ES2331956T3

ES2331956T3 - Microorganismo que produce l-aminoacidos y procedimiento para producir l-aminoacidos.

Info

Publication number: ES2331956T3
Application number: ES05704409T
Authority: ES
Inventors: Takuji Ueda; Yuta Nakai; Yoshiya Gunji; Rie Takikawa; Yuji Joe
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-28
Publication date: 2010-01-21
Anticipated expiration: 2025-01-28
Also published as: CN103146593B; PL1664318T3; DK1664318T3; DE602005016763D1; EP1664318A2; US20060019355A1; KR100786987B1; ATE443757T1; ZA200602484B; WO2005073390A3; BRPI0506369B1; WO2005073390A2; BRPI0506369A; RU2316588C1; CN103146593A; US8383363B1; CN101243177B; KR20060084446A; US7629142B2; EP1664318B1

Abstract

Microorganismo que presenta una capacidad productora de L-aminoácidos, en el que dicho microorganismo es modificado de manera que la expresión de un gen ybjE es potenciada, en el que dicho gen ybjE es seleccionado de entre el grupo que consiste en: (a) un ADN que comprende una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1; (b) un ADN que puede hibridizarse, bajo condiciones estrictas, con una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos; (c) un ADN que presenta una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49 a 948 en la SEC ID nº:1; y (d) un ADN que puede hibridizarse, bajo condiciones estrictas, con una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49 a 948 en la SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos.

Description

Microorganismo que produce L-aminoácidos y procedimiento para producir L-aminoácidos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir un L-aminoácido mediante fermentación utilizando un microorganismo. Específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir L-aminoácidos tales como L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína y ácido L-glutámico. Estos son L-aminoácidos industrialmente útiles. Principalmente, la L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-prolina son útiles como aditivos para la alimentación animal, componentes de alimentos saludables, e infusiones de aminoácidos. La L-arginina y L-ornitina son útiles como agentes que promueven la función hepática, infusiones de aminoácidos, y componentes de preparaciones que contienen aminoácidos. La L-histidina es útil como un agente promotor de la función hepática y como precursor de la histamina. La L-fenilalanina es útil como precursor de edulcorantes.

Antecedentes de la técnica

Los L-aminoácidos se producen industrialmente mediante fermentación, utilizando microorganismos que pertenecen al género Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia o similares.

Se ha informado de procedimientos para producir L-lisina en las patentes EP 0857784A, JP 11-192088A,
WO00/53726, y WO96/17930. Se ha informado de procedimientos para producir L-arginina en EP 0999267A, EP 1170358A, y JP 2002-017342A. En estos procedimientos en los que se informa, se utilizaron cepas bacterianas productoras de L-aminoácidos básicos, incluyendo cepas separadas de la naturaleza o sus cepas artificialmente mutadas, y cepas recombinantes que poseen actividad potenciada de una enzima biosintética de un L-aminoácido básico.

Además, también se ha informado de procedimientos para producir L-aminoácidos a partir del metanol, que está disponible para la fermentación en grandes cantidades y a un bajo coste, utilizando una cepa de un microorganismo mutado o modificado genéticamente, que pertenece al género Methylophilus o Methylobacillus (WO00/61723 y JP 2001-120269A).

Es conocido que los procedimientos para modificar la absorción o la exportación de L-aminoácidos en las células bacterianas han mejorado la capacidad de las bacterias para producir L-aminoácidos. Los procedimientos para modificar la absorción de los L-aminoácidos incluyen la eliminación o la disminución de la absorción de un L-aminoácido en las células para potenciar la capacidad productora de L-aminoácidos. Específicamente, estos procedimientos incluyen uno para "borrar" el operón gluABCD, o una parte del mismo, para eliminar o atenuar la absorción del ácido L-glutámico (EP 1038970A).

Los procedimientos para modificar la exportación incluyen la eliminación o reducción de la exportación de un intermediario o de un sustrato de la biosíntesis del L-aminoácido, y un procedimiento para potenciar la exportación de un L-aminoácido producido. Como un procedimiento para eliminar o reducir la exportación de un intermediario de la biosíntesis del ácido L-glutámico, se conoce un procedimiento para mutar o interrumpir el gen de la \alpha-cetoglutarato permeasa para reducir una exportación del ácido \alpha-cetoglutárico (W001/005959).

Como un procedimiento para potenciar la exportación de un L-aminoácido, resulta conocido un procedimiento para potenciar el gen lysE (un gen para la exportación de un L-aminoácido básico; J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1999 Nov; 1(2):327-36) en una cepa de la bacteria Corynebacterium, para producir L-lisina (WO97/23597) o la L-arginina (Publicación de patente US 2003-0113899). Asimismo, resulta conocido un procedimiento para potenciar la expresión de los genes rhta, B, C, (JP-2000-189177A) y de los genes yfiK, yahN (EP 1016710A), que se ha sugerido están implicados en la exportación de los L-aminoácidos, en las células de bacteria Escherichia.

Como un gen para exportar los L-aminoácidos básicos, resulta conocido el gen lysE mencionado anteriormente. Sin embargo, cuando un gen lysE se amplifica en una bacteria asimiladora del metanol tal como la bacteria Methylophilus, y la cepa resultante se utiliza para la producción de la L-lisina o de la L-arginina, un gen lysE de tipo salvaje derivado de una bacteria corineforme es letal para la bacteria Methylophylus, y, por lo tanto, es necesario introducir un gen lysE mutante (EP 1266966A) que permite el desarrollo del microorganismo huésped. Por tanto, el gen lysE no puede funcionar siempre en la exportación de la L-lisina o de la L-arginina cuando se introduce en microorganismos heterogéneos. Por tanto, es deseable obtener un gen para el L-aminoácido exportador y la producción que muestre una capacidad para secretar suficientes cantidades de L-aminoácidos, incluyendo la L-lisina y la L-arginina, en distintos microorganismos huésped heterogéneos.

El gen ybjE se localiza en el genoma de Escherichia coli y se ha predicho que codifica una proteína superficial putativa Science, 277 (5331): 1453-74, 1997). Sin embargo, no se ha informado de la clonación del gen y su análisis mediante la expresión en las células bacterianas, y por tanto, sus funciones fisiológicas han permanecido desconocidas.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una cepa bacteriana que pueda producir eficientemente un L-aminoácido. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir eficientemente un L-aminoácido utilizando dicha cepa.

En el contexto de la presente invención se ha estudiado asiduamente para conseguir los objetivos mencionados anteriormente, y como resultado, se obtuvo el gen ybjE, un gen nuevo para la exportación de L-aminoácidos, basado en la resistencia a altas concentraciones de L-lisina. Además, se ha descubierto que los L-aminoácidos, incluyendo L-aminoácidos básicos tales como L-lisina, L-arginina, L-ornitina, y L-histidina; L-aminoácidos alifáticos tales como L-isoleucina; L-aminoácidos hidroxílicos tales como L-treonina; L-aminoácidos circulares, tales como L-prolina; L-aminoácidos aromáticos tales como L-fenilalanina; L-aminoácidos que contienen azufre, tales como L-cisteína; y L-aminoácidos ácidos tal como el ácido L-glutámico, pueden ser producidos eficientemente utilizando un microorganismo en el cual se potencia la expresión del gen ybjE.

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un microorganismo que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos, en el que dicho microorganismo se modifica, de forma que la expresión de un gen ybjE se potencia.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que la expresión de dicho gen ybjE se potencia aumentando el número de copias de dicho gen ybjE, o modificando una secuencia reguladora de expresión de dicho gen ybjE.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que la secuencia aminoácida de una proteína codificada por dicho ybjE es tal como se define en SEC 2, y en el que dicha proteína posee la capacidad de exportación de un L-aminoácido.

En la presente invención, el gen ybjE se selecciona de entre el grupo que consiste en:

(a): un ADN que comprende una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1; y

(b): un ADN que puede hibridizarse bajo condiciones severas con una secuencia nucleótida de SEC ID nº: 1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que tiene una capacidad exportadora de un L-aminoácido.

(c): un ADN que tiene una secuencia nucleótida de 49 a 948 nucleótidos en SEC ID nº:1, y

(d): un ADN que puede hibridizarse bajo condiciones severas con una secuencia nucleótida de 49 a 948 en SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que posee una capacidad exportadora del L-aminoácido.

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Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que dicha capacidad de exportación del L-aminoácido, por dicho microorganismo, aumenta mediante dicha potenciación de dicho gen ybjE.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que la resistencia del microorganismo con respecto a un L-aminoácido o a un análogo del L-aminoácido, aumenta mediante la potenciación de dicha expresión de dicho gen ybjE.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que dicho L-aminoácido se selecciona de entre el grupo que consiste en L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína, y ácido L-glutámico.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que dicho microorganismo pertenece a una familia de Enterobacteriáceas.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que dicho microorganismo que pertenece a la familia de Enterobacteriáceas, es un microorganismo que pertenece al género Escherichia.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que dicho microorganismo es una bacteria Corineforme.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el dicho microorganismo es un microorganismo que asimila el metanol.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que dicho microorganismo que asimila el metanol pertenece al género Methylophilus o Methylobacillus.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir un L-aminoácido, que comprende el cultivo del microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en un medio, para producir y acumular dicho L-aminoácido, y recuperar dicho L-aminoácido a partir del medio o del microorganismo.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir un L-aminoácido, que comprende cultivar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente en un medio líquido que contiene metanol como principal fuente de carbono, para producir y acumular dicho L-aminoácido, y recuperar el L-aminoácido a partir del medio o del microorganismo.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el procedimiento tal como se ha indicado anteriormente, en el que el L-aminoácido se selecciona a partir del grupo formado por L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína, y ácido L-glutámico.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa un esquema de construcción de un plásmido para la amplificación del gen ybjE en la bacteria Escherichia.

La figura 2 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-lisina.

La figura 3 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE interrumpido de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-lisina.

La figura 4 representa un esquema de construcción de un plásmido para la amplificación del gen ybjE en bacterias que asimilan el metanol.

La Figura 5 representa un esquema de construcción de un plásmido para la producción de L-lisina, utilizando bacterias que asimilan el metanol.

La Figura 6 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Methylophilus methilotropus, en presencia de un análogo de la L-lisina.

La Figura 7 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-isoleucina.

La Figura 8 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-glutamato.

La Figura 9 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-treonina.

La Figura 10 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-histidina.

La Figura 11 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-prolina.

La Figura 12 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-ornitina.

La Figura 13 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-fenilalanina.

La Figura 14 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-cisteína.

La Figura 15 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-arginina.

La Figura 16 representa curvas de crecimiento para una cepa de control y una cepa con el gen ybjE (948 pares de bases o 900 pares de bases) amplificado de Escherichia coli, en presencia de altas concentraciones de L-lisina.

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Descripción detallada de las formas de realización preferidas

A continuación, la presente invención se explicará con mayor detalle.

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<1> Microorganismo de la presente invención

El microorganismo de la presente invención posee la capacidad para producir un L-aminoácido, y se ha modificado de forma que la expresión del gen ybjE está potenciada. La frase "capacidad para producir un L-aminoácido (capacidad productora de un L-aminoácido)" tal como se utiliza en la presente memoria, significa una capacidad para acumular un L-aminoácido en un medio o en las células del microorganismo, cuando el microorganismo de la presente invención se cultiva en el medio. El microorganismo de la presente invención puede tener capacidad para producir múltiples tipos de L-aminoácidos. El microorganismo que posee una capacidad para producir L-aminoácidos puede ser que posea originariamente una capacidad productora de L-aminoácidos, o puede ser un microorganismo que se obtenga modificando una cepa parental suya, tal como se menciona a continuación, utilizando una técnica mutagénica o una técnica del ADN recombinante, de forma que el microorganismo posea una capacidad productora del L-aminoácido. El microorganismo de la presente invención puede también ser uno que haya obtenido la capacidad productora del L-aminoácido potenciando la expresión del gen ybjE.

Los L-aminoácidos que van a producirse en la presente invención no están limitados particularmente, e incluyen L-aminoácidos básicos tales como L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, y L-citrulina; L-aminoácidos alifáticos tales como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina, y L-glicina; L-aminoácidos hidroxílicos tales como L-treonina y L-serina; L-aminoácidos circulares, tales como L-prolina; L-aminoácidos aromáticos tales como L-fenilalanina, L-tirosina y L-triptófano; L-aminoácidos que contienen azufre, tales como L-cisteína, L-cistina y L-metionina; y L-aminoácidos ácidos y sus amidas, tales como el ácido L-glutámico, ácido L-aspárgico, L-glutamina y L-asparagina. El microorganismo de la presente invención puede tener una capacidad para producir dos o más tipos de estos L-aminoácidos.

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Transmisión de la capacidad para producir L-aminoácidos

A continuación, se proporcionarán ejemplos de microorganismos que tengan capacidad productora de L-aminoácidos. Sin embargo, los microorganismos no se limitan a los ejemplos, pero incluyen cualquier microorganismo que posea una capacidad productora de L-aminoácidos.

Como cepas parentales del microorganismo de la presente invención, pueden utilizarse, de la familia de las Enterobacteriáceas, Escherichia, Pantoea, o las bacterias Corineformes. Además, las bacterias asimiladoras de metanol, tales como Methylophilus y Methylobacillus, que pueden producir L-aminoácidos a partir del metanol, pueden asimismo utilizarse. Además, ejemplos de cepas parentales incluyen la familia de las Enterobacteriáceas, que pertenece a las \gamma-proteobacterias, que incluyen bacterias que pertenecen a los géneros Escherichia, pantoea, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella y Morganella, y otras bacterias que incluyen Alicyclobacillus y Bacillus, y levaduras que incluyen las que pertenecen al género Saccharomyces, Candida, o similares. Estas cepas parentales pueden poseer inherentemente el gen ybjE, o pueden no poseerlo inherentemente, y muestran una potenciación de la capacidad exportadora de los L-aminoácidos cuando se introduce el gen ybjE.

Pueden utilizarse bacterias Escherichia de las que se informa en Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1208, Tabla 1), tal como Escherichia coli. Ejemplos de cepas salvaje de Escherichia coli incluyen, pero no se limitan a la cepa K12 y sus derivados, cepa MG1655 de Escherichia coli (ATCC nº 47076), y cepa W3110 (ATCC nº 27325). Estas cepas están disponibles en la American Type Culture Collection, (ATCC, dirección: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA).

Los ejemplos de bacterias Enterobacter incluyen Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, etc. Los ejemplos de bacterias Pantoea incluyen Pantoea ananatis, etc. Aunque algunas bacterias clasificadas originariamente como Enterobacter aerogenes pueden clasificarse actualmente como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis o Pantoea stewartii, basándose en el análisis del 16S ARNr, el microorganismo que pertenece a la familia Enterobacteriáceas que se utiliza en la presente invención puede ser Enterobacter o Pantoea. Ejemplos específicos de Pantoea ananatis incluyen Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615), Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207), y sus derivados. Estas cepas se identificaron originariamente y se depositaron como Enterobacter agglomerans, clasificándose en la actualidad como Pantoea ananatis.

Los ejemplos de bacterias Methylophilus incluyen, pero no se limitan a Methylophilus methylotrophus, y ejemplos típicos de Methylophilus methylotrophus incluyen la cepa AS1 (NCIMB10515) y así sucesivamente. La cepa AS1 (NCIMB10515) de Methylophilus methylotrophus está disponible en la National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Dirección: NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Reino Unido).

Los ejemplos de bacterias Methylobacillus incluyen, pero no se limitan a Methylobacillus glycogenes, Methylobacillus flagellatum, etc. Los ejemplos de Methylobacillus glycogenes incluyen la cepa T-11 (NCIMB 11375), la cepa ATCC 21276, la cepa ATCC 21371, la cepa ATR80 (Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 42, páginas 67-72 (1994)), [cepa A513 Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 42, págs. 67-72 (1994)], etc. La cepa 11375 NCIMB de Methylobacillus glycogenes está disponible en la National Collections of Industrial and Marine Bacteria (dirección: NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey R Road, Aberdeen AB9 8DG, Reino Unido). Ejemplos de Methylobacillus flagellatum incluyen la cepa KT (Arch. Microbiol., vol. 149, págs 441-446 (1988)) y así sucesivamente.

Las bacterias corineformes son un grupo de microorganismos que se definen en el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ª edición, pág 599, (1974), y puede utilizarse en la presente invención. Estos microorganismos se clasifican en aeróbicos, Gram positivos, y bacilos no ácidos rápidos, que son incapaces de esporular. Las bacterias Corineformes incluyen también las bacterias que se clasificaron en el género Brevibacterium, pero se unen habitualmente en el género Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)), así como las bacterias que pertenecen al género Brevibacterium o Microbacterium, que están estrechamente relacionadas con el género Corynebacterium.

Los ejemplos de dichas bacterias Corineformes se mencionan a continuación.

Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola

Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)

Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagens Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum

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Específicamente, las siguientes cepas pueden proporcionarse como ejemplo:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511

Corynebacterium callunae ATCC15991

Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC13032, ATCC13060

Corynebacterium lilium ATCC 15990

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Corynebacterium melassecola ATCC17965

Corynebacterium efficiens AJ12340 (FERM BP-1539)

Corynebacterium herculis ATCC13868

Brevibacterium divaricatum ATCC14020

Brevibacterium flavum ATCC13826, ATCC14067, AJ12418 (FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC14068

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 (Corynebacterium glutamicum ATCC13869)

Brevibacterium roseum ATCC13825

Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066

Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240

Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871, ATCC6872

Brevibacterium album ATCC15111

Brevibacterium cerinum ATCC15112

Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354

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Estas cepas pueden obtenerse, por ejemplo, a partir del American Type Culture Collection. A cada cepa se le proporciona un único número de registro que se menciona en el catálogo de la American Type Culture Collection. Las cepas pueden ordenarse utilizando este número de registro. Además, la cepa AJ12340 se depositó el 27 de octubre de 1987 en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (habitualmente, la agencia administrativa independiente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón, código postal: 305-5466), como un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest, y recibió un número de registro FERM BP-1539. La cepa AJ12418 se depositó el 5 de enero de 1989 en el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary como un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest, y recibió un número de registro FERM BP-2205.

A continuación, se explicarán los procedimientos para transmitir a una cepa parental la capacidad para producir un L-aminoácido, tal como se mencionó anteriormente.

Para transmitir la capacidad para producir L-aminoácidos, pueden utilizarse procedimientos convencionalmente utilizados para cultivar una bacteria productora de un L-aminoácido que pertenece al género Escherichia o Coryneform, etc. Por ejemplo, pueden utilizarse procedimientos para obtener una cepa mutante auxotrófica, una cepa análoga resistente, o una cepa mutante reguladora metabólica que tenga la capacidad para producir un L-aminoácido, y procedimientos para crear una cepa recombinante que muestre una potenciación de la actividad de una enzima biosintética de un L-aminoácido ("Amino-acid fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1ª edición, publicado el 30 de mayo de 1986, pág. 77-100). Cuando se crían bacterias productoras de L-aminoácidos utilizando estos procedimientos, pueden transmitirse una o varias propiedades, que incluyen la auxotrofía, resistencia análoga, y mutación reguladora metabólica.

Cuando se crea una cepa recombinante, la actividad de enzimas biosintéticas únicas o múltiples del L-aminoácido, puede potenciarse. Además, los procedimientos que trasmiten la auxotrofía, resistencia análoga, y mutación reguladora metabólica pueden combinarse con procedimientos que potencien una actividad de la enzima biosintética del L-aminoácido.

Una cepa mutante auxotrófica, una cepa análogo-resistente del L-aminoácido, o una cepa mutada de regulación metabólica que posee una capacidad productora de un L-aminoácido, puede obtenerse sometiendo una cepa parental o salvaje a un típico tratamiento mutagénico tal como la irradiación mediante rayos X o rayos ultravioleta, el tratamiento con un agente mutagénico tal como la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Entonces, a partir de las cepas mutadas, puede seleccionarse una cepa mutante una cepa mutante auxotrófica, una cepa análogo-resistente o una cepa mutada de regulación metabólica que posea una capacidad productora de un L-aminoácido.

Los ejemplos de análogos de la L-lisina incluyen la oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), \gamma-metillisina, \alpha-clorocaprolactán, norleucina, etc. Ejemplos de análogos de L-arginina incluyen hidroxamato de arginina, homoarginina, D-arginina, canavanina.

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Los ejemplos específicos de cepas análogo-resistentes de la L-lisina o de cepas mutadas de regulación metabólica que posean capacidad productora de L-lisina incluyen la cepa AJ11442 de Escherichia coli (FERM BP-1543, NRRL B-12185, JP 56-18596A y patente US nº 4.346.170), la cepa VL611 de Escherichia coli (JP 2000-189180A), etc. Además, la cepa WC196 (WO96/17930) puede utilizarse también como una Escherichia coli productora de L-lisina. La cepa WC196 se crió originariamente transmitiendo la resistencia a AEC (S-(2-aminoetil)-L-cisteína) a la cepa W3110, que se deriva de Escherichia coli K-12. La cepa WC196 se denominó como cepa AJ13069 de Escherichia coli, y se depositó en la agencia administrativa independiente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón, código postal:305-8566), el 6 de diciembre de 1994 y recibió un número de registro FERM P-14690. Entonces, el depósito se convirtió a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995, y recibió un número de registro FERM BP-5252.

Los ejemplos de bacterias Corineformes que poseen capacidad para producir L-lisina incluyen cepas mutantes resistentes a S-(2-aminoetil)cisteína (en adelante "AEC") que incluyen Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-11470) (descrita en JP56-1914B, JP56-1915B, JP57-14157B, JP57-14158B, JP57-30474B, JP58-10075B, JP59-4993B, JP61-35840B, JP62-24074B, JP62-36673B, JP5-11958B, JP7-112437B y JP7-112438B), cepas mutantes auxotróficas para un aminoácido tal como L-homoserina (JP48-28078B y JP56-6499B), cepas mutantes resistentes a AEC y auxotróficas para un aminoácido tal como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina, y L-valina (Patentes US nº 3.708.395 y nº 3.825.472), cepas mutantes resistentes que producen L-lisina resistentes a DL-\alpha-amino-\varepsilon-caprolactama, \alpha-amino-laurilactama, análogo del ácido aspártico, sulfamidas, quinoides, y N-laurilleucina, cepas mutantes productoras de L-lisina resistentes al inhibidor de la oxaloacetato decarboxilasa, o un inhibidor enzimático del tracto respiratorio (JP50-53588A, JP50-31093A, JP52-102498A, JP53-9394A, JP53-86089A, JP55-9783A, JP55-9759A, JP56-32995A, JP56-39778A, JP53-43591B y JP53-1833B), cepas mutantes que producen L-lisina auxotróficas para el inositol o el ácido acético (JP55-9784A y JP56-8692A), cepas mutantes productoras de L-lisina que son susceptibles al ácido fluoropirúvico o a una temperatura de 34ºC o superior (JP55-9783A y JP53-86090A), cepas mutantes productoras de L-lisina de las bacterias Brevibacterium o Corynebacterium resistentes al etilenglicol (Patente US nº 4.411.997), etc.

Una capacidad de producir L-aminoácidos puede también transmitirse potenciando la expresión de un gen que codifique una enzima biosintética de un L-aminoácido.

Por ejemplo, una capacidad de producir L-lisina puede transmitirse potenciando la expresión de un gen que codifique la dihidrodipicolinato sintasa y un gen que codifique la aspartoquinasa. Es decir, se prepara un ADN recombinante uniendo un fragmento génico que codifique la dihidrodipicolinato sintasa y un fragmento génico que codifique la aspartoquinasa en un vector, preferentemente un vector multicopia, que puede operarse en el microorganismo huésped que se utiliza para la producción de la L-lisina. Como resultado de la transformación, aumenta en la célula huésped el número de copias del gen que codifica la dihidrodipicolinato sintasa y del gen que codifica la aspartoquinasa, y por tanto, se potencian las actividades de estas enzimas. En adelante, se hará referencia a la dihidrodipicolinato sintasa, a la aspartoquinasa y a la aspartoquinasa III como DDPS, AK y AKIII, respectivamente.

Los genes que codifican DDPS y AK no están particularmente limitados, siempre que codifiquen proteínas que posean actividad DDPS o AK, respectivamente. Los ejemplos de dichos genes incluyen los genes de Escherichia coli, Methylophilus methylotrophus, Corynebacterium glutamicum, etc. Ya que se conocen las secuencias nucleótidas para un gen DDPS, (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)) y para un gen AKIII (lysC, Cassan, M., Parsot C., Cohen, G.N. y Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), estos genes pueden obtenerse mediante PCR utilizando cebadores diseñados basándose en sus secuencias nucleótidas a partir del ADN cromosómico de un microorganismo tal como la cepa K-12 de E. coli. En adelante, un gen que codifique DDPS y un gen que codifique AK se ejemplificarán por dapA y lysC derivados de E. coli, pero los genes que codifican DDPS y los genes que codifican AK no se limitan a dapA y lysC.

Es conocido que la DDPS de tipo salvaje derivada de Escherichia coli está la sometida a inhibición retroactiva por la L-lisina, y que la AKIII de tipo salvaje, derivada de Escherichia coli, está sometida a supresión e inhibición retroactiva por la L-lisina. Por tanto, cuando se utilizan dapA y lysC, resulta preferido utilizar genes mutantes que codifiquen DDPS y AK que sean resistentes a la inhibición retroactiva por la L-lisina. En adelante, a la DDPS con una mutación que se libere de la inhibición retroactiva por la L-lisina, se la puede denominar como "DDPS mutante", y a un ADN que codifique a la mutante DDPS se le puede aludir como "mutante dapA" o "dapA*". A la AKIII derivada de Escherichia coli con una mutación que elimina la inhibición retroactiva por la L-lisina se la puede aludir como "mutante AKIII", y a un ADN que codifique el mutante AKIII se le puede denominar también como "mutante lysC". La DDPS derivada de las bacterias Corynebacterium es originariamente resistente a la inhibición retroactiva por la L-lisina, y por tanto, las DDPS y AK utilizadas para la presente invención no necesariamente necesitan mutar.

Los ejemplos del ADN que codifica al DDPS mutante que es resistente a la inhibición retroactiva por la L-lisina, incluyen un ADN que codifica DDPS que posee una secuencia aminoácida que incluye la sustitución del residuo 118 de histidina por la tirosina (Patentes US nº 5.661.012 y nº 6.040.160). Además, ejemplos del ADN que codifica al mutante AKIII que es resistente a la inhibición retroactiva por la L-lisina incluye un ADN que codifica AKIII que posee la secuencia aminoácida que incluye la sustitución del residuo 352 de la treonina por la isoleucina. (Patentes nº 5.661.012 y nº 6.040.160 ). Puede obtenerse un mutante ADN mediante una técnica de mutagénesis puntual dirigida, utilizando PCR o similar.

El plásmido utilizado para la clonación génica puede ser cualquier plásmido, siempre que pueda replicarse en los microorganismos, y sus ejemplos específicos incluyen pBR322, pTWV228, (Takara Bio), pMW119 (Nippon Gene), pUC19, etc.

Un vector que puede operar en un microorganismo huésped que se utiliza para la transformación, es un plásmido que es autónomamente replicable en las células de dicho microorganismo. Ejemplos específicos de vectores para Escherichia coli incluyen pSTV29 (Takara Bio), RSF1010 (Gene, vol 75 (2), págs 271-288,1989), pUC19, pBR322, pMW119, etc. Asimismo, pueden utilizarse vectores de ADN fágico. El vector para la bacteria Methylophilus, por ejemplo, es un plásmido que puede replicarse autónomamente en las células de la bacteria Methylophilus. Ejemplos específicos de vectores para la bacteria Methylophilus incluyen RSF1010 y sus derivados, tales como pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 16,161-167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53 (1990)), pRF301, y pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)). Los ejemplos de un vector que puede operar en las bacterias Corineformes incluyen pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58-77895A), y pSFK6 (JP2000-262288A). Además, los vectores que se obtuvieron resecando un fragmento de ADN que permite que un plásmido se replique autónomamente en una bacteria Corineforme e insertando este fragmento en vectores para Escherichia coli, pueden utilizarse como vectores denominados lanzadera, que pueden replicarse autónomamente tanto en la bacteria Escherichia coli como en las bacterias Corineformes.

Para preparar un ADN recombinante mediante la unión de dapA y lysC con cualquiera de los vectores anteriormente citados, pueden utilizarse enzimas de restricción para digerir el fragmento de ADN que contiene dapA y lysC y el vector. La unión se lleva a cabo habitualmente utilizando una ligasa tal como la ligasa T4 ADN. dapA y lysC pueden incorporarse a vectores separados o aun vector único. Los procedimientos que pueden utilizarse para la digestión mediante las enzimas de restricción, unión del ADN, preparación del ADN cromosómico, PCR, preparación del ADN plasmídico, transformación, diseño de cebadores oligonucleótidos, etc., pueden ser procedimientos habituales bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos procedimientos se describen en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y etc. Para introducir un ADN recombinante preparado tal como se ha descrito anteriormente en un microorganismo, puede utilizarse cualquier procedimiento, siempre que se alcance una suficiente eficiencia de transformación. Por ejemplo, puede aplicarse la electroporación (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)).

El plásmido de amplio espectro RSFD80 del huésped puede utilizarse (Patente US nº 6.040.160) como el plásmido que contiene un mutante dapA que codifica un mutante DDPS y un mutante lysC que codifica un mutante AKIII. La cepa JM109 de Escherichia coli transformada con RSFD80 se denominó AJ12396 (Patente US nº 6.040.160) y esta cepa se depositó en la agencia administrativa independiente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary el 28 de octubre de 1993 y recibió un número de registro FERM P-13936. Entonces, el depósito se convirtió a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 1 de noviembre de 1994, y recibió un número de registro FERM BP-4859. RSFD80 puede obtenerse a partir de la cepa AJ12396 mediante un procedimiento conocido.

La expresión del gen DDPS y del gen AK puede también potenciarse mediante la integración de copias múltiples de dapA y lysC en un ADN cromosómico de un microorganismo. Para introducir copias múltiples de dapA y lysC en un ADN cromosómico de un microorganismo, la recombinación homóloga puede llevarse a cabo haciendo diana en una secuencia que se encuentra en el ADN cromosómico en múltiples copias. Un ADN repetitivo o una repetición invertida presente en el extremo de un elemento transposón, puede utilizarse como una secuencia que se encuentre en un ADN cromosómico en múltiples copias. Alternativamente, tal como se da a conocer en JP2-109985A, copias múltiples de dapA y/o lysC pueden introducirse en un ADN cromosómico utilizando un transposón. En los dos procedimientos, las actividad de DDPS y AK son potenciadas como resultado del aumento del número de copias de dapA y lysC en las cepas transformadas.

Además de los procedimientos de amplificación génica anteriormente mencionados, la expresión del gen DDPS y del gen AK puede potenciarse también reemplazando secuencias reguladoras de la expresión, tales como promotores de dapA y lysC, con otras (secuencias reguladoras) más intensas (JP1-215280A). Los ejemplos de dichos promotores incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor tac, el promotor P_{R} y el promotor P_{L} del fago lambda, promotor tet, promotor amyE, promotor spac, etc. La inserción de estos promotores de los promotores activos potencia la expresión de dapA y lysC, que dan lugar a la potenciación de la actividad de DDPS y AK. La potenciación de las secuencias reguladoras de la expresión puede combinarse con la amplificación del número de copias de dapA y lysC.

Una capacidad productora de L-lisina puede también transmitirse potenciando la expresión de un gen que codifica una enzima biosintética de la L-lisina distinta que DDPS y AK. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen enzimas de la vía sintética del diaminopimelato tales como la diaminopimelato reductasa, diaminopimelato decarboxilasa, diaminopimelato deshidrogenasa (WO96/40934), fosfoenolpiruvato carboxilasa (JP60-87788A), aspartato aminotransferasa (JP6-102028B), diaminopimelato epimerasa (JP2003-135066A), y aspartato semialdehído deshidrogenasa (WO00/61723). Otros ejemplos de dichas enzimas incluyen enzimas de la vía del aminoadipato tales como la homoaconitato hidratasa (JP2000-157276A), etc. La potenciación de la expresión génica de estas enzimas puede combinarse con la potenciación de la expresión de los genes DDPS y AK.

Además, un microorganismo que posee una capacidad de producir L-lisina, puede obtenerse también reduciendo o eliminando la actividad intracelular de una enzima que cataliza una reacción para sintetizar un compuesto distinto a la L-lisina, y que provienen de la vía biosintética de la L-lisina. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen la homoserina deshidrogenasa y la lisina decarboxilasa. Las cepas en las que las actividades de estas enzimas se reducen o eliminan, se describen en WO95/23864 yWO96/17930.

Los ejemplos de procedimientos para reducir o eliminar la actividad intracelular de una enzima incluyen la mutación o deleción de un gen que codifica la enzima en las células de un microorganismo, de forma que la actividad intracelular se reduzca o elimine cuando se compare con una cepa no mutada. Ejemplos de procedimientos para llevar a cabo una mutación o una deleción de un gen incluyen la modificación de las secuencias reguladoras de la expresión tales como promotores y las secuencias Shine-Delgarno (SD), la introducción de mutaciones sin sentido, mutaciones finalizadoras, o mutaciones por cambio en el marco de lectura en un marco de lectura abierto, y la deleción de una parte del gen (J. Biol. Chem. 1997 272 (13):8611-7). Un gen mutado puede introducirse en un microorganismo utilizando una técnica de recombinación homóloga en la que un gen de tipo salvaje en un cromosoma es reemplazado con el gen mutado, o utilizando un transposón o factor IS. Las técnicas de recombinación homóloga incluyen procedimientos que utilizan ADN lineal, un plásmido sensible a la temperatura, y un plásmido capaz de no replicarse. Estos procedimientos se describen en Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2000, 6 de Junio; 97 (12):6640-5., patentes US nº 6303383, JP05-007491A, y similares.

Los procedimientos de potenciación y reducción de la actividad enzimática biosintética de la L-lisina son aplicables para transmitir una capacidad productora de otros los L-aminoácidos. Los ejemplos específicos de Escherichia coli que tienen la capacidad de producir L-arginina, incluyen cepas mutantes resistentes a \alpha-metilmetionina, p-fluorofenilalanina, D-arginina, hidroxamato de arginina, S-(2-aminoetil) cisteína, \alpha-metilserina, \beta-2-tienilalanina, o sulfaguanidina (JP nº 56-106598A), etc. Además, la cepa 237 de Escherichia coli, que es una bacteria productora de L-arginina, que posee una mutación que transmite resistencia a la inhibición retroactiva por la L-arginina y que muestra una alta actividad de la N-acetilglutamato sintasa, (Solicitud de patente rusa nº 200117677) puede también utilizarse. Esta cepa se depositó en el Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika con un número de VKPM B-7925 el 10 de abril de 2000, y convertido a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 18 de mayo de 2001. La cepa 382 de Escherichia coli, que se deriva de la cepa 237, y posee una capacidad potenciada de la asimilación del acetato, puede utilizarse también (JP2002-017342A). La cepa 382 de Escherichia coli se depositó en el Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), con un número de VKPM B-7926 el 10 de abril de 2000.

Los ejemplos de bacterias Corineformes con capacidad para producir L-arginina incluyen cepas de bacterias Corineformes que no sólo son resistentes a la 2-tiazolalanina, sino que también son auxotróficas para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina, o L-triptófano (JP54-44096A), una cepa de bacteria Corineforme resistente al ácido quetomalónico, ácido fluoromalónico, o ácido monofluoroacético (JP57-18989A), una cepa de bacteria Corineforme resistente al argininol (JP62-24075A), una cepa de bacteria Corineforme resistente a la X-guanidina (X representa un derivado de un ácido graso o una cadena alifática, JP2-186995A), una cepa de bacteria Corineforme resistente al hidroxamato de arginina y al 6-azauracilo (JP57-150381A), una cepa de bacteria Corineforme que es deficiente en ArgR (una proteína represora de las enzimas biosintéticas de la arginina) (JP2002-51790A), etc.

Las actividades de las enzimas biosintéticas para la L-arginina, L-histidina, L-ornitina, y otros L-aminoácidos, pueden potenciarse mediante procedimientos similares a los procedimientos anteriormente mencionados para las enzimas biosintéticas de la L-lisina.

Los ejemplos de enzimas biosintéticas de la L-arginina incluyen uno o más tipos de enzimas seleccionadas a partir de la N-acetilglutamato sintasa (argA), N-acetilglutamil fosfato reductasa (argC), ornitina acetiltransferasa (argJ), N-acetilglutamato quinasa (argB), acetilornitina transaminasa (argD), acetilornitina desacetilasa (argE), ornitina carmaboiltransferasa (argF), argininosuccinato sintasa (argG), argininosuccinato liasa (argH), y carbamoil fosfatosintasa (carAB). Los nombres de los genes que codifican estas enzimas se dan entre paréntesis después de los nombres de las enzimas, respectivamente. Los ejemplos de las cepas en las que se potencian las actividades de estas enzimas incluyen, por ejemplo, las cepas que se describen en JP2000-287693A, JP2000-197490A, JP07-028749B, etc.

Una capacidad de producir la L-arginina puede también transmitirse potenciando la expresión de un gen que codifica la glutamato deshidrogenasa (EP1057893A) o potenciando la actividad de la glutamato sintetasa (US2005-00142236). Se sabe que las enzimas biosintéticas de la L-arginina están reprimidas por la L-arginina, y por tanto, la capacidad de producir L-arginina puede ser también potenciada eficientemente suprimiendo un represor de la arginina o introduciendo una mutación en la N-acetilglutamina sintasa (EP1154020A y EP1170361A), que confiere resistencia a la inhibición retroactiva.

Además, bacterias Bacillus resistentes a un análogo de la histidina o a un análogo del triptófano (JP52-114092A), bacterias Bacillus auxotróficas para, por lo menos, uno o una de (los aminoácidos o de las bases de ácidos nucleicos siguientes): L-metionina, L-histidina, L-treonina, L-prolina, L-isoleucina, L-lisina, adenina, guanina, y uracilo (o precursor de éste) (JP52-99289A), bacterias Bacillus resistentes al hidroxamato de arginina (JP51-6754B), Serratia marcescens auxotróficas para el ácido succínico o resistente a un análogo resistente (JP58-9692A), Serratia marcescens que es deficiente en la capacidad para metabolizar arginina, resistente a un antagonista de la arginina y canavanina, y auxotrófica para la lisina (JP52-8729A), Saccharomyces cerevisiae resistente a arginina, hidroxamato de arginina, homoarginina, D-arginina, canavanina, hidroxamato de arginina y 6-azauracilo (JP53-143288A), Candida tropicalis resistente a la canavanina (JP53-3586A), etc, pueden también utilizarse como cepas productoras de L-arginina.

Ejemplos de las enzimas biosintéticas de la L-histidina incluyen la ATP fosforibosiltransferasa (hisG), fosforibosil AMF ciclohidrolasa (hisI), fosforibosiL-ATP pirofosfohidrolasa (hisIE), fosforibosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribótido isomerasa (hisA), amidotransferasa (hisH), histidinol fosfato aminotransferasa) (hisC), histidinol fosfatasa (hisB), histidinol deshidrogenasa (hisD), etc.

Es conocido que los genes que codifican la enzima biosintética de la L-histidina (hisG, hisBHAFI), son inhibidos por la L-histidina, y por tanto, una capacidad productora de la L-histidina puede también ser potenciada de modo eficiente introduciendo una mutación que confiere resistencia a la inhibición retroactiva en la ATP fosforibosiltransferasa (hisG) (Patentes Rusas nº 2003677 y nº 2119536).

Los ejemplos específicos de microorganismos que tienen capacidad productora de la L-histidina, incluyen cepas FERM-P5030 y 5048 de E. coli que se introdujeron con un vector que transporta un ADN que codifica una enzima biosintética de la L-histidina (JP56-005099A), cepas introducidas con rht, un gen para una exportación de aminoácidos (EP1016710A), cepa 80 de E. coli transmitida con sulfaguanidina, DL-1,2,4-triazoL-3-alanina, y resistencia a la estreptomicina (VKPM B-7270, Patente Rusa nº 2119536, etc.

La vía biosintética de la L-ornitina incluye varias enzimas en común con la vía biosintética de la L-arginina. Ejemplos de enzimas biosintéticas de la L-ornitina incluyen la N-acetilglutamato sintasa (argA), la N-acetilglutamil fosfato reductasa (argC), la ornitina acetiltransferasa (argJ), la N-acetilglutamato quinasa (argB), acetilornitina transaminasa (argD), acetilornitina desacetilasa (argE), etc.

Los ejemplos de bacterias que poseen capacidad para producir L-ornitina incluyen bacterias Corineformes y bacterias Arthrobacter en las que se introdujo una mutación auxotrófica-L-arginina o L-citrulina, (JP02-283290A), la cepa AJ11589 de la bacteria Corineforme resistente a una sustancia activa similar a la vitamina P (FERM-P5644, JP57-016696A), etc.

Ejemplos de microorganismos que poseen capacidad productora de L-treonina incluyen un mutante resistente a la 6-dimetilaminopurina que posee una capacidad para producir L-treonina (JP5-304969A), una cepa en la que un gen para una enzima biosintética de treonina que posee una mutación para potenciar la actividad enzimática, es amplificado con un plásmido (JP1-29559B, JP05-227977A), una cepa en la que el operón de la treonina es amplificado con un plásmido (JP2-109985A), una cepa en la que un gen que codifica la piruvato carboxilasa y un gen que codifica la nicotinamido nucleótido transhidrogenasa son amplificados (JP2002-51787A), etc.

La cepa VKPM B-3996 de Escherichia coli (Patente US nº 5.175.107) puede utilizarse asimismo como una cepa productora de L-treonina. VKPM B-3996 se depositó en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika con un número de registro VKPM B-3996 el 19 de noviembre de 1987. La cepa VKPM B-3996 alberga el plásmido pVIC40 (Publicación de Patente Internacional WO90/04636), que se obtiene insertando un operon de treonina (thrABC) en el plásmido pAYC32 que posee un gen marcador resistente a la estreptomicina (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167). La aspartoquinasa I-homoserina deshidrogenasa I codificada por el gen mutante thrA contenido en pVIC40, es liberada de la inhibición retroalimentadora por la L-treonina.

La cepa VKPM B-5318 de Escherichia coli (EP 0593792B) puede utilizarse también como una cepa productora de L-treonina. VKPM B-5318 se depositó en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (Dirección de VKPM GNII Genetika: Dorozhny proezd 1, Moscow 113545. Rusia), con un número de registro VKPM B-5318 el 3 de mayo de 1990. La cepa VKPM B-5318 es autotrófica para la L-isoleucina, y el operón de la treonina que codifica la enzima biosintética de la treonina se localiza por debajo del represor C1 termosensible, del promotor PR y del extremo N de la proteína Cro derivada del fago \lambda, y además, la cepa alberga el ADN plasmídico construido de forma que la expresión del gen de la biosíntesis de la treonina es regulada por el promotor y el represor derivado del fago \lambda.

Además, la cepa MG442 de Escherichia coli (US nº 4.278.765) puede también utilizarse como una cepa productora de L-treonina. La cepa MG442 se depositó en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) como CMIMB-1628.

Las bacterias que poseen la capacidad para producir L-treonina pueden obtenerse potenciando la actividad de una enzima biosintética de la L-treonina. Ejemplos de genes que codifican enzimas biosintéticas de la L-treonina incluyen un gen de la aspartoquinasa III, un gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, etc. La actividad de una enzima biosintética de la L-treonina, puede potenciarse en una bacteria en la que se reprime la actividad enzimática de la degradación de la treonina. Ejemplos de una bacteria en la que la actividad de una enzima degradante de la treonina se reprime, incluyen la cepa TDH6, que es deficiente en actividad treonina deshidrogenasa (JP2001-346578A).

Las bacterias que poseen la capacidad para producir ácido L-glutámico pueden también obtenerse potenciando la actividad de una enzima biosintética del ácido L-glutámico. Ejemplos de enzimas biosintéticas del ácido L-glutámico incluyen la glutamato deshidrogenasa, glutamina sintetasa, glutamato sintasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato sintasa, piruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvatocarboxilasa, fosfoenolpiravato sintasa, enolasa, fosfogliceromutasa, fosfoglicerato quinasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrognasa, triosafosfato isomerasa, fructosa fifosfato aldolasa, fosfofructoquinasa, glucosa fosfato isomerasa, etc.

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Específicamente, las bacterias que poseen una actividad potenciada de estas enzimas biosintéticas del ácido L-glutámico, incluyan cepas de bacterias Corineformes dadas a conocer en WO00/18935 y JP2000-232890A, y cepas de la familia Enterobacteriáceas dadas a conocer en JP2001-333769A, JP2000-106869A, JP2000-189169A, y JP2000-333769A.

Las bacterias que poseen capacidad para producir ácido L-glutámico pueden obtenerse también reduciendo o eliminando la actividad de una o más enzimas que catalizan una reacción que provoca una derivación de la síntesis del ácido L-glutámico y que da lugar a un compuesto distinto que el ácido L-glutámico. Dichas enzimas incluyen la isocitrato liasa, \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa, fosfato acetiltransferasa, acetato quinasa, acetohidroxi ácido sintasa, acetolactato sintasa, formato acetiltransferasa, lactato deshidrogenasa, glutamato descarboxilasa, 1-pirofosfato deshidrogenasa, etc.

Específicamente, las bacterias en las que una actividad \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa está reducida, incluyen la cepa \Deltas de Brevibacterium lactofermentum que se da a conocer en WO95/34672, la cepa AJ12821 de Brevibacterium lactofermentum (FERM BP-4172), dada a conocer en JP6-237779A, cepas de Escherichia coli dadas a conocer en JP5-244970A, o JP7-203980A, y la cepa de Enterobacter agglomerans dada a conocer en JP2001-333769A.

Los ejemplos de bacterias que poseen la capacidad de producir L-cisteína incluyen la cepa de Escherichia coli en la que la actividad cistationín \beta-liasa está reducida (JP2003-169668A), y una cepa de Escherichia coli (JP11-155571A)o una bacteria Corineforme (JP2002-233384A) en las cuales se libera la inhibición retroalimentadora de la serina acetiltransferasa L-cisteína.

Los ejemplos de bacterias de Escherichia coli que poseen capacidad para producir L-prolina, incluyen la cepa 702 de Escherichia coli (VKPM B-8011), que es resistente a la 3,4-dihidroxiprolina y al azatidín-2-carboxilato, y la cepa 702ilvA (VKPM B-8012) que se obtiene suprimiendo el gen ilvA en la cepa 702 (JP2002-300874A).

Los ejemplos de bacterias de Escherichia que tienen capacidad para producir L-fenilalanina incluyen la cepa AJ12739 de Escherichia coli (tyrA:Tn10,TyrR; VKPM B-8197) en la que los genes tyrA y tyrR están suprimidos, y la cepa NW1089 de Escherichia coli en la que se introduce un pheA mutado (Patente US nº 5.354.672) y la cepa de Escherichia coli en la que los genes yddG y yedA son amplificados (WO 03/044192). Ejemplos de bacterias Corineformes que tienen capacidad para producir L-fenilalanina incluyen una cepa que es auxotrófica para la tirosina y resistente a la L-fenilalaniL-L-tirosina (JP5-49489A).

Las bacterias que poseen capacidad para producir L-triptófano pueden obtenerse potenciando las actividad de las enzimas biosintéticas del L-triptófano, incluyendo la fosfoglicerato deshidrogenasa y la antranilato sintasa. Estas enzimas pueden ser resistentes a la inhibición por retroalimentación mediante el L-triptófano o la L-serina. Por ejemplo, una bacteria que posea estas enzimas resistentes a la retroalimentación, puede obtenerse introduciendo el plásmido pGH5, que contiene un gen mutante serA que codifica la fosfoglicerato deshidrogenasa resistente al L-triptófano, en la cepa SV164 de Escherichia coli que alberga un gen que codifica la antranilato sintasa resistente a la L-serina (WO94/08031).

Pueden obtenerse también bacterias que tengan capacidad para producir L-triptófano potenciando las actividades de las enzimas biosintéticas del L-triptófano, codificadas por el operón del triptófano. Dichas enzimas incluyen la L-triptófano operón triptófano sintasa y la antranilato sintasa. Ejemplos de estas bacterias incluyen una cepa de Escherichia coli en la cual se introduce el operón triptófano que contiene un gen que codifica la antranilato sintasa resistente a la L-serina (JP57-71397A, JP62-244382A, y patente US nº 4.371.614).

Además, los ejemplos de bacterias que poseen capacidad para producir L-triptófano incluyen la cepa AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) de Escherichia coli, auxotrófica para L-fenilalanina y L-tirosina, y la cepa AGX6 (pGX50)aroP (NRRL B-12264) que alberga el plásmido pGX50 que contiene el operón triptófano (Patente US nº 4.371.614).

Los ejemplos de bacterias Escherichia coli que poseen capacidad para producir L-isoleucina incluyen una cepa mutante resistente a la 6-dimetilaminopurina (JP5-304969A), una cepa mutante resistente al L-isoleucinhidroxamato, tiaisoleucina, DL-etionina o argininhidroxamato (JP5-130882A), y una cepa recombinante en la que un gen que codifica la treonina deaminasa y la ácido acetohidroxílico sintasa es amplificado con un plásmido (JP2-458 A, JP2-42988A y JP8-47397A).

Las bacterias que poseen capacidad para producir L-valina, pueden obtenerse potenciando las actividades de las enzimas biosintéticas de la L-valina, incluyendo aquéllas codificadas por el operón ilvGMEDA, especialmente la acetohidroxilato sintasa codificada por el gen ilvG (JP02-748418B). Estas enzimas pueden ser resistentes a la inhibición por retroacción por la L-valina.

Las bacterias que tienen capacidad para producir L-valina pueden ser bacterias en las que la expresión del gen de la acetolactato sintasa III (gen ilvIH) disminuye.

Las bacterias que poseen la capacidad de producir L-valina pueden ser resistentes a análogos de aminoácidos. Los ejemplos de dichas bacterias incluyen una cepa mutante que es auxotrófica para la L-isoleucina y la L-metionina y es resistente a la D-ribosa, purín nucleósido, o pirimidina ribonucleósido (FERM P-1841, P-5556; JP53-025034A), y una cepa mutante resistente al policetonoide (FERM P-9325; JP04-045314B).

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Los ejemplos de bacterias que poseen capacidad para producir L-alanina incluyen una cepa de bacterias Corineforme que es deficiente en actividad H^{+} - ATPasa (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001 Nov; 57(4):534-40) o una cepa de bacterias Corineformes en la cual el gen de la ácido aspártico \beta-descarboxilasa está amplificado (JP07-163383A).

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Potenciación de la expresión del gen ybjE

El microorganismo de la presente invención puede obtenerse modificando un microorganismo que posea la capacidad de producir un L-aminoácido tal como se ha descrito anteriormente, de forma que la expresión del gen ybjE sea potenciada. Alternativamente, la expresión del gen ybjE puede potenciarse en primer lugar, seguido por la transmisión de la capacidad de producir un L-aminoácido.

La expresión del gen ybjE puede potenciarse potenciando la expresión del gen endógeno yjbE, modificando una secuencia reguladora de la expresión tal como un promotor, o introduciendo exógenamente el gen ybjE utilizando un plásmido o similar. Estas técnicas pueden combinarse.

La potenciación de la expresión del gen ybjE puede confirmarse midiendo la cantidad de ARN por la expresión del gen ybjE en la bacteria de la presente invención mediante hibridización northern o RT-PCR (Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001, y comparándola con la de un tipo salvaje o la de una cepa no modificada. La expresión del gen ybjE en el microorganismo de la presente invención se potencia más que la de una cepa no modificada o de tipo salvaje, y preferentemente, de forma no inferior a 1,5 veces, más preferentemente de forma no inferior a 2 veces, y muy preferentemente de forma no inferior a 3 veces que la de una cepa de tipo salvaje o no modificada.

El gen ybjE puede ser de Escherichia coli o de un homólogo suyo. Ejemplos del gen ybjE de Escherichia coli incluyen un gen que codifica una proteína que posee una secuencia aminoácida de los aminoácidos n^{os} 17 a 315 en SEC ID nº:2, preferentemente un gen que tiene una secuencia nucleótida de los nucleótidos n^{os} 49 a 948 en SEC ID nº1. Aunque el codón para Val en posición 1 en la secuencia aminoácida de SEC ID nº:2 es gtg, puede traducirse como Met, y la proteína codificada por el gen ybjE puede ser una proteína que tiene una secuencia aminoácida de SEC ID nº:2 (1 a 315). En tal caso, es preferible la utilización del ADN que contenga la secuencia nucleótida de los nucleótidos números 1 a 948 de SEC ID nº:1. Sin embargo, se entiende claramente a partir de los Ejemplos que un microorganismo que puede utilizarse para el procedimiento de producción de la presente invención, puede obtenerse utilizando un ADN que contenga la secuencia nucleótida SEC ID nº:1 (49 a 948), a pesar de lo cual, el residuo aminoácido es el codón de inicio de la traducción.

Un homólogo del gen ybjE de Escherichia coli se refiere a un gen que muestra una alta similitud estructural para con el gen ybjE de Escherichia coli y potencia la capacidad exportadora del L-aminoácido o la resistencia del L-aminoácido y la capacidad productora del L-aminoácido del microorganismo huésped. Los ejemplos del homólogo del gen ybjE incluyen un gen que codifica una proteína que tiene una secuencia aminoácida de SEC ID nº:9 o nº:10. La secuencia aminoácida de SEC ID nº:9 es una secuencia que se conserva entre la proteína YbjE de Escherichia coli (SEC ID nº:2) y la proteína YbjE de la cepa LT2 de Salmonella typhimurium. La secuencia aminoácida de SEC ID nº: 10 es una secuencia que se conserva entre la proteína YbjE de Escherichia coli y la proteína YbjE de la cepa CO92 YPO1361 de Yersinia pestis.

El homólogo del gen ybjE puede ser un gen que codifique una proteína que presente una homología del 70% o más, preferentemente del 80% o más, más preferentemente del 90% o más, más preferentemente del 95% o más, particularmente con preferencia del 98% o más, hasta la secuencia aminoácida total de SEC ID nº:2 o (hasta) la secuencia aminoácida de los aminoácidos n^{os} 17 a 315 en SEC ID nº2, y con capacidad de exportación de L-aminoácidos. Ejemplos de un homólogo del gen ybjE incluyen también una proteína con una secuencia aminoácida de SEC ID nº:9 o nº:10 y que posee capacidad de exportación del L-aminoácido. La homología de la secuencia aminoácida y de la secuencia del ADN puede determinarse utilizando el algoritmo BLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, y 5873 (1993)) y FASTA (Methods Enzymol., 183, y 63 (1990), por Karlin y Altschul. El programa denominado BLASTN y BLASTX se desarrolla basándose en este algoritmo BLAST. (Referencia en http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Pueden utilizarse genes ybjE derivados de un microorganismo distinto que E. coli y que incluyen un gen derivado de la 2ª cepa 2457T de Shigella flexneri, que posee una secuencia complementarla a los nucleótidos n^{os} 275793 a 276692 o 275793 a 276740 del nº de registro AE016980 de GenBank, un gen derivado de la cepa LT2 de Salmonella typhimurium, que tiene una secuencia complementarla a los nucleótidos n^{os} 97 a 996 del nº AE008740 de registro de GenBank, y un gen derivado de la cepa CO92 de Yersinia pestis que posee una secuencia complementarla a los nucleótidos n^{os} 197812 a 198708 del nº AJ414147 de registro de GenBank. Además, puede clonarse un gen ybjE de una bacteria Corineforme tal como Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium lactofermentum, de una bacteria Pseudomonas tal como Pseudomonas aeruginosa, de una bacteria Mycobacterium tal como Mycobacterium tuberculosis o similares, basándose en la homología con los genes, tal como anteriormente se ejemplificó.

Además, el gen ybjE de la presente invención no se limita a un gen de tipo salvaje, sino que puede ser un mutante o un gen modificado artificialmente que codifica una proteína que posee una secuencia aminoácida de SEC ID nº:2, y una secuencia aminoácida de los aminoácidos n^{os} 17 a 315 en SEC ID nº:2. La proteína codificada puede incluir sustituciones, deleciones o inserciones, de uno o de los diversos residuos aminoácidos, en una o más de las posiciones, siempre que se conserve la función de la proteína codificada YbjE, principalmente, la capacidad exportadora de la L-lisina. Aunque el número de "varios" residuos aminoácidos a los que se alude en la presente memoria difiere, dependiendo de las posiciones en la estructura tridimensional o en los tipos de residuos aminoácidos, pueden ser de 2 a 20, preferentemente de 2 a 10, más preferentemente de 2 a 5. La sustitución de los aminoácidos es preferentemente una sustitución conservada, incluyendo la sustitución de Ser o Thr por Ala, la sustitución de Gln, His o Lys por Arg, la sustitución de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn, la sustitución de Asn, Glu, o Gln por Asp, la sustitución de Ser o Ala por Cys, la sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln, la sustitución de Gly, Asn, Gln, Lys o Asp por Glu, la sustitución de Pro por Gly, la sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His, la sustitución de Leu, Met, Val o Phe por Ile, la sustitución de Ile, Met, Val o Phe por Leu, la sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys, la sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met, la sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe, la sustitución de Thr o Ala por Ser, la sustitución de Ser o Ala por Thr, la sustitución de Phe o Tyr por Trp, la sustitución de His, Phe o Trp por Tyr, y la sustitución de Met, Ile o Leu por Val. La sustitución, deleción, o inserción, de uno o varios nucleótidos, tal como se describe anteriormente, incluye también una mutación que se produce naturalmente, que proviene de diferencias individuales, y diferencias en las especies de microorganismos que albergan el gen ybjE (mutante o variante).

Dichos genes pueden obtenerse modificando una secuencia nucleótida que se muestra en SEC ID nº:1, o una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49 a 948 en SEC ID nº:1, mediante, por ejemplo, mutagénesis específica puntual, de forma que una o más sustituciones, deleciones, o inserciones se introduzcan en un sitio específico de la proteína codificada por el gen.

Ejemplos del gen ybjE que posee una mutación en la secuencia de SEC ID n:1, incluyen el gen ybjE que tiene una secuencia de SEC ID nº:1 en la cual el nucleótido (guanina) en la posición 3ª es reemplazado por la adenina.

Además, dichos genes pueden también obtenerse mediante tratamientos de mutagénesis convencional, tales como los que se mencionan a continuación. Ejemplos de tratamientos de mutagénesis incluyen el tratamiento de un gen que posee la secuencia nucleótida que se muestra en SEC ID nº:1, o una secuencia nucleótida de nucleótidos n^{os} 49 a 948 en SEC ID nº:1 in vitro con hidroxilamina, y tratando un microorganismo tal como la bacteria Escherichia coli que alberga el gen con irradiación de rayos ultravioleta o con un agente mutagénico que se utilice en un típico tratamiento mutacional, tal como la N-metiL-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o la EMB (etilmetanosulfonato). Puede confirmarse si estos genes codifican una proteína que posea capacidad exportadora de un L-aminoácido, mediante, por ejemplo, expresando estos genes en una célula apropiada y determinando si aumenta la cantidad del L-aminoácido exportado al medio. Puede confirmarse si estos genes confieren resistencia del L-aminoácido a un microorganismo huésped introduciendo los genes en un microorganismo huésped, cultivando éste en presencia de altas concentraciones del L-aminoácido, y comparando el desarrollo del microorganismo al de una cepa de control.

El gen ybjE incluye también un ADN que puede hibridizarse bajo condiciones estrictas con una secuencia nucleótida de SEC ID n:º1, una secuencia nucleótida de los nucleótidos n^{os} 49 a 848 en SEC ID nº:1, o una sonda preparada a partir de estas secuencias, y que codifica una proteína que posee capacidad exportadora del L-aminoácido. "Condiciones estrictas" tal como se utiliza en la presente memoria, son condiciones bajo las cuales se forma un así denominado híbrido específico, no formándose un híbrido no específico. Es difícil expresar claramente esta condición, utilizando cualquier valor numérico. Sin embargo, los ejemplos de condiciones estrictas incluyen aquéllas bajo las cuales los ADN que presentan una alta homología entre ellos, por ejemplo, ADN que muestren una homología no menor que del 50%, se hibridicen entre ellos, y ADN que muestren una homología inferior al 50%, no se hibridicen entre ellos, y aquéllas (condiciones) bajo las cuales hibridizan los ADN entre ellos con una concentración salina y con un lavado típico de la hibridización Southern, es decir, lavando una vez o preferentemente 2-3 veces bajo 1 x SSC, SDS al 0,1% a 6ºC, preferentemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 6ºC, más preferentemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 68ºC.

La expresión del gen ybjE puede potenciarse, por ejemplo, aumentando el número de copias del gen ybjE en las células que utilizan técnicas de recombinación genética Por ejemplo, puede prepararse un ADN recombinante uniendo un fragmento génico que contiene el gen ybjE a un vector, preferentemente un vector multicopia, que puede replicar en el microorganismo huésped, e introducir el vector resultante en el microorganismo huésped.

Cuando se utiliza el gen ybjE de Escherichia coli, puede obtenerse, mediante, por ejemplo, el procedimiento PCR (reacción en cadena de la polimerasa, referencia: White T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), utilizando cebadores que se han diseñado basándose en una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1, por ejemplo, cebadores que tienen una secuencia, cada uno, de SEC ID n^{os}:5 ó 6, y utilizando como matriz ADN cromosómico de Escherichia coli. El gen ybjE de otros microorganismos puede también utilizarse, y puede obtenerse a partir de su ADN cromosómico o su biblioteca del ADN cromosómico mediante PCR, utilizando cebadores oligonucleótidos diseñados basándose en una secuencia de su gen ybjE o de una secuencia homóloga suya o la proteína YbjE de distintas especies de microorganismos, o mediante hibridización, utilizando una sonda oligonucleótida preparada basándose en dicha información secuencial. Puede prepararse un ADN cromosómico a partir de un microorganismo que sirve como un donador de ADN, mediante, por ejemplo, el procedimiento de Saito y Miura (referencia: H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, editado por Society for Bioscience and Bioengineering, Japón, págs 97-98, Baifukan, 1992).

Entonces, el gen ybjE se une a un ADN vectorial que puede operar en el microorganismo huésped para preparar un ADN recombinante. Preferentemente, se utilizan vectores autónomamente replicables en el microorganismo huésped.

Los ejemplos de vectores autónomamente replicables en Escherichia coli incluyen pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG y pACYC están disponibles en Takara Bio), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW está disponible en Nippon Gene), etc.

Los ejemplos de vectores que son autónomamente replicables en las bacterias Corineformes incluyen pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58-77895A), pVK7 (US2003-0175912) y pSFK6 (JP2000-262288A). Además, puede utilizarse asimismo un vector autónomamente replicable denominado "lanzadera" tanto en Escherichia coli como en las bacterias Corineformes.

Los ejemplos de vectores autónomamente replicables en las bacterias Methylophilus incluyen RSF1010, y sus derivados, tales como pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, págs 161-167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, p.53 (1990)), pRK301, y pTB70 (Nature, 287, 396 (1980)).

Para preparar un ADN recombinante uniendo el gen ybjE y cualquiera de los vectores anteriormente mencionados, el vector y un fragmento que contiene el gen ybjE son digeridos mediante enzimas de restricción y se unen, utilizando habitualmente una ligasa tal como una T4 ADN ligasa.

Para introducir un ADN recombinante preparado en un microorganismo, tal como se ha descrito anteriormente, puede utilizarse cualquier procedimiento de transformación conocido del que se haya informado. Por ejemplo, tratando las células receptoras con cloruro cálcico de forma que aumente la permeabilidad del ADN, que se ha informado que puede utilizarse para Escherichia coli (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), y utilizando células competentes preparadas a partir de células en crecimiento para introducir un ADN, que se ha informado (que también puede utilizarse) para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. y Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977). Además de estos procedimientos, puede utilizarse la introducción de un ADN recombinante en células receptoras de tipo protoplástico o esferoplástico, pudiendo aplicarse lo que se ha informado en Bacillus subtilis, actinomicetos, y levaduras ((Chang, S. y Choen, S.N., Molec. Gen. Genet, 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. y Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. y Fink, G.R., Proc. Natl. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). Además, la transformación de las bacterias Corineformes puede llevarse asimismo a cabo mediante el procedimiento de impulsos eléctricos (Sugimoto et al., JP2-207791A).

El número de copias del gen ybjE puede aumentarse también integrando copias múltiples del gen en un ADN cromosómico de un microorganismo. Para integrar copias múltiples del gen ybjE en un ADN cromosómico de un microorganismo, puede llevarse a cabo una recombinación homóloga dirigiendo, a un ADN cromosómico, una secuencia que existe en copias múltiples. Puede utilizarse ADN repetitivo y repeticiones invertidas en el extremo de un transposón, como secuencia en la que existen copias múltiples en un ADN cromosómico. Alternativamente, tal como se expone en JP2-109985A, es también posible incorporar el gen ybjE a un transposón, y permitir que sea transferido de forma que múltiples copias del gen se integren en el ADN cromosómico. La integración del gen ybjE en el cromosoma puede confirmarse mediante hibridización Southern utilizando una sonda que posea una secuencia parcial del gen ybjE.

La potenciación de la expresión del gen ybjE puede también obtenerse reemplazando una secuencia reguladora de la expresión, que incluye un promotor del gen ybjE, en un ADN cromosómico o en un plásmido con uno más potente, tal como se describe en WO00/18935, amplificando un factor regulador que aumenta la expresión del gen ybjE, o eliminando o atenuando un factor regulador que reduce la expresión del gen ybjE. Por ejemplo, el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, etc., se conocen como promotores potentes. Además, también es posible introducir varias sustituciones nucleótidas en una región promotora para el gen ybjE, de forma que el promotor sea más potente. Un procedimiento para evaluar la potencia del promotor y ejemplos de promotores potentes se dan a conocer en Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128). Además, se sabe que una secuencia espaciadora entre el sitio de unión al ribosoma (RBS) y el codón de iniciación de la traducción, especialmente, de varios nucleótidos justamente por encima del codón de iniciación, posee una gran influencia en la eficiencia de la traducción. Entonces, esta secuencia puede modificarse. Las secuencias reguladoras de la expresión del gen ybjE pueden identificarse utilizando un vector para la identificación del promotor, o un programa de análisis genético tal como GENETYX.

La expresión del gen ybjE es potenciada por dicha sustitución o modificación de un promotor. La sustitución de una secuencia reguladora de la expresión puede también alcanzarse mediante, la utilización, por ejemplo, de un plásmido termosensible. Ejemplos de un plásmido termosensible para las bacterias Corineformes incluyen p48k y pSFKT2 (JP2000-262288A), pHSC4 (referencia a las Publicaciones de Patente Francesa sometidas a examen nº 2667875, 1992 y JP5-7491A), etc. Estos plásmidos pueden replicarse autonómamente, por lo menos, a una temperatura de 25ºC, pero no pueden replicarse autónomamente a una temperatura de 37ºC en las bacterias Corineformes. La modificación de la secuencia reguladora de la expresión puede combinarse con el aumento en el número de copias del gen ybjE.

Para potenciar la actividad de la proteína codificada por el gen ybjE, puede introducirse en el gen ybjE mutación que aumenta la capacidad exportadora del L-aminoácido. Ejemplos de una mutación que aumente la actividad de la proteína codificada por el gen ybjE (proteína YbjE)), incluye una mutación en una secuencia promotora que aumenta la transcripción del gen ybjE y una mutación en la región codificante del gen ybjE que aumenta la actividad específica de la proteína YbjE.

El microorganismo de la presente invención es preferentemente uno en el que la capacidad exportadora del L-aminoácido se potencia, debido a una modificación que da lugar a un aumento en la expresión del gen ybjE. La frase "capacidad exportadora del L-aminoácido se potencia" que se utiliza en la presente memoria, significa que cuando se cultiva un microorganismo que se ha modificado para potenciar la expresión del gen ybjE, la cantidad que se exporta al medio del L-aminoácido por el microorganismo supera a la del L-aminoácido exportado a partir de una cepa no modificada, tal como una cepa parental o una correspondiente cepa salvaje. El aumento en la capacidad exportadora del L-aminoácido se observa determinando el aumento en la concentración del L-aminoácido en el medio. Además, el aumento en la capacidad exportadora del L-aminoácido se observa también determinando la disminución en la concentración intracelular del L-aminoácido después de la introducción del gen ybjE en el microorganismo. La cantidad del L-aminoácido que se exporta a partir del microorganismo de la presente invención aumenta preferentemente en un 10% o más, más preferentemente en un 30% o más, y de modo preferido, particularmente, en un 50% o más, cuando se compara con la cantidad del L-aminoácido que se exporta a partir de una cepa no modificada. Además, el aumento en la capacidad exportadora del L-aminoácido también se observa en términos de una disminución en la concentración intracelular del L-aminoácido, después de la introducción del gen ybjE en un microorganismo. Por ejemplo, la concentración intracelular de un L-aminoácido puede medirse de la forma siguiente: se añade a un medio que contiene células microbianas, una cantidad apropiada de aceite de silicio que posee una gravedad específica de 1,07, recuperándose las células a partir del medio mediante centrifugación, preferentemente a 12.000 rpm durante 2 minutos. Entonces, se trataron las células con ácido perclórico al 22% (A. Ishizaki et al. Biotech. Teqniq. (1995) Vol 9, nº 6, pág 409). Utilizando las células así preparadas, puede medirse una concentración intracelular de un L-aminoácido. Además, la "capacidad exportadora del L-aminoácido" puede examinarse indirectamente midiendo la absorción celular del L-aminoácido marcado radioactivamente, utilizando vesículas membranosas evertidas (J. Biol. Chem. Vol. 277, número 51, 49841-49849). Por ejemplo, se preparan vesículas membranosas evertidas a partir de células en las que se introduce el gen ybjE. Entonces, se añaden a las vesículas el ATP u otros sustratos que proporcionan energía conductora, midiéndose la absorción celular del L-aminoácido marcado. Alternativamente, la "capacidad exportadora del L-aminoácido" puede examinarse midiendo, en las células activas, la tasa de la reacción de intercambio entre un aminoácido no marcado y un aminoácido marcado.

Además, el microorganismo de la presente invención es preferentemente uno que resulte más resistente a un L-aminoácido o a un análogo de L-aminoácido, debido a una modificación que da lugar a una potenciación de la expresión del gen ybjE. Es decir, el microorganismo de la presente invención es preferentemente un microorganismo que puede desarrollarse en presencia de un L-aminoácido o de un análogo de L-aminoácido a una concentración en la que la cepa no modificada no puede desarrollarse. El desarrollo celular en presencia del L-aminoácido o del análogo del L-aminoácido puede confirmarse en un medio mínimo que contiene altas concentraciones del L-aminoácido o del análogo del L-aminoácido, por ejemplo, 0,3 g/l o superior. La resistencia al L-aminoácido o al análogo del L-aminoácido de la cepa potenciada del gen ybjE puede confirmarse midiendo el desarrollo de la cepa en un medio mínimo que contenga altas concentraciones del L-aminoácido o del análogo del L-aminoácido, y comparando al desarrollo de una cepa parental o de una cepa no modificada. El procedimiento que consiste en comparar el desarrollo incluye un procedimiento de comparar una densidad óptica de 580-660 nm de un medio en el que cada cepa se está desarrollando. La concentración de un L-aminoácido o de un análogo del L-aminoácido que se ha añadido a un medio, no está particularmente limitada, siempre que inhiba el desarrollo de una cepa no modificada, preferentemente, no menos que 0,3 g/l. Por ejemplo, el clorhidrato de L-lisina se añade a 80 g/l, el clorhidrato de L-arginina se añade a 90 g/l, el clorhidrato de L-ornitina se añade a 45 g/l, el clorhidrato de L-histidina se añade a 30 g/l, la L-isoleucina se añade a 12 g/l, la L-treonina se añade a 40 g/l, el L-glutamato monosódico se añade a 15 g/l, la L-fenilalanina se añade a 8 g/l, la L-prolina se añade a 85 g/l, y la L-cisteína se añade a 0,3 g/l.

El microorganismo de la presente invención puede ser uno que resulte más resistente a la L-lisina o a un análogo de la L-lisina, debido a la modificación que da lugar a una potenciación de la expresión del gen ybjE. Ejemplos de análogos de la L-lisina incluyen oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), \gamma-metillisina, \alpha-clorocaprolactama, etc., pero no se limitan a éstos. La resistencia a la L-lisina puede confirmarse del mismo modo que la resistencia al L-aminoácido o al análogo del L-aminoácido anteriormente mencionada.

El microorganismo de la presente invención puede ser uno que se haya vuelto más resistente a la L-arginina o a un análogo de L-arginina, debido la modificación que da lugar a la potenciación de la expresión del gen ybjE. Los ejemplos de análogos de la L-arginina incluyen hidroxamato de arginina, homoarginina, D-arginina, canavanina, etc. La resistencia a la L-arginina o al análogo de L-arginina puede confirmarse de la misma forma que la resistencia al L-aminoácido o al análogo de éste anteriormente mencionada.

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<2> Procedimiento para producir un L-aminoácido

El procedimiento de producción de la presente invención comprende el cultivo del microorganismo de la presente invención en un medio para producir y provocar la acumulación del L-aminoácido en el medio o en las células del microorganismo, y la recuperación del L-aminoácido a partir del medio o de las células.

El medio que va a utilizarse en la presente invención puede seleccionarse a partir de los bien conocidos medios que se utilizan convencionalmente para producir la fermentación de los L-aminoácidos utilizando microorganismos. Es decir, puede utilizarse un medio habitual que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, y si es necesario, otros ingredientes orgánicos. Como fuente de carbono, pueden utilizarse sacáridos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, galactosa, fructosa, o hidrolizado de almidón, alcoholes tales como glicerol o sorbitol, o ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico, o ácido succínico. Como fuente de nitrógeno, pueden utilizarse sales inorgánicas de amonio, tales como sulfato amónico, cloruro amónico, o fosfato amónico, nitrógeno orgánico tal como hidrolizado de proteínas de soja, gas amoníaco, amoníaco acuoso, etc. Es deseable añadir sustancias tales como vitamina B_{1} y L-homoserina, extracto de levadura, etc., al medio, en cantidades apropiadas como nutrientes traza orgánicos. Además de los anteriores, se añaden en pequeñas cantidades, si es necesario, fosfato potásico, sulfato magnésico, iones de hierro, iones de manganeso, etc. El medio utilizado para la presente invención puede ser un medio natural o un medio sintético, siempre que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, y si es necesario, otros ingredientes orgánicos.

El cultivo se lleva a cabo preferentemente bajo condiciones aeróbicas durante 1 a 7 días. La temperatura del cultivo se controla preferentemente entre 24ºC y 37ºC, y el pH se controla preferentemente entre 5 y 9 durante el cultivo. Pueden utilizarse sustancias inorgánicas u orgánicas, ácidas o alcalinas, así como gas amoníaco etc., para ajustar el pH. Pueden recuperarse habitualmente L-aminoácidos a partir del medio líquido de fermentación mediante técnicas bien conocidas, tales como utilizando resinas de intercambio iónico, precipitación, y otras técnicas. Cuando un L-aminoácido se acumula en las células, por ejemplo, las células pueden fragmentarse mediante ultrasonidos, pudiéndose eliminar mediante centrifugación las células fragmentadas, y el L-aminoácido puede recuperarse a partir del sobrenadante obtenido, utilizando una resina iónica de intercambio o similar.

Si el metanol se utiliza como la principal fuente de carbono en el procedimiento de producción de la presente invención, el coste disminuye, y por tanto, microorganismos tales como bacterias Methylophilus y Methylobacillus, que poseen capacidad para asimilar el metanol, resultan preferidos. En este caso, el cultivo puede realizarse según un procedimiento de cultivo que es típico para un microorganismo que asimila el metanol (referencia a, por ejemplo, WO00/61723, JP2001-120269A, etc.). Cuando el cultivo se lleva a cabo utilizando metanol como la principal fuente de carbono, el metanol se añade preferentemente al medio a una concentración de 0,001 al 30%. Para el cultivo de un microorganismo que asimile el metanol, el sulfato amónico, y etc., se añaden preferentemente al medio, utilizándose como una fuente de nitrógeno. Además, los componentes en cantidades traza tales como fosfato potásico, fosfato sódico, sulfato magnésico, sulfato ferroso, y sulfato de manganeso, se añaden preferentemente en pequeñas cantidades.

El cultivo de un microorganismo que asimile el metanol se lleva a cabo preferentemente bajo condiciones aeróbicas con agitación o agilación para aireación, a un pH de 5 a 9, y a una temperatura de 20 a 45ºC, habitualmente durante 24 a 120 horas. Los L-aminoácidos pueden recuperarse a partir del cultivo combinando técnicas bien conocidas, como las resinas de intercambio iónico, precipitación y otras. La recuperación de los L-aminoácidos a partir de las células puede realizarse de la misma forma en que se ha mencionado anteriormente.

Ejemplos

A continuación, la presente invención se explicará con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. Los reactivos que se utilizan en los ejemplos siguientes se obtuvieron de Wako Pure Chemicals o de Nakarai Tesque, si no se indica de otro modo. La composición del medio utilizado en cada ejemplo se muestra a continuación, y el pH se ajustó con NaOH o HCl para la totalidad de los medios.

Medio L:

1

Éstos se sometieron a esterilización con vapor a 120ºC durante 20 minutos.

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2

Éstos se sometieron a esterilización con vapor a 120ºC durante 20 minutos.

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Medio mínimo: (siguiendo Molecular Cloning, Vol 3)

3

4

Después de rellenar hasta 1 l, se sometieron a esterilización al vapor a 115ºC durante 10 minutos, añadiéndose L-lisina en un tiempo apropiado.

5

Éstos se sometieron a esterilización con vapor a 115ºC durante 10 minutos.

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Medio de producción de L-lisina para bacterias Escherichia:

6

El pH se ajustó a 7,0 con hidróxido de potasio, y los componentes se sometieron a esterilización con vapor a 115ºC durante 10 minutos, excepto la glucosa y el MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O, que se esterilizaron separadamente. Como antibiótico se añadieron 50 mg/l de cloranfenicol.

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Medio de producción de L-arginina para la bacteria Escherichia coli:

7

El pH se ajustó a 7,2 con hidróxido de potasio, y los componentes se sometieron a esterilización con vapor a 115ºC durante 10 minutos, excepto la glucosa y el MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O, que se esterilizaron separadamente. Como antibiótico se añadieron 50 mg/l de cloranfenicol.

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Medio de producción de L-lisina para bacterias Methylophilus (medio SEII):

8

Los componentes distintos al metanol se sometieron a esterilización con vapor a 121ºC durante 15 minutos, y se añadió el metanol después de que los componentes se hubieran enfriado convenientemente. Este medio se preparó tomando como referencia el Journal of General Microbiology (1989) 125, 135, 3153-3164, Silman N.J., Carver M.A. & Jones C.W. En vez de sulfato amónico, se utilizaron 1,18 g de acetamida, añadiéndose cloruro cálcico a una concentración de 72 mg/l.

10

Los componentes distintos al metanol se sometieron a esterilización con vapor a 121ºC durante 15 minutos, y se añadió el metanol después de que los componentes se hubieran enfriado convenientemente.

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Medio CM2S para bacterias Corineformes:

11

El pH se ajustó a 7,2 con hidróxido de potasio, y los componentes se sometieron a esterilización con vapor a 120ºC durante 30 minutos. Cuando el medio se utilizó para el cultivo en placas, se añadieron 20 g/l de agar.

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Medio de producción de L-lisina para bacterias Corineformes:

12

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El pH se ajustó a 7,5 con hidróxido de potasio, y los componentes se sometieron a esterilización con vapor a 115ºC durante 10 minutos, excepto la glucosa y el MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, que se esterilizaron separadamente.

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Ejemplo 1 Cribado del gen exportador de la L-lisina

La búsqueda para un gen de exportación de la L-lisina se llevó a cabo de la siguiente forma:

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<1-1> Construcción de la cepa de Escherichia coli en la cual se introduce la biblioteca plasmídica

Se extrajo ADN cromosómico de forma convencional de una cepa obtenida suprimiendo lysA (gen de la diaminopimelato descarboxilasa) en la cepa MG1655 (ATCC 47076). Fragmentos de 2 a 4 kbp obtenidos mediante digestión parcial del ADN cromosómico con la enzima de restricción Sau3AI, se introdujeron en cada uno de los vectores pTWV229 (Takara Bio), pSTV28 (Takara Bio), y pMW118 (Nippon Gene), todos los cuales fueron digeridos con BamHI por adelantado, y por tanto, obteniéndose de este modo las bibliotecas plasmídicas. Cada una de estas bibliotecas plasmídicas se introdujo en cada cepa MG1655 mediante electroporación.

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<1-2> Cribado del gen de resistencia a la L-lisina

Las cepas MG1655 en las que se introdujeron las bibliotecas plasmídicas se seleccionaron en el medio L, basándose en la resistencia a la ampicilina para la cepa en la que se introdujo pTWV229, en la resistencia al cloranfenicol para la cepa en la que se introdujo pSTV28, y en la resistencia a la ampicilina en la que se introdujo pMW118. Se obtuvieron en total aproximadamente 80.000 colonias transformadas. Estos transformantes se sembraron en el medio mínimo que contenía 60 g/l de clorhidrato de lisina, sobre el cual la cepa MG1655 puede formar muy pocas colonias, si es que forma alguna.

Después de cultivar a 37ºC durante 36 horas, a aproximadamente 50 colonias que aparecieron en el medio conteniendo una alta concentración de lisina, se seleccionaron como cepas candidatas resistentes a la lisina. Para determinar las secuencias insertadas en los vectores de las cepas candidatas a resistentes a la lisina, se llevó a cabo una PCR utilizando oligonucleótidos sintéticos que poseían una secuencia de SEC ID: nº 3 (M13 por delante del cebador), y de SEC ID nº: 4 (M13 cebador inverso), que son complementarias a la secuencia de ADN que se localiza alrededor del sitio de multiclonación del plásmido, determinándose las secuencias de los fragmentos amplificados.

Como resultado de la determinación de las secuencias nucleótidas, se descubrió que casi todos los fragmentos contenían ybjE, localizado en los números 913181 a 914128, en las cepas resistentes a la L-lisina.

Se analizó la secuencia aminoácida predicha de la secuencia del gen ybjE. Cuando la secuencia de la proteína se analizó con respecto a las propiedades hidrofóbicas, se encontró que la proteína es muy hidrofóbica. Por tanto, se sugirió que la proteína codificada por ybjE era una proteína de la membrana que podría estar implicada en la exportación aminoácida.

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Ejemplo 2 Efecto de la amplificación del gen ybjE en Escherichia coli <2-1> Construcción de un plásmido para la amplificación de ybjE y su introducción en Escherichia coli

Entonces, para estudiar el efecto de amplificación del gen ybjE, se construyó un vector para amplificar ybjE y se introdujo en MG1655. Se ha informado de la secuencia nucleótida total del cromosoma de Escherichia coli (cepa K-12 de Escherichia coli) (Science, 277, 1453-1474 (1997), y por tanto, el oligonucleótido sintético de SEC ID nº:5, que posee una secuencia complementarla a la secuencia de los nucleótidos n^{os} 4085 a 4104 del nº de registro AE000189 de GenBank, y el oligonucleótido sintético de SEC ID nº 6, que corresponde a la secuencia de los nucleótidos números 2689 a 2708 de la misma secuencia nucleótida, se prepararon basándose en la secuencia nucleótida del gen ybjE de la que se informó en la literatura anteriormente mencionada y que se utilizó como el cebador del extremo 5' y el cebador del extremo 3', respectivamente, para llevar acabo la PCR. El ADN cromosómico de la cepa MG1655 de Escherichia coli se utilizó como una matriz.

El producto PCR obtenido se unió al vector pSTV28, que se había digerido con SmaI (Takara Bio), para construir un plásmido pSYBJE para la amplificación de ybjE. El esquema de construcción se muestra en la figura 1. Un plásmido al que el gen ybjE se unió en por delante del promotor lac, se denominó pSYBJE1, y un plásmido al que se unió en la dirección inversa se denominó pSYBJE2.

Los plásmidos para la amplificación del gen ybjE, pSYBJE1, pSYBJE2, y un plásmido de control pSTV28 (Takara Bio), se introdujeron cada uno en MG1655 (ATCC 47076) de forma convencional. Los transformantes se seleccionaron basándose en la resistencia al cloranfenicol y la cepa que se introdujo con pSYBJE1 se denominó MG1655/pSYJE1, la cepa que se introdujo con pSYBJE2, se denominó MG1655/pSYBJE2, y la cepa que se introdujo con pSTV28 se denominó MG1655/pSTV28.

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<2-2> Efecto de la amplificación del gen ybjE en la bacteria Escherichia

Se examinó el efecto de amplificación del gen ybjE en la resistencia de la cepa MG1655 de Escherichia coli para varios aminoácidos, utilizando la cepa que se introdujo pSYBJE2 o pSYBJE1. Cada una de las cepas MG1655/pSYBJE1, MG1655/pSYBJE2, y la de control MG1655/pSTV28 se inocularon en 5 ml del medio L que contiene 50 \mug/ml de cloranfenicol y se cultivaron durante 6 horas aproximadamente utilizando un dispositivo de cultivo con agilación mediante movimiento recíproco. El medio de cultivo líquido en el cual habían proliferado las células hasta alcanzar una turbidez con una OD600=1,0, se centrifugó, y entonces, las células se lavaron dos veces con el medio mínimo M9. A continuación, las células se inocularon en un medio mínimo M9 que contenía 50 \mug/ml de cloranfenicol y en un medio mínimo M9 que contenía 80 g/l de clorhidrato de lisina, hasta alcanzar una turbidez con una OD600=0,05, y se cultivó durante aproximadamente 70 horas.

Los resultados se muestran en la figura 2, que muestra que la potenciación de la expresión del gen ybjE mejoró la tasa de crecimiento en un estadio temprano, así como la tasa de división celular durante la fase de crecimiento logarítmico, en presencia de una alta concentración de L-lisina, cuando se compara con la cepa de control.

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Ejemplo 3 Efecto de la interrupción del gen ybjE en la resistencia a los aminoácidos de una bacteria Escherichia <3-1> Construcción de una cepa de un gen ybjE interrumpido

La deleción del gen ybjE se obtuvo mediante el procedimiento desarrollado por Datsenko y Wanner denominado "Integración gobernada por Red" (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol 97, nº 12, páginas 6640-6645). Según este procedimiento, se obtuvo un producto PCR utilizando un oligonucleótido sintético que contiene un gen objeto en el extremo 5' y un gen de resistencia antibiótica en el extremo 3'. Utilizando este procedimiento, puede construirse, en una etapa única, una cepa con un gen interrumpido. Según este procedimiento, se diseñaron cebadores complementarios a las regiones (que se encuentran) alrededor del gen ybjE o del gen que transmite la resistencia antibiótica a un plásmido matriz, obteniéndose el producto PCR del gen ybjE endógeno. El producto PCR puede obtenerse utilizando el plásmido pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., U.K., número de registro X06403 del GenBank/EMBL) como matriz y oligonucleótidos sintéticos con una secuencia de SEC ID n^{os} : 7 y 8 como cebadores.

El producto PCR amplificado se purificó en un gel de agarosa y se utilizó para electroporación de la cepa MG1655 de Escherichia coli, que aloja el plásmido pKD46 que posee capacidad de replicación termosensible. El plásmido pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol 97, nº: 12, páginas 6640-6645) contiene un fragmento de ADN de 2154 nucleótidos de genes que contienen el fago \lambda del sistema Red \lambda de recombinación homóloga (\lambda, \beta, genes exo), que están controlados por el promotor ParaB inducible por la arabinosa (nº J02459 del registro de GenBank/EMBL, nucleótidos 31088 a 33241). El plásmido pKD46 es necesario para incorporar el producto PCR en el cromosoma de la cepa MG1655.

Se prepararon células competentes para la electroporación de la siguiente forma. La cepa MG1655 de Escherichia coli se cultivó durante la noche a 30ºC en medio LB que contenía 100 mg/l de ampicilina, diluyéndose entonces 100 veces con 5 ml del medio SOB (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª adición, Sambrook J et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) que contenía ampicilina y L-arabinosa (1 mM). Las células diluidas se hicieron crecer a 30ºC con aireación hasta que la OD600 alcanzara aproximadamente 0,6, concentrándose entonces 100 veces y lavándose tres veces con agua desionizada enfriada en hielo, de forma que las células pudieron utilizarse para la electroporación. La electroporación se llevó a cabo utilizando 70 \mul de las células competentes y aproximadamente 100 ng del producto PCR. Las células después de electroporación se añadieron a 1 ml del medio SOC (Molecular Clonig, A Laboratory Manual, 2ª adición, Sambrook J et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), que se cultivó a 37ºC durante 2,5 horas, y que se sembró entonces en el medio L agar a 37ºC. De esta forma, se seleccionaron las cepas recombinantes resistentes a Cm (cloranfenicol). Entonces, para tratarlas con el plásmido pKD46, las células se subcultivaron dos veces a 42ºC en medio L agar que contenía Cm (cloranfenicol), y se examinó la resistencia a la ampicilina de las colonias obtenidas. De esta forma, se obtuvieron cepas sensibles a la ampicilina tratadas
con pKD46.

La interrupción del gen ybjE en la cepa mutante, que podría identificarse por la resistencia al cloranfenicol, se confirmó mediante PCR. El producto PCR obtenido utilizando ADN en las células de la cepa MG1655\DeltaybjE::cat del gen ybjE interrumpido, fue más largo que el obtenido para una cepa de tipo salvaje. De esta forma, se confirmó que el gen de la resistencia al cloranfenicol se insertó en el gen ybjE, y que el gen ybjE mostraba una interrupción. La cepa interrumpida del ybjE en la que se había insertado el gen de resistencia al cloranfenicol, se denominó MG1655\DeltaybjE::Cm.

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<3-2> Confirmación de la resistencia aminoácida de la cepa deficiente en el gen ybjE

Se examinó la influencia de la cepa MG1655\DeltaybjE::Cm deficiente en el gen ybjE en la resistencia aminoácida. Se centrifugaron medios líquidos de cultivo (OD600 de 1,0) obtenidos cultivando la cepa MG1655\DeltaybjE::Cm y la de control MG1655 en medio L durante aproximadamente 6 horas en un dispositivo para cultivo con agilación mediante movimiento recíproco. Entonces, las células se lavaron dos veces con medio mínimo M9 y se inocularon en medio mínimo M9 o en medio mínimo M9 que contenía 80 g/l de clorhidrato de lisina, hasta alcanzar una OD600 de 0,05, cultivándose durante aproximadamente 70 horas. Entonces, se examinó el crecimiento de las células.

Los resultados se muestran en la figura 3. Como se muestra en la figura 3, la deleción del gen ybjE redujo el crecimiento en un estadio temprano en presencia de altas concentraciones de L-lisina, en comparación con la cepa de control. A partir de este resultado y de los resultados del Ejemplo 2, se reveló que el gen ybjE transmitió resistencia a la L-lisina.

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Ejemplo 4 El efecto de la amplificación de ybjE en la producción de L-lisina de una bacteria Escherichia

Como cepa productora de L-lisina de Escherichia coli, se utilizó la cepa WC196 (AJ13069 (FERM BP-5252), WO96/17930), que es AEC (S-(2-aminoetil)cisteína) resistente.

La cepa WC196 se transformó con el plásmido pSYBJE1 para la amplificación de ybjE. El plásmido pSTV28 (Takara Bio) se transformó separadamente como un control (como en el Ejemplo 2). De este modo, se obtuvieron cepas resistentes al cloranfenicol. Se confirmó la introducción de los plásmidos, y la cepa introducida con el plásmido pSYBSE1 se designó como WC196/ybjE, y la cepa que se introdujo con el plásmido de control pSTV28 se denominó WC196/pSTV28.

Las cepas WC196/ybjE y WC196/pSTV28 se cultivaron cada una a 37ºC en medio L que contenía 50 mg/l de cloranfenicol, hasta alcanzar una OD600 de aproximadamente 0,6. Entonces, a cada caldo de cultivo se añadió un volumen idéntico de una solución de glicerol al 40%, se agitó, y se dividió entonces en volúmenes apropiados, guardándose a -80ºC. A estos se hace referencia en la presente memoria como "reservas" de glicerol.

Las reservas de glicerol de estas cepas se descongelaron, y 100 \mul de cada almacén se sembró uniformemente en una placa L que contenía 50 mg/l de cloranfenicol, y se incubó a 37ºC durante 24 horas. Aproximadamente 1/8 de las células recuperadas a partir de la placa se inocularon en 20 ml de medio de fermentación (medio mínimo M9) que contenía 50 mg/l de cloranfenicol en un matraz de Sakaguchi de 500 ml, y se cultivó a 37ºC durante 27 horas en un dispositivo de cultivo con agilación mediante movimiento recíproco. Después del cultivo, la cantidad de lisina que se había acumulado en el medio, se midió utilizando el Analizador AS210 Biotech (Sakura Seiki). Como para la concentración de L-lisina en las células, se añadió un volumen apropiado del caldo de cultivo al aceite de silicona con una gravedad específica de 1,07, recuperándose las células mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 2 minutos. Entonces, las células recuperadas se fragmentaron mediante tratamiento con ácido perclórico al 22%, y se midió la concentración de lisina.

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La acumulación y el rendimiento de la L-lisina, así como la proporción de concentraciones de lisina extra a intracelular después de 24 horas, se muestran en la Tabla 1. La proporción de la concentración de lisina extra a intracelular indicada con *, se determinó dividiendo la concentración extracelular de lisina (mg/g del peso celular en seco) por la concentración intracelular de lisina (mg/g del peso celular en seco). Tal como se muestra en la Tabla 1, la cepa WC196/pSYBJE1 acumuló una cantidad más grande de lisina, comparada con la cepa WC196/pSTV28, en la que no se había introducido el gen ybjE. Además, en la cepa WC196/pSYBJE1 en la que se introdujo el gen ybjE, la concentración de L-lisina extracelular aumentó con respecto a la concentración de L-lisina intracelular, debido a una marcada disminución de la concentración intracelular de lisina, comparada con la cepa control WC196/pSTV28, y por tanto, se sugirió que el gen ybjE era un gen exportador de la L-lisina.

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TABLA 1

14

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Ejemplo 5 El efecto de la amplificación de ybjE en la producción de L-arginina de una bacteria Escherichia

Se observó que tanto la acumulación como el rendimiento de la L-lisina aumentaron en la cepa que poseía el gen ybjE amplificado, comparada con la cepa control. Asimismo, se examinó el efecto de la amplificación de ybjE en la producción de L-arginina, que es un conocido aminoácido básico como la L-lisina. Como bacteria productora de L-arginina de Escherichia coli, se utilizó la cepa 237 que presentaba inhibición por retroalimentación de la N-acetilglutamato sintasa liberada (VKPM B-7925, solicitud de patente rusa nº 2000117677).

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<5-1> Preparación de la cepa 237 de Escherichia coli con el gen ybjE amplificado

Utilizando idéntico procedimiento que en el Ejemplo 4, se prepararon una cepa 237/pSTV28 de control y una cepa 237/pSYBJE1 con el gen ybjE amplificado.

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<5-2> Producción de L-arginina

Utilizando los medios, procedimientos de cultivo, y procedimientos de análisis tal como se describe a continuación, se examinó el efecto de la amplificación del gen ybjE en la producción de L-arginina. Como precultivo, se inocularon 100 \mul de las reservas de glicerol en medio L agar, y se sembraron entonces uniformemente en una placa L que contenía 50 mg/l de cloranfenicol, y se incubaron a 32ºC durante 24 horas. Aproximadamente 1/8 de las células que se recuperaron a partir de la placa se inocularon en 20 ml de un medio productor de arginina y se cultivaron a 32ºC durante 90 horas. El cultivo de las cepas en las que se introdujo el plásmido se llevó a cabo añadiendo cloranfenicol.

Se tomó 1 ml del caldo de cultivo durante el cultivo, y se midió la acumulación de L-arginina y la concentración de glucosa en las células y en el caldo de cultivo. Para determinar la concentración de glucosa y la de L-arginina en el caldo de cultivo, éste se centrifugó a 15.000 rpm durante 5 minutos, y el sobrenadante obtenido se diluyó apropiadamente con agua, midiéndose las concentraciones en el sobrenadante diluido utilizando un Analizador Biotech (Sakura Seiki) y un Analizador de Aminoácidos L-8500 (Hitachi Instrument Service). Para determinar la concentración de L-arginina en las células, se añadió un volumen apropiado de caldo de cultivo a aceite de silicona que presentaba una gravedad específica de 1,07 y se centrifugó a 12.000 rpm durante 2 minutos, disgregando entonces las células recuperadas mediante un tratamiento con ácido perclórico al 22%, y midiendo la concentración de L-arginina. La acumulación y el rendimiento de la L-arginina, así como la proporción de concentración extra a intracelular de L-arginina, después de 90 horas, se muestra en la Tabla 2. La proporción extra a intracelular que se indica con *, se determinó dividiendo la concentración de L-arginina extracelular (mg/g de peso celular seco) por la concentración de L-arginina intracelular (mg/g de peso celular seco).

TABLA 2 Producción de L-arginina con la cepa con el gen ybjE amplificado

15

Se observó que la acumulación y rendimiento de la L-arginina aumentaron en la cepa con el gen ybjE amplificado, comparada con la cepa de control. Además, la proporción de la concentración de arginina extra a intracelular también aumentó. Se sugirió así que el gen también estaba implicado en la exportación de la L-arginina.

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Ejemplo 6 El efecto de la introducción del gen ybjE derivado de una bacteria Escherichia coli en una bacteria Methylophilus <6-1> Construcción del plásmido pRSybjE para la amplificación de ybjE

Para introducir el gen ybjE en una bacteria Methylophilus, el plásmido conocido pRS (JP 3-501682A) se utilizó para construir un plásmido pRSybjE para la expresión de ybjE. pRS es un plásmido que tiene un segmento vectorial del plásmido pVIC40, que es (WO90/04636, JP 3-501682A) obtenido suprimiendo una región de ADN que codifica el operón de la treonina. El plásmido pVIC40 se deriva del plásmido vectorial de amplio espectro del huésped pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167), que es un derivado de RSF1010.

En primer lugar, un plásmido pRStac que contiene el promotor lac se construyó a partir de pRS según el esquema que se muestra en la figura 3, de la siguiente forma. El vector pRS se sometió a digestión con las enzimas de restricción EcoRI y PstI, se añadió a una solución fenol/cloroformo, y se mezcló para finalizar la reacción. Después de que la mezcla reactiva se centrifugara, la capa más alta se recuperó, y los ADN se recuperaron mediante precipitación etanólica y separados en un gel de agarosa al 0,8%. Se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 8 kilobase de pares (en adelante, "kbp"), utilizando EASY TRAP Ver. 2 (equipo de recuperación de ADN, Takara Bio). Alternativamente, la región promotora tac se amplificó mediante PCR utilizando el plásmido pKK223-3 (vector de expresión, Pharmacia) como una matriz, y utilizando cebadores que tenían una secuencia de SEC IID n^{os} 16 y 17 (un ciclo que consiste en una desnaturalización a 94ºC durante 20 segundos, una hibridización a 55ºC durante 30 segundos, y una reacción de prolongación a 72ºC durante 60 segundos, repitiéndose 30 ciclos). Para PCR se utilizó Pyrobest ADN polimerasa (Takara Bio). El fragmento de ADN amplificado que contenía el promotor tac se purificó utilizando PCR prep (Promega), y entonces se sometió a digestión con las enzimas de restricción EcoRI y EcoT22I, habiéndose diseñado en los cebadores sus sitios de reconocimiento. Entonces, la mezcla reactiva se añadió a una solución fenol/clorofórmica y se mezcló para finalizar la reacción. Después de que la mezcla reactiva fuera centrifugada, la capa superior se recuperó, y los ADN se recuperaron mediante precipitación etanólica y se separaron en un gel de agarosa al 0,8%. Un fragmento de ADN de aproximadamente 0,5 kbp se recuperó utilizando EASY TRAP Ver. 2.

El producto de la digestión del vector pRS y el fragmento de la región promotora tac preparado tal como se ha descrito anteriormente, se unieron utilizando el Equipo de Unión de ADN ver.2 (Takara Bio). Esta solución de la reacción de unión se utilizó para transformar Escherichia coli (células competentes JM109 de Escherichia coli, Takara Bio). Las células se sembraron en medio agar LB que contenía 20 mg/l de estreptomicina y se incubaron durante la noche a 37ºC. Las colonias que aparecieron en el medio de agar se inocularon cada una en medio líquido LB que contenía 20 mg/l de estreptomicina, cultivándose a 37ºC durante 8 horas con agilación. Se extrajo ADN plasmídico de cada cultivo mediante el procedimiento SDS-álcali, y se confirmó la estructura de cada plásmido mediante digestión con enzimas de restricción. Se seleccionó un plásmido en el que la dirección de la transcripción del gen de resistencia a la estreptomicina y el promotor tac eran las mismas, denominándose pRStac.

El pRStac obtenido tal como se ha descrito anteriormente, s se sometió a digestión con Sse8387I (Takara Bio), y se mezcló con una solución fenol/clorofórmica para finalizar la reacción. D Después de que la mezcla reactiva se centrifugara, la capa superior se recuperó, y los ADN se recuperaron mediante precipitación etanólica seguida por la conversión en romos de los extremos Con un Equipo de Redondeo del ADN.

Además, pSYBJE1 tal como se describe anteriormente, se sometió a digestión con la enzima de restricción PvuII, y se mezcló con una solución fenol/clorofórmica para finalizar la reacción. Después de que la mezcla reactiva se centrifugara, se recuperó la capa superior, y los ADN se recuperaron mediante precipitación etanólica y se separaron en un gel de agarosa al 0,8%. Un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kbp que contiene el promotor lac y el gen ybjE se recuperó utilizando EASY TRAP Ver. 2 (Equipo de recuperación de ADN, Takara Bio).

El producto de digestión del vector pRStac y el fragmento de la región del gen ybjE preparado tal como se ha descrito anteriormente, se unieron conjuntamente, utilizando el Equipo de Unión del ADN Ver.2 (Takara Bio). Esta solución de la reacción de unión se utilizó para transformar Escherichia coli (células competentes JM109 de Escherichia coli Takara Bio). Las células se sembraron en el medio agar LB que contiene 20 mg/l de estreptomicina y se incubaron por la noche a 37ºC. Las colonias que aparecieron en el medio de agar se inocularon en el medio líquido LB conteniendo 20 mg/l de estreptomicina y se cultivaron a 37ºC durante 8 horas con agilación. Se extrajo ADN plasmídico de cada cultivo mediante el procedimiento SDS-álcali, y se confirmó la estructura de cada plásmido mediante digestión con enzimas de restricción y la secuenciación de ADN para seleccionar pRSybjE (figura 4). En el plásmido pRSybJE, el gen ybjE se localiza de forma que se transcribe en la misma dirección que el promotor tac.

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<6-2> Introducción de pRSybjE en una bacteria Methylophilus

pRSybjE obtenido tal como se ha descrito anteriormente, se introdujo en la cepa AS1 (NCIMB10515) de Methylophilus methylotrophus mediante electroporación (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Además, también se introdujo pRS en la cepa AS1 como un control. Se obtuvieron transformantes para pRSybjE y pRS basados en la resistencia a la estreptomicina.

La cepa AS1 de Methylophilus methylotrophus que alberga pRS o pRSybjE (AS1/pRS, AS1/pRSybjE) se sembró en una placa SEII que contenía 20 mg/l de estreptomicina y se cultivó por la noche a 37ºC. Entonces, se rasparon las células de aproximadamente 0,3 cm^{2} de la superficie del medio, se inocularon en el medio de producción SEII (20 ml) que contenía 20 mg/l de estreptomicina y se cultivaron a 37ºC durante 34 horas con agilación. Cuando finalizó el cultivo, las células se eliminaron mediante centrifugación, y la concentración de L-lisina en el sobrenadante del cultivo se determinó utilizando un analizador de aminoácidos (Nihon Bunko, cromatografía líquida de alta resolución). Los resultados se muestran en la tabla 3.

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TABLA 3

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Como resultado de la amplificación del gen ybjE, las cantidades acumuladas de L-lisina y L-arginina aumentaron notablemente comparadas con la cepa de control AS1/pRS. De este modo, se sugirió que ybjE funciona también en la exportación del L-aminoácido básico en Methylophilus methylotrophus.

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Ejemplo 7 Evaluación de Methylophilus methylotrophus en la que se introducen un gen que codifica un tipo de inhibición por retroalimentación liberada de la dihidrodipicolinato sintasa y el gen ybjE

A causa de que se encontró que la introducción del gen ybjE promovía la exportación de L-lisina en la cepa AS1 de Methylophilus methylotrophus, se potenció una actividad de la enzima biosintética de la L-lisina en la cepa en la que se introdujo el gen ybjE, para intentar una mejoría posterior de la producción de L-lisina.

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<7-1> Construcción del plásmido pRSdapA que contiene un gen que codifica la dihidrodipicolinato sintasa resistente a la inhibición por retroalimentación mediante la L-lisina

Se preparó, según el esquema de construcción que se muestra en la figura 5, un plásmido que contiene un gen que codifica la dihidrodipicolinato sintasa resistente a la inhibición por retroalimentación mediante la L-lisina (al que se hace referencia en adelante como "dapA*").

El pRStac preparado en el Ejemplo 6 se sometió a digestión con Sse8387I y XbaI y se mezcló con una solución de fenol/cloroformo para finalizar la reacción. Después de que la mezcla reactiva se centrifugara, se recuperó la capa superior, y se recuperaron los ADN mediante precipitación etanólica y se separaron en un gel de agarosa al 0,8%. Como resultado, se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 8,2 kbp.

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El fragmento del gen dapA* se amplificó mediante PCR utilizando el plásmido RSFD80 (se hace referencia a la patente US nº 6.040.160) que contiene el gen dapA* como matriz y los cebadores que tienen la SEC ID n^{os}:14 y 15 (desnaturalización a 94ºC durante 20 segundos, hibridización a 55ºC durante 30 segundos, y reacción de prolongación a 72ºC durante 60 segundos). Para PCR, se utilizó la Pyrobest ADN polimerasa (Takara Bio). El fragmento dapA* obtenido se purificó utilizando PCR prep (Promega), sometiéndose entonces a digestión con las enzimas de restricción Sse8387I y XbaI. La solución reactiva se mezcló con una solución fenol/clorofórmica para finalizar la reacción. Después de que la mezcla reactiva se centrifugara, la capa superior se recuperó, y los ADN se recuperaron mediante precipitación, y se separaron en un gel de agarosa al 0,8%. Como resultado, se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kbp.

El producto de digestión del vector pRStac y el fragmento del gen dapA* preparados tal como se ha descrito anteriormente, se unieron entre ellos utilizando el Equipo de Unión del ADN Ver.2 (Takara Bio). Esta solución de la reacción de unión se utilizó para transformar las células de Escherichia coli (células competentes JM109 de Escherichia coli, Takara Bio). Las células se sembraron en el medio agar LB que contiene 20 mg/l de estreptomicina y se incubaron por la noche a 37ºC. Las colonias que aparecieron en el medio de agar se inocularon en el medio líquido LB conteniendo 20 mg/l de estreptomicina y se cultivaron a 37ºC durante 8 horas con agilación. Se extrajo ADN plasmídico de cada cultivo mediante el procedimiento SDS-álcali, y se confirmó la estructura de cada plásmido mediante digestión con enzimas de restricción y la secuenciación de ADN para seleccionar un plásmido pRSdapA. En el plásmido pRSdapA, el gen dapA* se localizó de forma que se transcribe en la misma dirección que el promotor tac.

La cepa JM109 de Escherichia coli transformada con el plásmido pRSdapA se denominó AJ13831, y esta cepa se depositó en la agencia administrativa independiente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary el 4 de junio de 2001, y recibió un número de registro FERM P-18370. Entonces, el depósito se convirtió a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 13 de mayo de 2002, y recibió un número de registro FERM BP-8041. Por tanto, el plásmido pRSdapA puede también obtenerse a partir de esta cepa.

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<7-2> Construcción del plásmido que contiene ybjE y dapA*

Para evaluar el efecto de combinar ybjE y dapA*, se construyó según el procedimiento representado en la figura 5, un plásmido obtenido insertando el gen ybjE en el plásmido pRSdapA. El pRSybjE que se preparó en el Ejemplo 6, se sometió a digestión con la enzima de restricción SapI, y sus extremos se volvieron romos utilizando el equipo de redondeo (de los extremos) del ADN (Takara Bio). Además, el plásmido pRSdapA se sometió a digestión con las enzimas de restricción EcoRI y SapI, separándose sobre un gel de agarosa al 0,8% un fragmento de aproximadamente 1 kbp que contiene el promotor tac y la región dapA*, y recuperándolo mediante la utilización de EASY TRAP Ver. 2 (Takara Bio). A este fragmento se le redondearon los extremos de la misma forma que se ha descrito anteriormente, y se unió al producto de digestión anteriormente mencionado de pRSybjE utilizando el Equipo de Unión del ADN Ver 2. (Takara Bio).

Esta solución de la reacción de unión se utilizó para transformar Escherichia coli (células competentes JM109 de Escherichia coli, Takara Bio). Las células se sembraron en medio agar LB que contenía 20 mg/l de estreptomicina y se incubaron durante la noche a 37ºC. Las colonias que aparecieron en el medio de agar se inocularon cada una en medio líquido LB que contenía 20 mg/l de estreptomicina, cultivándose a 37ºC durante 8 horas con agilación. Se extrajo ADN plasmídico de cada cultivo mediante el procedimiento SDS-álcali, y se confirmó la estructura de cada plásmido mediante digestión con enzimas de restricción y la secuenciación del ADN para seleccionar el plásmido pRSybjEdapA. En este plásmido, el gen ybjE y el gen dapA* se localizaron de forma que se transcriben en la misma dirección uno con respecto al otro pRSybjEdapA obtenido tal como se ha descrito anteriormente, así como pRSybjE, pRSdapA, y el plásmido pRS de control, se introdujeron en la cepa AS1 de Methylophilus methylotrophus (NCIMB10515) mediante electroporación, respectivamente.

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<7-3> Producción de L-lisina mediante la bacteria Methylophilus que alberga ybjE y dapA*

Cada una de las cepas AS1 en las que se introdujeron pRSybjEdapA, pRSybjE, pRSdapA, o pRS, que se obtuvieron tal como se ha descrito anteriormente, se sembraron en una placa SEII que contenía 20 mg/l de estreptomicina y que se cultivó por la noche a 37ºC. Entonces, se rasparon las células de aproximadamente 0,3 cm^{2} de la superficie del medio, se inocularon en el medio de producción SEII (20 ml) que contenía 20 mg/l de estreptomicina, y se cultivaron a 37ºC durante 34 horas con agilación. Cuando finalizó el cultivo, las células se eliminaron mediante centrifugación, y la concentración de L-lisina en el sobrenadante del cultivo se determinó utilizando un analizador de aminoácidos (Nihon Bunko, cromatografía líquida de alta resolución). Los resultados se muestran en la tabla 4. La cepa en la que se había introducido pRSybjEdapA aumentó la acumulación de L-lisina, comparada con las cepas en las que se habían sólo introducido pRSdapA o pRSybjE. De esta forma, se encontró que la potenciación de tanto el gen ybjE como del gen dapA * tuvo un efecto sinérgico sobre la producción de L-lisina.

TABLA 4

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Ejemplo 8 El efecto de la amplificación de ybjE sobre la resistencia del análogo de la lisina

Entonces, se examinó el efecto de la amplificación del gen ybjE en la resistencia de un análogo de la L-lisina. Las cepas AS1 de Methylophilus methylotrophus anteriormente mencionadas que albergan AS1/pRSybjE o la pRS de control se cultivaron cada una por la noche en medio SEII que contenía 20 mg/l de estreptomicina. Cada cultivo se inoculó en medio SEII recién preparado (que contenía 20 mg/l de estreptomicina) en un volumen del 10% y se cultivó a 37ºC con agilación, hasta que las células alcanzaron la fase de crecimiento logarítmico. Cada cultivo se inoculó en un volumen del 4% en medio SEII que contenía 20 mg/l de estreptomicina y 0,3 ó 5 g/l de S-(2-aminoetil)cisteína (AEC), y se cultivó a 37ºC con agilación. Durante el cultivo, el valor OD a 660 nm se midió cada 30 minutos para examinar el grado de resistencia - AEC de las cepas. Los resultados se muestran en la figura 6. Un biofotograbador TN-1506 de Advantec se utilizó para medir el grado de resistencia, y 5 ml del cultivo se situó en un tubo de ensayo y se analizó. Los resultados se muestran en la Fig. 6.

Como resultado, y con la adición de AEC, no se observó retraso en el crecimiento para la cepa AS1/pRSybjE, mientras que el crecimiento de la cepa AS1/pRS se retrasó notablemente. Así, se reveló que la amplificación del gen ybjE transmitió no sólo la resistencia a la L-lisina, sino también la resistencia al análogo de la L-lisina.

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Ejemplo 9 El efecto de la amplificación del ybjE en la producción de L-treonina

La cepa B-5318 de Escherichia coli (EP 0593792) se utilizó como una cepa de inicio. La cepa B-5318 se transformó con el plásmido pSYBJE1, tal como se describe en el Ejemplo 2 o con un plásmido de control pSTV28 (Takara Bio), para obtener una cepa resistente al cloranfenicol. Después de determinar la secuencia, se pudieron seleccionar una cepa B-5318/pSYBJE1 y una cepa B-5318/pSTV28.

Estas cepas se cultivaron en medio L que contenía 50 mg/l de cloranfenicol a 37ºC hasta que la OD600 alcanzó un valor de 0,6 aproximadamente. El cultivo se mezcló con la misma cantidad de solución de glicerol al 40% y se dividió en partes, teniendo cada una un volumen apropiado y se guarda a -80ºC.

La reserva de glicerol se descongeló y se inocularon uniformemente 100 \mul de ella en una placa L que contenía 50 mg/l de cloranfenicol, incubándose a 37ºC durante 24 horas. Entonces, las células se recuperaron a partir de aproximadamente un octavo de la superficie del medio, se inocularon en un medio productor de L-treonina y se cultivaron a 37ºC durante 24 horas con agilación. Después de finalizar el cultivo, las células se eliminaron mediante centrifugación, y se determinó la concentración de L-treonina en el sobrenadante del cultivo utilizando un procedimiento convencional. Pudo obtenerse así una cepa en la que el gen ybjE es amplificado y que posee una potenciación de la capacidad para producir L-treonina.

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Ejemplo 10 El efecto de la amplificación del gen ybjE en las bacterias Corineformes <10-1> Construcción de un plásmido para la amplificación del gen ybjE

El pSYBJE2, tal como se describe en el Ejemplo 2, se sometió a digestión con EcoRI y PstI, y el fragmento digerido se unió a pVK7 (US 20030175912), que se había digerido con las mismas enzimas. El plásmido obtenido se denominó pVYBJE1.

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<10-2> Efecto de la amplificación del gen ybjE en la producción de L-lisina, utilizando bacterias Corineformes

La cepa ATCC13861 de Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) se utilizó como la cepa de inicio. La cepa ATCC13861 se transformó con el plásmido pVYBJE1 o un plásmido de control pVK7 para obtener una cepa resistente ala kanamicina. Después de la determinación secuencial, se seleccionaron las cepas ATCC13861/pVYBJE1 y ATCC13861/pVK7.

Estas cepas se cultivaron en medio M-CM2S que contenía 25 mg/l de kanamicina a 31,5ºC, hasta que se obtuvo una OD600 de aproximadamente 0,6. El cultivo se mezcló con una cantidad idéntica de solución de glicerol al 40% y se dividió en partes, teniendo cada una un volumen apropiado, guardándose a -80ºC.

La reserva de glicerol se descongeló y se inocularon uniformemente 100 \mul de ella en placas M-CM2S que contenían 25 mg/l de kanamicina, incubándose a 31,5ºC durante 24 horas. Entonces, las células se recuperaron a partir de aproximadamente un octavo de la superficie del medio, se inocularon en 20 ml de un medio de fermentación que contenía 25 mg/l de kanamicina, y se cultivaron a 31,5ºC durante 42 horas con agilación 115 rpm. Después de finalizar el cultivo, las células se eliminaron mediante centrifugación, y se determinó la concentración de L-lisina en el sobrenadante del cultivo utilizando un Analizador Biotech AS 210 (Sakura Seiki). La totalidad de la glucosa en el medio se había consumido completamente después de cultivar durante 42 horas.

Los resultados se muestran en la Tabla 5. El ATCC13861/pVYBJE1 en el que el gen ybjE es amplificado, puede provocar la acumulación de L-lisina en una cantidad más alta comparada con la cepa ATCC13861/pVK7 de control. Se encontró que el gen ybjE funciona también en la exportación del L-aminoácido y potencia la producción de L-lisina en las bacterias Corineformes.

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TABLA 5

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Ejemplo 11 El efecto de la amplificación del gen ybjE en el crecimiento bajo concentraciones altas de L-aminoácidos

La cepa MG1655 de Escherichia coli (ATCC47076) se transformó con pSYBJE1 incluyendo el gen ybjE o el plásmido de control pTSV28 (Takara Bio). Además, la cepa MG1655 se transformó también con pSYJE1* 2-1 incluyendo un gen mutante ybjE con una secuencia de SEC ID nº:1 en la cual el nucleótido (guanina) en la 3ª posición es reemplazado con adenina.

Los transformantes en los que se introdujeron estos plásmidos se seleccionaron según la resistencia al cloranfenicol, y las cepas que se seleccionaron se denominaron MG1655/pSYJE1, MG1655/pSYJE1* 2-1, y MG1655/pSTV28, respectivamente.

LA pSYJE1* 2-1 se construyó de la forma siguiente: el gen ybjE mutante se amplificó mediante PCR utilizando cebadores, cada uno de los cuales tenía una secuencia de SEC ID n^{os} 5 ó 6, a partir de un ADN cromosómico de la cepa NVC578 de E. coli productora de L-lisina. El ADN amplificado se secuenció y se encontró que tenía una secuencia de SEC ID nº:1 en la cual el nucleótido (guanina) en la 3ª posición es reemplazado con adenina. El ADN amplificado se unió con el pTV28 digerido con SmaI, y un plásmido en el que el gen mutante ybjE se situó de forma que se expresó mediante un promotor lac, se seleccionó y denominó pSYJE* 2-1.

El gen mutante ybjE puede también obtenerse introduciendo la mutación en un gen ybjE de tipo salvaje utilizando procedimientos tales como la PCR de prolongación por solapamiento (Nucleic Acids Res, 25, 2227-8, 1997), en la que el gen mutante ybjE se amplifica con cebadores, uno de los cuales posee el nucleótido reemplazado.

Entonces, se examinó el crecimiento de las cepas MG1655/pSYJE1, MG1655/pSYJE1* 2-1, y MG1655/pSTV28 en presencia de altas concentraciones de cada L-aminoácido.

Estas cepas se cultivaron con agilación en 5 ml de medio L que contenía 50 mg/l de cloranfenicol durante aproximadamente 6 horas. Después de que la OD600 del medio alcanzara aproximadamente 1,0, el cultivo se centrifugó y las células se lavaron dos veces con medio mínimo M9 y se inocularon con una OD600=0,05 en medio mínimo M9 que contenía 50 mg/l de cloranfenicol y determinadas cantidades de cada L-aminoácido (12 g/l de isoleucina, 40 g/l de treonina, 15 g/l de glutamato sódico, 30 g/l de clorhidrato de histidina, 45 g/l de clorhidrato de ornitina, 90 g/l de clorhidrato de arginina, 8 g/l de fenilalanina, 85 g/l de prolina o 0,3 g/l de L-cisteína), y se cultivó durante 70 horas. La L-isoleucina se seleccionó como representante de los L-aminoácidos alifáticos, la L-treonina se seleccionó como representante de los L-aminoácidos hidroxílicos, la L-prolina se seleccionó como representante de los L-aminoácidos circulares, la L-fenilalanina se seleccionó como representante de los L-aminoácidos aromáticos, la L-cisteína se seleccionó como representante de los L-aminoácidos que contenían azufre, el ácido L-glutámico se seleccionó como representante de los L-aminoácidos ácidos y sus amidas. Los resultados se muestran en las Figuras 7-15. Se encontró que la amplificación del gen ybjE mejoró el crecimiento de la cepa MG1655 en presencia de altas concentraciones de L-aminoácidos, especialmente L-arginina, L-ornitina, L-isoleucina, ácido L-glutámico, L-treonina, L-histidina, L-prolina, L-fenilalanina, y L-cisteína. También se encontró que el gen mutante ybjE confiere resistencia aminoácida a la cepa MG1655 de un modo más eficiente que el gen ybjE de tipo salvaje.

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Ejemplo 12 Efecto del gen ybjE que posee una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49-948 de SEC ID nº:1

El gen ybjE, que posee una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49-948 de SEC ID nº:1, (a la que se hace referencia como ybjE-900 en adelante), se amplificó a partir de un ADN cromosómico de la cepa MG1655 mediante PCR, utilizando cebadores que presentaban una secuencia nucleótida de SEC ID nº:13 ó 12. El gen ybjE con una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 1-948 de SEC ID nº:1, en la que la guanina en posición 1 es reemplazada con adenina (al que se hace referencia en adelante como ybjE-948), se amplificó también mediante PCR utilizando cebadores que tenían una secuencia nucleótida de SEC ID nº:11 ó 12.

El producto PCR obtenido de cada reacción se purificó y cada uno de ellos se unió a un vector pTV28 digerido por SmaI (Takara Bio), obteniendo por tanto un plásmido para amplificar el gen ybjE-900 o el gen ybjE-948. Se seleccionó y denominó pSYBJE900 un plásmido en el que el gen ybjE-900 se situó de forma que se expresara mediante el promotor lac, y (se seleccionó y denominó) pSYBJE948 un plásmido en el que el gen ybjE-948 se situó de forma que se expresara mediante el promotor lac.

La cepa MG1655 (ATCC47076) de Escherichia coli se transformó con pSYBJE900, pSYBJE948, pSYBJE1 que se utilizaron en el Ejemplo 2, o con el plásmido de control pSTV28. Los transformantes en los que se introdujeron estos plásmidos se seleccionaron según la resistencia al cloranfenicol, denominándose las cepas seleccionadas MG1655/pSYBJE900, MG1655/pSYBJE948, MG655/pSYJE1 y MG1655/pSTV28, respectivamente.

Entonces, se examinó el crecimiento de las cepas MG1655/pSYBJE900, MG1655/pSYBJE948, MG1655/pSYJE1 y MG1655/pSTV28, en presencia de altas concentraciones de L-lisina.

Estas cepas se cultivaron con agilación en 3 ml de medio L que contenía 50 mg/l de cloranfenicol durante aproximadamente 6 horas. Después de que la OD600 del medio alcanzara aproximadamente 1,0, el cultivo se centrifugó y las células se lavaron dos veces con medio mínimo M9 y se inocularon con una OD600=0,05 en medio mínimo M9 que contenía 50 mg/l de cloranfenicol y 80g/l de clorhidrato de lisina, cultivándose durante 20 horas. Los resultados se muestran en la Figura 16. Se encontró que la amplificación del gen ybjE-900 mejoró el crecimiento de la cepa MG1655 en presencia de altas concentraciones de L-lisina en la fase temprana de crecimiento, así como en la fase de crecimiento logarítmico, en casi el mismo grado que el gen ybjE-948 y los genes ybjE contenidos en pSYJE1. Estos datos sugieren que una secuencia de los nucleótidos números 49-948 en la secuencia del gen ybjE (SEC ID nº:1) es suficiente para llevar a cabo su efecto de exportación del L-aminoácido.

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Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, los L-aminoácidos, especialmente la L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, L-prolina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-fenilalanina y el ácido L-glutámico, pueden producirse mediante fermentación. La L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-prolina son útiles como aditivos para la alimentación animal, componentes de alimentos salutíferos, e infusiones de aminoácidos. La L-arginina y la L-ornitina son útiles como agentes que promueven la función hepática, de infusiones aminoácidas y componentes de preparaciones aminoácidas. La L-histidina es útil como un agente que promueve la función hepática y como precursor de la histamina. La L-fenilalanina es útil como precursor de edulcorantes.

Claims

1. Microorganismo que presenta una capacidad productora de L-aminoácidos, en el que dicho microorganismo es modificado de manera que la expresión de un gen ybjE es potenciada, en el que dicho gen ybjE es seleccionado de entre el grupo que consiste en:

(a): un ADN que comprende una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1;

(b): un ADN que puede hibridizarse, bajo condiciones estrictas, con una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos;

(c): un ADN que presenta una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49 a 948 en la SEC ID nº:1; y

(d): un ADN que puede hibridizarse, bajo condiciones estrictas, con una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49 a 948 en la SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos.

2. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que la expresión de dicho gen ybjE se ha potenciado aumentando un número de copias de dicho gen ybjE, o modificando una secuencia reguladora de la expresión de dicho gen ybjE.

3. Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia aminoácida de una proteína codificada por dicho gen ybjE es seleccionada de entre el grupo que consiste en (A) a (D) que se muestra a continuación, en el que dicha proteína presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos.

(A): una secuencia aminoácida de SEC ID nº:2,

(B): una secuencia aminoácida de SEC ID nº:2, que incluye sustituciones, deleciones, o inserciones, de uno a 20 residuos aminoácidos

(C): una secuencia aminoácida de los aminoácidos números 17 a 315 en la SEC ID nº:2, y

(D): una secuencia aminoácida de los aminoácidos números 17 a 315 en la SEC ID nº:2, que incluye sustituciones, deleciones, o inserciones, de uno a 20 residuos aminoácidos.

4. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho gen ybjE presenta una mutación que reemplaza la guanina en la 3ª posición de la SEC ID n:º1 con la adenina.

5. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha capacidad exportadora de L-aminoácidos de dicho microorganismo aumenta mediante dicha potenciación de la expresión de dicho gen ybjE.

6. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que una resistencia del microorganismo a un L-aminoácido o análogo de L-aminoácido es aumentada mediante dicha potenciación de la expresión de dicho gen ybjE.

7. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho L-aminoácido es seleccionado de entre el grupo que consiste en L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína, y ácido L-glutámico.

8. Microorganismo según la reivindicación 7, en el que dicho L-aminoácido es la L-lisina.

9. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho microorganismo pertenece a una familia de Enterobacteriáceas.

10. Microorganismo según la reivindicación 9, en el que dicho microorganismo que pertenece a una familia de Enterobacteriáceas, es un microorganismo que pertenece al género Escherichia.

11. Microorganismo según la reivindicación 10, en el que dicho microorganismo es Escherichia coli.

12. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho microorganismo es una bacteria Corineforme.

13. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho microorganismo es una bacteria que asimila metanol.

14. Microorganismo según la reivindicación 13, en el que dicha bacteria que asimila metanol es un microorganismo que pertenece al género Methylophilus o Methylobacillus.

15. Procedimiento para producir un L-aminoácido que comprende el cultivo del microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en un medio para producir y provocar la acumulación de dicho L-aminoácido, y recoger dicho L-aminoácido del medio o del microorganismo.

16. Procedimiento para producir un L-aminoácido, que comprende cultivar el microorganismo según la reivindicación 13 ó 14 en un medio líquido que contiene metanol como principal fuente de carbono para producir y provocar la acumulación de dicho L-aminoácido, y recoger el L-aminoácido del medio o del microorganismo.

17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que el L-aminoácido es seleccionado de entre el grupo que consiste en L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína y ácido L-glutámico.