JP7491312B2 - 腸内細菌科の細菌の発酵による塩基性l-アミノ酸またはその塩の製造方法 - Google Patents
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Description
ドする遺伝子を過剰発現し、塩基性L-アミノ酸の生産が非改変細菌と比較して増強されるように改変された腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する細菌の発酵により塩基性L-アミノ酸を製造する方法に関する。
よる微生物の形質転換(例えば、U.S. Patent No. 4,278,765 Aを参照のこと)、プロモ
ーター、リーダー配列及び/又はアテニュエーター、あるいはその他の当業者に知られた発現制御領域の改変(例えば、US20060216796 A1やWO9615246 A1を参照のこと)等がある。生産収率を高めるその他の技術としては、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び/又は生成したL-アミノ酸による目的とする酵素のフィードバック阻害を解除すること(例えば、WO9516042 A1, EP0685555 A1, またはU.S. Patent Nos. 4,346,170 A, 5,661,012 A, および6,040,160 Aを参照のこと)が挙げられる。
チンおよびL-シトルリン生成を経て、L-グルタミン酸からL-アルギニンが生成するまでの8つのステップが含まれる(Vogel H.J. and MacLellan W.L., Acetylornithinase
(Escherichia coli), Methods Enzymol., 1970, 17A:265-269)。生合成は、argA遺伝子にコードされるアミノ酸N-アセチルトランスフェラーゼ(amino acid N-acetyltransferase;EC 2.3.1.1;「N-アセチル-L-グルタミン酸シンテターゼ(N-acetyl-L-glutamate synthetase)」とも呼ばれる)によりL-グルタミン酸をアセチル化することで開始される。後続の生合成反応は、argB、argC、argD、argE、argFまたはargI、argG、およびargH遺伝子にそれぞれコードされるN-アセチルグルタミン酸キナーゼ(N-acetylglutamate kinase)、N-アセチル-γ-グルタミルホスフェートリダクターゼ(N-acetyl-γ-glutamylphosphate reductase)、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(N-acetylornithine
aminotransferase)、N-アセチルオルニチンデアセチラーゼ(N-acetylornithine deacetylase)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ornithine carbamoyltransferase)、アルギニノコハク酸シンターゼ(argininosuccinate synthase)、およびアルギニノコハク酸リアーゼ(argininosuccinate lyase)と一般的に呼ばれる酵素によって触媒
される。
ン生産細菌を得た。
ルバモイルアミノ)ペンタン酸としても知られている)を製造する方法が知られている(WO2015064454 and WO2015030019)。これらの方法では、argG遺伝子にコードされるargininosuccinate synthaseを不活化することにより、L-アルギニン生産細菌からL-シト
ルリン生産細菌を得た。
アミノ酸排出担体(L-methionine/branched-chain amino acid exporter)として特徴付
けられている(EcoCyc database, https://ecocyc.org/, accession ID: G7833)。トラ
ンスポーター分類データベースにおいて、YjeHは、L-メチオニンならびに他の中性および疎水性アミノ酸(L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン等)を排出する疎水性アミノ酸排出トランスポーターに分類されている(Saier M.H. Jr. et al., The Transporter Classification Database (TCDB): recent advances, Nucleic Acids Res., 2016, 44(D1):D372-9; doi: 10.1093/nar/gkv1103)。YjeHタンパク質は、アミノ酸-ポリアミン-有機
カチオン(Amino Acid-Polyamine-Organocation;APC)スーパーファミリー内のアミノ酸排出(Amino Acid Efflux;AAE)ファミリーのトランスポーターのメンバーである(transporter classification number (TCID) 2.A.3.13.1 (Jack D.L. et al., The amino acid/polyamine/organocation (APC) superfamily of transporters specific for amino acids, polyamines and organocations, Microbiology, 2000, 146 (8):1797-1814; Saier M.H. et al., The transporter classification database, Nucleic. Acids Res., 2014,
42(1):D251-8)。YjeHは、12個の膜貫通型αヘリックスを含むと予測され、そのうち10
個はAPCスーパーファミリーの特徴である反転繰り返し折り畳み構造(inverted repeat fold)を形成する((Liu Q. et al., 2015)。
いてL-メチオニンを生産した(CN105886449 A)。また、YjeHタンパク質の活性を高めた
エシェリヒア(Escherichia)属微生物を用いてO-アセチルホモセリンおよびL-メチオニ
ンを製造する方法も報告されている(KR101825777 A)。また、ppGppase活性を低下させ
、且つ、少なくともYjeH酵素をコードする核酸配列を過剰発現するように改変したE. coli細胞を培養することによりメチオニンまたはトリプトファンを調製する方法が知られて
いる(EP2814945 B1)。
(i)腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する塩基性L-アミノ酸生産細菌を培地で
培養して培地もしくは該細菌の菌体、またはその両者中に塩基性L-アミノ酸を生産および蓄積させること、および
(ii)培地もしくは菌体、またはその両者から塩基性L-アミノ酸を回収すること
を含み、
前記細菌が、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、方法を提供することである。
(A)YjeHタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(C)配列番号2に示すアミノ酸配列において、約1~100個のアミノ酸残基の置換、欠失
、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質;および
(D)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質。
である:
(a)yjeH遺伝子;
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNA;
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~100個のアミノ酸残基の置換、欠失、
挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであっ
て、該タンパク質がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する、DNA;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質がL-メチオニン/分岐鎖ア
ミノ酸排出担体活性を有する、DNA:および
(e)遺伝暗号の縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA。
(Pantoea)属に属する細菌である、前記方法を提供することである。
本明細書に記載の細菌は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体(L-methionine/branched-chain amino acid exporter)活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過
剰発現するように改変された腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属するL-アミノ酸生産菌である。本明細書に記載の細菌は、本明細書に記載の方法で使用できる。よって、同細菌に関する以下の説明は、本明細書に記載の方法で代替可能または等価に使用されるいずれの細菌にも準用できる。
K-12株(例えば、W3110 (ATCC 27325) やMG1655 (ATCC 47076))およびPantoea ananatis (P. ananatis) AJ13355等の、野生株または親株が挙げられる。また、「塩基性L-ア
ミノ酸生産菌」の用語は、例えば、0.1 g/L以上、0.5 g/L以上、あるいは1.0 g/L以上の
量で塩基性L-アミノ酸を培地中に蓄積することができる細菌も意味し得る。また、「塩基性L-アミノ酸生産菌」の用語は、例えば、非改変細菌と比較して、より多い量で塩基性L-アミノ酸を培地中に生成し、排出もしくは分泌し、且つ/又は蓄積する能力を有し、且つ0.1 g/L以上、0.5 g/L以上、あるいは1.0 g/L以上の量で塩基性L-アミノ酸を培
地中に蓄積することができる細菌も意味し得る。
有する細菌において、または塩基性L-アミノ酸生産能を既に付与された細菌において、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させることにより取得できる。あるいは、前記細菌は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように既に改変された細菌に塩基性L-アミノ酸生産能を付与することにより取得できる。あるいは、前記細菌は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されたことにより塩基性L-アミノ酸生産能を獲得したものであってもよい。本明細書に記載の細菌は、具体的には、例えば、後述する細菌株を改変することにより取得できる。
デンシア(Providencia)、サルモネラ(Salmonella)、イェルシニア(Yersinia)等の
属に属する細菌が挙げられる。そのような細菌は、塩基性L-アミノ酸を生産する能力を有し得る。具体的には、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のデ
ータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)で用いられ
ている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を使用することができる。腸内細菌科に属する細菌としては、特に、Escherichia、Enterobacter、およびPantoea属に属する細菌が挙げられる。
。
ントエア・スチューアルティ(Pantoea stewartii)に再分類されている。腸内細菌科に
分類された細菌であれば、Enterobacter属またはPantoea属のいずれに属するものであっ
ても使用することができる。P. ananatisとして、具体的には、Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)、及び
それらの派生株が挙げられる。これらの株は、分離された当時はEnterobacter agglomeransと同定され、Enterobacter agglomeransとして寄託されたが、上記のとおり最近16S rRNAの塩基配列解析等によりPantoea ananatisに再分類されている。
登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。これらの株は、例えば、各株が寄託された寄託機関から入手することもできる。
のような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、塩基性L-アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、塩基性L-アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。塩基性L-アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、2種又は3種以上であってもよい。また、塩基性L-アミノ酸生産菌の育種において、活性が増強される塩基性L-アミノ酸生合成系酵素も、単独であってもよく、2種又は3種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つ塩基性L-アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、X線や紫外線の照射、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)、エチルメタンスルフォネート(EMS)、メチルメタンスルフォネート(MMS)等の変異剤による処理が挙げられる。
L-アルギニン生産菌およびL-アルギニン生産菌を誘導するために使用できる親株としては、例えば、1種またはそれ以上のL-アルギニン生合成系酵素の活性が増大した株が挙げられる。そのような酵素としては、制限されないが、N-アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、N-アセチル-γ-グルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(argF, argI)、アルギニノコハク酸シンターゼ(argG)、アルギニノコハク酸リアーゼ(argH)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、カルバモイルリン酸シンターゼ(carAB)が挙げられる。酵素名の後のカッコ内には、その酵素をコ
ードする遺伝子の一例を示す(同一の命名法は、以下、タンパク質/酵素および遺伝子について言及する場合にも準用される)。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)遺伝子としては、例えば、野生型の15位~19位に相当するアミノ酸残基が置換され、L-アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型N-アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子を用いると好適である(EP1170361A)。
N-アセチルグルタミン酸シンターゼをコードするargA遺伝子が導入されたその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号, EP1170361A1)、237株由来の酢酸資化能が向上した株であるE. coli 382株(VKPM B-7926;EP1170358A1)、及び382株にE. coli K-12株由来の野生型ilvA遺伝子が導入された株であるE. coli 382ilvA+株等のEscherichia属に属する株
が挙げられる。E. coli 237株は、2000年4月10日にルシアン・ナショナル・コレクション
・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)(FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。E. coli 382株は、2000年4月10日にルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロ
オルガニズムズ(VKPM)(FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)にVKPM B-7926の受託番号で寄託され、2001年5月18日にブダペスト条約に基
づく国際寄託に移管された。
開昭56-106598)が挙げられる。
L-シトルリンおよびL-オルニチンは、L-アルギニン生合成経路における中間体である。よって、L-シトルリンまたはL-オルニチンの生産菌およびL-シトルリンまたはL-オルニチンの生産菌を誘導するために使用できる親株としては、例えば、1種またはそれ以上のL-アルギニン生合成系酵素の活性が増大した株が挙げられる。そのような酵素としては、制限されないが、L-シトルリンについて、N-アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、N-アセチル-γ-グルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(argF, argI)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、カルバモイルリン酸シンターゼ(carAB)が挙げられる。また、そのような酵素としては、制
限されないが、L-オルニチンについて、N-アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、N-アセチル-γ-グルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)が挙げられる。
性のカルバモイルリン酸シンセターゼを保持するE. coli 333株(VKPM B-8084)及び374
株(VKPM B-8086)(ロシア特許第2,264,459号)、α-ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大し、且つフェレドキシンNADP+レダクターゼ、ピルビン酸シンターゼ、及び/又は
α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性がさらに改変されたE. coli株(EP2133417A
)等のエシェリヒア属に属する株が挙げられる。
(VKPM B-7926)等)から、argG遺伝子にコードされるアルギニノコハク酸シンターゼ不
活化することにより容易に得ることができる。遺伝子を不活化する方法は、本明細書に記載されている。
L-ヒスチジン生産菌およびL-ヒスチジン生産菌を誘導するために使用できる親株としては、1種またはそれ以上のL-ヒスチジン生合成系酵素の活性が増大した株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(hisG)、ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ(hisE)、ホスホリボシル-AMPサイクロヒドロラーゼ(hisI)、二機能性ホスホリボシル-AMPサイクロヒドロラーゼ/ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ(hisIE)、ホスホリボシルフ
ォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ(hisA)、アミドトランスフェラーゼ(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(hisD)が挙げられる。
特許第2,119,536号C1)。
ル-3-アラニン、及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM
B-7270;RU2119536 C1)、E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR(RU2119536 and Doroshenko V.G. et al., The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (Russian), 2013, 49(2):149-154)等のEscherichia属に属する株が挙げられる。
L-リジン生産菌およびL-リジン生産菌を誘導するために使用できる親株としては、Escherichia属に属し、且つL-リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。L
-リジンアナログはEscherichia属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、L-
リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に脱感作される。L-リジンアナログとしては、制限されないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、S-(2-アミノエチル)-L-システイン(AEC)、γ-メチルリジン、α-クロロカプロラクタム等
が挙げられる。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、Escherichia属
に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。
ノピメリン酸デカルボキシラーゼ(diaminopimelate decarboxylase)(lysA)、ジアミ
ノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(diaminopimelate dehydrogenase)(ddh)(米国特許第
6,040,160号)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(phosphoenolpyruvate carboxylase)(ppc)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(aspartate semialdehyde dehydrogenase)(asd)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase)(アスパラギン酸トランスアミナーゼ(aspartate transaminase))(aspC)、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(diaminopimelate epimerase)(dapF)
、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(tetrahydrodipicolinate succinylase)(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(succinyl diaminopimelate deacylase)(dapE)、及びアスパルターゼ(aspartase)(aspA)(EP1253195 A1)をコード
する遺伝子が挙げられる。これらの酵素の中では、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの1種またはそれ以上の活性を増強するのが好ましい。また、L-ヒスチジン生産菌およびL-ヒスチジン生産菌を誘導するために使用できる親株では、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo)(EP1170376 A1)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロ
ゲナーゼ(nicotinamide nucleotide transhydrogenase)をコードする遺伝子(pntAB)
(米国特許第5,830,716号A)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、またはこれらの組み合わ
せの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIII(lysC)はL-リジンに
よるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子
を利用してもよい(米国特許第5,932,453号)。L-リジンによるフィードバック阻害が
解除されたアスパルトキナーゼIIIとしては、318位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換される変異、323位のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換される変異、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換される変異等の1またはそれ以上の変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIが挙げられる(米国特許第5,661,012号、米国特許第6,040,160号)。また、ジヒドロジピコリン酸合成酵素(dapA)はL-
リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA遺伝子を利用してもよい。L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素としては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換さ
れる変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素が挙げられる(米国特許第6,040,160号)。
decarboxylase;cadA, ldcC)、リンゴ酸酵素(malic enzyme)が挙げられ、これらの酵素の活性が低下または欠損した株は、WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175等に開示
されている。lysine decarboxylase活性は、例えば、lysine decarboxylaseをコードするcadAおよびldcC遺伝子の両方の発現を低下させることにより、低下または欠損させることができる。両遺伝子の発現は、例えば、WO2006/078039に記載の方法により、低下させる
ことができる。
げられる。これらの株では、アスパルトキナーゼにおけるL-リジンによるフィードバッ
ク阻害が解除されている。
た(米国特許第5,827,698号)。WC196株は、E. coli AJ13069と命名され、1994年12月6日に、通商産業省 工業技術院生命工学工業技術研究所(現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE IPOD)、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉
県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
名され、2008年10月7日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(
現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE IPOD)、郵便番
号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM BP-11027として国際寄託された。
むプラスミドpCABD2(米国特許第6,040,160号)を導入することにより構築された。pCABD2は、L-リジンによるフィードバック阻害が解除される変異(H118Y)を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素(DDPS)をコードする変異型dapA遺伝子と、L-リジンによるフィードバック阻害が解除される変異(T352I)を有するエシェリ
ヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒ
ア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。
名され、2013年1月29日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センタ
ー(NITE NPMD;郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に寄託され、2014年5月15日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託
番号NITE BP-01520が付与されている。
パク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている。
a novel exporter of L-methionine and branched-chain amino acids in Escherichia coli, Appl. Environ. Microbiol., 2015, 81(22):7753-7766)。「L-メチオニン/分
岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質」の用語は、細菌を培地で培養した際に、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、および/またはL-バリン、例えば、これら全て、の細菌菌体外への輸送を引き起こすことができるタンパク質も意味し得る。特に、「L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質」の用語は、ジペプチドMet-Met、Ile-Ile、Leu-Leu、およびVal-Valを含む培地で細菌を培養した際に、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、およびL-バリンの細菌菌体外への輸送を引き起こすことができるタンパク質も意味し得る(Liu Q. et al., 2015)。
得る。
バリン等)を含有する培地で細菌を培養し(すなわち生育させ)、生育阻害を評価することで実施できる(Liu Q. et al., 2015)。細菌菌体外へのアミノ酸の輸送は、例えば、
菌体の細胞外画分および細胞内画分に含まれる2,4-ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)の誘導体の形態でのアミノ酸の量を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて評価することで判断できる(Liu Q. et al., 2015)。
の活性を測定する方法が知られており、それらの方法はL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の活性を測定するためにも同様に用いることができ、その際には、例えば、標的化合物に対するタンパク質の最小阻害濃度(MIC)が測定される
(例えば、Doroshenko V. et al., 2007; Livshits V.A. et al., Identification and characterization of the new gene rhtA involved in threonine and homoserine efflux
in Escherichia coli, Res. Microbiol., 2003, 154(2):123-135を参照のこと)。
にコードされ得る。E. coli K-12株に固有のyjeH遺伝子(GenBank, accession No. NC_000913.3; nucleotide positions: 4369156 to 4370412; Gene ID: 948656)は、L-メチ
オニン/分岐鎖アミノ酸排出担体であるYjeH(EcoCyc database, https://ecocyc.org/, accession ID: G7833; UniProtKB/Swiss-Prot database, accession No. P39277; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, entry No. b4141)をコードする。yjeH遺伝子は、E. coli K-12株の染色体において、反対側の鎖にあるfxsA遺伝子とgroS遺伝子の間に位置する。yjeH遺伝子の塩基配列(配列番号1)およびyjeH遺伝子がコードするYjeHタ
ンパク質のアミノ酸配列(配列番号2)は公知である。
塩基配列またはアミノ酸配列を有する」という表現は、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列または当該アミノ酸配列をより長い配列中に含むことを意味し得、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列または当該アミノ酸配列のみを有することも意味し得る。
L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、yjeH遺伝子)は、配列番号1に示す塩基配列を有する遺伝子に限定されず、配列
番号1の変異体塩基配列を有し、且つL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有
する変異体タンパク質をコードする遺伝子を包含してもよい。同様に、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質(例えば、YjeHタンパク質)は、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質に限定されず、配列番号2の変異体アミノ酸配列を有し、且つL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質を包含してもよい。そのような変異体塩基配列または変異体アミノ酸配列としては、上記例示したL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および上記例示したL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質のホモログや人為的改変体が挙げられる。
の同義のアミノ酸コドンを使用してL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質)をコードす
る塩基配列を意味し得る。従って、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するL-メチオニ
ン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝暗号の縮重による配列番号1の変異体塩基配列を有する遺伝子であり得る。
/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の活性または機能が維持されているか、その三次元構造がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、E. coli固有の野生型YjeHタンパク質)に対して顕著には変更されてい
ないタンパク質をコードする限り、配列番号1に示す配列に相補的な塩基配列または該塩
基配列から調製し得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列も意味し得る。「ストリンジェントな条件」の用語は、特異的なハイブリッド、例えばコンピュータプログラムblastnを使用する場合のパラメーター「同一性」として定義される相同性が70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上のハイブリッド、が形成され、非特異的なハイブリッド、例えば上記より相同性が低いハイブリッド、が形成されない条件を意味し得る。ストリンジェントな条件としては、例えば、1×SSC(標準クエン酸ナトリウムまたは標準塩化ナトリウム)、0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の塩濃度で60℃において、0.1×SSC、0.1% SDSの塩濃度で60℃において、または0.1×SSC、0.1% SDSの塩濃度で65℃において1回以上、別の例では2または3回洗浄する条件が挙げられる。洗浄時間は、ブロッティングに使用されたメンブレンの種類に依存し得るが、一般的には製造者により推奨されるものとすべきである。例えば、Amersham HybondTM-N+正荷電ナイロンメンブレン(GE Healthcare)のストリンジェントな条件下での推奨洗浄時
間は15分である。洗浄工程は2または3回行うことができる。プローブとしては、配列番号1に示す配列に相補的な配列の一部を使用してもよい。そのようなプローブは、配列番
号1に示す配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、塩
基配列を含むDNA断片を鋳型として使用するPCR(polymerase chain reaction;White T.J. et al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5:185-189を参照の
こと)によって調製することができる。プローブの長さは、50 bpを超えることが推奨さ
れるが、ハイブリゼーション条件により適切に選択することができ、通常100 bp ~1 kbpである。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合、ハイ
ブリダイゼーション後の洗浄条件は、例えば、50℃、60℃、または65℃における2×SSC、0.1%SDSの条件であり得る。
を意味し得る。
て、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加のいずれであるに
せよ、1つまたはそれ以上の変異を配列中に有するタンパク質であって、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の活性または機能が維持されているか、その三次元構造がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質)に対して顕著には変更されていないタンパク質を意味し得る。変異体タンパク質中の変異の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置またはアミノ酸残基の種類による。変異体タンパク質中の変更の数は、厳密に限定されるものではないが、配列番号2において1~100、別の例では1~90、別の例では1~80、別の例では1~70、別の例では1~60、別の例では1~50、別の例では1~40、別の例では1~30、別の例では1~20、別の例では1~15、別の例では1~10、あるいは別の例では1~5であってよい。こ
れは、アミノ酸は互いに高い相同性を有し得るものであり、それらアミノ酸間の変異によっては、タンパク質の活性または機能が影響を受けないか、タンパク質の三次元構造がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質)に対して顕著には変化しない場合がある
から可能である。従って、変異体タンパク質は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の活性または機能が維持されているか、タンパク質の三次元構造がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質)に対して顕著には変更されていな
い限り、配列番号2のアミノ酸配列全体に対して70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、あるいは99%以上の、コンピュータプログラムblastpを使用する際のパラメーター「同一
性」として定義される相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。本明細書において、「相同性」の用語は、「同一性」(これは、アミノ酸残基間の同一性である)を意味してよい。2つの配列間の配列同一性は、2つの配列を最大一致となるように整列した際の2つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
が親水性アミノ酸である場合にはGlu、Asp、Gln、Asn、Ser、His、Thr間で、置換部位が
極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合にはLys、Arg、His間で、置換部位が酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、置換部位
がヒドロキシル基を有するアミノ酸である場合には、Ser、Thr間で、互いに置換する置換である。保存的置換の例としては、AlaからSerまたはThrへの置換、ArgからGln、HisまたはLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、HisまたはAspへの置換、AspからAsn、GluまたはGlnへの置換、CysからSerまたはAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、AspまたはArgへの置換、GluからAsn、Gln、LysまたはAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、ArgまたはTyrへの置換、IleからLeu、Met、ValまたはPheへの置換、LeuからIle、Met、ValまたはPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、HisまたはArgへの置換、Met
からIle、Leu、ValまたはPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、IleまたはLeuへの置換、SerからThrまたはAlaへの置換、ThrからSerまたはAlaへの置換、TrpからPheまたはTyrへ
の置換、TyrからHis、PheまたはTrpへの置換、及びValからMet、IleまたはLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加等は、アミ
ノ酸配列が由来する生物の個体差によって天然に生じる変異を包含する。
はそれ以上の第2の変異により、変異体タンパク質の活性または機能が維持されるか、あ
るいはL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質)に対してタンパク質の三次元構
造が顕著には変更されないように、補償されるものである。
のScoring Parameters(Matrix:BLOSUM62;Gap Costs:Existence=11, Extension=1;Compositional Adjustments:Conditional compositional score matrix adjustment)を用いて算出できる。ポリヌクレオチドの同一性のパーセンテージは、blastnアルゴリズムにより算出できる。より具体的には、ポリヌクレオチドの同一性のパーセンテージは、NCBIより提供されるblastnアルゴリズムによりデフォルト設定のScoring Parameters(Match/Mismatch Scores=1,-2;Gap Costs=Linear)を用いて算出できる。
(ATCC 27325)、E. coli MG1655株(ATCC 47076)、P. ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)等)が挙げられる。
される、または増加する」の用語と代替可能または同等に用いられ得る。また、「細菌がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された」の用語は、改変された細菌において、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが非改変株で観察される発現レベルよりも高くなるように、細菌が改変されていることも意味し得る。遺伝子の発現レベルの増加は、例えば、細胞当たりの遺伝子の発現レベル(これは細胞当たりの遺伝子の平均発現レベルであってよい)の増加として測定され得る。「遺伝子の発現レベル」または「遺伝子の発現量」の用語は、例えば、遺伝子の発現産物の量(例えば、同遺伝子のmRNAの量または同遺伝子にコードされるタンパク質の量)を意味し得る。細菌は、例えば、細胞あたりのL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが、非改変株におけるL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルの150%以上、200%以上、または300%以上に増加するように改変されてよい。
、狭宿主域プラスミド(例えばpMW118/119、pBR322、pUC19等)、広宿主域プラスミド(RSF1010、RP4等)が挙げられる。L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、相同組み換えまたはMuドリブンインテグレーション等によって細菌の染色体DNAに導入することもできる。L-メチオニン/分岐鎖ア
ミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、1コピーのみ導入されてもよく、2コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体DNA中に複数のコピ
ーが存在する塩基配列をターゲットとして相同組み換えを実施することにより、染色体DNAに複数コピーのL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子を導入することができる。染色体DNA中に複数のコピーが存在する塩基配
列としては、限定するものではないが、レペティティブDNAや転移因子の末端に存在する
インバーテッドリピートが挙げられる。さらに、遺伝子をトランスポゾンに組み込んで転移させることにより、染色体DNAに複数コピーの遺伝子を導入することができる。染色体DNAに複数コピーの遺伝子を導入するためには、染色体間増幅法を使用できる。Mu-driven
転移により、3コピーより多い遺伝子を受容株の染色体DNAに1ステップで導入できる(Akhverdyan V.Z. et al., Biotechnol. (Russian), 2007, 3:3-20)。
御エレメント(例えば、リプレッサーまたはアクチベーターが結合する領域、及び/又は、例えば転写されたmRNA中の転写及び翻訳の制御タンパク質の結合部位)が挙げられる。このような制御領域は、例えば、公知の文献(Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis
T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Pfleger B.F. et al., Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes, Nat. Biotechnol., 2006, 24:1027-1032; Mutalik V.K. et al., Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements, Nat. Methods, 2013, 10:354-360)に記載されている。遺伝子の発現制御領域の改変は、遺伝子のコピー数の増加と組み合わせることができる(例えば、Akhverdyan V.Z. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871; Tyo K.E.J. et al., Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765を参照)。
プロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、msrAプロモーター、Pm1プロモ
ーター(Bifidobacterium属由来)、およびラムダ(λ)ファージのPRまたはPLプロモー
ターが挙げられる。強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35および-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの強度を高めることができる(WO0018935 A1)。プロモーターの強度は、RNA合成の開始作用の
頻度により定義され得る。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldstein M.A. et al.の論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995))等に記載されている。細菌(例えば、腸内細菌科の細菌等)において高いレベルの遺伝子発現を与える強力なプロモーターを使用できる。あるいは、プロモーターの効果は、例えば、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に変異を導入してより強いプロモーター機能を得ることにより増強することができ、以て、該プロモーターの下流に位
置するL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の転写レベルを増加させることができる。さらに、シャイン・ダルガルノ(SD)配列、及び/又はSD配列と開始コドンの間のスペーサー、及び/又はリボソーム結合部位中の開始コドンの直ぐ上流または下流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に大きく影響することが知られている。よって、これらの領域は、遺伝子の発現制御領域の一例であり得る。例えば、開始コドンに先行する3つのヌクレオチドの性質に依存
して、20倍の範囲の発現レベルが見出されている(Gold L. et al., Annu. Rev. Microbiol., 1981, 35:365-403; Hui A. et al., EMBO J., 1984, 3:623-629)。
損、遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸置換をもたらす1塩基以上の置換(ミスセ
ンス変異)、終止コドンの導入(ナンセンス変異)、遺伝子のリーディングフレームシフトをもたらす1塩基または2塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子および/もしくは転写終結シグナルの挿入、または発現制御領域(プロモーター、エンハンサー、オペレーター、アテニュエーターと終結シグナル、抗終結シグナル、リボソーム結合部位(RBS)、およびその他
の発現制御エレメント、等)の改変により、自然には遺伝子を発現できないように、遺伝子を改変することが挙げられる。遺伝子の不活化は、例えば、紫外線照射またはニトロソグアニジン(N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン)を用いた変異処理、部位特異
的変異導入、相同組み換えを用いた遺伝子破壊、および/または「Red/ET-driven integration」または「λRed/ET-mediated integration」に基づく挿入-欠失変異導入(Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(11):5978-5983; Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128)等の常法により実施できる。
した後、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッテイング、または蛍光in
situハイブリダイゼーション(FISH)等を行うことにより、測定することができる。遺
伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等の様々な周知の方法を使用して遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することにより決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEと、その後の免疫ブロッティング(ウェスタンブロッティング)やタンパク質試料の質量分析等の公知の方法により測定することができる。
ングのための方法は、当業者に周知の通常の方法であってよい。そのような方法は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory
Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)またはGreen M.R. and Sambrook J.R., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak and Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA”, 4th ed., Washington, DC, ASM Press (2009)に記載されている。
としては、任意の方法が挙げられる。例えば、効率的なDNAの形質転換およびトランスフェクションのために、E. coliK-12の細胞のDNAに対する透過性が高まるように受容
細胞を塩化カルシウムで処理する方法が報告されている(Mandel M. and Higa A., Calcium-dependent bacteriophage DNA infection, J. Mol. Biol., 1970, 53:159-162)。特
殊化および/または一般化された形質転換の方法が記載されている(Morse M.L. et al.,
Transduction in Escherichia coli K-12, Genetics, 1956, 41(1):142-156; Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor La. Press, 1972)。宿主微生物へのDNAのランダムおよび/または標的化された
組み込みのための他の方法、例えば、「Mu-driven integration/amplification」(Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871)、「Red/ET-driven integration」または「λRed/ET-mediated integration」(Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(12):6640-45; Zhang Y., et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128)、を適用できる。さらに、所望の遺伝子の多重挿入のために
は、Mu駆動の複製的転移(Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871)や所望の遺伝子の増幅をもたらすrecA依存性相同組み換えに基づく化学的に
誘導可能な染色体進化(Tyo K.E.J. et al., Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765)
に加えて、転移、部位特異的および/または相同的なRed/ETを介した組み換え、および/またはP1を介した一般化形質導入の種々の組み合わせを利用する他の方法(例えば、Minaeva N.I. et al., BMC Biotechnology, 2008, 8:63; Koma D. et al., Appl. Microbiol.
Biotechnol., 2012, 93(2):815-829を参照のこと)を利用できる。
するタンパク質をコードする遺伝子(その例は表1に列挙されている)の塩基配列および同遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列は既に解明されている(上記参照)ので、そのような細菌種に固有の同遺伝子またはその変異体塩基配列は、同細菌種のDNAと
、同細菌種に固有のyjeH遺伝子の塩基配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRによる同細菌種からのクローニングにより、またはyjeH遺伝子を含むDNAを例えばヒドロキシルアミンでin vitro処理する突然変異法またはyjeH遺伝子を有する細菌種を紫外線(UV)照射もしくはそのような処理に通常用いられるN-メチル-N'-ニトロ-
ニトロソグアニジン(NTG)や亜硝酸等の変異剤で処理する突然変異法により、または全
長遺伝子構造物として化学合成することにより、取得できる。他の細菌種を含む他の任意の生物に固有のL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびその変異体塩基配列も同様に取得できる。
または核酸が特定の生物(例えば、哺乳類、植物、昆虫、細菌、またはウイルス等)に固有であることを意味し得る。すなわち、特定の生物に固有のタンパク質または核酸は、それぞれ、当該生物に天然に存在するタンパク質または核酸を意味し得る。特定の生物に固有のタンパク質または核酸は、当該生物から単離でき、当業者に知られた方法により配列解析できる。さらに、タンパク質または核酸が存在する生物からそれぞれ単離されたタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列は容易に決定することができるので、タンパク質または核酸に言及する際の「固有の」の用語は、得られるタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列が当該生物に天然に存在する、天然に発現する、且つ/又は天然に製造されるタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列と同一である限り、任意の手段、例えば、組み換えDNA技術を含む遺伝子工学的手法または化学合成法等、により得られるタンパク質または核酸も意味し得る。「タンパク質」の用語は、限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素等のいずれも意味し得る。「核酸」の用語は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)を意味し得、限定されるものではないが、特に、プロモーター、アテニュエーター、ターミネーター等を含む発現調節配列、遺伝子、遺伝子間配列、シグナルペプチド
、タンパク質のプロ部位、人工アミノ酸配列等をコードする塩基配列のいずれも意味し得る。例えば、遺伝子は、特に、DNAであり得る。アミノ酸配列および塩基配列ならびに各
種生物に固有のそれらのホモログは本明細書に記載されており、これらの例としては、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質(これは、E. coli種の細菌に固有であり得、配列番号1に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされ得る)。
13355株が挙げられる。非改変遺伝子は、非改変タンパク質をコードし得る。
細菌を用いて塩基性L-アミノ酸を製造する本明細書に記載の方法は、前記細菌を培地で培養(cultivating(culturingともいう))して塩基性L-アミノ酸を培地もしくは該細菌の菌体、またはその両者中に生成させ、排出もしくは分泌させ、且つ/又は蓄積させる工程と、培地及び/又は菌体から塩基性L-アミノ酸を回収する工程を含む。同方法は、さらに、任意で(optionally)、培地及び/又は菌体から塩基性L-アミノ酸を精製する工程を含み得る。塩基性L-アミノ酸は、上記のような形態で製造され得る。塩基性L-アミノ酸は、特に、遊離形態、もしくはその塩、またはそれらの混合物として製造され得る。例えば、塩基性L-アミノ酸のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩または両性イオン等の分子内塩が、前記方法により製造され得る。これは、アミノ酸が発酵条件下で、互いに、あるいは無機または有機の酸またはアルカリ性物質等の中和剤と、典型的な酸塩基中和反応により反応して塩を生成し得ることから可能であり、これは当業者に明らかなアミノ酸の化学的特徴である。具体的には、L-アルギニンの一塩酸塩(L-アルギニン×HCl)またはL-リジンの一塩酸塩(L-リジン×HCl)が、前記方法により製造され得る。
1種またはそれ以上を含むことができる。硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、チオ硫酸、硫化物等が挙げられる。培地は、炭素源、窒素源、及び硫黄源に加えて、リン源を含んでもよい。リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、ピロ燐酸等のリン酸ポリマー等を使用することができる。ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチンアミド、ビタミンB12等
のビタミンや、その他の必要物質、例えばアデニン、RNA等の核酸、アミノ酸、ペプトン
、カザミノ酸、酵母エキス等の有機栄養素等を、適当量(痕跡量であってもよい)存在させることができる。これら以外に、必要であれば、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を加えてもよい。
1.1 E. coli MG1655-Pnlp8-yjeH (CmR)株の構築
温度感受性複製起点を有するpKD46プラスミドを含むE. coli MG1655株(ATCC 47076)
を用いた。pKD46プラスミド(Datsenko K.A. and Wanner B.L., One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)は、ファージλの2,154ヌクレオチドのDNA断片(ヌクレオチド位置31088~33241, GenBank accession No.: J02459)を含み、アラビノ
ース誘導性のParaBプロモーターの制御下にあるλRed相同組み換え系の遺伝子(γ遺伝子、β遺伝子、およびexo遺伝子)を含む。pKD46プラスミドは、PCR産物をE. coli MG1655
株の染色体に組み込むために必要である。組み換えプラスミドpKD46を含むE. coli MG1655株は、E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USAから入手できる(Accession No. CGSC7669)。
、培養液1 mLを、終濃度50 mMのイソプロピルアラビノースと50 mg/Lのアンピシリンを含むLB液体培地100 mLに接種し、菌体を37℃で2時間、振盪(250 rpm)培養した。菌体を回収し、氷冷した10%グリセロールで3回洗浄してコンピテントセルを得た。増幅したλatt
L-CmR-λattR-Pnlp8断片(後述する実施例1.2)を、Wizard PCR Prep DNA Purification System(Promega)を用いて精製し、エレクトロポレーション法でコンピテントセルに導入した。菌体をSOC培地(Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)で2時間培養
した後、25 mg/Lのクロラムフェニコール(Cm)を含むL-寒天プレート上で37℃で18~24
時間培養した。出現したコロニーを同じ培地で純化した。次に、染色体上のyjeH遺伝子のプロモーター領域がλattL-CmR-λattR-Pnlp8断片で置換されていることを確認するため
に、プライマーP1(配列番号3)およびP2(配列番号4)を用いてPCR反応を実施した。そ
うして、E. coli MG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)株を得た。
λattL-CmR-λattR-Pnlp8断片は、以下のようにして構築した。pMW-attL-CmR-attR-Pnlp8 plasmid(配列番号5)を鋳型として、プライマーP3(配列番号6)およびP4(配列番号7)とPrime Star polymerase(Takara Bio Inc.)を用いてPCRを実施した。反応液はキットに添付されている組成にしたがって調製し、1 kbpあたり98℃10秒、55℃5秒、および72℃1分の30サイクルでDNAを増幅した。その結果、yjeH遺伝子のプロモーター領域の組み換え配列と両末端にyjeH遺伝子の隣接領域に相補的な領域を有するλattL-CmR-λattR-Pnlp8断片を得た。
E. coliのL-オルニチン生産株は、E. coliのL-アルギニン生産株382ilvA+から、argFおよびargI遺伝子にコードされるornithine carbamoyltransferaseの不活化により得た。382ilvA+株は、L-アルギニン生産株382(VKPM B-7926, EP1170358 A1)から、E. coli K-12株由来の野生型ilvA遺伝子のP1形質導入により得た。
argF遺伝子を欠損した株は、Datsenko K.A.とWanner B.L.により最初に開発された「λRed/ET-mediated integration」と呼ばれる方法(Datsenko K.A. and Wanner B.L., One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)により構築した。プライマーP5(配列番号8)およびP6(配列番号9)を用い、pMW118-attL-Km-attRプラスミドを鋳
型としたPCRにより、カナマイシン耐性マーカー(KmR)を含むDNA断片を得た(WO2011043485 A1)。プライマーP5は、argF遺伝子の5’末端に位置する領域に相補的な領域とattR
領域に相補的な領域の両方を含む。プライマーP6は、argF遺伝子の3’末端に位置する領
域に相補的な領域とattL領域に相補的な領域の両方を含む。PCR条件は以下の通りである
:95℃で3分間の変性ステップ;95℃で1分、50℃で30秒、72℃で40秒の2回の第1サイク
ルのプロファイル;95℃で30秒、54℃で30秒、72℃で40秒の最後の25サイクルのプロファイル;72℃で5分の最終ステップ。
argI遺伝子を欠損した株は、Datsenko K.A.とWanner B.L.により最初に開発された「λRed/ET-mediated integration」と呼ばれる方法(Datsenko K.A. and Wanner B.L., One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)により構築した。プライマ
ーP7(配列番号10)およびP8(配列番号11)を用い、pMW118-attL-Cm-attRプラスミドを
鋳型としたPCRにより、λattL-CmR-λattRカセットを含むDNA断片を得た(WO2005010175 A1)。プライマーP7は、argI遺伝子の5’末端に位置する領域に相補的な領域とattR領域
に相補的な領域の両方を含む。プライマーP8は、argI遺伝子の3’末端に位置する領域に
相補的な領域とattL領域に相補的な領域の両方を含む。PCR条件は以下の通りである:95
℃で3分間の変性ステップ;95℃で1分、50℃で30秒、72℃で40秒の2回の第1サイクルの
プロファイル;95℃で30秒、54℃で30秒、72℃で40秒の最後の25サイクルのプロファイル;72℃で5分の最終ステップ。
E. coliのL-オルニチン生産株を得るために、得られたE. coli MG1655ΔargF::KmR株(実施例2.1)およびE. coli MG1655ΔargI::CmR株(実施例2.2)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-アルギニン生産株382ilvA+に順に移植し、E. coli 382ilvA+ΔargI::CmR ΔargF::KmR株を得た。
株を得た。
yjeH遺伝子の発現増強の結果としてのL-オルニチン生産への影響を調べるために、得られたMG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)(実施例1)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-オルニチン生産株382ilvA+ΔargI ΔargF(実施例2.3)に導入し、E.
coli 382ilvA+ΔargI ΔargF Pnlp8-yjeH (CmR)株を得た。
した。
ン(2%)のアセトン溶液を可視化試薬として用いた。L-オルニチンを含むスポットを
切り出し、CdCl2の0.5%水溶液でL-オルニチンを溶出させ、L-オルニチンの量を540 nmにおける分光光度法で推定した。
改変株E. coli 382ilvA+ΔargI ΔargFPnlp8-yjeH (CmR)は、親株E. coli 382ilvA+ΔargI ΔargFと比較して、より多量のL-オルニチンを生産し蓄積できた。
4.1 E. coliのL-シトルリン生産株の構築
E. coliのL-シトルリン生産株は、E. coliのL-アルギニン生産株382ilvA+(実施例2)から、Datsenko K.A.とWanner B.L.により最初に開発された「λRed/ET-mediated integration」と呼ばれる方法(Datsenko K.A. and Wanner B.L., One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)でargG遺伝子にコードされるargininosuccinate synthetaseを不活化することにより構築した。この手順に従って、argG遺伝子の隣接領域と鋳型プラスミド内の抗生物質耐性を付与する遺伝子の両方に相同なPCRプライマーP9
(配列番号12)およびP10(配列番号13)を構築した。プラスミドpMW118-λattL-Cm-λattR(WO2005010175 A1)をPCR反応の鋳型として用いた。CmRマーカーは、実施例2.3に
記載したようにしてpMW-Int/Xisヘルパープラスミド(WO2005010175 A1)を用いて除去した。そうして、E. coli 382ilvA+ΔargG株を得た。382ilvA+株は、実施例2に記載したようにして得た。
yjeH遺伝子の発現増強によるL-シトルリン生産への影響を調べるために、得られたMG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)(実施例1)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-シトルリン生産株382ilvA+ΔargGに導入し、E. coli 382ilvA+ΔargGPnlp8-yjeH (CmR)株を得た。
の栄養ブロス中で37℃で18時間振盪しながら培養し、0.3 mLの得られた培養物を、20×200-mm試験管内の表2に示す2 mLの発酵培地に接種し、32℃で48時間、ロータリーシェーカー上で培養した。培養後、培地に蓄積したL-シトルリンの量を、実施例3に記載したようにして推定した。
改変株E. coli 382ilvA+ΔargG Pnlp8-yjeH (CmR)は、親株E. coli 382ilvA+ΔargGと比
較して、より多量のL-シトルリンを生産し蓄積できた。
yjeH遺伝子の発現増強によるL-アルギニン生産への影響を調べるために、得られたMG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)(実施例1)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-アルギニン生産株382ilvA+(実施例2)に導入し、E. coli 382ilvA+Pnlp8-yjeH (CmR)株を得る。
中で37℃で18時間振盪しながら培養し、0.3 mLの得られた培養物を、20×200-mm試験管内の2 mLの発酵培地に接種し、32℃で48時間、ロータリーシェーカー上で培養する。発酵培地の組成は、実施例3に記載したのと同一である。培養後、培地に蓄積したL-アルギニンの量を、実施例3に記載したようにして推定する。
yjeH遺伝子の発現増強によるL-ヒスチジン生産への影響を調べるために、得られたMG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)(実施例1)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-ヒスチジン生産株EA92に導入し、E. coli EA92 Pnlp8-yjeH (CmR)株を得た。EA92株は、予備実施例に記載したようにして得た。
ートにそれぞれプレーティングし、37℃で一晩培養した。プレート表面約0.1 cm2の菌体
をLB液体培地(5 mL)に接種し、30℃240 rpmで20時間培養した。次いで、0.1 mLの得ら
れた培養液をそれぞれ2 mLのLB液体培地に接種し、30℃240 rpmでOD(600 nm)が0.6になるまで培養して、シード培養液を得た。次いで、0.1 mLのシード培養液を、内径23 mmの
試験管(長さは全て200 mm)を用いて表5に示す2 mLの発酵培地に接種し、培養を開始した。培養は、240 rpmで撹拌しながら32℃で65時間実施した。
動相で展開した。ニンヒドリン(1%, w/v)のアセトン溶液を可視化試薬として用いた。
展開後、プレートを乾燥させ、Camag TLC Scanner 3を用いて、winCATSソフトウェア(バージョン1.4.2)により520 nmで検出する吸光度モードでスキャンした。
-ヒスチジンを蓄積できた。
E. coliのL-リジン生産株WC196LC(FERM BP-11027)を、dapA、dapB、lysC、およびddh遺伝子を搭載するリジン生産用プラスミドpCABD2(国際公開WO95/16042およびWO01/53459)で常法により形質転換し、WC196LC/pCABD2株を得た。プラスミドpCABD2は、L-リジンによるフィードバック阻害を解除するための変異を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするE. coli由来の変異型dapA遺伝子と、L-リジンによるフィードバック阻
害を解除するための変異を有するアスパルトキナーゼIIIをコードするE. coli由来の変異型lysC遺伝子と、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするE. coli由来のdapB遺
伝子と、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするBrevibacterium lactofermentum由来のddh遺伝子を含む(国際公開WO95/16042およびWO01/53459)。
coliのL-リジン生産株WC196LC/pCABD2に導入し、E. coli WC196LCPnlp8-yjeH (CmR)/pCABD2株を得た。
酵培地に接種し、34℃で48時間、ロータリーシェーカー(240 rpm)上で培養した。
改変株E. coli WC196LC Pnlp8-yjeH (CmR)/pCABD2は、親株E. coli WC196LC/pCABD2と比
較して、より多量のL-リジンを蓄積できた。
E. coli EA92株は、E. coliのL-ヒスチジン生産株EA83(MG1655rph+ilvG15-[ΔpurR Phis-ΔhisL' hisGE271KDCBHAFI]-[(IS5.11)::(λ-attB) Ptac21-purApitA-]-[(λ-attB)
PL-purH])(Malykh E.A. et al., Specific features of L-histidine production by Escherichia coli concerned with feedback control of AICAR formation and inorganic phosphate/metal transport, Microb. Cell Fact., 2018, 17(1):42)を元に構築した
。aspC遺伝子を過剰発現するようにEA83株を改変し、以てEA92株を構築した。
cat-PL-aspC株を得た。この株をドナーとして用い、標準的なP1形質導入(Moore S.D., Assembling new Escherichia coli strains by P1-duction, Methods Mol. Biol., 2011,
765:155-169)により、EA83の染色体にcat-PL-aspC発現カセットを導入した。切り出し
可能なクロラムフェニコール耐性マーカー(CmRex)は、pMWts-λInt/Xisヘルパープラスミド(Minaeva N.I. et al., 2008)を用いたXis/Int部位特異的組み換えシステムによりE. coli染色体から除去した。そうして、E. coli EA92株を得た。
Claims (5)
- 塩基性L-アミノ酸を製造する方法であって、
(i)エシェリヒア(Escherichia)属に属する塩基性L-アミノ酸生産細菌を培地で培養して培地もしくは該細菌の菌体、またはその両者中に塩基性L-アミノ酸を生産および蓄積させること、および
(ii)培地もしくは菌体、またはその両者から塩基性L-アミノ酸を回収すること
を含み、
前記細菌が、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、方法であって、
前記L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質が、下記からなる群より選択されるYjeHタンパク質である、方法:
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(C)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~40個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質;および
(D)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質。 - 前記塩基性L-アミノ酸が、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-リジン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するYjeHタンパク質が、下記からなる群より選択されるDNAにコードされる、請求項1または2に記載の方法:
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNA;
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~40個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって
、該タンパク質がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する、DNA;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質がL-メチオニン/分岐鎖ア
ミノ酸排出担体活性を有する、DNA:および
(e)遺伝暗号の縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA。 - 前記L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するYjeHタンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子を前記細菌に導入すること、前記細菌における該遺伝子のコピー数を増加させること、および/または該遺伝子の発現制御領域を改変することにより過剰発現し、以て該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強されている、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004236660A (ja) | 2003-02-06 | 2004-08-26 | Consortium Elektrochem Ind Gmbh | L−メチオニンを発酵により製造するための微生物菌株、プラスミド、微生物菌株の製法、およびl−メチオニンの製法 |
JP2013529890A (ja) | 2010-06-03 | 2013-07-25 | 味の素株式会社 | リジン/アルギニン/オルニチントランスポーターをコードする遺伝子の弱化された発現を有する腸内細菌科の細菌を使用するl−アミノ酸の製造方法 |
Family Cites Families (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU875663A1 (ru) | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
JPS565099A (en) | 1979-06-25 | 1981-01-20 | Ajinomoto Co Inc | Production of l-histidine through fermentation process and microorganism used therefor |
JPS5618596A (en) | 1979-07-23 | 1981-02-21 | Ajinomoto Co Inc | Production of l-lysine through fermentation process |
JPS56106598A (en) | 1980-01-30 | 1981-08-24 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-arginine by fermentation method |
RU2003677C1 (ru) | 1992-03-30 | 1993-11-30 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штамм бактерий ESCHERICHIA COLI - продуцент L-гистидина |
DE69330518T2 (de) | 1992-11-10 | 2002-05-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Dna, die aspartokinase iii-mutanten kodiert und ihre verwendung zur herstellung von l-threonin durch fermentation |
US5830716A (en) | 1993-10-28 | 1998-11-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Increased amounts of substances by modifying a microorganism to increase production of NADPH from NADH |
JPH07155184A (ja) | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−リジンの製造法 |
WO1995023864A1 (fr) | 1994-03-04 | 1995-09-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-lysine |
US5998178A (en) | 1994-05-30 | 1999-12-07 | Ajinomoto Co., Ltd. | L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation |
DE4440118C1 (de) | 1994-11-11 | 1995-11-09 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA |
HU223706B1 (hu) | 1994-12-09 | 2004-12-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Új lizin dekarboxiláz gén és eljárás L-lizin termelésére |
JP4088982B2 (ja) | 1996-10-15 | 2008-05-21 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−アミノ酸の製造法 |
RU2119536C1 (ru) | 1997-01-21 | 1998-09-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штамм escherichia coli - продуцент l-гистидина |
JP4294123B2 (ja) | 1998-07-03 | 2009-07-08 | 協和発酵バイオ株式会社 | ホスホリボシルピロリン酸を経由して生合成される代謝産物の製造法 |
HU225541B1 (en) | 1998-09-25 | 2007-03-28 | Ajinomoto Kk | Process for producing l-amino acids by fermentation and amino acid-producing bacterium strains |
MY137515A (en) | 1998-12-18 | 2009-02-27 | Ajinomoto Kk | Method for producing l-glutamic acid by fermentation |
RU2175351C2 (ru) | 1998-12-30 | 2001-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот |
CA2319283A1 (en) | 1999-09-20 | 2001-03-20 | Kuniki Kino | Method for producing l-amino acids by fermentation |
JP4245746B2 (ja) | 1999-09-20 | 2009-04-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
US7723081B1 (en) | 2000-01-21 | 2010-05-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacteria containing aspartate-semialdehyde dehydrogenase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and transhydrogenase to produce L-lysine in escherichia, and methods of using same |
JP4682454B2 (ja) | 2000-06-28 | 2011-05-11 | 味の素株式会社 | 新規変異型n−アセチルグルタミン酸合成酵素及びl−アルギニンの製造法 |
RU2215783C2 (ru) | 2001-05-15 | 2003-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото - Генетика" | МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА |
JP4380029B2 (ja) | 2000-07-05 | 2009-12-09 | 味の素株式会社 | 微生物を利用した物質の製造法 |
RU2208640C2 (ru) | 2000-07-06 | 2003-07-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА |
RU2207371C2 (ru) | 2000-09-26 | 2003-06-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислот семейства l-глутаминовой кислоты, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
DE60038560T2 (de) | 2000-10-27 | 2009-06-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Arginin |
RU2264459C2 (ru) | 2001-08-03 | 2005-11-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Новая мутантная карбамоилфосфатсинтетаза и способ продукции соединений - производных карбамоилфосфата |
JP4665451B2 (ja) | 2003-07-29 | 2011-04-06 | 味の素株式会社 | L−リジンまたはl−スレオニンの製造法 |
JP4380305B2 (ja) | 2003-11-21 | 2009-12-09 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−アミノ酸の製造法 |
ES2331956T3 (es) | 2004-01-30 | 2010-01-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Microorganismo que produce l-aminoacidos y procedimiento para producir l-aminoacidos. |
US7547531B2 (en) | 2005-01-18 | 2009-06-16 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing microorganism which has been modified to inactive the fimH gene, and a method for producing I-amino acid |
JP2010130899A (ja) | 2007-03-14 | 2010-06-17 | Ajinomoto Co Inc | L−グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
RU2009136544A (ru) | 2009-10-05 | 2011-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae |
EP2628792A1 (de) | 2012-02-17 | 2013-08-21 | Evonik Industries AG | Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität |
RU2013140115A (ru) | 2013-08-30 | 2015-03-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB |
RU2013147882A (ru) | 2013-10-28 | 2015-05-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕН ПУТЬ ДЕГРАДАЦИИ ПУТРЕСЦИНА |
KR101825777B1 (ko) | 2014-06-05 | 2018-02-07 | 씨제이제일제당 (주) | O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 |
CN105886449B (zh) | 2016-04-14 | 2019-07-26 | 浙江工业大学 | 一种重组大肠杆菌及其生产l-甲硫氨酸的应用 |
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Patent Citations (2)
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JP2004236660A (ja) | 2003-02-06 | 2004-08-26 | Consortium Elektrochem Ind Gmbh | L−メチオニンを発酵により製造するための微生物菌株、プラスミド、微生物菌株の製法、およびl−メチオニンの製法 |
JP2013529890A (ja) | 2010-06-03 | 2013-07-25 | 味の素株式会社 | リジン/アルギニン/オルニチントランスポーターをコードする遺伝子の弱化された発現を有する腸内細菌科の細菌を使用するl−アミノ酸の製造方法 |
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