性の水性媒体中で、Ｒ，Ｓ−マンデロ
   ニトリルまたはベンズアルデヒドと青酸の混合物に作用
   させることにより、原料のＲ，Ｓ−マンデロニトリルま
   たはベンズアルデヒドと青酸から直接優位量のＲ（−）
   −マンデル酸を生成せしめることを特徴とするＲ（−）
   −マンデル酸の製造法。