JPH11243979A - ピルビン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フマル酸を原料とし、プロセスが単純で工業
的に有利なピルビン酸の製造方法を提供すること 【解決手段】 環状イミド資化性を有し、フマル酸をピ
ルビン酸に変換する能力を持つアシネトバクター属やサ
ッカロマイセス属などの微生物をフマル酸に作用させ、
生成するピルビン酸を採取することを含むピルビン酸の
製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、環状イミド化合物
を資化する活性を有し、フマル酸をピルビン酸に変換す
る活性を有する微生物をフマル酸に作用させ、生成する
ピルビン酸を採取することを特徴とするピルビン酸の製
造法に関する。ピルビン酸は、生体代謝の重要中間体で
あり、各種アミノ酸ならびに医薬、農薬等の合成原料と
して有用である。

【０００２】

【従来の技術】従来、発酵法によるピルビン酸の製法と
して各種微生物を糖質を炭素源とする発酵培地に培養
し、培養液中にピルビン酸を蓄積させる方法が知られて
いる。これまでに各種微生物を酢酸、プロピオン酸を主
炭素源とする培地で培養する方法（特公昭51-34475）、
炭素数2-10の脂肪酸アミドを主炭素源とする培地で培養
する方法（特公昭52-112）、グルコン酸含有培地で培養
する方法（特公昭51-38792）、糖質を主炭素源とする発
酵培地に培養する方法（特公昭57-796、特公昭51-3447
5、特開昭57-159492 、特開昭61-146190 ）が発酵法に
よるピルビン酸の製法として知られている。しかしなが
ら、発酵法による製法は発酵時間も長く、副生物が多い
ため工業的に満足のいくものではなかった。

【０００３】これらの欠点を解決すべく微生物の培養物
を酵素源として基質を変換する方法が開発された。微生
物変換による反応としては、例えばL-酒石酸にL-酒石酸
デヒドラターゼ活性を有する微生物を作用させ、L-酒石
酸をピルビン酸に変換する方法（特開昭60-248187 、特
開昭61-12293）、フマル酸をピルビン酸に変換する能力
を持つ微生物をフマル酸に作用させる方法（特開昭61-4
0796）、フマラーゼ、ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシ
ラーゼおよびＮＡＤＨオキシダーゼの存在下にフマル
酸、金属イオン、ＮＡＤもしくはＮＡＤＨを反応させる
方法（特開昭64-43197）が知られている。しかし、L-酒
石酸をピルビン酸に変換する方法（特開昭60-248187 、
特開昭61-12293）では反応速度、収率、転換率の向上を
図るためには反応を不活性ガスシール下で行う必要があ
るため、工業的スケールでの反応は難しい。また、フマ
ル酸をピルビン酸に変換する能力を持つ微生物をフマル
酸に作用させる方法（特開昭61-40796）は収率が低く、
実際的な収率でピルビン酸を得るには反応液中に2-ケト
カルボン酸を添加する必要があるため経済的に不利であ
る。また反応時に2-ケトカルボン酸に対応するアミノ酸
が同時に副生してしまうため、反応液からピルビン酸を
分離精製するのが煩雑となる。フマラーゼ、ピルビン酸
−リンゴ酸カルボキシラーゼおよびＮＡＤＨオキシダー
ゼの存在下にフマル酸、金属イオン、ＮＡＤもしくはＮ
ＡＤＨを反応させる方法（特開昭64-43197）ではＮＡＤ
Ｈオキシダーゼを添加しない場合には、反応収率は非常
に低いが、ＮＡＤＨオキシダーゼの調製は煩雑な操作が
必要であり、また少量とはいえ高価な補酵素の添加が必
要なため、経済的に不利である。このように、いずれの
方法も欠点があり工業的に実際的とは言い難く、さらに
優れたピルビン酸の製造法が求められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、フマル酸を
原料とし、プロセスが単純で工業的に有利なピルビン酸
の製造方法を提供すること目的とする。

【課題を解決するための手段】本発明は、上記既存の方
法の欠点を改良するために鋭意検討の結果、環状イミド
化合物を資化する活性を有する微生物が、反応液中に2-
ケトカルボン酸のような反応の基質以外の添加物や、Ｎ
ＡＤＨオキシダーゼのような補酵素再生のための酵素の
添加無しに高収率、高蓄積でフマル酸をピルビン酸に変
換する能力を持つとの知見に基づくものである。すなわ
ち、本発明は、環状イミド化合物を資化する活性を有
し、フマル酸をピルビン酸に変換する能力を有する、プ
ロテウス属、キサントモナス属、クリセオバクテリウム
属、サイトファガ属、アシネトバクター属、サッカロマ
イセス属、オガテア属、スポロボロマイセス属、スポリ
ジオバラス属、カンジダ属、ワルトマイセス属、ミコバ
クテリウム属またはノカルジア属に属する微生物の培養
物、該培養物より分離した微生物菌体または該微生物の
菌体の処理物をフマル酸に作用せしめ、生成するピルビ
ン酸を採取することを特徴とするピルビン酸の製造法を
提供する。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明において環状イミド化合物
資化能を有するとは、各種環状イミド化合物を単一炭素
源として生育できることを意味し、本発明に用いられる
微生物としては、環状イミド化合物資化能を有し、高収
率でフマル酸をピルビン酸に変換する能力を持つプロテ
ウス属、キサントモナス属、サイトファガ属、アシネト
バクター属に属する細菌、サッカロマイセス属、ハンゼ
ヌラ属、スポロボロマイセス属、スポリジオバラス属、
トルロプシス属、カンジダ属、ワルトマイセス属に属す
る酵母、およびミコバクテリウム属、ノカルジア属に属
する放線菌であれば、野生株、変異株、細胞融合法、遺
伝子操作法その他の遺伝的手法で誘導される組換え株の
いずれも用いることができる。

【０００６】これらの微生物は、スクシンイミド、グル
タルイミドまたはフタルイミド等の環状イミド化合物を
資化可能であるが、特にスクシンイミドまたはグルタル
イミドを資化する能力を有する微生物が好ましい。これ
らの微生物の具体的な例としては、例えば以下のような
菌株を挙げることができる。 プロテウス・レットゲリ(Proteus rettgeri)IFO13501 キサントモナス・スピーシーズ(Xantomonas sp. )IFO30
85 クリセオバクテリウム・メニンゴスペチカム(Chryseoba
cterium meningospeticum)IFO12535 サイトファガ・ヘパリナ(Cytophaga heparina)IAM1493 アシネトバクター・カルコアセチカス(Acinetobacter c
alcoceticus)IFO12552 サッカロマイセス・ダイエンシス(Saccharomyces daire
nsis)IFO285 ウィリオプシス・サターナス・バール・サターナス(Wil
liopsis saturnus var.saturnus)IFO0125 オガテア・グルコジマ(Ogataea glucozyma)IFO1472 オガテア・ヘンリッヒ(Ogataea henrich)IFO1477 オガテア・ミヌータ・バール・ノンファーメンタンス(O
gataea minuta var. nonfermentans)IFO1473 スポロボロマイセス・サルモニカラー(Sporobolomyces
salmonicolor)IFO0374 スポロボロマイセス・サルモニカラー(Sporobolomyces
salmonicolor)IFO0375 スポリジオバラス・パラロゼウス(Sporidiobolus parar
oseus)IFO0376 カンジダ・ピナス(Candida pinus)IFO0741 カンジダ・クルゼイ(Candida krusei)IFO0013 カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)IFO0
585 カンジダ・アルビカンス(Candida alubicans)IFO1269 カンジダ・アルビカンス(Candida alubicans)IFO1270 ワルトマイセス・リポファー(Waltomyces lipofer)IFO0
673 ミコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegm
atis)IFO3153 ミコバクテリウム・フレイ(Mycobacterium phlei)IFO31
58 ミコバクテリウム・フレイ(Mycobacterium phlei)IFO31
42 ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)IFO
3423

【０００７】これらの微生物を培養する培地は格別の制
限はなく、通常の炭素源、窒素源、無機イオン更に必要
ならば有機栄養源を含む通常の培地でよい。炭素源とし
ては、グルコ−ス等の炭水化物、グリセロ−ル等のアル
コ−ル類、有機酸、その他が適宜使用される。窒素源と
しては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩、その他が用いられる。無機イオンとしては、マグネ
シウムイオン、燐酸イオン、カリウムイオン、鉄イオ
ン、マンガンイオン、その他が必要に応じ適宜使用され
る。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこ
れらを含有するレバーエキス、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、肉エキス、コ−ンスティ−プリカ−、カ
ゼイン分解物、その他が適宜用いられる。また、酵素の
誘導剤としてスクシンイミド、グルタルイミド、フタル
イミドなどの環状イミド化合物を培地に添加することに
よって、フマル酸をピルビン酸に変換する活性が向上す
る場合がある。培地中の環状イミド化合物の濃度は0.１
〜５重量％（以下、％と略称する）であるのが好まし
く、より好ましくは0.５〜１％である 培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下
pH５〜８及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度を適当
に制限しつつ12〜96時間程度培養を行なえばよい。

【０００８】上記微生物をフマル酸又はフマル酸塩に作
用せしめる方法としては、かくして得られる微生物培養
物にフマル酸を添加して反応させる方法、微生物培養物
から遠心分離等により菌体を分離し、これをそのままも
しくは洗浄した後、緩衝液に再懸濁したものにフマル酸
を添加して反応させる方法等がある。また、微生物菌体
の処理物として、菌体破砕物、アセトン処理菌体、凍結
乾燥菌体、あるいはポリアクリルアミドゲル法、カラギ
ーナン法、アルギン酸ゲル法等の公知の方法で固定化し
た菌体も用いることもできる。更に、微生物菌体処理物
としては、菌体抽出物もしくは菌体から公知の方法を組
み合わせて精製取得した酵素等も使用できる。

【０００９】反応は通常、温度20〜60℃、望ましくは25
〜35℃で、pH4.0 〜9.0 望ましくはpH7.0 〜8.0 で好結
果を与える。反応には、静置反応あるいは撹はん反応の
いずれの方法も採用し得る。反応時間は、使用する菌体
の活性、フマル酸濃度などの条件によって異なるが、1
〜100 時間が望ましい。フマル酸の塩としてはアンモニ
ウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等が
使用される。反応液中のフマル酸の添加量は格別の制限
はないが、一般には0.1 〜20％(w/v) が適当である。こ
の濃度を初発から添加してもよいし、逐次添加により最
終的にこの濃度になるように添加してもよい。このよう
にして生成したピルビン酸を反応終了混合物より採取分
離するには、合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用い
る方法、その他通常の採取分離方法が採用できる。

【００１０】

【発明の効果】本発明によると、高収率でフマル酸をピ
ルビン酸に変換する能力を持つ微生物を用い、反応液中
に反応の基質以外の添加物無しに、単純なプロセスでピ
ルビン酸を製造することができる。以下、実施例にて本
発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定さ
れるものではない。

【００１１】

【実施例】本実施例において、原料のフマル酸および生
成したピルビン酸は、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。 カラム：YMC-pack ODS-AQ AQ-303〔YMC 社製品〕 移動層：20mMリン酸バッファー（pH2.8 ) 流 速：0.7 ml/min、温 度：30℃、検 出：UV220nm 実施例 1 下記の成分を含有するスクリーニング用培地（寒天培
地）に各種菌を接種して培養し、環状イミド化合物を資
化する活性を有する微生物を選択した。 ＫＨ₂ ＰＯ₄ ：0.１％ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ：0.１％ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ：0.０３％ ＮＨ₄ Ｃｌ：0.２％ ＹＥＡＳＴ ＥＸＴＲＡＣＴ（酵母エキス）：0.０１％ 環状イミド化合物（スクシンイミド）：0.１５％ 上記の方法で選択した菌株を用いて、ピルビン酸を以下
の方法で調製した。トリプトン(Difco社製品)0.2％ (w/
v)、酵母エキス(Difco)0.2％、KH₂PO₄ 0.1％、スクシン
イミド0.5 ％を含む培地50ml（細菌と放線菌の培養には
pH7.0 、酵母の培養にはpH6.0 に調製）を500ml 坂口フ
ラスコに分注し、120 ℃、20分間加熱滅菌した。この培
地に各菌株を接種し、28℃で2 〜3 日間振とう培養し
た。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩
水で1 回洗浄した。フマル酸ナトリウム100mM を0.1Mト
リス−HCl 緩衝液 (pH 7.5) に溶解し、試験管に1ml ず
つ分注した。この反応液にそれぞれの培養菌体を湿重量
で約５％(w/v) となるように添加し、pH 7.5、28℃にて
16時間振とう反応を行った。反応後、遠心分離により菌
体を除いた後、生成したピルビン酸を定量した。この結
果を表１に示した。表１に示したようにいずれの菌体を
用いた反応によってもフマル酸よりピルビン酸が効率よ
く生成蓄積した。

【００１２】 表１ 菌体反応により生成したピルビン酸 菌株 生成ピルビン酸(mM) （細菌）Proteus rettgeri IFO13501 2.4 Xantomonas sp. IFO3085 2.4 Chryseobacterium meningospeticum IFO12535 1.4 Cytophaga heparinam IAM1493 1.6 Acinetobacter calcoceticus IFO12552 19.0 （酵母）Saccharomyces dairensis IFO285 6.0 Williopsis saturnus var. saturnus IFO0125 1.3 Ogataea glucozyma IFO1472 6.8 Ogataea henrichh IFO1477 1.4 Ogataea minuta var. nonfermentans IFO1473 1.6 Sporobolomyces salmonicolor IFO0374 2.3 Sporobolomyces salmonicolor IFO0375 3.5 Sporidiobolus pararoseus IFO0376 1.7 Candida pinus IFO0741 1.5 Candida krusei IFO0013 1.5 Candida parapsilosis IFO0585 1.1 Candida alubicans IFO1269 1.8 Candida alubicans IFO1270 1.9 Waltomyces lipofer IFO0673 1.8 （放線菌）Mycobacterium smegmatis IFO3153 5.0 Mycobacterium phlei IFO3158 1.3 Mycobacterium phlei IFO3142 5.2 Nocardia asteroides IFO3423 1.4

【００１３】実施例２ トリプトン(Difco社製品)0.2％ (w/v)、酵母エキス(Dif
co)0.2％％、KH₂PO₄ 0.1％、スクシンイミド0.5 ％を含
む培地50ml（pH7.0 ）を500ml 坂口フラスコに分注し、
120 ℃、20分間加熱滅菌した。この培地にアシネトバク
ター・カルコアセチカス(Acinetobacter calcoceticus)
I FO12552を接種し、28℃で2 日間振とう培養した。該
培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1
回洗浄した。フマル酸ナトリウム100mM を0.1Mトリス−
HCl 緩衝液 (pH 7.5)1mlに溶解した。この反応液に培養
菌体を湿重量で約５％(w/v) となるように添加し、pH
7.5、28℃にて振とう反応を行った。反応開始より24時
間および48時間目にフマル酸ナトリウム100mM を追加添
加し（合計300mM ）72時間反応を行った。遠心分離によ
り菌体を除いた後、生成したピルビン酸を定量したとこ
ろ74.1mMのピルビン酸がモル収率25% で生成蓄積した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:34） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:37） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:725） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:85）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 環状イミド化合物を資化する活性を有
   し、フマル酸をピルビン酸に変換する能力を有する、プ
   ロテウス属、キサントモナス属、クリセオバクテリウム
   属、サイトファガ属、アシネトバクター属、サッカロマ
   イセス属、オガテア属、スポロボロマイセス属、スポリ
   ジオバラス属、カンジダ属、ワルトマイセス属、ミコバ
   クテリウム属またはノカルジア属に属する微生物の培養
   物、該培養物より分離した微生物菌体または該微生物の
   菌体の処理物をフマル酸に作用せしめ、生成するピルビ
   ン酸を採取することを特徴とするピルビン酸の製造法。
2. 【請求項２】 アシネトバクター属に属する微生物が、
   アシネトバクター・カルコアセチカスである請求項１記
   載のピルビン酸の製造法。
3. 【請求項３】 環状イミド化合物が、スクシンイミド、
   グルタルイミドまたはフタルイミドである請求項１記載
   のピルビン酸の製造法。