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JP7491312B2 - 腸内細菌科の細菌の発酵による塩基性l-アミノ酸またはその塩の製造方法 - Google Patents

腸内細菌科の細菌の発酵による塩基性l-アミノ酸またはその塩の製造方法 Download PDF

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JP7491312B2 JP2021537999A JP2021537999A JP7491312B2 JP 7491312 B2 JP7491312 B2 JP 7491312B2 JP 2021537999 A JP2021537999 A JP 2021537999A JP 2021537999 A JP2021537999 A JP 2021537999A JP 7491312 B2 JP7491312 B2 JP 7491312B2
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Description

IPOD FERM BP-11027 VKPM B-7926
本発明は、広くは微生物工業に関し、特に、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体(L-methionine/branched-chain amino acid exporter)活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子を過剰発現し、塩基性L-アミノ酸の生産が非改変細菌と比較して増強されるように改変された腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する細菌の発酵により塩基性L-アミノ酸を製造する方法に関する。
従来、L-アミノ酸は自然源から得られた微生物株あるいはそれらの変異体を利用した発酵法によって工業的に製造されてきた。典型的には、そのような微生物はL-アミノ酸の生産収率が高まるように改変されている。
L-アミノ酸の生産収率を高めるための多くの技術が報告されており、組み換えDNAに
よる微生物の形質転換(例えば、U.S. Patent No. 4,278,765 Aを参照のこと)、プロモ
ーター、リーダー配列及び/又はアテニュエーター、あるいはその他の当業者に知られた発現制御領域の改変(例えば、US20060216796 A1やWO9615246 A1を参照のこと)等がある。生産収率を高めるその他の技術としては、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び/又は生成したL-アミノ酸による目的とする酵素のフィードバック阻害を解除すること(例えば、WO9516042 A1, EP0685555 A1, またはU.S. Patent Nos. 4,346,170 A, 5,661,012 A, および6,040,160 Aを参照のこと)が挙げられる。
L-アミノ酸の生産収率を高める別の方法としては、1種または数種の、目的とするL-アミノ酸の分解に関与する遺伝子、目的とするL-アミノ酸の生合成経路から該L-アミノ酸の前駆体を別の経路に逸らせる遺伝子、炭素、窒素、硫黄、及びリン酸の流れの再分配に関与する遺伝子、および毒素をコードする遺伝子等の発現を減少させることが挙げられる。
細菌におけるL-オルニチン、L-シトルリン、およびL-アルギニンの生合成経路は関連している。特に、腸内細菌科に属する細菌(例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli;E. coli)等)では、L-アルギニン生合成の直線型経路が起こり、L-オルニ
チンおよびL-シトルリン生成を経て、L-グルタミン酸からL-アルギニンが生成するまでの8つのステップが含まれる(Vogel H.J. and MacLellan W.L., Acetylornithinase
(Escherichia coli), Methods Enzymol., 1970, 17A:265-269)。生合成は、argA遺伝子にコードされるアミノ酸N-アセチルトランスフェラーゼ(amino acid N-acetyltransferase;EC 2.3.1.1;「N-アセチル-L-グルタミン酸シンテターゼ(N-acetyl-L-glutamate synthetase)」とも呼ばれる)によりL-グルタミン酸をアセチル化することで開始される。後続の生合成反応は、argB、argC、argD、argE、argFまたはargI、argG、およびargH遺伝子にそれぞれコードされるN-アセチルグルタミン酸キナーゼ(N-acetylglutamate kinase)、N-アセチル-γ-グルタミルホスフェートリダクターゼ(N-acetyl-γ-glutamylphosphate reductase)、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(N-acetylornithine
aminotransferase)、N-アセチルオルニチンデアセチラーゼ(N-acetylornithine deacetylase)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ornithine carbamoyltransferase)、アルギニノコハク酸シンターゼ(argininosuccinate synthase)、およびアルギニノコハク酸リアーゼ(argininosuccinate lyase)と一般的に呼ばれる酵素によって触媒
される。
本来(native)の直線型経路を有するE. coli細菌を、二機能型ArgJ酵素をコードするBacillus stearothermophilusまたはThermotoga neapolitanaのargJ遺伝子を含むように改変することにより、エネルギー消費の少ない環状型経路を開始させ、以て改変細菌によるL-アルギニンの生産量を増加させている(U.S. Patent No. 6,897,048 B2)。
本来の直線型経路を利用する微生物または環状型経路として機能するよう改変された直線型経路を利用する微生物では、N-アセチルグルタミン酸の供給によるL-アルギニンの生合成を開始および支援するために、amino acid N-acetyltransferase(N-acetyl-L-glutamate synthetase;ArgA)が要求され得る。したがって、組み換えE. coli株によるL-アルギニンの生産を増加させるためには、野生型のargA遺伝子をプラスミドベクターにクローニングし、argJ遺伝子をクローニングした株に組み込むことで、argA遺伝子のコピー数を増加させることができる(U.S. Patent No. 6,897,048 B2)。あるいは、L-アルギニンによるフィードバック阻害に耐性の変異型amino acid N-acetyltransferaseをコードするargA遺伝子(Eckhardt T. et al., Mol. Gen. Genet., 1975, 138:225-232)をE. coli株に導入することにより、L-アルギニンの生産を向上させることができる(EP1170361 A2)。
組み換えL-オルニチン生産細菌を培地で培養してL-オルニチン((+)-(S)-2,5-ジアミノ吉草酸としても知られている)を製造する方法が知られている(WO2015064454 and WO2015030019)これらの方法では、argFおよびargI遺伝子にコードされるornithine carbamoyltransferaseを不活性化することにより、L-アルギニン生産細菌からL-オルニチ
ン生産細菌を得た。
組み換えL-シトルリン生産細菌を培地で培養してL-シトルリン(2-アミノ-5-(カ
ルバモイルアミノ)ペンタン酸としても知られている)を製造する方法が知られている(WO2015064454 and WO2015030019)。これらの方法では、argG遺伝子にコードされるargininosuccinate synthaseを不活化することにより、L-アルギニン生産細菌からL-シト
ルリン生産細菌を得た。
また、細菌の発酵によるL-ヒスチジンおよびL-リジンを製造する方法も知られている(例えば、Russian patent Nos. 2003677 C1 and 2119536 C1, U.S. Patent No. 6,258,554 B1; and U.S. Patent Nos. 4,346,170 A and 5,827,698 Aを参照のこと)。
yjeH遺伝子にコードされるE. coli固有のYjeHタンパク質は、L-メチオニン/分岐鎖
アミノ酸排出担体(L-methionine/branched-chain amino acid exporter)として特徴付
けられている(EcoCyc database, https://ecocyc.org/, accession ID: G7833)。トラ
ンスポーター分類データベースにおいて、YjeHは、L-メチオニンならびに他の中性および疎水性アミノ酸(L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン等)を排出する疎水性アミノ酸排出トランスポーターに分類されている(Saier M.H. Jr. et al., The Transporter Classification Database (TCDB): recent advances, Nucleic Acids Res., 2016, 44(D1):D372-9; doi: 10.1093/nar/gkv1103)。YjeHタンパク質は、アミノ酸-ポリアミン-有機
カチオン(Amino Acid-Polyamine-Organocation;APC)スーパーファミリー内のアミノ酸排出(Amino Acid Efflux;AAE)ファミリーのトランスポーターのメンバーである(transporter classification number (TCID) 2.A.3.13.1 (Jack D.L. et al., The amino acid/polyamine/organocation (APC) superfamily of transporters specific for amino acids, polyamines and organocations, Microbiology, 2000, 146 (8):1797-1814; Saier M.H. et al., The transporter classification database, Nucleic. Acids Res., 2014,
42(1):D251-8)。YjeHは、12個の膜貫通型αヘリックスを含むと予測され、そのうち10
個はAPCスーパーファミリーの特徴である反転繰り返し折り畳み構造(inverted repeat fold)を形成する((Liu Q. et al., 2015)。
少なくともyjeH遺伝子を過剰発現するように改変された細菌の発酵により、疎水性または非荷電(つまり中性)の側鎖を有するアミノ酸またはこれらのアミノ酸の誘導体を製造する方法が知られている。例えば、yjeH遺伝子産物またはその機能的対立遺伝子変異体の活性を高めた微生物の発酵により、L-メチオニンを製造する方法が知られている(EP1445310 B2)。別の方法では、少なくともyjeH遺伝子が導入された組み換えE. coli細菌を用
いてL-メチオニンを生産した(CN105886449 A)。また、YjeHタンパク質の活性を高めた
エシェリヒア(Escherichia)属微生物を用いてO-アセチルホモセリンおよびL-メチオニ
ンを製造する方法も報告されている(KR101825777 A)。また、ppGppase活性を低下させ
、且つ、少なくともYjeH酵素をコードする核酸配列を過剰発現するように改変したE. coli細胞を培養することによりメチオニンまたはトリプトファンを調製する方法が知られて
いる(EP2814945 B1)。
しかし、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された腸内細菌科に属する細菌の発酵により塩基性L-アミノ酸の生産を改善する方法には、未だに技術的な問題がある。特に、腸内細菌科に属する細菌の発酵による塩基性L-アミノ酸の生産におけるyjeH遺伝子の過剰発現の影響を記載したデータは、これまでに報告されていない。
本明細書は、腸内細菌科に属する細菌の発酵によって塩基性L-アミノ酸を製造する、改善された方法を記載するものである。本発明によれば、腸内細菌科に属する細菌の発酵による塩基性L-アミノ酸の製造を増加させることができる。具体的には、腸内細菌科に属する細菌の発酵による塩基性L-アミノ酸の生産は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように該細菌を改変し、以て改変された該細菌による塩基性L-アミノ酸の生産を増強することにより、改善できる。
本発明は、下記のものを提供する。
本発明のひとつの態様は、塩基性L-アミノ酸を製造する方法であって、
(i)腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する塩基性L-アミノ酸生産細菌を培地で
培養して培地もしくは該細菌の菌体、またはその両者中に塩基性L-アミノ酸を生産および蓄積させること、および
(ii)培地もしくは菌体、またはその両者から塩基性L-アミノ酸を回収すること
を含み、
前記細菌が、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、方法を提供することである。
本発明の別の態様は、前記塩基性L-アミノ酸が、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-リジン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記方法を提供することである。
本発明の別の態様は、前記L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質が、下記からなる群より選択される、前記方法を提供することである:
(A)YjeHタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(C)配列番号2に示すアミノ酸配列において、約1~100個のアミノ酸残基の置換、欠失
、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質;および
(D)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質。
本発明の別の態様は、前記L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質が、下記からなる群より選択されるDNAにコードされる、前記方法を提供すること
である:
(a)yjeH遺伝子;
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNA;
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~100個のアミノ酸残基の置換、欠失、
挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであっ
て、該タンパク質がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する、DNA;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質がL-メチオニン/分岐鎖ア
ミノ酸排出担体活性を有する、DNA:および
(e)遺伝暗号の縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA。
本発明の別の態様は、前記L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子を導入すること、該遺伝子のコピー数を増加させること、および/または該遺伝子の発現制御領域を改変することにより過剰発現し、以て該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強されている、前記方法を提供することである。
本発明の別の態様は、前記細菌が、エシェリヒア(Escherichia)属またはパントエア
(Pantoea)属に属する細菌である、前記方法を提供することである。
本発明の別の態様は、前記細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)またはパントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)である、前記方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的、特徴、および付随する利点は、それに従って構築された実施形態の以下の詳細な説明を読めば当業者に明らかになるであろう。
1.細菌
本明細書に記載の細菌は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体(L-methionine/branched-chain amino acid exporter)活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過
剰発現するように改変された腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属するL-アミノ酸生産菌である。本明細書に記載の細菌は、本明細書に記載の方法で使用できる。よって、同細菌に関する以下の説明は、本明細書に記載の方法で代替可能または等価に使用されるいずれの細菌にも準用できる。
本明細書に記載の方法で使用できる細菌は、その方法を用いて生産される目的のL-アミノ酸の種類に応じて適切に選択された細菌であり得る。したがって、細菌は、塩基性L-アミノ酸生産菌であり得る。具体的には、細菌は、目的のL-アミノ酸がL-オルニチンである場合にはL-オルニチン生産菌であり得る。なお、誘導体L-アミノ酸であるL-シトルリンおよびL-アルギニンは、L-オルニチンからの生合成により得られるため、細菌は、目的のL-アミノ酸がL-シトルリンである場合にはL-シトルリン生産菌であり得、目的のL-アミノ酸がL-アルギニンである場合にはL-アルギニン生産菌であり得る。また、本明細書に記載の細菌は、目的のL-アミノ酸がL-ヒスチジンまたはL-リジンである場合には、それに応じて、L-ヒスチジン生産菌またはL-リジン生産菌であり得る。塩基性L-アミノ酸生産菌の例は、本明細書に記載されている。
L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されたものであれば、腸内細菌科に属する任意の塩基性L-アミノ酸生産菌を本明細書に記載の方法で使用できる。例えば、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変され、以て塩基性L-アミノ酸の生産が非改変細菌と比較して増強され得るものであれば、腸内細菌科に属する塩基性L-アミノ酸生産菌を本明細書に記載の方法で使用できる。
「塩基性L-アミノ酸生産菌」の用語は、「塩基性L-アミノ酸を生産できる細菌」の用語または「塩基性L-アミノ酸を生産する能力を有する細菌」の用語と代替可能または等価に使用されてよい。
「塩基性L-アミノ酸生産菌」の用語は、当該細菌を培地で培養したときに、培地及び/又は該細菌の菌体中に塩基性L-アミノ酸を生成し、排出もしくは分泌し、且つ/又は蓄積する能力を有する腸内細菌科に属する細菌を意味し得る。
また、「塩基性L-アミノ酸生産菌」の用語は、例えば、非改変細菌と比較して、より多い量で塩基性L-アミノ酸を培地中に生成し、排出もしくは分泌し、且つ/又は蓄積する能力を有する細菌も意味し得る。「非改変細菌」の用語は、「非改変株」の用語と代替可能または等価に使用されてよい。「非改変株」の用語は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されていない対照株を意味し得る。非改変細菌としては、例えばEscherichia coli (E. coli)
K-12株(例えば、W3110 (ATCC 27325) やMG1655 (ATCC 47076))およびPantoea ananatis (P. ananatis) AJ13355等の、野生株または親株が挙げられる。また、「塩基性L-ア
ミノ酸生産菌」の用語は、例えば、0.1 g/L以上、0.5 g/L以上、あるいは1.0 g/L以上の
量で塩基性L-アミノ酸を培地中に蓄積することができる細菌も意味し得る。また、「塩基性L-アミノ酸生産菌」の用語は、例えば、非改変細菌と比較して、より多い量で塩基性L-アミノ酸を培地中に生成し、排出もしくは分泌し、且つ/又は蓄積する能力を有し、且つ0.1 g/L以上、0.5 g/L以上、あるいは1.0 g/L以上の量で塩基性L-アミノ酸を培
地中に蓄積することができる細菌も意味し得る。
細菌は、本来的に塩基性L-アミノ酸生産能を有していてもよく、塩基性L-アミノ酸生産能を有するように改変されてもよい。そのような改変は、例えば、突然変異法またはDNA組み換え技術により達成できる。前記細菌は、本来的に塩基性L-アミノ酸生産能を
有する細菌において、または塩基性L-アミノ酸生産能を既に付与された細菌において、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させることにより取得できる。あるいは、前記細菌は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように既に改変された細菌に塩基性L-アミノ酸生産能を付与することにより取得できる。あるいは、前記細菌は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されたことにより塩基性L-アミノ酸生産能を獲得したものであってもよい。本明細書に記載の細菌は、具体的には、例えば、後述する細菌株を改変することにより取得できる。
「塩基性L-アミノ酸生産能」の用語は、細菌を培地で培養したときに、培地及び/又は該細菌の菌体中に塩基性L-アミノ酸を生成し、排出もしくは分泌し、且つ/又は蓄積する、細菌の能力を意味し得る。「塩基性L-アミノ酸生産能」の用語は、具体的には、細菌を培地で培養したときに、培地及び/又は菌体から回収できる程度に、培地及び/又は該細菌の菌体中に塩基性L-アミノ酸を生成し、排出もしくは分泌し、且つ/又は蓄積する、腸内細菌科に属する細菌の能力を意味し得る。
本明細書に記載の方法で使用され得る細菌について言及される「培養される(cultured)」という用語は、当業者に周知である「培養される(cultivated)」等の用語と代替可能または等価に使用されてよい。
細菌は、塩基性L-アミノ酸を、単独で、あるいは塩基性L-アミノ酸と塩基性L-アミノ酸とは異なる1種またはそれ以上の物質の混合物として、生産し得る。例えば、細菌は、塩基性L-アミノ酸を、単独で、あるいは塩基性L-アミノ酸と塩基性L-アミノ酸とは異なる1種またはそれ以上のアミノ酸(例えば塩基性L-アミノ酸ではないL-アミノ酸等)の混合物として、生産し得る。さらに、例えば、細菌は、目的の塩基性L-アミノ酸を、単独で、あるいは目的の塩基性L-アミノ酸と目的の塩基性L-アミノ酸とは異なる他の1種またはそれ以上の塩基性L-アミノ酸の混合物として、生産し得る。言い換えると、細菌が2種またはそれ以上の塩基性L-アミノ酸を生産し得ることが許容される。さらに、例えば、細菌は、塩基性L-アミノ酸を、単独で、あるいは塩基性L-アミノ酸と他の1種またはそれ以上の有機酸(例えばカルボン酸等)の混合物として、生産し得る。
L-アミノ酸としては、特に制限されないが、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シトルリン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、及びL-バリンが挙げられる。
「塩基性L-アミノ酸」の用語は、中性pH(pH 7)で正に荷電したラジカル側鎖を有するL-アミノ酸を意味し得る。塩基性L-アミノ酸としては、L-アルギニン、L-シトルリン、L-ヒスチジン、L-リジン、L-オルニチンが挙げられる。
カルボン酸としては、特に制限されないが、ギ酸、酢酸、クエン酸、酪酸、乳酸、プロピオン酸、およびそれらの誘導体が挙げられる。
「L-アミノ酸」および「カルボン酸」の用語は、遊離形態のL-アミノ酸およびカルボン酸に限られず、それらの派生形態(塩、水和物、付加物、またはそれらの組み合わせ、等)も意味し得る。付加物は、L-アミノ酸またはカルボン酸と別の有機もしくは無機の化合物との組み合わせで形成された化合物であり得る。すなわち、「L-アミノ酸」および「カルボン酸」の用語は、例えば、遊離形態、派生形態、またはそれらの混合物であるL-アミノ酸およびカルボン酸を意味し得る。「L-アミノ酸」および「カルボン酸」の用語は、例えば、特に、遊離形態のL-アミノ酸およびカルボン酸、それらの塩、またはそれらの混合物を意味し得る。「L-アミノ酸」および「カルボン酸」の用語は、例えば、それらの、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、一水和物、二水和物、三水和物、一塩酸塩、二塩酸塩等の塩のいずれも意味し得る。特記しない限り、水和状態について言及しない「L-アミノ酸」および「カルボン酸」の用語(例えば、「遊離形態のL-アミノ酸またはカルボン酸」の用語や「L-アミノ酸またはカルボン酸の塩」の用語)は、L-アミノ酸およびカルボン酸の非水和物を意味し得、また、L-アミノ酸およびカルボン酸の水和物を意味し得る。
腸内細菌科に属する細菌としては、エンテロバクター(Enterobacter)、エルビニア(Erwinia)、エシェリヒア(Escherichia)、クレブシエラ(Klebsiella)、モルガネラ(Morganella)、パントエア(Pantoea)、フォトルハブドゥス(Photorhabdus)、プロビ
デンシア(Providencia)、サルモネラ(Salmonella)、イェルシニア(Yersinia)等の
属に属する細菌が挙げられる。そのような細菌は、塩基性L-アミノ酸を生産する能力を有し得る。具体的には、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のデ
ータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)で用いられ
ている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を使用することができる。腸内細菌科に属する細菌としては、特に、Escherichia、Enterobacter、およびPantoea属に属する細菌が挙げられる。
Escherichia属細菌は特に限定されず、具体的には、Neidhardtらの著書(Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12, p. 2460-2488. In F.C. Neidhardt et al. (ed.), E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nded. ASM Press, Washington, D.C., 1996)に記載のものが挙げられる。Escherichia属細菌としては、特に、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli (E. coli))が挙げられる。E. coliとして、具体的には、プロトタイプ野生株であるE. coli K-12株(E. coli W3110(ATCC 27325)やE. coli MG1655(ATCC 47076)等)が挙げられる
Enterobacter属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)やエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等が挙げられる。Pantoea属細菌としてはパントエア・アナナティス(Pantoea ananatis(P. ananatis))等が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)のいくつかの株は、近年、16S rRNAの塩基配列解析等によりパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)、またはパ
ントエア・スチューアルティ(Pantoea stewartii)に再分類されている。腸内細菌科に
分類された細菌であれば、Enterobacter属またはPantoea属のいずれに属するものであっ
ても使用することができる。P. ananatisとして、具体的には、Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)、及び
それらの派生株が挙げられる。これらの株は、分離された当時はEnterobacter agglomeransと同定され、Enterobacter agglomeransとして寄託されたが、上記のとおり最近16S rRNAの塩基配列解析等によりPantoea ananatisに再分類されている。
これらの株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC; Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)から入手することができる。すなわち各菌株には対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して発注することができる(https://www.lgcstandards-atcc.orgを参照)。各菌株の
登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。これらの株は、例えば、各株が寄託された寄託機関から入手することもできる。
塩基性L-アミノ酸生産能の付与又は増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる(アミノ酸発酵、(株)学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77~100頁参照)。そ
のような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、塩基性L-アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、塩基性L-アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。塩基性L-アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、2種又は3種以上であってもよい。また、塩基性L-アミノ酸生産菌の育種において、活性が増強される塩基性L-アミノ酸生合成系酵素も、単独であってもよく、2種又は3種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
塩基性L-アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御
変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つ塩基性L-アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、X線や紫外線の照射、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)、エチルメタンスルフォネート(EMS)、メチルメタンスルフォネート(MMS)等の変異剤による処理が挙げられる。
また、塩基性L-アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的の塩基性L-アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935やEP1010755A等に記載されている。後述するL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する方法は、酵素の活性の増強または酵素をコードする遺伝子の発現の増強にも準用できる。
また、塩基性L-アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的の塩基性L-アミノ酸の生合成経路から分岐して目的の塩基性L-アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的の塩基性L-アミノ酸の生合成経路から分岐して目的の塩基性L-アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」の用語は、目的の塩基性L-アミノ酸の分解に関与する酵素も意味し得る。
以下、塩基性L-アミノ酸生産菌、および塩基性L-アミノ酸生産能を付与又は増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するような塩基性L-アミノ酸生産菌が有する性質および塩基性L-アミノ酸生産能を付与又は増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。
<L-アルギニン生産菌>
L-アルギニン生産菌およびL-アルギニン生産菌を誘導するために使用できる親株としては、例えば、1種またはそれ以上のL-アルギニン生合成系酵素の活性が増大した株が挙げられる。そのような酵素としては、制限されないが、N-アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、N-アセチル-γ-グルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(argF, argI)、アルギニノコハク酸シンターゼ(argG)、アルギニノコハク酸リアーゼ(argH)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、カルバモイルリン酸シンターゼ(carAB)が挙げられる。酵素名の後のカッコ内には、その酵素をコ
ードする遺伝子の一例を示す(同一の命名法は、以下、タンパク質/酵素および遺伝子について言及する場合にも準用される)。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)遺伝子としては、例えば、野生型の15位~19位に相当するアミノ酸残基が置換され、L-アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型N-アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子を用いると好適である(EP1170361A)。
L-アルギニン生産菌およびL-アルギニン生産菌を誘導するために使用できる親株として、具体的には、例えば、E. coli 237株(VKPM B-7925;US2002-058315A1)、変異型
N-アセチルグルタミン酸シンターゼをコードするargA遺伝子が導入されたその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号, EP1170361A1)、237株由来の酢酸資化能が向上した株であるE. coli 382株(VKPM B-7926;EP1170358A1)、及び382株にE. coli K-12株由来の野生型ilvA遺伝子が導入された株であるE. coli 382ilvA+株等のEscherichia属に属する株
が挙げられる。E. coli 237株は、2000年4月10日にルシアン・ナショナル・コレクション
・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)(FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。E. coli 382株は、2000年4月10日にルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロ
オルガニズムズ(VKPM)(FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)にVKPM B-7926の受託番号で寄託され、2001年5月18日にブダペスト条約に基
づく国際寄託に移管された。
L-アルギニン生産菌およびL-アルギニン生産菌を誘導するために使用できる親株としては、アミノ酸アナログ等への耐性を有する株も挙げられる。そのような株としては、例えば、α-メチルメチオニン、p-フルオロフェニルアラニン、D-アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、S-(2-アミノエチル)-システイン、α-メチルセリン、β-2-チエニルアラニン、またはスルファグアニジンに耐性を有するE. coli変異株(特
開昭56-106598)が挙げられる。
<L-シトルリン生産菌およびL-オルニチン生産菌>
L-シトルリンおよびL-オルニチンは、L-アルギニン生合成経路における中間体である。よって、L-シトルリンまたはL-オルニチンの生産菌およびL-シトルリンまたはL-オルニチンの生産菌を誘導するために使用できる親株としては、例えば、1種またはそれ以上のL-アルギニン生合成系酵素の活性が増大した株が挙げられる。そのような酵素としては、制限されないが、L-シトルリンについて、N-アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、N-アセチル-γ-グルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(argF, argI)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、カルバモイルリン酸シンターゼ(carAB)が挙げられる。また、そのような酵素としては、制
限されないが、L-オルニチンについて、N-アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、N-アセチル-γ-グルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)が挙げられる。
L-シトルリン生産菌およびL-シトルリン生産菌を誘導するために使用できる親株として、具体的には、制限されないが、変異型N-アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するE. coli 237/pMADS11株、237/pMADS12株、及び237/pMADS13株(ロシア特許第2215783号, 欧州特許1170361 B1, および米国特許第6,790,647号B2)、フィードバック阻害に耐
性のカルバモイルリン酸シンセターゼを保持するE. coli 333株(VKPM B-8084)及び374
株(VKPM B-8086)(ロシア特許第2,264,459号)、α-ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大し、且つフェレドキシンNADP+レダクターゼ、ピルビン酸シンターゼ、及び/又は
α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性がさらに改変されたE. coli株(EP2133417A
)等のエシェリヒア属に属する株が挙げられる。
また、L-シトルリン生産菌は、任意のL-アルギニン生産菌(例えばE. coli 382株
(VKPM B-7926)等)から、argG遺伝子にコードされるアルギニノコハク酸シンターゼ不
活化することにより容易に得ることができる。遺伝子を不活化する方法は、本明細書に記載されている。
L-オルニチン生産菌は、任意のL-アルギニン生産菌(例えばE. coli 382株(VKPM B-7926)等)から、argF及びargI遺伝子によりコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ不活化することにより容易に得ることができる。
<L-ヒスチジン生産菌>
L-ヒスチジン生産菌およびL-ヒスチジン生産菌を誘導するために使用できる親株としては、1種またはそれ以上のL-ヒスチジン生合成系酵素の活性が増大した株が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(hisG)、ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ(hisE)、ホスホリボシル-AMPサイクロヒドロラーゼ(hisI)、二機能性ホスホリボシル-AMPサイクロヒドロラーゼ/ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ(hisIE)、ホスホリボシルフ
ォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ(hisA)、アミドトランスフェラーゼ(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(hisD)が挙げられる。
hisG及びhisBHAFIにコードされるL-ヒスチジン生合成系酵素は、L-ヒスチジンにより阻害されることが知られている。従って、L-ヒスチジン生産能は、例えば、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼにフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより、効率的に増強することができる(ロシア特許第2,003,677号C1及びロシア
特許第2,119,536号C1)。
L-ヒスチジン生産菌およびL-ヒスチジン生産菌を誘導するために使用できる親株として、具体的には、制限されないが、E. coli 24株(VKPM B-5945;RU2003677 C1)、E. coli NRRL B-12116~B-12121(米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342(FERM BP-6675)及びH-9343(FERM BP-6676)(米国特許第6,344,347号B1)、E. coli H-9341(FERM BP-6674;EP1085087 A2)、E. coli AI80/pFM201(米国特許第6,258,554号B1)、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターで形質転換したE. coli FERM P-5038及びFERM P-5048(JP 56-005099 A)、アミノ酸排出用の遺伝子であるrhtで形質転換したE. coli株(EP1016710 A2)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾー
ル-3-アラニン、及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM
B-7270;RU2119536 C1)、E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR(RU2119536 and Doroshenko V.G. et al., The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (Russian), 2013, 49(2):149-154)等のEscherichia属に属する株が挙げられる。
<L-リジン生産菌>
L-リジン生産菌およびL-リジン生産菌を誘導するために使用できる親株としては、Escherichia属に属し、且つL-リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。L
-リジンアナログはEscherichia属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、L-
リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に脱感作される。L-リジンアナログとしては、制限されないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、S-(2-アミノエチル)-L-システイン(AEC)、γ-メチルリジン、α-クロロカプロラクタム等
が挙げられる。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、Escherichia属
に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。
L-リジン生産菌およびL-リジン生産菌を誘導するために使用できる親株としては、1種またはそれ以上のL-リジン生合成系酵素の活性が増大した株が挙げられる。そのような酵素としては、制限されないが、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dihydrodipicolinate synthase)(dapA)、アスパルトキナーゼIII(aspartokinase III)(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dihydrodipicolinate reductase)(dapB)、ジアミ
ノピメリン酸デカルボキシラーゼ(diaminopimelate decarboxylase)(lysA)、ジアミ
ノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(diaminopimelate dehydrogenase)(ddh)(米国特許第
6,040,160号)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(phosphoenolpyruvate carboxylase)(ppc)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(aspartate semialdehyde dehydrogenase)(asd)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase)(アスパラギン酸トランスアミナーゼ(aspartate transaminase))(aspC)、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(diaminopimelate epimerase)(dapF)
、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(tetrahydrodipicolinate succinylase)(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(succinyl diaminopimelate deacylase)(dapE)、及びアスパルターゼ(aspartase)(aspA)(EP1253195 A1)をコード
する遺伝子が挙げられる。これらの酵素の中では、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの1種またはそれ以上の活性を増強するのが好ましい。また、L-ヒスチジン生産菌およびL-ヒスチジン生産菌を誘導するために使用できる親株では、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo)(EP1170376 A1)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロ
ゲナーゼ(nicotinamide nucleotide transhydrogenase)をコードする遺伝子(pntAB)
(米国特許第5,830,716号A)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、またはこれらの組み合わ
せの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIII(lysC)はL-リジンに
よるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子
を利用してもよい(米国特許第5,932,453号)。L-リジンによるフィードバック阻害が
解除されたアスパルトキナーゼIIIとしては、318位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換される変異、323位のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換される変異、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換される変異等の1またはそれ以上の変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIが挙げられる(米国特許第5,661,012号、米国特許第6,040,160号)。また、ジヒドロジピコリン酸合成酵素(dapA)はL-
リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA遺伝子を利用してもよい。L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素としては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換さ
れる変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素が挙げられる(米国特許第6,040,160号)。
L-リジン生産菌またはL-リジン生産菌を誘導するために使用できる親株では、L-アミノ酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または消失していてよい。また、L-リジン生産菌またはL-リジン生産菌を誘導するために使用できる親株では、L-リジンの合成または蓄積に対して負に作用する酵素の活性が低下または消失していてよい。そのような酵素としては、制限されないが、ホモセリンデヒドロゲナーゼ(homoserine dehydrogenase)、リジンデカルボキシラーゼ(lysine
decarboxylase;cadA, ldcC)、リンゴ酸酵素(malic enzyme)が挙げられ、これらの酵素の活性が低下または欠損した株は、WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175等に開示
されている。lysine decarboxylase活性は、例えば、lysine decarboxylaseをコードするcadAおよびldcC遺伝子の両方の発現を低下させることにより、低下または欠損させることができる。両遺伝子の発現は、例えば、WO2006/078039に記載の方法により、低下させる
ことができる。
L-リジン生産に有用な細菌株として、具体的には、例えば、E. coli AJ11442(FERM BP-1543, NRRL B-12185;米国特許第4,346,170号を参照のこと)及びE. coli VL611が挙
げられる。これらの株では、アスパルトキナーゼにおけるL-リジンによるフィードバッ
ク阻害が解除されている。
L-リジン生産菌またはL-リジン生産菌を誘導するために使用できる親株として、具体的には、E. coli WC196株(FERM BP-5252, U.S. Patent No. 5,827,698)、E. coli WC196ΔcadAΔldcC株(FERM BP-11027;「WC196LC」とも呼ばれる)、E. coli WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株(WO2006/078039)も挙げられる。
WC196株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種され
た(米国特許第5,827,698号)。WC196株は、E. coli AJ13069と命名され、1994年12月6日に、通商産業省 工業技術院生命工学工業技術研究所(現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE IPOD)、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉
県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
WC196ΔcadAΔldcC株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊することにより構築された。WC196ΔcadAΔldcC株は、AJ110692と命
名され、2008年10月7日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(
現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE IPOD)、郵便番
号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM BP-11027として国際寄託された。
WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株は、WC196ΔcadAΔldcC株に、リジン生合成系遺伝子を含
むプラスミドpCABD2(米国特許第6,040,160号)を導入することにより構築された。pCABD2は、L-リジンによるフィードバック阻害が解除される変異(H118Y)を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素(DDPS)をコードする変異型dapA遺伝子と、L-リジンによるフィードバック阻害が解除される変異(T352I)を有するエシェリ
ヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒ
ア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。
L-リジン生産菌またはL-リジン生産菌を誘導するために使用できる親株としては、E. coli AJIK01株(NITE BP-01520)も挙げられる。AJIK01株は、E. coli AJ111046と命
名され、2013年1月29日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センタ
ー(NITE NPMD;郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に寄託され、2014年5月15日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託
番号NITE BP-01520が付与されている。
塩基性L-アミノ酸生産菌の育種に用いられる遺伝子およびタンパク質は、例えば、上記例示した遺伝子およびタンパク質の公知の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ有していてよい。また、塩基性L-アミノ酸生産菌の育種に用いられる遺伝子およびタンパク質は、元の機能(例えば、タンパク質の場合はそれぞれの酵素活性)が維持されている限り、上記例示した遺伝子およびタンパク質のバリアント(例えば、そのような公知の塩基配列およびアミノ酸配列を有する遺伝子およびタンパク質のバリアント)であってもよい。遺伝子およびタンパク質のバリアントについては、本明細書に記載のL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびコードされるタンパク質のバリアントについての記載を準用できる。
本明細書に記載の細菌は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている。
「L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質」の用語は、細菌を培地で培養した際に、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、および/またはL-バリン、例えば、これら全て、の細胞外濃度の上昇を引き起こすことができるタンパク質を意味し得る。特に、「L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質」の用語は、ジペプチドMet-Met、Ile-Ile、Leu-Leu、およびVal-Valを含む培地で細菌を培養した際に、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、およびL-バリンの細胞外濃度の上昇を引き起こすことができるタンパク質を意味し得る(Liu Q. et al., YjeH is
a novel exporter of L-methionine and branched-chain amino acids in Escherichia coli, Appl. Environ. Microbiol., 2015, 81(22):7753-7766)。「L-メチオニン/分
岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質」の用語は、細菌を培地で培養した際に、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、および/またはL-バリン、例えば、これら全て、の細菌菌体外への輸送を引き起こすことができるタンパク質も意味し得る。特に、「L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質」の用語は、ジペプチドMet-Met、Ile-Ile、Leu-Leu、およびVal-Valを含む培地で細菌を培養した際に、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、およびL-バリンの細菌菌体外への輸送を引き起こすことができるタンパク質も意味し得る(Liu Q. et al., 2015)。
「L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質」の用語は、L-メチオニンおよび分岐鎖アミノ酸(「BCAA」と略す)の毒性アナログ(DL-エチオニン、DL-ノルロイシン、DL-ノルバリン等)に対する耐性を細菌に付与できるタンパク質も意味し
得る。
「L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質」の用語は、細菌を培地で培養した際に、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、およびL-バリンの細胞外濃度の上昇、またはL-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、およびL-バリンの細菌菌体外への輸送を引き起こすことができ、且つDL-エチオニン、DL-ノルロイシン、およびDL-ノルバリンに対する耐性を細菌に付与できるタンパク質も意味し得る。
L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の活性は、生育阻害試験および/またはアミノ酸排出アッセイにより測定できる。生育阻害試験は、L-メチオニンまたは分岐鎖アミノ酸の構造アナログ(DL-エチオニン、DL-ノルロイシン、DL-ノル
バリン等)を含有する培地で細菌を培養し(すなわち生育させ)、生育阻害を評価することで実施できる(Liu Q. et al., 2015)。細菌菌体外へのアミノ酸の輸送は、例えば、
菌体の細胞外画分および細胞内画分に含まれる2,4-ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)の誘導体の形態でのアミノ酸の量を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて評価することで判断できる(Liu Q. et al., 2015)。
さらに、例えばアミノ酸のアナログ等の標的化合物に対する耐性を細菌に付与できる膜タンパク質があることが知られている(Doroshenko V. et al., YddG from Escherichia coli promotes export of aromatic amino acids, FEMS Microbiol. Lett., 2007, 275(2):312-318)。標的化合物に対する耐性を細菌に付与できるトランスポータータンパク質
の活性を測定する方法が知られており、それらの方法はL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の活性を測定するためにも同様に用いることができ、その際には、例えば、標的化合物に対するタンパク質の最小阻害濃度(MIC)が測定される
(例えば、Doroshenko V. et al., 2007; Livshits V.A. et al., Identification and characterization of the new gene rhtA involved in threonine and homoserine efflux
in Escherichia coli, Res. Microbiol., 2003, 154(2):123-135を参照のこと)。
タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン(BSA)を標準としてクマシー色素を用いたBradfordタンパク質アッセイまたはLowry法により決定することができる(Bradford M.M., Anal. Biochem., 1976, 72:248-254; Lowry O.H. et al., J. Biol. Chem., 1951, 193:265-275)。
L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質としては、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。配列番号2に示すアミノ酸配列は、配列番号1に示す塩基配列(これは、E. coli K-12株に固有のyjeH遺伝子に相当する)
にコードされ得る。E. coli K-12株に固有のyjeH遺伝子(GenBank, accession No. NC_000913.3; nucleotide positions: 4369156 to 4370412; Gene ID: 948656)は、L-メチ
オニン/分岐鎖アミノ酸排出担体であるYjeH(EcoCyc database, https://ecocyc.org/, accession ID: G7833; UniProtKB/Swiss-Prot database, accession No. P39277; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, entry No. b4141)をコードする。yjeH遺伝子は、E. coli K-12株の染色体において、反対側の鎖にあるfxsA遺伝子とgroS遺伝子の間に位置する。yjeH遺伝子の塩基配列(配列番号1)およびyjeH遺伝子がコードするYjeHタ
ンパク質のアミノ酸配列(配列番号2)は公知である。
すなわち、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子はyjeH遺伝子であってよく、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質はYjeHタンパク質であってよい。具体的には、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、yjeH遺伝子)は配列番号1に示す塩基配列を有する遺伝子(例えば、DNA)であってよく、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質(例えば、YjeHタンパク質)は配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。「遺伝子またはタンパク質が
塩基配列またはアミノ酸配列を有する」という表現は、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列または当該アミノ酸配列をより長い配列中に含むことを意味し得、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列または当該アミノ酸配列のみを有することも意味し得る。
腸内細菌科に属する種々の細菌に固有のYjeHタンパク質ホモログは公知であり、その例を表1に示す。
Figure 0007491312000001
腸内細菌科に属する細菌の属、種、または株間でDNA配列に相違があり得る。従って、
L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、yjeH遺伝子)は、配列番号1に示す塩基配列を有する遺伝子に限定されず、配列
番号1の変異体塩基配列を有し、且つL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有
する変異体タンパク質をコードする遺伝子を包含してもよい。同様に、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質(例えば、YjeHタンパク質)は、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質に限定されず、配列番号2の変異体アミノ酸配列を有し、且つL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質を包含してもよい。そのような変異体塩基配列または変異体アミノ酸配列としては、上記例示したL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および上記例示したL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質のホモログや人為的改変体が挙げられる。
「変異体塩基配列」の用語は、標準遺伝子暗号表(例えば、Lewin B., “Genes VIII”, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458を参照)による任意
の同義のアミノ酸コドンを使用してL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質)をコードす
る塩基配列を意味し得る。従って、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するL-メチオニ
ン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝暗号の縮重による配列番号1の変異体塩基配列を有する遺伝子であり得る。
「変異体塩基配列」の用語は、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するL-メチオニン
/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の活性または機能が維持されているか、その三次元構造がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、E. coli固有の野生型YjeHタンパク質)に対して顕著には変更されてい
ないタンパク質をコードする限り、配列番号1に示す配列に相補的な塩基配列または該塩
基配列から調製し得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列も意味し得る。「ストリンジェントな条件」の用語は、特異的なハイブリッド、例えばコンピュータプログラムblastnを使用する場合のパラメーター「同一性」として定義される相同性が70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上のハイブリッド、が形成され、非特異的なハイブリッド、例えば上記より相同性が低いハイブリッド、が形成されない条件を意味し得る。ストリンジェントな条件としては、例えば、1×SSC(標準クエン酸ナトリウムまたは標準塩化ナトリウム)、0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の塩濃度で60℃において、0.1×SSC、0.1% SDSの塩濃度で60℃において、または0.1×SSC、0.1% SDSの塩濃度で65℃において1回以上、別の例では2または3回洗浄する条件が挙げられる。洗浄時間は、ブロッティングに使用されたメンブレンの種類に依存し得るが、一般的には製造者により推奨されるものとすべきである。例えば、Amersham HybondTM-N+正荷電ナイロンメンブレン(GE Healthcare)のストリンジェントな条件下での推奨洗浄時
間は15分である。洗浄工程は2または3回行うことができる。プローブとしては、配列番号1に示す配列に相補的な配列の一部を使用してもよい。そのようなプローブは、配列番
号1に示す配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、塩
基配列を含むDNA断片を鋳型として使用するPCR(polymerase chain reaction;White T.J. et al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5:185-189を参照の
こと)によって調製することができる。プローブの長さは、50 bpを超えることが推奨さ
れるが、ハイブリゼーション条件により適切に選択することができ、通常100 bp ~1 kbpである。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合、ハイ
ブリダイゼーション後の洗浄条件は、例えば、50℃、60℃、または65℃における2×SSC、0.1%SDSの条件であり得る。
「変異体塩基配列」の用語は、変異体タンパク質をコードする塩基配列も意味し得る。
「変異体タンパク質」の用語は、配列番号2の変異体アミノ酸配列を有するタンパク質
を意味し得る。
「変異体タンパク質」の用語は、具体的には、配列番号2に示すアミノ酸配列と比較し
て、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加のいずれであるに
せよ、1つまたはそれ以上の変異を配列中に有するタンパク質であって、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の活性または機能が維持されているか、その三次元構造がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質)に対して顕著には変更されていないタンパク質を意味し得る。変異体タンパク質中の変異の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置またはアミノ酸残基の種類による。変異体タンパク質中の変更の数は、厳密に限定されるものではないが、配列番号2において1~100、別の例では1~90、別の例では1~80、別の例では1~70、別の例では1~60、別の例では1~50、別の例では1~40、別の例では1~30、別の例では1~20、別の例では1~15、別の例では1~10、あるいは別の例では1~5であってよい。こ
れは、アミノ酸は互いに高い相同性を有し得るものであり、それらアミノ酸間の変異によっては、タンパク質の活性または機能が影響を受けないか、タンパク質の三次元構造がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質)に対して顕著には変化しない場合がある
から可能である。従って、変異体タンパク質は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の活性または機能が維持されているか、タンパク質の三次元構造がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質)に対して顕著には変更されていな
い限り、配列番号2のアミノ酸配列全体に対して70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、あるいは99%以上の、コンピュータプログラムblastpを使用する際のパラメーター「同一
性」として定義される相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。本明細書において、「相同性」の用語は、「同一性」(これは、アミノ酸残基間の同一性である)を意味してよい。2つの配列間の配列同一性は、2つの配列を最大一致となるように整列した際の2つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加の例としては、保存的変異が挙げられる。保存的変異の代表的なものは保存的置換であり得る。保存的置換は、限定するものではないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ala、Leu、Ile、Val間で、置換部位
が親水性アミノ酸である場合にはGlu、Asp、Gln、Asn、Ser、His、Thr間で、置換部位が
極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合にはLys、Arg、His間で、置換部位が酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、置換部位
がヒドロキシル基を有するアミノ酸である場合には、Ser、Thr間で、互いに置換する置換である。保存的置換の例としては、AlaからSerまたはThrへの置換、ArgからGln、HisまたはLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、HisまたはAspへの置換、AspからAsn、GluまたはGlnへの置換、CysからSerまたはAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、AspまたはArgへの置換、GluからAsn、Gln、LysまたはAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、ArgまたはTyrへの置換、IleからLeu、Met、ValまたはPheへの置換、LeuからIle、Met、ValまたはPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、HisまたはArgへの置換、Met
からIle、Leu、ValまたはPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、IleまたはLeuへの置換、SerからThrまたはAlaへの置換、ThrからSerまたはAlaへの置換、TrpからPheまたはTyrへ
の置換、TyrからHis、PheまたはTrpへの置換、及びValからMet、IleまたはLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加等は、アミ
ノ酸配列が由来する生物の個体差によって天然に生じる変異を包含する。
1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加の例としては、非保存的変異も挙げられるが、ただし、その変異は、アミノ酸配列の異なる位置の1つまた
はそれ以上の第2の変異により、変異体タンパク質の活性または機能が維持されるか、あ
るいはL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する非改変型タンパク質(例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質)に対してタンパク質の三次元構
造が顕著には変更されないように、補償されるものである。
ポリペプチドの同一性のパーセンテージは、blastpアルゴリズムにより算出できる。より具体的には、ポリペプチドの同一性のパーセンテージは、National Center for Biotechnology Information(NCBI)より提供されるblastpアルゴリズムによりデフォルト設定
のScoring Parameters(Matrix:BLOSUM62;Gap Costs:Existence=11, Extension=1;Compositional Adjustments:Conditional compositional score matrix adjustment)を用いて算出できる。ポリヌクレオチドの同一性のパーセンテージは、blastnアルゴリズムにより算出できる。より具体的には、ポリヌクレオチドの同一性のパーセンテージは、NCBIより提供されるblastnアルゴリズムによりデフォルト設定のScoring Parameters(Match/Mismatch Scores=1,-2;Gap Costs=Linear)を用いて算出できる。
「細菌がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された」の用語は、改変された細菌において、非改変株(例えば、野生株または親株)と比較して、対応する遺伝子産物(例えば、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質)の総量および/または総酵素活が増加するように、あるいはL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベル(すなわち発現量)が増加する(すなわち、より高くなる)ように、細菌が改変されていることを意味し得る。上記比較のための対照となり得る非改変株としては、腸内細菌科に属する細菌の野生株(例えば、E. coli W3110株
(ATCC 27325)、E. coli MG1655株(ATCC 47076)、P. ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)等)が挙げられる。
対応する遺伝子産物(例えば、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質)の総量および/または総酵素活性は、例えば、遺伝子の発現レベルを非改変細菌株と比較して増加させる(すなわち増強する)ことにより、または遺伝子にコードされるタンパク質の分子あたりの活性(比活性ともいう)を非改変株(例えば、野生株または親株)と比較して増加させることにより、増加し得る。タンパク質の総量または総活性の増加は、例えば、細胞当たりのタンパク質の量または活性(これは細胞当たりのタンパク質の平均量または平均活性であってよい)の増加として測定され得る。細菌は、細胞あたりのL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質の量および/または活性が、非改変株における量および/または活性の150%以上、200%以上、または300%以上に増加するように改変され得る。
「細菌がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された」の用語は、改変された細菌において、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベル(すなわち発現量)が非改変株(例えば、野生株または親株)と比較して増加するまたは増強されるように、細菌が改変されていることも意味し得る。従って、「L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現する」の用語は、「L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が増強される、または増加する」の用語または「L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが増強
される、または増加する」の用語と代替可能または同等に用いられ得る。また、「細菌がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された」の用語は、改変された細菌において、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが非改変株で観察される発現レベルよりも高くなるように、細菌が改変されていることも意味し得る。遺伝子の発現レベルの増加は、例えば、細胞当たりの遺伝子の発現レベル(これは細胞当たりの遺伝子の平均発現レベルであってよい)の増加として測定され得る。「遺伝子の発現レベル」または「遺伝子の発現量」の用語は、例えば、遺伝子の発現産物の量(例えば、同遺伝子のmRNAの量または同遺伝子にコードされるタンパク質の量)を意味し得る。細菌は、例えば、細胞あたりのL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが、非改変株におけるL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルの150%以上、200%以上、または300%以上に増加するように改変されてよい。
L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子等の遺伝子を過剰発現させるために使用できる方法としては、限定するものではないが、遺伝子のコピー数、例えば、細菌の染色体における遺伝子のコピー数および/または細菌に保持された自律複製するベクター(例えばプラスミド)における遺伝子のコピー数、を増加させる方法が挙げられる。遺伝子のコピー数は、例えば、遺伝子を細菌の染色体に導入すること、および/または、遺伝子を含む自律複製するプラスミドを細菌に導入することにより、増加させることができる。そのような遺伝子のコピー数の増加は、当業者に周知の遺伝子工学的手法により実施できる。
腸内細菌科の細菌で使用できるベクターとしては、限定するものではないが、条件付き複製ベクター(例えば、pAH162ベクター等のR6K(oriRγ)起点で複製するベクター等)
、狭宿主域プラスミド(例えばpMW118/119、pBR322、pUC19等)、広宿主域プラスミド(RSF1010、RP4等)が挙げられる。L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、相同組み換えまたはMuドリブンインテグレーション等によって細菌の染色体DNAに導入することもできる。L-メチオニン/分岐鎖ア
ミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、1コピーのみ導入されてもよく、2コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体DNA中に複数のコピ
ーが存在する塩基配列をターゲットとして相同組み換えを実施することにより、染色体DNAに複数コピーのL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子を導入することができる。染色体DNA中に複数のコピーが存在する塩基配
列としては、限定するものではないが、レペティティブDNAや転移因子の末端に存在する
インバーテッドリピートが挙げられる。さらに、遺伝子をトランスポゾンに組み込んで転移させることにより、染色体DNAに複数コピーの遺伝子を導入することができる。染色体DNAに複数コピーの遺伝子を導入するためには、染色体間増幅法を使用できる。Mu-driven
転移により、3コピーより多い遺伝子を受容株の染色体DNAに1ステップで導入できる(Akhverdyan V.Z. et al., Biotechnol. (Russian), 2007, 3:3-20)。
本明細書に記載の細菌に導入される遺伝子は、プロモーターの下流に接続できる。プロモーターは、宿主細菌において機能するものが選択される限り特に制限されず、宿主細菌由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入される遺伝子由来のプロモーターであってもよく、他の遺伝子由来のプロモーターであってもよい。「宿主細菌において機能するプロモーター」の用語は、宿主細菌においてプロモーター活性を有するプロモーターを意味し得る。腸内細菌科の細菌において機能するプロモーターとして、具体的には、限定するものではないが、下記例示する強力なプロモーターが挙げられる。
L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子等の遺伝子を過剰発現させるために使用できる方法としては、遺伝子の発現制御領域を改変することにより、遺伝子の発現レベルを増加させる方法が挙げられる。遺伝子の発現制御領域の改変は、遺伝子のコピー数の増加と組み合わせて採用できる。遺伝子の発現制御領域は、例えば、遺伝子の生来の発現制御領域を生来(native)の及び/又は改変された外来の発現制御領域で置換することにより、改変することができる。「発現制御領域」の用語は、「発現制御配列」の用語と代替可能または同等に用いられ得る。L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が他の1つまたはそれ以上の遺伝子とオペロン構造に編成されている場合、同遺伝子の発現を増強するために使用できる方法は、オペロンの発現制御領域の改変により同遺伝子を含むオペロンの発現レベルを増加させることも含み、改変は、例えば、オペロンの生来の発現制御領域を生来(native)の及び/又は改変された外来の発現制御領域で置換することにより実施できる。この方法では、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む2つまたはそれ以上の遺伝子の発現を同時に増強することができる。
発現制御領域としては、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、アテニュエーターと終結シグナル、抗終結シグナル、リボソーム結合部位(RBS)、及びその他の発現制
御エレメント(例えば、リプレッサーまたはアクチベーターが結合する領域、及び/又は、例えば転写されたmRNA中の転写及び翻訳の制御タンパク質の結合部位)が挙げられる。このような制御領域は、例えば、公知の文献(Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis
T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Pfleger B.F. et al., Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes, Nat. Biotechnol., 2006, 24:1027-1032; Mutalik V.K. et al., Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements, Nat. Methods, 2013, 10:354-360)に記載されている。遺伝子の発現制御領域の改変は、遺伝子のコピー数の増加と組み合わせることができる(例えば、Akhverdyan V.Z. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871; Tyo K.E.J. et al., Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765を参照)。
L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強するのに適したプロモーターとしては、強力なプロモーターが挙げられる。「強力なプロモーター」の用語は、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の生来のプロモーターより強いプロモーターを意味し得る。腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとしては、限定するものではないが、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、tet
プロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、msrAプロモーター、Pm1プロモ
ーター(Bifidobacterium属由来)、およびラムダ(λ)ファージのPRまたはPLプロモー
ターが挙げられる。強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35および-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの強度を高めることができる(WO0018935 A1)。プロモーターの強度は、RNA合成の開始作用の
頻度により定義され得る。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldstein M.A. et al.の論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995))等に記載されている。細菌(例えば、腸内細菌科の細菌等)において高いレベルの遺伝子発現を与える強力なプロモーターを使用できる。あるいは、プロモーターの効果は、例えば、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に変異を導入してより強いプロモーター機能を得ることにより増強することができ、以て、該プロモーターの下流に位
置するL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の転写レベルを増加させることができる。さらに、シャイン・ダルガルノ(SD)配列、及び/又はSD配列と開始コドンの間のスペーサー、及び/又はリボソーム結合部位中の開始コドンの直ぐ上流または下流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に大きく影響することが知られている。よって、これらの領域は、遺伝子の発現制御領域の一例であり得る。例えば、開始コドンに先行する3つのヌクレオチドの性質に依存
して、20倍の範囲の発現レベルが見出されている(Gold L. et al., Annu. Rev. Microbiol., 1981, 35:365-403; Hui A. et al., EMBO J., 1984, 3:623-629)。
遺伝子を不活化するために使用できる方法としては、改変された遺伝子が、生来のタンパク質をコードする遺伝子と比較して完全に不活性または機能しないタンパク質をコードするように、または改変されたDNA領域が、遺伝子の一部の欠損もしくは遺伝子全体の欠
損、遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸置換をもたらす1塩基以上の置換(ミスセ
ンス変異)、終止コドンの導入(ナンセンス変異)、遺伝子のリーディングフレームシフトをもたらす1塩基または2塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子および/もしくは転写終結シグナルの挿入、または発現制御領域(プロモーター、エンハンサー、オペレーター、アテニュエーターと終結シグナル、抗終結シグナル、リボソーム結合部位(RBS)、およびその他
の発現制御エレメント、等)の改変により、自然には遺伝子を発現できないように、遺伝子を改変することが挙げられる。遺伝子の不活化は、例えば、紫外線照射またはニトロソグアニジン(N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン)を用いた変異処理、部位特異
的変異導入、相同組み換えを用いた遺伝子破壊、および/または「Red/ET-driven integration」または「λRed/ET-mediated integration」に基づく挿入-欠失変異導入(Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(11):5978-5983; Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128)等の常法により実施できる。
遺伝子のコピー数または遺伝子の存在あるいは不在は、例えば、染色体DNAを制限処理
した後、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッテイング、または蛍光in
situハイブリダイゼーション(FISH)等を行うことにより、測定することができる。遺
伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等の様々な周知の方法を使用して遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することにより決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEと、その後の免疫ブロッティング(ウェスタンブロッティング)やタンパク質試料の質量分析等の公知の方法により測定することができる。
プラスミドDNAの調製、DNAの切断、DNAの結合、DNAの形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択、変異の導入等の、DNAの組み換え分子の操作及び分子クローニ
ングのための方法は、当業者に周知の通常の方法であってよい。そのような方法は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory
Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)またはGreen M.R. and Sambrook J.R., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak and Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA”, 4th ed., Washington, DC, ASM Press (2009)に記載されている。
組み換えDNAを用いた操作法としては、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、接合、可動等の従来の方法を含め、任意の方法を用いることができる。タンパク質をコードするDNAを用いた細菌の形質転換、トランスフェクション、感染、接合、または可動により、当該細菌に当該DNAによりコードされるタンパク質を合成する能力を付与することができる。形質転換、トランスフェクション、感染、接合、および可動の方法
としては、任意の方法が挙げられる。例えば、効率的なDNAの形質転換およびトランスフェクションのために、E. coliK-12の細胞のDNAに対する透過性が高まるように受容
細胞を塩化カルシウムで処理する方法が報告されている(Mandel M. and Higa A., Calcium-dependent bacteriophage DNA infection, J. Mol. Biol., 1970, 53:159-162)。特
殊化および/または一般化された形質転換の方法が記載されている(Morse M.L. et al.,
Transduction in Escherichia coli K-12, Genetics, 1956, 41(1):142-156; Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor La. Press, 1972)。宿主微生物へのDNAのランダムおよび/または標的化された
組み込みのための他の方法、例えば、「Mu-driven integration/amplification」(Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871)、「Red/ET-driven integration」または「λRed/ET-mediated integration」(Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(12):6640-45; Zhang Y., et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128)、を適用できる。さらに、所望の遺伝子の多重挿入のために
は、Mu駆動の複製的転移(Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871)や所望の遺伝子の増幅をもたらすrecA依存性相同組み換えに基づく化学的に
誘導可能な染色体進化(Tyo K.E.J. et al., Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765)
に加えて、転移、部位特異的および/または相同的なRed/ETを介した組み換え、および/またはP1を介した一般化形質導入の種々の組み合わせを利用する他の方法(例えば、Minaeva N.I. et al., BMC Biotechnology, 2008, 8:63; Koma D. et al., Appl. Microbiol.
Biotechnol., 2012, 93(2):815-829を参照のこと)を利用できる。
E. coliやその他の細菌種に固有のL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子(その例は表1に列挙されている)の塩基配列および同遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列は既に解明されている(上記参照)ので、そのような細菌種に固有の同遺伝子またはその変異体塩基配列は、同細菌種のDNAと
、同細菌種に固有のyjeH遺伝子の塩基配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRによる同細菌種からのクローニングにより、またはyjeH遺伝子を含むDNAを例えばヒドロキシルアミンでin vitro処理する突然変異法またはyjeH遺伝子を有する細菌種を紫外線(UV)照射もしくはそのような処理に通常用いられるN-メチル-N'-ニトロ-
ニトロソグアニジン(NTG)や亜硝酸等の変異剤で処理する突然変異法により、または全
長遺伝子構造物として化学合成することにより、取得できる。他の細菌種を含む他の任意の生物に固有のL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびその変異体塩基配列も同様に取得できる。
タンパク質または核酸に言及する際の「固有の(native to)」の用語は、タンパク質
または核酸が特定の生物(例えば、哺乳類、植物、昆虫、細菌、またはウイルス等)に固有であることを意味し得る。すなわち、特定の生物に固有のタンパク質または核酸は、それぞれ、当該生物に天然に存在するタンパク質または核酸を意味し得る。特定の生物に固有のタンパク質または核酸は、当該生物から単離でき、当業者に知られた方法により配列解析できる。さらに、タンパク質または核酸が存在する生物からそれぞれ単離されたタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列は容易に決定することができるので、タンパク質または核酸に言及する際の「固有の」の用語は、得られるタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列が当該生物に天然に存在する、天然に発現する、且つ/又は天然に製造されるタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列と同一である限り、任意の手段、例えば、組み換えDNA技術を含む遺伝子工学的手法または化学合成法等、により得られるタンパク質または核酸も意味し得る。「タンパク質」の用語は、限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素等のいずれも意味し得る。「核酸」の用語は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)を意味し得、限定されるものではないが、特に、プロモーター、アテニュエーター、ターミネーター等を含む発現調節配列、遺伝子、遺伝子間配列、シグナルペプチド
、タンパク質のプロ部位、人工アミノ酸配列等をコードする塩基配列のいずれも意味し得る。例えば、遺伝子は、特に、DNAであり得る。アミノ酸配列および塩基配列ならびに各
種生物に固有のそれらのホモログは本明細書に記載されており、これらの例としては、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質(これは、E. coli種の細菌に固有であり得、配列番号1に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされ得る)。
遺伝子(例えば、「非改変遺伝子」)およびタンパク質(例えば、「非改変タンパク質」)について言及する際の「非改変(non-modified)」の用語(これは、「生来(native)」、「天然(natural)」、および「野生型(wild-type)」の用語と代替可能または同等に用いられ得る)は、それぞれ、生物に、具体的には、細菌の非改変株に、天然に存在する、天然に発現する、且つ/又は天然に製造される生来の遺伝子およびタンパク質を意味し得る。そのような生物としては、対応する遺伝子またはタンパク質を有する任意の生物が挙げられ、具体的には、例えば、E. coli W3110株、E. coli MG1655株、P. ananatis
13355株が挙げられる。非改変遺伝子は、非改変タンパク質をコードし得る。
細菌は、本発明の範囲から逸脱することなく、上記のような性質に加えて、様々な栄養要求性、薬物耐性、薬物感受性、薬物依存性等の特定の性質を有することができる。
2.方法
細菌を用いて塩基性L-アミノ酸を製造する本明細書に記載の方法は、前記細菌を培地で培養(cultivating(culturingともいう))して塩基性L-アミノ酸を培地もしくは該細菌の菌体、またはその両者中に生成させ、排出もしくは分泌させ、且つ/又は蓄積させる工程と、培地及び/又は菌体から塩基性L-アミノ酸を回収する工程を含む。同方法は、さらに、任意で(optionally)、培地及び/又は菌体から塩基性L-アミノ酸を精製する工程を含み得る。塩基性L-アミノ酸は、上記のような形態で製造され得る。塩基性L-アミノ酸は、特に、遊離形態、もしくはその塩、またはそれらの混合物として製造され得る。例えば、塩基性L-アミノ酸のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩または両性イオン等の分子内塩が、前記方法により製造され得る。これは、アミノ酸が発酵条件下で、互いに、あるいは無機または有機の酸またはアルカリ性物質等の中和剤と、典型的な酸塩基中和反応により反応して塩を生成し得ることから可能であり、これは当業者に明らかなアミノ酸の化学的特徴である。具体的には、L-アルギニンの一塩酸塩(L-アルギニン×HCl)またはL-リジンの一塩酸塩(L-リジン×HCl)が、前記方法により製造され得る。
細菌の培養、ならびに培地等からの塩基性L-アミノ酸の回収および任意で精製は、微生物を使用してL-アミノ酸を製造する従来の発酵法と同様に実施することができる。すなわち、細菌の培養、ならびに培地等からの塩基性L-アミノ酸の回収および精製は、当業者に周知の、細菌の培養に適した条件ならびにL-アミノ酸の回収および精製に適した条件を適用することにより実施してよい。
培地は、炭素源、窒素源、硫黄源、リン源、無機イオン、並びにその他の有機及び無機成分を必要に応じて含む典型的な培地等の、合成培地あるいは天然培地でよい。炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、澱粉加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロール、マンニトール、ソルビトール等のアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸、および脂肪酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、およびアンモニア水等を使用することができる。さらに、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、およびコーンスティープリカー等も使用することができる。培地は、これらの窒素源の
1種またはそれ以上を含むことができる。硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、チオ硫酸、硫化物等が挙げられる。培地は、炭素源、窒素源、及び硫黄源に加えて、リン源を含んでもよい。リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、ピロ燐酸等のリン酸ポリマー等を使用することができる。ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチンアミド、ビタミンB12等
のビタミンや、その他の必要物質、例えばアデニン、RNA等の核酸、アミノ酸、ペプトン
、カザミノ酸、酵母エキス等の有機栄養素等を、適当量(痕跡量であってもよい)存在させることができる。これら以外に、必要であれば、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を加えてもよい。
培養は、本明細書に記載の方法で使用される細菌の培養に適した条件で実施することができる。例えば、培養は、好気的条件下で16~72時間、または16~24時間実施することができる。培養中の培養温度は、30~45℃、または30~37℃の範囲内に制御することができる。pHは、5~8の間、または6~7.5の間に調節することができる。pHは、無機もしくは有機の酸性またはアルカリ性物質、例えば、尿素、炭酸カルシウム、またはアンモニアガス、を使用することにより調節することができる。
培養後、培地から塩基性L-アミノ酸を回収することができる。具体的には、菌体外に存在する塩基性L-アミノ酸を培地から回収することができる。また、培養後、細菌の菌体から塩基性L-アミノ酸を回収することができる。具体的には、菌体を破砕し、菌体や菌体破砕懸濁物(細胞デブリともいう)等の固形分を除去して上清を取得し、上清から塩基性L-アミノ酸を回収することができる。菌体の破砕は、例えば、高周波音波を用いた超音波破砕等の周知の方法により実施することができる。固形分の除去は、例えば、遠心分離または膜ろ過により実施することができる。培地や上清等からの塩基性L-アミノ酸の回収は、例えば、濃縮、晶析、イオン交換クロマトグラフィー、中圧または高圧の液体クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせ等の慣用の技術により実施することができる。
下記の非限定的な実施例を参照して本発明をより正確に説明する。
実施例1 E. coli MG1655-Pnlp8-yjeH (CmR)株の構築
1.1 E. coli MG1655-Pnlp8-yjeH (CmR)株の構築
温度感受性複製起点を有するpKD46プラスミドを含むE. coli MG1655株(ATCC 47076)
を用いた。pKD46プラスミド(Datsenko K.A. and Wanner B.L., One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)は、ファージλの2,154ヌクレオチドのDNA断片(ヌクレオチド位置31088~33241, GenBank accession No.: J02459)を含み、アラビノ
ース誘導性のParaBプロモーターの制御下にあるλRed相同組み換え系の遺伝子(γ遺伝子、β遺伝子、およびexo遺伝子)を含む。pKD46プラスミドは、PCR産物をE. coli MG1655
株の染色体に組み込むために必要である。組み換えプラスミドpKD46を含むE. coli MG1655株は、E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USAから入手できる(Accession No. CGSC7669)。
エレクトロコンピテントセルは、以下のようにして調製した。E. coli MG1655/pKD46株をLB液体培地(Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)で一晩培養した。その後
、培養液1 mLを、終濃度50 mMのイソプロピルアラビノースと50 mg/Lのアンピシリンを含むLB液体培地100 mLに接種し、菌体を37℃で2時間、振盪(250 rpm)培養した。菌体を回収し、氷冷した10%グリセロールで3回洗浄してコンピテントセルを得た。増幅したλatt
L-CmR-λattR-Pnlp8断片(後述する実施例1.2)を、Wizard PCR Prep DNA Purification System(Promega)を用いて精製し、エレクトロポレーション法でコンピテントセルに導入した。菌体をSOC培地(Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)で2時間培養
した後、25 mg/Lのクロラムフェニコール(Cm)を含むL-寒天プレート上で37℃で18~24
時間培養した。出現したコロニーを同じ培地で純化した。次に、染色体上のyjeH遺伝子のプロモーター領域がλattL-CmR-λattR-Pnlp8断片で置換されていることを確認するため
に、プライマーP1(配列番号3)およびP2(配列番号4)を用いてPCR反応を実施した。そ
うして、E. coli MG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)株を得た。
1.2 λattL-CmR-λattR-Pnlp8断片の構築
λattL-CmR-λattR-Pnlp8断片は、以下のようにして構築した。pMW-attL-CmR-attR-Pnlp8 plasmid(配列番号5)を鋳型として、プライマーP3(配列番号6)およびP4(配列番号7)とPrime Star polymerase(Takara Bio Inc.)を用いてPCRを実施した。反応液はキットに添付されている組成にしたがって調製し、1 kbpあたり98℃10秒、55℃5秒、および72℃1分の30サイクルでDNAを増幅した。その結果、yjeH遺伝子のプロモーター領域の組み換え配列と両末端にyjeH遺伝子の隣接領域に相補的な領域を有するλattL-CmR-λattR-Pnlp8断片を得た。
実施例2 E. coliのL-オルニチン生産株の構築
E. coliのL-オルニチン生産株は、E. coliのL-アルギニン生産株382ilvA+から、argFおよびargI遺伝子にコードされるornithine carbamoyltransferaseの不活化により得た。382ilvA+株は、L-アルギニン生産株382(VKPM B-7926, EP1170358 A1)から、E. coli K-12株由来の野生型ilvA遺伝子のP1形質導入により得た。
2.1 argF遺伝子の不活化
argF遺伝子を欠損した株は、Datsenko K.A.とWanner B.L.により最初に開発された「λRed/ET-mediated integration」と呼ばれる方法(Datsenko K.A. and Wanner B.L., One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)により構築した。プライマーP5(配列番号8)およびP6(配列番号9)を用い、pMW118-attL-Km-attRプラスミドを鋳
型としたPCRにより、カナマイシン耐性マーカー(KmR)を含むDNA断片を得た(WO2011043485 A1)。プライマーP5は、argF遺伝子の5’末端に位置する領域に相補的な領域とattR
領域に相補的な領域の両方を含む。プライマーP6は、argF遺伝子の3’末端に位置する領
域に相補的な領域とattL領域に相補的な領域の両方を含む。PCR条件は以下の通りである
:95℃で3分間の変性ステップ;95℃で1分、50℃で30秒、72℃で40秒の2回の第1サイク
ルのプロファイル;95℃で30秒、54℃で30秒、72℃で40秒の最後の25サイクルのプロファイル;72℃で5分の最終ステップ。
得られたPCR産物(約1.6 kbp)を、Wizard PCR Prep DNA Purification System(Promega)を用いて精製し、クロラムフェニコールに代えてカナマイシン(Km)を選択マーカーとして実施例1に記載したようにしてλRed-mediated integrationによりE. coli MG1655(ATCC 47076)株の染色体に組み込み、生来のargF遺伝子を置換した。そうして、E. coli MG1655ΔargF::KmR株を得た。
2.2 argI遺伝子の不活化
argI遺伝子を欠損した株は、Datsenko K.A.とWanner B.L.により最初に開発された「λRed/ET-mediated integration」と呼ばれる方法(Datsenko K.A. and Wanner B.L., One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)により構築した。プライマ
ーP7(配列番号10)およびP8(配列番号11)を用い、pMW118-attL-Cm-attRプラスミドを
鋳型としたPCRにより、λattL-CmR-λattRカセットを含むDNA断片を得た(WO2005010175 A1)。プライマーP7は、argI遺伝子の5’末端に位置する領域に相補的な領域とattR領域
に相補的な領域の両方を含む。プライマーP8は、argI遺伝子の3’末端に位置する領域に
相補的な領域とattL領域に相補的な領域の両方を含む。PCR条件は以下の通りである:95
℃で3分間の変性ステップ;95℃で1分、50℃で30秒、72℃で40秒の2回の第1サイクルの
プロファイル;95℃で30秒、54℃で30秒、72℃で40秒の最後の25サイクルのプロファイル;72℃で5分の最終ステップ。
得られたPCR産物(約1.6 kbp)を、Wizard PCR Prep DNA Purification System(Promega)を用いて精製し、実施例1に記載したようにしてλRed-mediated integrationによりE. coli MG1655(ATCC 47076)株の染色体に組み込み、生来のargI遺伝子を置換した。そうして、E. coli MG1655ΔargI::CmR株を得た。
2.3 argFおよびargI遺伝子を不活化したE. coli株の構築
E. coliのL-オルニチン生産株を得るために、得られたE. coli MG1655ΔargF::KmR株(実施例2.1)およびE. coli MG1655ΔargI::CmR株(実施例2.2)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-アルギニン生産株382ilvA+に順に移植し、E. coli 382ilvA+ΔargI::CmR ΔargF::KmR株を得た。
CmRおよびKmRマーカーは、選択したプラスミドなしの組み込み株にPCR生成したDNA断片のエレクトロポレーションについて実施例1に記載したようにしてエレクトロポレーションにより導入したpMW-Int/Xisヘルパープラスミド(WO2005010175 A1)を用いて同時に除去した。エレクトロポレーション後、0.5%グルコースとアンピシリン(150 mg/L)を含有するL-寒天上に菌体をプレーティングし、30°Cで一晩インキュベートして、Int/Xisタンパク質の合成を誘導した。生育したクローンを、クロラムフェニコールとカナマイシンありとなしのL-寒天にレプリカプレーティングし、CmS且つKmS(クロラムフェニコールとカナマイシンに感受性)の変異体を選択した。そうして、E. coli 382ilvA+ΔargI ΔargF
株を得た。
実施例3 E. coli 382ilvA+ΔargI ΔargF Pnlp8-yjeH (CmR)株を用いたL-オルニチンの生産
yjeH遺伝子の発現増強の結果としてのL-オルニチン生産への影響を調べるために、得られたMG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)(実施例1)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-オルニチン生産株382ilvA+ΔargI ΔargF(実施例2.3)に導入し、E.
coli 382ilvA+ΔargI ΔargF Pnlp8-yjeH (CmR)株を得た。
L-オルニチンの生産量は、以下のようにして評価した。E. coli株382ilvA+ΔargIΔargFおよび382ilvA+ΔargI ΔargF Pnlp8-yjeH (CmR)を、それぞれ、3 mLの栄養ブロス(LB培地)中で37℃で18時間振盪(220 rpm)しながら培養した。次いで、0.3 mLの得られた培養物を、20×200-mm試験管を用いて表2に示す2 mLの発酵培地に接種し、32℃で48時間、ロータリーシェーカー上でOD540が約38になりグルコースが完全に消費されるまで培養
した。
培養後、培地に蓄積したL-オルニチンの量を、butan-1-ol: acetic acid : water = 4 : 1 : 1 (v/v)の移動相を用いたペーパークロマトグラフィーで測定した。ニンヒドリ
ン(2%)のアセトン溶液を可視化試薬として用いた。L-オルニチンを含むスポットを
切り出し、CdCl2の0.5%水溶液でL-オルニチンを溶出させ、L-オルニチンの量を540 nmにおける分光光度法で推定した。
Figure 0007491312000002
独立した8回の試験管発酵の結果(平均値として)を表3に示す。表3に示すように、
改変株E. coli 382ilvA+ΔargI ΔargFPnlp8-yjeH (CmR)は、親株E. coli 382ilvA+ΔargI ΔargFと比較して、より多量のL-オルニチンを生産し蓄積できた。
Figure 0007491312000003
実施例4 E. coli 382ilvA+ΔargG Pnlp8-yjeH (CmR)株を用いたL-シトルリンの生産
4.1 E. coliのL-シトルリン生産株の構築
E. coliのL-シトルリン生産株は、E. coliのL-アルギニン生産株382ilvA+(実施例2)から、Datsenko K.A.とWanner B.L.により最初に開発された「λRed/ET-mediated integration」と呼ばれる方法(Datsenko K.A. and Wanner B.L., One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)でargG遺伝子にコードされるargininosuccinate synthetaseを不活化することにより構築した。この手順に従って、argG遺伝子の隣接領域と鋳型プラスミド内の抗生物質耐性を付与する遺伝子の両方に相同なPCRプライマーP9
(配列番号12)およびP10(配列番号13)を構築した。プラスミドpMW118-λattL-Cm-λattR(WO2005010175 A1)をPCR反応の鋳型として用いた。CmRマーカーは、実施例2.3に
記載したようにしてpMW-Int/Xisヘルパープラスミド(WO2005010175 A1)を用いて除去した。そうして、E. coli 382ilvA+ΔargG株を得た。382ilvA+株は、実施例2に記載したようにして得た。
4.2 L-シトルリンの生産
yjeH遺伝子の発現増強によるL-シトルリン生産への影響を調べるために、得られたMG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)(実施例1)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-シトルリン生産株382ilvA+ΔargGに導入し、E. coli 382ilvA+ΔargGPnlp8-yjeH (CmR)株を得た。
E. coli株382ilvA+ΔargGおよび382ilvA+ΔargGPnlp8-yjeH (CmR)を、それぞれ、3 mL
の栄養ブロス中で37℃で18時間振盪しながら培養し、0.3 mLの得られた培養物を、20×200-mm試験管内の表2に示す2 mLの発酵培地に接種し、32℃で48時間、ロータリーシェーカー上で培養した。培養後、培地に蓄積したL-シトルリンの量を、実施例3に記載したようにして推定した。
独立した8回の試験管発酵の結果(平均値として)を表4に示す。表4に示すように、
改変株E. coli 382ilvA+ΔargG Pnlp8-yjeH (CmR)は、親株E. coli 382ilvA+ΔargGと比
較して、より多量のL-シトルリンを生産し蓄積できた。
Figure 0007491312000004
実施例5 E. coli 382ilvA+Pnlp8-yjeH (CmR)株を用いたL-アルギニンの生産
yjeH遺伝子の発現増強によるL-アルギニン生産への影響を調べるために、得られたMG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)(実施例1)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-アルギニン生産株382ilvA+(実施例2)に導入し、E. coli 382ilvA+Pnlp8-yjeH (CmR)株を得る。
E. coli株382ilvA+および382ilvA+Pnlp8-yjeH (CmR)を、それぞれ、3 mLの栄養ブロス
中で37℃で18時間振盪しながら培養し、0.3 mLの得られた培養物を、20×200-mm試験管内の2 mLの発酵培地に接種し、32℃で48時間、ロータリーシェーカー上で培養する。発酵培地の組成は、実施例3に記載したのと同一である。培養後、培地に蓄積したL-アルギニンの量を、実施例3に記載したようにして推定する。
実施例6 E. coli EA92 Pnlp8-yjeH (CmR)株を用いたL-ヒスチジンの生産
yjeH遺伝子の発現増強によるL-ヒスチジン生産への影響を調べるために、得られたMG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)(実施例1)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE. coliのL-ヒスチジン生産株EA92に導入し、E. coli EA92 Pnlp8-yjeH (CmR)株を得た。EA92株は、予備実施例に記載したようにして得た。
ストックチューブのE. coli株EA92およびEA92 Pnlp8-yjeH (CmR)(25%グリセロールと0.9%NaClの混合液中で-70℃で保存)を、必要に応じて抗生物質を添加したL-寒天プレ
ートにそれぞれプレーティングし、37℃で一晩培養した。プレート表面約0.1 cm2の菌体
をLB液体培地(5 mL)に接種し、30℃240 rpmで20時間培養した。次いで、0.1 mLの得ら
れた培養液をそれぞれ2 mLのLB液体培地に接種し、30℃240 rpmでOD(600 nm)が0.6になるまで培養して、シード培養液を得た。次いで、0.1 mLのシード培養液を、内径23 mmの
試験管(長さは全て200 mm)を用いて表5に示す2 mLの発酵培地に接種し、培養を開始した。培養は、240 rpmで撹拌しながら32℃で65時間実施した。
Figure 0007491312000005
培養後、蓄積したL-ヒスチジンを薄層クロマトグラフィー(TLC)で測定した。TLCプレート(10×20 cm)は、無蛍光指示薬を含むSorbfilシリカゲル(Sorbpolymer, Krasnodar, Russian Federation)の0.11 mmの層でコーティングした。サンプルは、Camag Linomat 5サンプルアプリケーターを用いてプレートに塗布した。Sorbfilプレートは、iso-propanol : acetone : 25% aqueous ammonia : water = 6 : 6 : 1.5 : 1 (v/v)からなる移
動相で展開した。ニンヒドリン(1%, w/v)のアセトン溶液を可視化試薬として用いた。
展開後、プレートを乾燥させ、Camag TLC Scanner 3を用いて、winCATSソフトウェア(バージョン1.4.2)により520 nmで検出する吸光度モードでスキャンした。
独立した3回の試験管発酵の結果(平均値として)を表6に示す。表6に示すように、改変株E. coli EA92 Pnlp8-yjeH (CmR)は、親株E. coli EA92と比較して、より多量のL
-ヒスチジンを蓄積できた。
Figure 0007491312000006
実施例7 E. coli WC196LC Pnlp8-yjeH (CmR)/pCABD2株を用いたL-リジンの生産
E. coliのL-リジン生産株WC196LC(FERM BP-11027)を、dapA、dapB、lysC、およびddh遺伝子を搭載するリジン生産用プラスミドpCABD2(国際公開WO95/16042およびWO01/53459)で常法により形質転換し、WC196LC/pCABD2株を得た。プラスミドpCABD2は、L-リジンによるフィードバック阻害を解除するための変異を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするE. coli由来の変異型dapA遺伝子と、L-リジンによるフィードバック阻
害を解除するための変異を有するアスパルトキナーゼIIIをコードするE. coli由来の変異型lysC遺伝子と、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするE. coli由来のdapB遺
伝子と、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするBrevibacterium lactofermentum由来のddh遺伝子を含む(国際公開WO95/16042およびWO01/53459)。
yjeH遺伝子の発現増強によるL-リジン生産への影響を調べるために、得られたE. coli MG1655 Pnlp8-yjeH (CmR)(実施例1)の染色体由来のDNA断片を、P1形質導入によりE.
coliのL-リジン生産株WC196LC/pCABD2に導入し、E. coli WC196LCPnlp8-yjeH (CmR)/pCABD2株を得た。
E. coli株WC196LC/pCABD2およびWC196LC Pnlp8-yjeH (CmR)/pCABD2を、それぞれ、3 mLの栄養ブロス中で37℃で18時間振盪しながら培養した。次いで、0.3 mLの得られた培養物を、20×200-mm試験管内の30 mg/Lのストレプトマイシンを添加した表2に示す2 mLの発
酵培地に接種し、34℃で48時間、ロータリーシェーカー(240 rpm)上で培養した。
培養後、培地に蓄積したL-リジンの量を、実施例3に記載したようにして推定した。
独立した8回の試験管発酵の結果(平均値として)を表7に示す。表7に示すように、
改変株E. coli WC196LC Pnlp8-yjeH (CmR)/pCABD2は、親株E. coli WC196LC/pCABD2と比
較して、より多量のL-リジンを蓄積できた。
Figure 0007491312000007
予備実施例 E. coli EA92株の構築
E. coli EA92株は、E. coliのL-ヒスチジン生産株EA83(MG1655rph+ilvG15-[ΔpurR Phis-ΔhisL' hisGE271KDCBHAFI]-[(IS5.11)::(λ-attB) Ptac21-purApitA-]-[(λ-attB)
PL-purH])(Malykh E.A. et al., Specific features of L-histidine production by Escherichia coli concerned with feedback control of AICAR formation and inorganic phosphate/metal transport, Microb. Cell Fact., 2018, 17(1):42)を元に構築した
。aspC遺伝子を過剰発現するようにEA83株を改変し、以てEA92株を構築した。
詳細には、λRed組み換えシステム(Datsenko and Wanner, 2000)を用いて生来の調節領域をλファージのPLプロモーターに置換することにより、aspC遺伝子の上流領域を改変した。プライマーP11(配列番号14)およびP12(配列番号15)を用いて、切り出し可能なcatマーカーおよびaspC遺伝子の制御領域に相同な塩基配列を有するλRed組み換え用のPCR断片を構築した。染色体に導入されたPLプロモーターの存在は、プライマーP13(配列番号16)およびP14(配列番号17)を用いたPCRにより確認した。そうして、E. coli MG1655
cat-PL-aspC株を得た。この株をドナーとして用い、標準的なP1形質導入(Moore S.D., Assembling new Escherichia coli strains by P1-duction, Methods Mol. Biol., 2011,
765:155-169)により、EA83の染色体にcat-PL-aspC発現カセットを導入した。切り出し
可能なクロラムフェニコール耐性マーカー(CmRex)は、pMWts-λInt/Xisヘルパープラスミド(Minaeva N.I. et al., 2008)を用いたXis/Int部位特異的組み換えシステムによりE. coli染色体から除去した。そうして、E. coli EA92株を得た。
本発明を例示的な態様を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更や等価物の採用が可能であることは当業者に明らかであろう。
本発明の方法は、細菌の発酵により塩基性L-アミノ酸(例えば、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-リジン、等)を製造するのに有用である。

Claims (5)

  1. 塩基性L-アミノ酸を製造する方法であって、
    (i)エシェリヒア(Escherichia)属に属する塩基性L-アミノ酸生産細菌を培地で培養して培地もしくは該細菌の菌体、またはその両者中に塩基性L-アミノ酸を生産および蓄積させること、および
    (ii)培地もしくは菌体、またはその両者から塩基性L-アミノ酸を回収すること
    を含み、
    前記細菌が、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、方法であって、
    前記L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質が、下記からなる群より選択されるYjeHタンパク質である、方法:
    (B)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
    (C)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~40個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質;および
    (D)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するタンパク質。
  2. 前記塩基性L-アミノ酸が、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-リジン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
  3. 前記L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するYjeHタンパク質が、下記からなる群より選択されるDNAにコードされる、請求項1または2に記載の方法
    b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNA;
    (c)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~40個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって
    、該タンパク質がL-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有する、DNA;
    (d)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質がL-メチオニン/分岐鎖ア
    ミノ酸排出担体活性を有する、DNA:および
    (e)遺伝暗号の縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA。
  4. 前記L-メチオニン/分岐鎖アミノ酸排出担体活性を有するYjeHタンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子を前記細菌に導入すること、前記細菌における該遺伝子のコピー数を増加させること、および/または該遺伝子の発現制御領域を改変することにより過剰発現し、以て該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強されている、請求項1~のいずれか1項に記載の方法。
  5. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
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