RU2215783C2 - МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА - Google Patents
МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2215783C2 RU2215783C2 RU2001112869/13A RU2001112869A RU2215783C2 RU 2215783 C2 RU2215783 C2 RU 2215783C2 RU 2001112869/13 A RU2001112869/13 A RU 2001112869/13A RU 2001112869 A RU2001112869 A RU 2001112869A RU 2215783 C2 RU2215783 C2 RU 2215783C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mutant
- arginine
- acetylglutamate synthase
- amino acid
- synthase
- Prior art date
Links
- 108010032178 Amino-acid N-acetyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 102000007610 Amino-acid N-acetyltransferase Human genes 0.000 title claims abstract description 83
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 title abstract description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 18
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims abstract description 37
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 33
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 101150072344 argA gene Proteins 0.000 description 58
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 101100217185 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aruC gene Proteins 0.000 description 4
- 108091022908 Serine O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101100022072 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) lysJ gene Proteins 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 101150050866 argD gene Proteins 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- -1 glucose and sucrose Chemical class 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 3
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- RFMMMVDNIPUKGG-YFKPBYRVSA-N N-acetyl-L-glutamic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O RFMMMVDNIPUKGG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108030006759 Acetylornithine deacetylases Proteins 0.000 description 1
- 101100290837 Bacillus subtilis (strain 168) metAA gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- KABXUUFDPUOJMW-BYPYZUCNSA-N L-glutamic 5-semialdehyde Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC=O KABXUUFDPUOJMW-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 101150105638 argE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 101150111114 cysE gene Proteins 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001640 fractional crystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 101150003180 metB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102220093670 rs371299772 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. L-аргинин получают культивированием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной фрагментом ДНК, кодирующим мутантную N-ацетилглутамат синтазу. Мутантная N-ацетилглутамат синтаза представляет собой синтазу, в которой последовательность аминокислот, соответствующая положениям с 15 по 19 в природной N-ацетилглутамат синтазе, заменена любой из последовательностей аминокислот под номерами 1-4 (SEQ ID NOS: 1-4) или синтазу, обладающую указанными свойствами и дополнительно содержащую делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в одной или множестве положений, кроме положений с 15 по 19. В качестве штаммов-продуцентов L-аргинина могут быть использованы штаммы Escherichia coli 237/pMADS11, E.coli 237/pMADS12 или E.coli 237/pMADS13. Данное изобретение позволяет увеличить выход аргинина. 7 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности, к способу продуцирования L-аргинина и касается использования нового мутантного, устойчивого к ингибированию по типу обратной связи фермента в пути биосинтеза аргинина в штаммах Е.coli - продуцентах L-аргинина.
Описание существующих методов
Биосинтез аргинина из глутамата в клетках Е.coli происходит посредством серии реакций, начинающейся ацетилированием глутамата N-ацетилглутамат синтазой (NAGS), кодируемой геном argA. Этот процесс регулируется путем репрессии транскрипции arg-регулона и ингибированием NAGS аргинином по типу обратной связи (Cunin R. et al, Microbiol. Rev., v. 50, p.314-352, 1986). L-Аргинин подавляет экспрессию гена argA в соотношении более чем 250 раз и ингибирует активность NAGS (Кi=0,02 mM) (Leisinger Т., Haas D., J.Biol.Chem. , v. 250, р. 1690-1693, 1975). Для усиленного биосинтеза аргинина в клетках Е. coli требуются ферменты NAGS, устойчивые к ингибированию по типу обратной связи (также обозначаемые как "fbr").
Биосинтез аргинина из глутамата в клетках Е.coli происходит посредством серии реакций, начинающейся ацетилированием глутамата N-ацетилглутамат синтазой (NAGS), кодируемой геном argA. Этот процесс регулируется путем репрессии транскрипции arg-регулона и ингибированием NAGS аргинином по типу обратной связи (Cunin R. et al, Microbiol. Rev., v. 50, p.314-352, 1986). L-Аргинин подавляет экспрессию гена argA в соотношении более чем 250 раз и ингибирует активность NAGS (Кi=0,02 mM) (Leisinger Т., Haas D., J.Biol.Chem. , v. 250, р. 1690-1693, 1975). Для усиленного биосинтеза аргинина в клетках Е. coli требуются ферменты NAGS, устойчивые к ингибированию по типу обратной связи (также обозначаемые как "fbr").
Мутанты ферментов, устойчивых к ингибированию по типу обратной связи, могут быть получены при спонтанном, химическом или сайт-направленном мутагенезе.
Некоторые из мутантов fbr argA были выделены и изучены. Клетки Serratia marcescens, содержащие fbr argA мутации в хромосоме, были нестабильными и дали начало argA мутантам с пониженной активностью или измененной аффинностью к глутамату (Takagi Т. et al, J. Biochem., v.99, p.357-364, 1986).
Гены fbr argA из пяти штаммов Е.coli, содержащих fbr NAGS, были клонированы, и в каждом из этих штаммов были найдены различные единичные замены оснований в генах argA. Было выявлено, что данные замены вызывают замещение His-15 на Туr, Туr-19 на Cys, Ser-54 на Asn, Arg-58 на His, Gly-287 на Ser, Gln-432 на Arg (Rajagopal B.S. et al, Appl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, No. 5, p.1805-1811).
Как правило, fbr фенотип фермента возникает в результате замены одного аминокислотного остатка другим в одном или нескольких местах последовательности белка, и эти замены приводят к уменьшению активности фермента. Например, замена природного Met-256 остальными 19-тью аминокислотными остатками в сериновой ацетилтрансферазе (SAT) (ген cysE) из E.coli в большинстве случаев приводит к появлению fbr фенотипа, но уровень активности мутантных белков SAT не достигает уровня активности природного SAT (Nakamori S. et al, AEM, 64(5): 1607-11, 1998).
Таким образом, недостатком мутантных ферментов, полученных этими методами, является снижение активности мутантных ферментов в сравнении с природными ферментами.
Краткое изложение сути изобретения
Целью настоящего изобретения является получение мутантного, устойчивого к ингибированию по типу обратной связи и высокоактивного фермента, играющего ключевую роль в биосинтезе аргинина бактериями Е.coli.
Целью настоящего изобретения является получение мутантного, устойчивого к ингибированию по типу обратной связи и высокоактивного фермента, играющего ключевую роль в биосинтезе аргинина бактериями Е.coli.
В настоящем изобретении предложен новый метод синтеза большого набора мутантных генов argA с использованием полной рандомизации фрагмента гена argA. Одновременная замена нескольких аминокислотных остатков в фрагменте последовательности белка, в котором могут быть локализованы мутации fbr, способна привести к образованию мутантных белков с восстановленной активностью, уровень которой близок к природному в виду того, что трехмерная структура фермента становится более правильной. Таким образом описанное ниже настоящее изобретение было осуществлено.
Вот то, что предоставляет настоящее изобретение:
(1) Мутантная N-ацетилглутамат синтаза, в которой последовательность аминокислот, соответствующая положениям с 15 по 19 в природной N-ацетилглутамат синтазе, заменена любой из последовательностей аминокислот под номерами 1-4 (SEQ ID NOS: 1-4) и ингибирование L-аргинином по типу обратной связи утрачено;
(2) Мутантная N-ацетилглутамат синтаза по пункту 1, которая является природной мутантной N-ацетилглутамат синтазой из Escherichia coli;
(3) Мутантная N-ацетилглутамат синтаза по пункту 1, которая содержит делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в одном или множестве положений, кроме положений с 15 по 19, и в которой ингибирование L-аргинином по типу обратной связи утрачено;
(4) ДНК, кодирующая мутантную N-ацетилглутамат синтазу по любому из пунктов 1-3;
(5) Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, трансформированная ДНК по пункту 4 и обладающая активностью по продукции L-аргинина; и
(6) Способ продуцирования L-аргинина, включающий стадии выращивания бактерии по пункту 5 в питательной среде для продукции и накопления L-аргинина в питательной среде и сбора L-аргинина из культуральной жидкости.
(1) Мутантная N-ацетилглутамат синтаза, в которой последовательность аминокислот, соответствующая положениям с 15 по 19 в природной N-ацетилглутамат синтазе, заменена любой из последовательностей аминокислот под номерами 1-4 (SEQ ID NOS: 1-4) и ингибирование L-аргинином по типу обратной связи утрачено;
(2) Мутантная N-ацетилглутамат синтаза по пункту 1, которая является природной мутантной N-ацетилглутамат синтазой из Escherichia coli;
(3) Мутантная N-ацетилглутамат синтаза по пункту 1, которая содержит делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в одном или множестве положений, кроме положений с 15 по 19, и в которой ингибирование L-аргинином по типу обратной связи утрачено;
(4) ДНК, кодирующая мутантную N-ацетилглутамат синтазу по любому из пунктов 1-3;
(5) Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, трансформированная ДНК по пункту 4 и обладающая активностью по продукции L-аргинина; и
(6) Способ продуцирования L-аргинина, включающий стадии выращивания бактерии по пункту 5 в питательной среде для продукции и накопления L-аргинина в питательной среде и сбора L-аргинина из культуральной жидкости.
Белок NAGS, содержащий любую из fbr мутаций, описанных выше, может упоминаться как "мутантный NAGS", ДНК, кодирующая мутантный NAGS, может упоминаться как "мутантный ген argA", белок NAGS, не содержащий мутаций, может упоминаться как "природный NAGS".
Далее настоящее изобретение будет разъяснено подробнее.
<1> Мутантные белки NAGS и мутантные гены argA.
Мутантные белки NAGS и мутантные гены argA, кодирующие эти белки, были получены с помощью мутагенеза путем рандомизации фрагмента нуклеотидной последовательности гена. Для получения множественных мутаций в гене argA была произведена полная рандомизация фрагмента из 15 нуклеотидов, кодирующих район в последовательности белка с 15-го по 19-й аминокислотный остаток включительно. Полная рандомизация фрагмента из 15 нуклеотидов дает 415 или около 109 различных последовательностей ДНК, кодирующих 205 различных аминокислотных остатков в 5-мерном пептиде. Вероятность невозникновения стоп-кодонов в рамке считывания в этой последовательности равняется 0,955 или около 78%. Таким образом, полная рандомизация фрагмента гена argA, кодирующего пептид с 15-го по 19-й аминокислотный остаток, должна давать приблизительно 2,5 миллиона различных последовательностей белков, отличающихся этим пептидным фрагментом в структуре NAGS. Последовательная селекция и отбор рекомбинантных клонов, несущих мутантные гены argA, клонированные в экспрессирующие векторы, позволяет отобрать fbr варианты мутантных NAGS с различным уровнем их биологической активности вплоть до уровня активности природной NAGS. При селекции авторы изобретения решили, что штаммы, несущие мутантный ген argA, могут быть получены с использованием штаммов argD- и рrоВ- или рrоА-, потому что такие штаммы не могут продуцировать L-пролин вследствие ингибирования NAGS и в связи с этим не могут расти, если в культуральной среде присутствует избыток L-аргинина, но при этом штаммы, несущие fbr NAGS, могут расти на минимальной среде потому, что глутамат полуальдегид, предшественник L-пролина, может получаться с помощью ацетилорнитин деацетилазы (продукт гена argE) из N-ацетилглутамат полуальдегида, предшественника L-аргинина (Eckhardt Т., Leisinger Т., Mol. Gen. Genet., v.138, p. 225-232, 1975). Однако авторы изобретения обнаружили, что описанным выше методом, как это описано в последующих примерах, трудно получить fbr NAGS, обладающую высокой активностью, и что такая fbr NAGS, обладающая высокой активностью, может быть получена путем введения мутантного гена argA в природный штамм и селекцией штаммов, показывающих замедление роста.
В рамках настоящего изобретения были определены последовательности аминокислот мутантных NAGS, соответствующих fbr фенотипу NAGS. Вследствие этого мутантная NAGS может быть получена на основе этих последовательностей введением мутаций в природный ген argA с использованием обычных методов. В качестве примера природного гена argA может быть упомянут ген argA Е.coli (номер Y00492 в GenBank).
Последовательность аминокислот в положении с 15 по 19 в мутантной NAGS согласно настоящему изобретению соответствует любой из последовательностей 1-4 (SEQ ID NOS: 1-4). Соответствующая последовательность известной мутантной NAGS, в которой тирозин в положении 19 заменен на цистеин, а также природная NAGS из Е.coli приведены под номерами 5 и 6 (SEQ ID NOS: 5 и 6). Примеры последовательностей нуклеотидов, кодирующих эти последовательности аминокислот, приведены под номерами 7-12 (SEQ ID NOS: 7-12). Указанные последовательности представлены в таблице 1 (см. в конце описания).
Мутантная NAGS может содержать делеции, замены, вставки или добавки одной или нескольких аминокислот в одном или множестве положений, кроме положений с 15 по 19, при условии, что активность NAGS, которая является активностью по катализу реакции ацетилирования L-глутаминовой кислоты с получением N-ацетилглутамата, не ухудшена.
Значение "несколько" в отношении количества аминокислот различается в зависимости от положения или типа аминокислотных остатков в трехмерной структуре белка по следующей причине. Некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией по отношению к другим аминокислотам, и разница при их замене не влияет значительным образом на трехмерную структуру белка. По этой причине мутантной NAGS согласно настоящему изобретению может быть такая NAGS, гомология у которой составляет не менее чем 30-50%, предпочтительно 50-70%, в сравнении с полной последовательностью аминокислот, установленной для NAGS, и которая обладает активностью fbr NAGS.
В настоящем изобретении "последовательность аминокислот, соответствующая последовательности в положении с 15 по 19", означает последовательность аминокислот, соответствующую последовательности аминокислот в положении с 15 по 19 в последовательности природной NAGS из E.coli. Положение аминокислотных остатков может меняться. Например, если остаток какой-либо аминокислоты введен в N-концевой участок, то остаток аминокислоты, расположенный от природы в положении 15, перемещается в положение 16. В таком случае остаток аминокислоты, соответствующий первоначальному положению 15, обозначается в настоящем изобретении как остаток аминокислоты в положении 15.
ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как мутантная NAGS, описанная выше, может быть получена, например, путем модификации последовательности нуклеотидов, к примеру, методом сайт-направленного мутагенеза, таким образом, что вместо одного или нескольких аминокислотных остатков в указанном месте появятся делеции, замены, вставки или добавки. Описанная выше модифицированная ДНК может быть создана с использованием традиционных методов обработки для получения мутаций. Обработка для получения мутаций включает в себя метод обработки ДНК, содержащей ген argA, in vitro, например с помощью гидроксиламина, и метод обработки микроорганизма, например бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, несущей ген argA, ультрафиолетовым облучением или агентом, вызывающим мутации, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) и азотистой кислотой, обычно используемым при обработке для получения мутаций.
Замена, делеция, вставка или добавка нуклеотида, как это описано выше, включает также мутации, которые случаются естественным образом (мутант или вариант), например, на основе индивидуальных различий или различий на уровне вида или рода бактерии, содержащей NAGS.
ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как и ген argA, выявляется экспрессией ДНК, содержащей описанную выше мутацию, в подходящей клетке и исследованием активности продукта экспрессии.
Также ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как и мутантный NAGS, может быть получена выделением ДНК, которая гибридизуется с ДНК, имеющей известную последовательность гена argA, или зонда, получаемого из нее, в жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью NAGS, из клетки, несущей мутантную NAGS, подвергшейся обработке для получения мутации.
Упомянутый здесь термин "жесткие условия" обозначает условия, при которых образуется так называемый специфический гибрид (дуплекс), а неспецифический - не образуется. Четко описать эти условия с помощью численных значений довольно трудно. Однако, например, жесткими условиями являются такие условия, при которых молекулы ДНК, обладающие высокой гомологией, например ДНК, обладающие гомологией друг с другом не менее 50%, гибридизуются, а ДНК с меньшей гомологией - не гибридизуются. В качестве альтернативы примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом при концентрации солей, соответствующей обычной концентрации при отмывке в ходе гибридизации по Саузерну, т.е. 60oС, 1xSSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1xSSC, 0,1%SDS.
В число генов, которые гибридизуются в описанных выше условиях, включаются гены, содержащие стоп-кодон внутри кодирующего участка гена, а также те, которые кодируют неактивный белок вследствие мутаций в активном центре. Однако подобные затруднения могут быть легко разрешены путем лигирования гена в коммерчески доступный вектор для экспрессии и изучения активности NAGS.
<2> Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, согласно настоящему изобретению.
Бактерией, принадлежащей к роду Escherichia, согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, в которую введен мутантный ген argA, описанный выше. Примером бактерии, принадлежащей к роду Escherichia. является Е.coli. Мутантный ген argA может быть введен, например, путем трансформации бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, рекомбинантной плазмидой, содержащей вектор, функционирующий в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, и мутантный ген argA. Мутантный ген argA также может быть введен заменой гена argA на мутантный ген argA в хромосоме.
Примерами векторов, которые можно использовать для введения мутантного гена argA, являются плазмидные векторы, такие как pBR322, pMW118, pUC19 или подобные, фаговые векторы, такие как 11059, 1BF101, M13mp9 или подобные, и транспозоны, такие как Mu, Tn10, Тn5 или подобные.
Введение ДНК в бактерию, принадлежащую к роду Escherichia, может быть осуществлено, например, по методу D.A. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) или методом, в котором бактериальная клетка - реципиент обрабатывается хлоридом кальция для увеличения проницаемости для ДНК (Mandel, M. and Higa, A., J.Mol.Biol. 53, 159 (1970)) или подобньм им методом.
Если мутантный ген argA введен в бактерию, принадлежащую к роду Escherichia, - продуцент L-аргинина, количество продуцируемого L-аргинина может быть увеличено. Кроме того, способность к продукции L-аргинина может быть придана бактерии, в которую мутантный ген argA уже введен.
Примером бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, обладающей активностью в продукции L-аргинина, является штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925). Штамм 237 был депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ).
<3> Способ получения L-аргинина.
L-аргинин может быть получен с высокой эффективностью при выращивании бактерии, в которую введен мутантный ген argA, и которая обладает способностью к продукции L-аргинина, в питательной среде, продукции и накоплении L-аргинина в питательной среде и сбора L-аргинина из культуральной жидкости.
В способе согласно настоящему изобретению выращивание бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, накопление и сбор L-аргинина из культуральной жидкости может быть осуществлено способом, подобным способу, традиционно используемому для продукции L-аргинина методом ферментации с использованием бактерий. Питательная среда для выращивания может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что она содержит источники углерода и азота, минеральные соединения и, если необходимо, питательные добавки в количестве, необходимом для роста бактерии. Источники углерода включают в себя различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты, в зависимости от способности к их усвоению используемыми бактериями. Могут быть использованы спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источников азота используются аммиак, различные соли аммония, такие как сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и микробный ферментализат. В качестве минеральных соединений используются однозамещенный фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция. Выращивание проводят предпочтительно в аэробных условиях, таких как взбалтывание и аэрация с перемешиванием. Температура культуры обычно поддерживается от 20oС до 40oС, предпочтительно от 30oС до 38oС. Значение рН находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно в пределах от 6,5 до 7,2. рН среды может быть скорректировано аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 3 дней приводит к накоплению L-аргинина в культуральной жидкости.
Сбор L-аргинина может быть осуществлен путем удаления из питательной среды после выращивания нерастворимых компонент, таких как клетки, методом центрифугирования или фильтрации на мембране, с последующим сбором и очисткой L-аргинина методами ионного обмена, концентрации и фракционной кристаллизации или подобными.
Краткое описание чертежей.
На чертеже показана схема конструирования пула мутантных генов argA.
Наилучший способ осуществления изобретения.
Настоящее изобретение будет детальнее разъяснено со ссылкой на следующие примеры.
Пример 1.
<1> Мутагенез путем рандомизации фрагмента нуклеотидной последовательности гена.
BamHI-SalI фрагмент хромосомной ДНК (2.02 т.п.н.), содержащий ген argA, был клонирован в плазмиду pUC19 (плазмида pUC19-argA). Для амплификации с помощью ПЦР была использована ДНК полимераза PyrobestTM от Takara Shuzo Co. (Япония), она использовалась в условиях, рекомендованных производителем.
Для конструирования пула мутантных генов argA на первой стадии был амплифицирован фрагмент гена argA, кодирующий последовательность с 20-го остатка аминокислоты до конца NAGS (чертеж). В качестве матрицы использовалась плазмида pUC19-argA, смысловая затравка Р1: 5'-CGAGGGATTCCGCNNNNNNNNNNNNNNNATCAATACCCACCGGG-3' (SEQ ID NO:13), была сконструирована на основе последовательности нуклеотидов гена argA, в качестве антисмысловой затравки Р2 использовалась стандартная затравка М13 с обратной последовательностью. Фиксированная последовательность из 16-ти нуклеотидов на 3'-конце затравки Р1 гомологична последовательности гена argA после кодона Туr-19, а фиксированная последовательность из 13-ти нуклеотидов на 5'-конце затравки - перед кодоном His-15. Гомология к последовательности гена argA на 3'-конце затравки Р1 была использована для синтезирования фрагмента ДНК (1,75 т.п.н.) в ходе двадцати циклов ПЦР.
В качестве матрицы 100 нг плазмиды pUC19-argA было добавлено в раствор ПЦР (50 мкл), содержащий обе затравки (40 пмоль каждой). Были выполнены двадцать циклов ПЦР (94oС в течение 0,6 мин, 55oС в течение 0,5 мин, 72oС в течение 2 мин) в термоциклере модели 2400 DNA (Perkin-Elmer Co., Foster City, CA).
На второй стадии проводилось восемь циклов амплификации (94oС в течение 1 мин, 37oС в течение 1 мин, 72oС в течение 0,5 мин), в ходе которых (-) цепь этого фрагмента выступала в качестве затравки для его удлинения для получения полной последовательности гена.
На третьей стадии аликвота 10 мкл реакционной смеси добавлялась в свежую реакционную смесь (40 мкл), содержащую 100 пмоль смысловой затравки Р3: 5'-TGCCATGGTAAAGGAACGTAAAACC-3' (SEQ ID NO:14), гомологичной 5'-концу последовательности гена argA, и антисмысловой затравки Р2, затем проводилось десять циклов амплификации (94oС в течение 0,5 мин, 52oС в течение 0,5 мин, 72oС в течение 2 мин),
ДНК фрагмент (1.78 т.п.н.), кодирующий пул мутантных вариантов полноразмерного гена argA, очищался в ходе электрофореза в агарозном геле, расщеплялся ферментами NcoI (место узнавания включает начальный ATG-кодон гена argA) и HmdIII, затем лигировался в вектор рКК233-2 (Pharmacia, Sweden), расщепленный ферментами NcoI и HindIII.
ДНК фрагмент (1.78 т.п.н.), кодирующий пул мутантных вариантов полноразмерного гена argA, очищался в ходе электрофореза в агарозном геле, расщеплялся ферментами NcoI (место узнавания включает начальный ATG-кодон гена argA) и HmdIII, затем лигировался в вектор рКК233-2 (Pharmacia, Sweden), расщепленный ферментами NcoI и HindIII.
Около 150 нг дотированной ДНК использовалось в последующих экспериментах для трансформации клеток Е.coli - реципиентов с тем, чтобы получить около 2000 рекомбинантных клонов в каждом случае.
<2> Выделение новых мутантов argA и влияние замен аминокислот на каталитические свойства NAGS.
Плазмидный вектор рКК233-2 (Pharmacia, Sweden) использовался для клонирования и экспрессии вариантов гена argA. В качестве штамма Е.coli - реципиента использовался TG1 (supE hsdΔ5 thi Δ(lас-рrоАВ) F'[traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15] ) (Sambrook, J. et al. Molecular Cloning. 1989). Отбор клеток TG1, содержащих набор рекомбинантных плазмид pKK-argA-random (с мутантными генами argA)? проводился на чашках с LB агаром. Наблюдалось замедление клеточного роста некоторых мутантных клонов и предполагалось, что этот эффект коррелирует с продукцией активного мутантного fbr фермента NAGS. Из некоторых клонов были выделены плазмиды и методом секвенирования (метод терминации цепи с использованием дидезоксинуклеотидов) была определена последовательность ДНК 5'-концевого фрагмента гена argA (таблица 2).
Для определения активности NAGS штамм Е.coli B3083 (argA-. MetB-) - ауксотроф по аргинину трансформировался полученными плазмидами. Ферменты в растворимых фракциях, полученных из рекомбинантных клеток, разрушенных ультразвуком, были частично очищены осаждением сульфатом аммония и проанализированы, как описано ниже. Активность NAGS из штаммов, содержащих плазмиды pKK-argA-r11 (3390 нмоль/мин х мг), pKK-argA-r12 (1220 нмоль/мин х мг) pKK-argA-r13 (3120 нмоль/мин х мг), значительно выше активности NAGS из штамма, содержащего плазмиду pKK-argA-r4 (300 нмоль/мин х мг). Последняя плазмида содержит мутантный ген argA с такой же заменой (Y19C), как и наиболее активный вариант гена argA с единичной заменой, описанный Rajagopal B. S. et al (Rajagopal B.S. et al. Appl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, No.5, p.1805-1811).
Также активность NAGS в штамме, содержащем плазмиду pKK-argA(wt) (природный argA), ниже, чем в случае с pKK-argA-r11, -r12 и -r13. Уровень активности мутантных ферментов в присутствии 10 mM аргинина приблизительно одинаковый, притом что природный фермент в значительной степени ингибировался аргинином (менее одной десятой исходной активности). Эти результаты показывают, что пептидный фрагмент с 15 по 19 аминокислотный остаток отвечает за ингибирование NAGS аргинином по типу обратной связи и за уровень каталитической активности.
(Проверка активности фермента)
Ацетил коэнзим А и все химические реактивы куплены у Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. Для определения активности NAGS клетки Е. coli B3083 (argA-, metB-), содержащие рекомбинантые плазмиды, выращивались в среде М9 (5 мл) до поздней экспоненциальной фазы, отмывались 0,14 М раствором NaCl и ресуспендировались в 2 мл 40 mM калий-фосфатного буфера (рН 7,0) с 100 mM KCl. Клетки разрушались под действием ультразвука и центрифугировались. Фракции, содержащие NAGS, осаждались 5 объемами насыщенного (NH4)2SO4 и осадки растворялись в 2 мл 40 mM калий-фосфатного буфера (рН 7,0) с 100 mM KC1 и 30%(v/v) глицерином. Раствор с NAGS добавлялся к 0,1 мл реакционной смеси (100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 35 mM KCl, 20 mM L-глутамата, 1,2 mM ацетил коэнзима А) и реакционная смесь инкубировалась при 37oС в течение 10 мин. Реакция останавливалась добавлением 0,3 мл этанола с последующим центрифугированием реакционной смеси. 0,95 мл 0,24 mM раствора DTNB (5,5-дитио-bis-2-нитробензоата) добавлялись к супернатанту и смесь инкубировалась в течение 15 мин. Активность NAGS определялась измерением поглощения при 412 нм.
Ацетил коэнзим А и все химические реактивы куплены у Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. Для определения активности NAGS клетки Е. coli B3083 (argA-, metB-), содержащие рекомбинантые плазмиды, выращивались в среде М9 (5 мл) до поздней экспоненциальной фазы, отмывались 0,14 М раствором NaCl и ресуспендировались в 2 мл 40 mM калий-фосфатного буфера (рН 7,0) с 100 mM KCl. Клетки разрушались под действием ультразвука и центрифугировались. Фракции, содержащие NAGS, осаждались 5 объемами насыщенного (NH4)2SO4 и осадки растворялись в 2 мл 40 mM калий-фосфатного буфера (рН 7,0) с 100 mM KC1 и 30%(v/v) глицерином. Раствор с NAGS добавлялся к 0,1 мл реакционной смеси (100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 35 mM KCl, 20 mM L-глутамата, 1,2 mM ацетил коэнзима А) и реакционная смесь инкубировалась при 37oС в течение 10 мин. Реакция останавливалась добавлением 0,3 мл этанола с последующим центрифугированием реакционной смеси. 0,95 мл 0,24 mM раствора DTNB (5,5-дитио-bis-2-нитробензоата) добавлялись к супернатанту и смесь инкубировалась в течение 15 мин. Активность NAGS определялась измерением поглощения при 412 нм.
<3> Выделение новых мутантов гена argA путем отбора среди клеток В 16-4 (pro- argD-).
Отбор мутантных генов argA из штамма Е.соli В 16-4 (pro- argD-), несущего плазмиды pKK-argA-random, осуществлялся способом, описанным выше. Рекомбинантные клоны с чашек с агаром были суспендированы в среде М9 с L-аргинином и выращивались до стационарной фазы. Аликвота культуры была суспендирована в свежей среде и процедура выращивания повторена четыре раза. После этого аликвота культуры переносилась на агаризованную среду М9, содержащую 5 мг/мл L-аргинина и 100 мкг ампицилина. Из некоторых клонов были выделены плазмиды, определены последовательности 5'-концевых фрагментов мутантных генов argA и проверен, как описано выше, уровень активности мутантных NAGS. 60% мутантов содержали последовательность -Gly-Trp-Pro-Cys-Val- (SEQ ID NO: 4) в подвергавшемся мутагенезу фрагменте фермента и обладали слабой, но fbr активностью NAGS. Очевидно, что такой мутантный белок обладает оптимальным уровнем активности NAGS для роста клеток В16-4 (pro- argD-) в использованных для отбора условиях. Таким образом, условия отбора определяют активность полученной мутантной NAGS.
<4> Продукция L-аргинина с использованием мутантных генов argA.
Рекомбинантные плазмиды pKKArgA-r4, 11, 12, 13 и 32 были расщеплены рестриктазами BamHI и SalI, и фрагменты, содержащие мутантные гены argA, находящиеся под контролем промотора trc, были заново клонированы в низкокопийную плазмиду pMW119 (Nippon Gene Co., Tokyo). Полученные плазмиды были названы pMADS4, pMADS11, pMADS12, pMADS13 и pMADS32 соответственно. Эти плазмиды были введены в штамм Е.coli 237 - продуцент L-аргинина (ВКПМ В-7925). Продукция L-аргинина (Arg) и цитрулина (Cit) трансформантами показана в таблице 3. Большинство штаммов - продуцентов с новыми мутантными генами NAGS обладали более высокой продуктивностью Arg и Cit, чем штамм - реципиент или штамм с известной мутантной Tyrl9Cys NAGS (pMADS4).
(Условия выращивания при ферментации в пробирках)
Питательная среда для ферментации содержала 60 г/л глюкозы, 25 г/л сульфата аммония, 2 г/л КН2РO4, 1 г/л MgSO4, 0,1 мг тиамина, 5 г/л дрожжевого экстракта Difco, 25 г/л мела на 1 л воды (рН 7,2). Глюкоза и мел были стерилизованы по отдельности. 2 мл питательной среды помещали в пробирку, высевали одну петлю испытываемого микроорганизма, выращивание продолжали при 32oС в течение 3 дней со встряхиванием.
Питательная среда для ферментации содержала 60 г/л глюкозы, 25 г/л сульфата аммония, 2 г/л КН2РO4, 1 г/л MgSO4, 0,1 мг тиамина, 5 г/л дрожжевого экстракта Difco, 25 г/л мела на 1 л воды (рН 7,2). Глюкоза и мел были стерилизованы по отдельности. 2 мл питательной среды помещали в пробирку, высевали одну петлю испытываемого микроорганизма, выращивание продолжали при 32oС в течение 3 дней со встряхиванием.
Перечень последовательностей приведен в конце описания.
Claims (9)
1. Мутантная N-ацетилглутамат синтаза, в которой последовательность аминокислот, соответствующая положениям с 15 по 19 в природной N-ацетилглутамат синтазе, заменена любой из последовательностей аминокислот под номерами 1-4 (SEQ ID NOS: 1-4).
2. Мутантная N-ацетилглутамат синтаза по п. 1, где природной N-ацетилглутамат синтазой является N-ацетилглутамат синтаза из Escherichia coli.
3. Мутантная N-ацетилглутамат синтаза, в которой последовательность аминокислот, соответствующая положениям с 15 по 19 в природной N-ацетилглутамат синтазе, заменена любой из последовательностей аминокислот под номерами 1-4 (SEQ ID NOS: 1-4), и такая синтаза содержит делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в одном или множестве положений, кроме положений с 15 по 19.
4. Мутантная N-ацетилглутамат синтаза по п. 3, где природной N-ацетилглутамат синтазой является N-ацетилглутамат синтаза из Escherichia coli.
5. Фрагмент ДНК, кодирующий мутантную N-ацетилглутамат синтазу по любому из пп. 1-4.
6. Штамм бактерии Escherichia coli 237/pMADS11, трансформированный фрагментом ДНК, кодирующим мутантную N-ацетилглутамат синтазу, в которой последовательность аминокислот, соответствующая положениям с 15 по 19 в природной N-ацетилглутамат синтазе, заменена на последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, - продуцент L-аргинина.
7. Штамм бактерии Escherichia coli 237/pMADS12, трансформированный фрагментом ДНК, кодирующим мутантную N-ацетилглутамат синтазу, в которой последовательность аминокислот, соответствующая положениям с 15 по 19 в природной N-ацетилглутамат синтазе, заменена на последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, - продуцент L-аргинина.
8. Штамм бактерии Escherichia coli 237/pMADS13, трансформированный фрагментом ДНК, кодирующим мутантную N-ацетилглутамат синтазу, в которой последовательность аминокислот, соответствующая положениям с 15 по 19 в природной N-ацетилглутамат синтазе, заменена на последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, - продуцент L-аргинина.
9. Способ получения L-аргинина, включающий стадии выращивания бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, - продуцента L-аргинина в питательной среде и выделения L-аргинина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве штамма - продуцента используют штамм бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированный фрагментом ДНК по п. 5.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001112869/13A RU2215783C2 (ru) | 2001-05-15 | 2001-05-15 | МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА |
| JP2001180219A JP4682454B2 (ja) | 2000-06-28 | 2001-06-14 | 新規変異型ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素及びｌ−アルギニンの製造法 |
| EP01114572A EP1170361B1 (en) | 2000-06-28 | 2001-06-18 | New mutant N-Acetylglutamate synthase and method for L-Arginine production |
| ES01114572T ES2228699T3 (es) | 2000-06-28 | 2001-06-18 | Nuevo mutante de la n-acetigltamato sintasa y procedimiento para la produccion de-arginina. |
| DE60106526T DE60106526T2 (de) | 2000-06-28 | 2001-06-18 | Neue N-Acetylglutamatsynthase-Mutante und ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin |
| US09/886,135 US6790647B2 (en) | 2000-06-28 | 2001-06-22 | Mutant N-acetylglutamate synthase and method for L-arginine production |
| CNB011259191A CN1180082C (zh) | 2000-06-28 | 2001-06-28 | 新的突变型n-乙酰谷氨酸合酶和l-精氨酸生产方法 |
| US10/891,122 US7169586B2 (en) | 2000-06-28 | 2004-07-15 | Mutant N-acetylglutamate synthase and method for L-arginine production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001112869/13A RU2215783C2 (ru) | 2001-05-15 | 2001-05-15 | МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000116481/13A Substitution RU2000116481A (ru) | 2000-06-28 | 2000-06-28 | Мутантная n-ацетилглутамат синтаза, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, способ продуцирования l-аргинина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001112869A RU2001112869A (ru) | 2003-03-20 |
| RU2215783C2 true RU2215783C2 (ru) | 2003-11-10 |
Family
ID=32026594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001112869/13A RU2215783C2 (ru) | 2000-06-28 | 2001-05-15 | МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2215783C2 (ru) |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007100009A1 (ja) | 2006-03-03 | 2007-09-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2011152568A1 (en) | 2010-06-03 | 2011-12-08 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family, having attenuated expression of genes encoding a lysine/arginine/ornithine transporter |
| WO2012011595A1 (en) | 2010-07-21 | 2012-01-26 | Ajinomoto Co.,Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY HAVING ATTENUATED EXPRESSION OF THE astCADBE OPERON |
| WO2012011596A1 (en) | 2010-07-21 | 2012-01-26 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l- amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with enhanced expression of the bssr gene |
| RU2468083C1 (ru) * | 2011-04-25 | 2012-11-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина |
| RU2471870C2 (ru) * | 2010-06-03 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA |
| US8372606B2 (en) | 2006-12-25 | 2013-02-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Methods for obtaining crystals of a basic amino acid hydrochloride |
| EP2796560A1 (en) | 2013-04-23 | 2014-10-29 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having attenuated expression of the yjjK gene |
| WO2015030019A1 (en) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Ajinomoto Co.,Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE FAMILY ENTEROBACTERIACEAE HAVING ATTENUATED EXPRESSION OF THE znuACB GENE CLUSTER |
| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
| WO2015050276A1 (en) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having attenuated expression of a phosphate transporter-encoding gene |
| WO2015122544A1 (en) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Ajinomoto Co.,Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE FAMILY ENTEROBACTERIACEAE HAVING OVEREXPRESSED THE yajL GENE |
| EP3098319A1 (en) | 2015-05-28 | 2016-11-30 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having an attenuated expression of a gsha gene |
| WO2017146195A1 (en) | 2016-02-25 | 2017-08-31 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter |
| EP3385389A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid from fructose |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| WO2020138178A1 (en) | 2018-12-27 | 2020-07-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing basic l-amino acids or salts thereof by fermentation of an enterobacteriaceae bacterium |
| WO2020171227A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE |
| WO2020204179A1 (en) | 2019-04-05 | 2020-10-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing l-amino acids |
| WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
| EP4345166A2 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009165355A (ja) | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2006143864A (ru) | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| KR101730837B1 (ko) | 2007-01-22 | 2017-04-27 | 아지노모토 가부시키가이샤 | Ｌ-아미노산을 생산하는 미생물 및 ｌ-아미노산의 제조법 |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2396336C2 (ru) | 2007-09-27 | 2010-08-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| RU2008105793A (ru) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена |
| JP5488467B2 (ja) | 2008-09-05 | 2014-05-14 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2010027045A1 (ja) | 2008-09-08 | 2010-03-11 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2010084995A2 (en) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid |
| BRPI1014661B1 (pt) | 2009-07-29 | 2020-12-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Método para produzir um l-aminoácido |
| RU2460793C2 (ru) | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| RU2010101135A (ru) | 2010-01-15 | 2011-07-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата |
| JP2013074795A (ja) | 2010-02-08 | 2013-04-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法 |
| RU2471868C2 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
| JP2014036576A (ja) | 2010-12-10 | 2014-02-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
| JP6459962B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-01-30 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2020162549A (ja) | 2019-03-29 | 2020-10-08 | 味の素株式会社 | 制御装置、制御方法およびプログラムならびに有機化合物の製造方法 |
-
2001
- 2001-05-15 RU RU2001112869/13A patent/RU2215783C2/ru active
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007100009A1 (ja) | 2006-03-03 | 2007-09-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| US8372606B2 (en) | 2006-12-25 | 2013-02-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Methods for obtaining crystals of a basic amino acid hydrochloride |
| WO2011152568A1 (en) | 2010-06-03 | 2011-12-08 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family, having attenuated expression of genes encoding a lysine/arginine/ornithine transporter |
| RU2471870C2 (ru) * | 2010-06-03 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA |
| WO2012011595A1 (en) | 2010-07-21 | 2012-01-26 | Ajinomoto Co.,Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY HAVING ATTENUATED EXPRESSION OF THE astCADBE OPERON |
| WO2012011596A1 (en) | 2010-07-21 | 2012-01-26 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l- amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with enhanced expression of the bssr gene |
| RU2468083C1 (ru) * | 2011-04-25 | 2012-11-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина |
| EP2796560A1 (en) | 2013-04-23 | 2014-10-29 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having attenuated expression of the yjjK gene |
| WO2015030019A1 (en) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Ajinomoto Co.,Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE FAMILY ENTEROBACTERIACEAE HAVING ATTENUATED EXPRESSION OF THE znuACB GENE CLUSTER |
| WO2015050276A1 (en) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having attenuated expression of a phosphate transporter-encoding gene |
| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
| WO2015122544A1 (en) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Ajinomoto Co.,Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE FAMILY ENTEROBACTERIACEAE HAVING OVEREXPRESSED THE yajL GENE |
| EP3098319A1 (en) | 2015-05-28 | 2016-11-30 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having an attenuated expression of a gsha gene |
| WO2017146195A1 (en) | 2016-02-25 | 2017-08-31 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter |
| EP3385389A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid from fructose |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| WO2020138178A1 (en) | 2018-12-27 | 2020-07-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing basic l-amino acids or salts thereof by fermentation of an enterobacteriaceae bacterium |
| WO2020171227A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE |
| WO2020204179A1 (en) | 2019-04-05 | 2020-10-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing l-amino acids |
| WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
| EP4345166A2 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2215783C2 (ru) | МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА | |
| JP4682454B2 (ja) | 新規変異型ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素及びｌ−アルギニンの製造法 | |
| RU2355763C2 (ru) | Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот | |
| KR100420743B1 (ko) | 신규한리신데카복실라제유전자및l-리신의제조방법 | |
| JP4561010B2 (ja) | Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| EP1650296B1 (en) | Mutant serine acetyltransferase and process for producing l-cysteine | |
| RU2275424C2 (ru) | Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia | |
| JP4626220B2 (ja) | 腸内細菌科の細菌を用いたｌ−ヒスチジンの製造法 | |
| RU2264459C2 (ru) | Новая мутантная карбамоилфосфатсинтетаза и способ продукции соединений - производных карбамоилфосфата | |
| JP4821321B2 (ja) | 腸内細菌科の細菌を用いたｌ−ヒスチジンの製造法 | |
| BR122013017187B1 (pt) | bactéria transgênica produtora de l-aminoácido pertencente ao gênero escherichia, e, método para produzir l-aminoácido | |
| JP5214633B2 (ja) | Ｌ−アルギニン生産コリネバクテリウムグルタミカム変異株およびその製造方法 | |
| RU2215782C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) | |
| RU2550269C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, СОДЕРЖАЩЕЙ N-АЦЕТИЛОРНИТИНДЕАЦЕТИЛАЗУ С НАРУШЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ | |
| RU2279477C2 (ru) | Мутантная серинацетилтрансфераза, фрагмент днк, кодирующий мутантную серинацетилтрансферазу (варианты), бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина, и способ продукции l-цистеина | |
| JP4561009B2 (ja) | Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| US20230332116A1 (en) | Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid | |
| JP2007513601A (ja) | エシェリヒア属に属するｌ−スレオニン生産菌及びｌ−スレオニンの製造法 | |
| JP4852839B2 (ja) | 変異型ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ及びｌ−ヒスチジンの製造方法 | |
| JP2003189863A (ja) | アスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方法 | |
| RU2215785C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) | |
| JP2000287688A (ja) | コリネ型細菌のピリミジン生合成系酵素遺伝子 | |
| JPH05207886A (ja) | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 | |
| JP2004242564A (ja) | メチロフィラス属細菌のベクター |