KR102616694B1

KR102616694B1 - 쉬와넬라 아틀란티카 유래 단백질을 발현하는 미생물, 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법

Info

Publication number: KR102616694B1
Application number: KR1020200171739A
Authority: KR
Inventors: 배현원; 정무영; 김상준; 박상민; 변효정; 신용욱; 이한형; 임보람; 장재원; 최윤정
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2023-12-20
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN115605599A; ZA202210974B; AU2021394840A1; AU2021394840B2; AR124292A1; MX2023000785A; KR20220081825A; PH12023550029A1; JP2023517591A; EP4261286A1; JP7447294B2; WO2022124670A1

Abstract

외래 단백질을 발현하는 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법이 제공된다. 상기 외래 단백질을 발현하는 미생물은, 야생형과 비교하여, L-아미노산의 배출능 및/또는 생산능이 향상된 것일 수 있다.

Description

쉬와넬라 아틀란티카 유래 단백질을 발현하는 미생물, 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법{Shewanella atlantica-Drived Protein Expressing Microorganism and Method of L-Amino Acid Production Using the Same}

외래 단백질을 발현하는 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법이 제공된다. 상기 외래 단백질을 발현하는 미생물은, 야생형과 비교하여, L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 향상된 것일 수 있다.

코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며 코리네박테리움 균주를 이용한 발효에 의해 생성되고 있다.

코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제조방법을 개선하기 위하여 많은 시도가 행해지고 있다. 그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 특정유전자를 파괴시키거나, 감쇠 발현시킴으로써 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있었다. 또한, 각각의 L-아미노산 생합성에 관련된 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 많이 있어왔다. 그럼에도, 여전히 L-아미노산의 생산능이 향상된 균주 개발이 요구되고 있다.

일 예는 외래 단백질을 발현하는 미생물을 제공한다. 상기 외래 단백질은 상기 미생물과 이종 미생물 유래의 단백질로서, 본 명세서에서 새롭게 라이신 배출 기능이 밝혀진 단백질일 수 있다. 상기 외래 단백질을 발현하는 미생물은 상기 외래 단백질을 발현하지 않는 동종 미생물과 비교하여, L-아미노산의 배출능 및/또는 생산능이 향상된 것일 수 있다.

다른 예는 상기 외래 단백질을 발현하는 미생물을 포함하는 L-아미노산 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 외래 단백질을 발현하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법을 제공한다.

상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.

본 명세서에서는 코리네박테리움 속 미생물의 L-아미노산 생산능 증가를 목적으로 L-아미노산의 신규한 배출 단백질을 탐색하고, 도입함으로써 균주를 개량하고자 하였다. L-라이신을 대표적인 예로서 설명하면, 일반적으로 라이신 생산능 증가를 위해서는 균주가 가지는 L-라이신 수율을 향상시키거나, 시간당 L-라이신 생산량 (생산성)을 증가시키는 방법이 있다. L-라이신 배출 단백질은 생합성을 거쳐 생성된 라이신을 배출하는 막 단백질이며, 이 단백질의 개량은 라이신 수율과 생산성 증가에 중요하다. 하지만 코리네박테리움 속 미생물이 보유하고 있는 L-라이신 배출 단백질 (lysE, Ncgl1214)의 발현량 증가는 L-라이신 생산능을 향상시키는데 한계가 있다.

이에, 본 명세서에서는 L-아미노산 배출 활성이 높은 새로운 외래 L-아미노산 배출 단백질을 탐색하고, 이를 라이신 생산 균주에 도입시킴으로써, L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 향상된, 재조합 균주를 제공한다.

본 명세서에서, 새로운 외래 L-아미노산 배출 단백질의 대표적인 예로서 쉬와넬라 아틀란티카 (Shewanella atlantica) 유래 신규 L-아미노산 배출 단백질 및 이를 암호화하는 유전자를 발굴하였으며, 이를 L-아미노산을 생산하는 미생물에 발현시킨 결과, 상기 유전자가 발현되지 않은 미생물과 비교하여 L-아미노산의 배출능/생산능이 현저히 향상됨을 확인하였다.

일 예는 외래 단백질을 발현하는 미생물을 제공한다. 상기 외래 단백질은 상기 미생물과 이종 미생물 유래의 단백질로서, 본 명세서에서 새롭게 라이신 배출 기능이 밝혀진 단백질일 수 있다. 상기 외래 단백질을 발현하는 미생물은 상기 외래 단백질을 발현하지 않는 동종 미생물과 비교하여, L-아미노산, 예컨대, L-라이신 또는 L-아르기닌의 배출능 및/또는 생산능이 향상된 것일 수 있다.

다른 예는 상기 외래 단백질을 발현하는 미생물을 포함하는 L-아미노산의 생산용 조성물을 제공한다.

상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.

상기 L-아미노산은 L-라이신 또는 L-아르기닌을 포함할 수 있다.

이하, 보다 상세히 설명한다.

본 명세서에서, 상기 외래 단백질은 모균주(변이 전 미생물)와 다른 속에 속하는 미생물 또는 다른 종의 미생물로부터 유래하는 단백질일 수 있으며, 예컨대, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물 이외의 미생물로부터 유래하는 단백질로서, 본 명세서에서 새롭게 밝혀진 L-아미노산, 예컨대, L-라이신 또는 L-아르기닌의 배출능을 가지는 단백질일 수 있다. 일 예에서, 상기 외래 단백질은 쉬와넬라 속 미생물, 예컨대 쉬와넬라 아틀란티카 (Shewanella atlantica) 유래의 막단백질 (예컨대, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표현됨); 또는 상기 단백질과 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 동일성 또는 상동성을 가지는 단백질(e.g., 막단백질) 일 수 있다.

상기 미생물은 1종 이상의 상기 외래 단백질을 포함하거나 발현하는 것일 수 있다. 상기 외래 단백질을 발현하는 미생물은 앞서 설명한 외래 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 재조합 미생물일 수 있다. 일 예에서, 상기 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 핵산 서열 또는 서열번호 2의 핵산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 동일성 또는 상동성을 가지는 서열로 표현될 수 있다.

상기 외래 단백질을 발현하는 미생물은 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖는 L-아미노산 생산 미생물일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "L-아미노산 생산 미생물"은 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖는 미생물이 앞서 설명된 바와 같은 외래 단백질을 발현하도록 변이됨으로써 상기 미생물이 증가된 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖는 경우, 및/또는 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖지 않는 미생물이 상기 외래 단백질을 발현하도록 변이됨으로써 상기 미생물이 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖게 되는 경우를 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "미생물"은 단세포 박테리아를 포괄하는 것으로, "세포"와 혼용될 수 있다. 본 명세서에서, 상기 외래 단백질을 발현하도록 변이되기 전의 미생물을 상기 변이된 미생물과 구별하기 위하여, "모균주 (parent microorganism or parent strain) 또는 숙주 세포 (host cell)"로 표현될 수 있다.

상기 L-아미노산은 L-라이신 또는 L-아르기닌, 예컨대, L-라이신일 수 있다.

일 예에서, 상기 미생물은 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖는 모든 미생물에서 선택된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 미생물, 예컨대, 변이 전의 모균주는, (1) 자연적으로 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지는 미생물, 또는 (2) 상기 자연적으로 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지는 미생물 또는 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 없거나 현저히 적은 균주에 변이가 도입되어 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지거나 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 향상된 미생물일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 미생물은 (1) 자연적으로 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지는 미생물, 또는 (2) 상기 자연적으로 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지는 미생물 또는 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 없거나 현저히 적은 모균주에 변이가 도입되어 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지거나 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 향상된 모든 코리네박테리움 속 (the genus　Corynebacterium) 미생물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium　glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium　thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium　efficiens) 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더욱 구체적으로는, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium　glutamicum)일 수 있다.

일 예에서, 상기 외래 단백질을 발현하는 미생물은 상기 외래 단백질을 발현하도록 하는 변이가 도입된 미생물일 수 있다. 이와 같이, 외래 단백질을 발현하도록 변이된 미생물은, 동종의 비변형 미생물과 비교하여, L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 증가된 것일 수 있다. 상기 비변형 미생물은 상기 외래 단백질을 발현하지 않는 미생물로서, 상기 외래 단백질을 발현하도록 하는 변이가 도입되지 않은 동종의 미생물 또는 상기 변이가 도입되기 전의 미생물을 의미할 수 있다.

본 명세서에서, "외래 단백질을 발현하도록 하는 변이"는 모균주에 앞서 설명한 외래 단백질을 발현하도록 하는 모든 조작을 의미할 수 있다. 일 예에서, 외래 단백질을 발현하도록 하는 변이는 상기 외래 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 모균주에 도입하는 것일 수 있다.

상기 "외래 단백질을 발현하도록 하는 변이가 도입된 미생물" 또는 "외래 단백질을 발현하도록 변이된 미생물"은 상기 외래 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 미생물일 수 있으며, 비변형 미생물과 비교하여, L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 부여되거나 증가된 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 모균주는 야생형이거나, L-아미노산의 배출능 및/또는 생산능이 증가되도록 변이된 것, 예컨대, 야생형과 비교하여 L-아미노산의 생합성 또는 대사에 관여하는 단백질 활성이 조절 (증가(촉진) 또는 감소(억제))된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에서, 상기 외래 단백질이 발현된 L-아미노산 생산 미생물은 기탁번호 KCCM 12828P인 것일 수 있다.

본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다, 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다, 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 표현된다" 함은 동등한 의미로 호환 가능한 표현으로, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 이들의 본래의 기능 또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 통상적인 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및/또는 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis) 등에 의하여 변형된 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 다르게 기재되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 상기 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 본래의 기능은, 라이신 배출 단백질 기능 (아미노산 서열의 경우), 또는 상기 라이신 배출 단백질 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 기능 (핵산 서열의 경우)일 수 있고, 상기 목적하는 기능은 미생물의 L-아미노산 (예컨대, L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합) 배출능 및/또는 생산능을 증가시키거나 부여하는 기능을 의미할 수 있다.

본 출원에서 용어, ‘상동성 (homology)’ 또는 ‘동일성 (identity)’은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함됨이 자명하다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 명세서에 기재된 핵산 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질(라이신 배출 단백질)을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열 및/또는 기능을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에 제공되는 특정 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 특정 핵산 서열 또는 이와 실질적으로 동등한 핵산 서열뿐만 아니라, 상기 특정 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 구체적으로, 상기 상보성을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절 가능한 Tm 값, 예컨대, 55℃, 60℃, 63℃ 또는 65℃의 Tm 값에서 혼성화하고, 후술하는 조건에서 분석할 수 있다: 이러한 조건은 공지의 문헌에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 높은 상보성을 갖는 유전자끼리 혼성화하고, 그보다 낮은 상보성을 갖는 유전자끼리는 혼성화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1x SSC(saline-sodium citrate buffer), 및 0.1%(w/v) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate); 60℃, 0.1x SSC, 및 0.1% SDS; 또는 68℃, 0.1x SSC, 및 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세척하는 조건을 등을 열거할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 혼성화에는 두 개의 뉴클레오타이드가 상보적 서열을 가질 것을 요구되거나, 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 허용될 수 있다. 상기 용어 "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오타이드 염기 간의 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, DNA의 경우, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고, 이는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "형질전환"은 표적 단백질(외래 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드나 이를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주 세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 발현조절 요소가 목적 단백질(외래 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 (예, 전사 개시)를 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 예컨대, 통상적인 부위-특이적 DNA 절단 및 연결에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전법, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 도입 (삽입)은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease system 또는 CRISPR system; 예컨대, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, 리보핵산 융합단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된 후, 숙주 세포의 게놈(유전체)과 무관하게 발현되거나, 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다.

본 명세서에서 사용가능한 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 통상 사용되는 모든 벡터들 중에서 선택될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터로서, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는　pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용 가능한 벡터는 공지된 발현 벡터 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입용 벡터일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합 또는 CRISPR 시스템에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 벡터는 상기 염색체 내 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들 중에서 선택되어 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

다른 예는 상기한 외래 단백질, 이의 암호화 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입(형질전환)시키는 단계를 포함하는, 상기 미생물의 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능 증가 방법 또는 상기 미생물에 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능 부여 방법을 제공한다.

상기 외래 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 및 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.

다른 예는 상기한 L-아미노산 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

　상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-아미노산은　배지　중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

상기 배양에 사용 가능한 배지는 탄소 공급원으로 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올), 유기산 (예: 아세트산) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한,　상기 배지는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산, 및/또는 비타민 등과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

상기 L-아미노산을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지, 배양액, 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 회수하는 단계는 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화, HPLC 등에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다. 상기 L-아미노산을 회수하는 방법은, 그 이전, 동시, 또는 그 이후에, 정제단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서는 미생물의 L-아미노산의 배출능 및/또는 생산능을 증가시키는 기술이 제공되며, 이를 위하여, 새롭게 L-아미노산의 배출능이 밝혀진 외래 단백질, 및 상기 외래 단백질을 미생물에 도입함으로써, 모균주 대비 L-아미노산의 생산성을 향상시킬 수 있는 기술이 제공된다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1: L-라이신 배출 유전자 탐색 및 선별

코리네박테리움 속 미생물이 내재적으로 보유하는 L-라이신 배출자(lysE, Ncgl1214)와 비교하여 L-라이신 배출 활성이 높은 배출자를 탐색하기 위해, NCBI CDD(Common Domain Database)를 이용한 RPS-BLAST 탐색과 KEGG Protein Database를 이용한 BLAST 탐색을 수행하였다. L-라이신을 배출할 수 있는 막단백질로 고려되는 후보 단백질을 선정하였다.

L-라이신 배출 막단백질 후보군

No.	균 주	단백질 등록 번호	게놈 등록 번호
1	Shewanella oneidensis MR-1	WP_011072781.1	NC_004347.2
2	Corynebacterium glutamicum ATCC13032	WP_003854734.1	NC_003450.3
3	Aeromonas allosaccharophila	WP_042063605.1	NZ_CDCB01000123
4	Bacillus pseudofirmus OF4	WP_012958260.1	NC_013791.2
5	Bacillus halodurans C-125	WP_010899078.1	NC_002570.2
6	Natrialba aegyptia	WP_006666837.1	NZ_AOIP01000039.1
7	Haloquadratum walsbyi	WP_011571763.1	NC_008212.1
8	Thermotoga maritima MSB8	WP_004083139.1	NC_000853.1
9	Pyrodictium delaneyi	WP_055407773.1	NZ_CP013011.1
10	Bacteroides coprophilus	WP_008140089.1	NZ_EQ973631.1
11	Shewanella atlantica HAW-EB5	WP_126504868.1	NZ_RXNV01000002.1

실시예 2: 외래 막단백질 유전자 도입 벡터 제작

상기 실시예 1에서 선정된 쉬와넬라 아틀란티카 (Shewanella atlantica, Sat) 유래의 막 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다. 미국 국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 상기 막단백질을 코딩하는 유전자 및 주변 핵산서열에 대한 정보(등록번호 NZ_RXNV01000002.1)를 획득하였다. 해당 유전자 서열을 기반으로 DNA 합성을 수행하였다(Cosmo genetech, Korea). 유전자를 증폭시키기 위하여, 합성된 DNA를 주형으로 하고 서열번호 3와 4의 프라이머(표 2)를 이용하여 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)을 수행하였다(표 3). 그 결과 609 bp의 유전자(서열번호 2)를 포함한 639 bp의 유전자 단편을 수득하였다.

프라이머 서열

No.	명칭	DNA 서열
서열번호 3	Sat-F	TAGAGGAGACACAACATGCAGGCATTTATTCAGGG
서열번호 4	Sat-R	TAGATGTCGGGCCCATTACAAGTAAGGCCATAACAA
서열번호 5	PgapA-F	AATGAGTTCCTCGAGAAACGACCGAGCCTATTGGG
서열번호 6	PgapA-R	TAAATGCCTGCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTG
서열번호 7	pDZTn-1	ACGACGCTGGTATTTCTCCC
서열번호 8	pDZTn-2	TGATTGTCGATATGACCGGG

PCR 수행 조건

단계	온도	시간
Initialization	95 ℃	2분
Denaturation	95 ℃	20초
Annealing	62 ℃	40초
Elongation	72 ℃	0.5~1분
Post Elongation	72 ℃	5분

코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 gapA 프로모터를 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 5와 6의 프라이머(표 2)를 이용하여 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)을 수행하였다(표 3).

증폭된 gapA 프로모터 부위와 상기 수득된 쉬와넬라 아틀란티카 유래 유전자 단편 및 NdeI 제한효소로 절단된 벡터 pDZTn (한국 등록특허 제10-1126041호)를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l) 이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 목적한 유전자와 pDZTn이 연결된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 7과 8(표 2)의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZTn-PgapA-Sat으로 명명하였다.

실시예 3: 외래 막단백질 도입 균주 제작

제작된 pDZTn-PgapA-Sat 벡터를 이용하여 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주 (대한민국 등록특허 제10-0159812호)를 전기천공법 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 트랜스포존 유전자의 사이에 PgapA-Sat 이 삽입된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 9와 서열번호 10의 프라이머(표4)를 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P::PgapA-Sat 로 명명하였다.

프라이머 서열

No.	명칭	DNA 서열
서열번호 9	Tn-1	TAAGGCACCGCAGAATGTAG
서열번호 10	Tn-2	TAGGACTCACCATCACCGGC

실시예 4: 외래 막단백질이 도입된 KCCM11016P 균주에서 L-아미노산 생산능 비교

KCCM11016P::PgapA-Sat 균주와 대조구 KCCM11016P를 아래와 같은 방법으로 배양하여, 균체량, 당소모능, 아미노산 생산능을 비교하였다.

먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주를 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 37℃에서 42 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-아미노산의 생산량을 측정하였다. 상기 실험은 3번 반복되었으며, 배양 결과(평균값)는 표 5에 나타내었다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO47H2O 0.5 g, 바이오틴 0.1 mg, 티아민 HCl 1 mg, 칼슘-판토텐산 22 mg, 니코틴아미드 2 mg (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 45 g, (NH4)2SO4 15 g, 대두 단백질 10 g, 당밀 10 g, KH2PO4 0.55 g, MgSO4·7H2O 0.6 g, 바이오틴 0.9 mg, 티아민 염산염 4.5 mg, 칼슘-판토텐산 4.5 mg, 니코틴아미드 30 mg, MnSO4 9 mg, FeSO4 9 mg, ZnSO4 0.45 mg, CuSO4 0.45 mg, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).

L-아미노산 생산능 비교 (KCCM11016P)

균 주	OD₅₆₂	소모당 (g/L)	라이신 농도 (g/L)	아르기닌 농도 (mg/L)
KCCM11016P	51	50	12.1	24.2
KCCM11016P::PgapA-Sat	40.5	50	13.2	26.8

KCCM11016P::PgapA-Sat 균주(Corynebacterium glutamicum CM03-1486)는 2020년 10_월 29일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12828P로 기탁번호를 부여받았다.

실시예 5: 외래 막단백질이 도입된 KCCM10770P 균주에서 L-아미노산 생산능 비교

상기 실시예 3에 기술한 방법을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P (대한민국등록특허 제10-0924065호) 균주의 게놈상 트랜스포존 위치에 PgapA-Sat 유전자가 삽입된 균주를 획득하였다. 이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P::PgapA-Sat로 명명하였다.

KCCM10770P::PgapA-Sat 균주와 대조구 KCCM10770P를 배양하여, 균체량, 당소모능, 아미노산 생산능을 비교하였다. 상기 실험은 3번 반복되었으며, 배양 결과(평균값)는 표 6에 나타내었다.

L-아미노산 생산능 비교 (KCCM10770P)

균 주	OD₅₆₂	소모당 (g/L)	라이신 생산량 (g/L)	아르기닌 농도 (mg/L)
KCCM10770P	70.3	50	8.3	16.6
KCCM10770P:: PgapA-Sat	58.8	50	9.8	20.1

표 6에 나타난 바와 같이, KCCM10770P::PgapA-Sat 균주는 대조균주인 KCCM10770P와 비교하여 증가된 아미노산 생산능을 보였다.

실시예 6: 외래 막단백질이 도입된 CJ3P 균주에서 L-아미노산 생산능 비교

야생주에 3종의 변이[pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)]를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게 된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(US 9556463 B2) 균주의 게놈상 트랜스포존 위치에 상기 실시예 3에 기술한 방법을 이용하여 PgapA-Sat 유전자가 삽입된 균주를 획득하였다. 이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P::PgapA-Sat 로 명명하였다.

CJ3P::PgapA-Sat 균주와 대조구 CJ3P 를 배양하여, 균체량, 당소모능, 아미노산 생산능을 비교하였다 (실시예 4 참조). 상기 실험은 3번 반복되었으며, 배양 결과(평균값)는 표 6에 나타내었다.

L-아미노산 생산능 비교 (CJ3P)

균 주	OD₅₆₂	소모당 (g/L)	라이신 생산량 (g/L)	아르기닌 농도 (mg/L)
CJ3P	75.5	50	3.4	53.4
CJ3P::PgapA-Sat	69.7	50	4.5	78.2

표 7에 나타난 바와 같이, CJ3P::PgapA-Sat 균주는 대조균주인 CJ3P 와 비교하여 증가된 아미노산 생산능을 보였다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12828P

20201029

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Shewanella atlantica-Drived Protein Expressing Microorganism and Method of L-Amino Acid Production Using the Same <130> DPP20203029KR <160> 10 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Membrane protein derived from Shewanella atlantica (Sat) <400> 1 Met Gln Ala Phe Ile Gln Gly Val Gly Ile Gly Gly Ser Leu Ile Met 1 5 10 15 Ala Val Gly Ala Gln Asn Ala Phe Val Leu Lys Gln Gly Leu Lys Arg 20 25 30 Ser His Ser Leu Pro Ile Ala Gly Leu Cys Ser Leu Ile Asp Ala Leu 35 40 45 Met Ile Thr Ala Gly Val Ala Gly Leu Gly His Leu Ile Leu Ala Phe 50 55 60 Pro Leu Ile Lys Asp Ile Ala Ser Ile Gly Gly Ala Ile Phe Leu Leu 65 70 75 80 Val Tyr Gly Ala Lys Ala Leu Arg Ser Ser Phe Asn Glu Gln Thr Ile 85 90 95 Ser Gln Gly Ala Thr Lys Gly Thr Glu Thr Leu Lys Ala Ala Val Leu 100 105 110 Thr Thr Leu Gly Ile Ser Leu Leu Asn Pro His Leu Tyr Leu Asp Thr 115 120 125 Val Val Leu Leu Gly Ser Ile Ser Ala Gln Phe Glu Gly Val Asp Arg 130 135 140 Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ala Val Leu Ala Ser Phe Val Trp Phe Phe 145 150 155 160 Ser Leu Ser Phe Gly Ala Arg Tyr Leu Ser Pro Leu Phe Gln Asn Pro 165 170 175 Lys Ala Trp Ser Tyr Leu Asp Arg Phe Ile Cys Met Thr Met Trp Thr 180 185 190 Ile Ala Ala Val Leu Leu Trp Pro Tyr Leu 195 200 <210> 2 <211> 609 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sat coding nucleotide sequence <400> 2 atgcaggcat ttattcaggg tgtaggaatt ggcggaagcc ttattatggc ggtgggcgca 60 caaaatgcgt ttgtattaaa gcaggggctg aagcgttcgc actctttacc cattgccgga 120 ctgtgttcat tgatcgatgc cttaatgata acggctggtg tggcaggcct gggtcatttg 180 attttggcct ttccattgat taaggatatt gccagtattg gtggggcgat cttcttgctg 240 gtttatggtg caaaggcttt aaggtcttcg tttaatgagc aaaccatatc tcaaggtgcg 300 acgaaaggga ctgaaaccct taaagctgcg gtgttgacaa ctttgggtat tagtttgctc 360 aacccgcatc tgtatctgga cacggttgtc ttgcttggta gcatcagtgc tcagtttgaa 420 ggtgttgacc gtcctctgtt tggcgcaggt gccgtactgg catcgtttgt gtggtttttt 480 agtttaagtt ttggtgcgag atacttaagt ccattatttc aaaaccctaa agcctggagc 540 tatttagaca ggtttatctg catgactatg tggaccattg cggcggtctt gttatggcct 600 tacttgtaa 609 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sat-F_primer <400> 3 tagaggagac acaacatgca ggcatttatt caggg 35 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sat-R_primer <400> 4 tagatgtcgg gcccattaca agtaaggcca taacaa 36 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgapA-F_primer <400> 5 aatgagttcc tcgagaaacg accgagccta ttggg 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgapA-R_primer <400> 6 taaatgcctg catgttgtgt ctcctctaaa gattg 35 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDZTn-1_primer <400> 7 acgacgctgg tatttctccc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDZTn-2_primer <400> 8 tgattgtcga tatgaccggg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tn-1_primer <400> 9 taaggcaccg cagaatgtag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tn-2_primer <400> 10 taggactcac catcaccggc 20

Claims

L-아미노산 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물이 서열번호 1의 쉬와넬라 아틀란티카(Shewanella atlantica) 유래 막단백질을 발현하도록 변이되고,
상기 막단백질을 발현하지 않는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물과 비교하여 L-아미노산의 생산능이 증가된,
코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물은 상기 막단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 핵산 서열로 표현되는 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신 또는 L-아르기닌인, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
삭제
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 포함하는, L-아미노산 생산용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신 또는 L-아르기닌인, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및
상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-아미노산을 회수하는 단계
를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법.
제9항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신 또는 L-아르기닌인, 방법.