KR101058893B1 - Ｌ-아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 L-아미노산 생산능 및 수크로오스 PTS(phosphoenolypyruvate dependent sucrose phosphotransferase system) 활성을 갖는 수크로오스 비자화성(non-assimilative) 에스케리시아(Escherichia) 속 미생물에 수크로오스 자화성 미생물 유래의 수크로오스 대사 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 수득된, 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
수크로오스, L-아미노산, PTS 퍼미아제, 에스케리시아 속 미생물.
Description
본 발명은 L-아미노산 생산능 및 수크로오스 PTS(phosphoenolypyruvate dependent sucrose phosphotransferase system) 활성을 갖는 수크로오스 비자화성(non-assimilative) 에스케리시아(Escherichia) 속 미생물에 수크로오스 자화성 미생물 유래의 수크로오스 대사 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 수득된, 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
발효 산업에서 주로 이용되는 전분당은 최근 바이오 연료 개발이 가속화됨에 따라 수요가 급증하고, 이상 기후에 의한 작물의 흉작으로 가격이 급상승하고 있다. 따라서, 전분당에 비해 값이 싼 수크로오스 또는 수크로오스를 다량 포함하는 당밀(molasses)을 발효 산업의 탄소원으로 이용할 경우, 보다 높은 원가 경쟁력을 확보할 수 있다.
자연계에 존재하는 야생형 대장균의 약 50 % 정도는 수크로오스를 대사할 수 있는 능력을 갖지만, 발효 산업에서 주로 이용되고 있는 산업용 대장균 K12 균주, B 균주, C 균주 등은 수크로오스를 탄소원으로 이용할 수 있는 수크로오스 자화성이 없다(Mol. Microbiol. (1988) 2:1-8, Can. J. Microbiol. (1999) 45:418-422). 그러므로 수크로오스 자화성과 관련된 유전자들을 규명하고 이를 개량하여 강화된 수크로오스 자화성 관련 유전자들을 확보하는 것과 이들을 수크로오스 비자화성 산업용 대장균에 도입하여 목적하는 대사산물을 생산하는 것은 발효산업의 가장 중요한 연구주제 중 하나이다.
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산업용 대장균에 수크로오스 자화성을 부여하기 위해 수크로오스 자화성을 갖는 미생물 유래의 수크로오스 이용성 유전자 또는 유전자군을 도입하는 방법이 주로 이용되고 있다. 예를 들면, 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae ) 과에 속하는 살모넬라 (Salmonella) 종 (J. Bacteriol. (1982) 151:68-76, Mol. Microbiol. (1988) 2:1-8, J. Bacteriol. (1991) 173:7464-7470, 미국등록특허 제7179623호), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) (J. Gen. Microbiol. (1988) 134:1635-1644), 및 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) (J. Bacteriol. (2000) 182:5351-5358)에 존재하는 scr 레귤론(regulon)을 대장균 K12에 형질전환하여 수크로오스 자화성을 부여한 것이 알려져 있다. 또한 수크로오스 자화성을 갖는 비-K12(non-K12) 대장균 또는 병원성 대장균(Appl. Environ. Microbiol. (1992) 58:2081-2088, 미국등록특허 제6960455호) 유래의 csc 레귤론, 대장균 AB1281 (미국공개특허 4806480)의 접합 플라스미드(conjugative plasmid) scr53에 존재하는 수크로오스 이용성 유전자군 및 그람 양성 미생물인 스트렙토콕코스 뮤탄스(Streptococcus mutans) (J. Bacteriol. (1989) 171:263-271), Bacillus subtilis (J. Bacteriol. (1989) 171:1519-1523) 유래의 scr 레귤론, sac 오페론 (operon) 등이 수크로오스 비자화성 미생물에 수크로오스 자화성을 부여하기 위해 이용되고 있다. 미국등록특허 제7179623호는 대장균 VKPM B-7915 유래의 scr 레귤론을 도입한 대장균 K12를 이용하여 라이신, 이소루이신, 및 발린을 생산하는 방법을 개시한다.
그러나, 수크로오스를 효율적으로 이용할 수 있는 대사 시스템을 갖춘, 산업 미생물 및 이를 이용한 발효 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다. 이에, 본 발명자들은 수크로오스 자화성을 갖는 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 수크로오스 이용 유전자군이 도입된, L-아미노산 생산 에스케리시아 속 미생물이 수크로오스로부터 고수율로 L-아미노산을 생산한다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 L-아미노산 생산능을 갖는 수크로오스 비자화성 에스케리시아 속 미생물에 수크로오스 자화성을 부여하여, 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물을 이용하여 수크로오스로부터 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-아미노산 생산능 및 수크로오스 PTS(phosphoenolypyruvate dependent sucrose phosphotransferase system) 활성을 갖는, 수크로오스 비자화성(non-assimilative) 에스케리시아(Escherichia) 속 미생물에 수크로오스 자화성 미생물 유래의 수크로오스 대사 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 수득된, 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물을 제공한다.
본 발명에서 "수크로오스 비자화성(non-assimilative) 미생물"은 수크로오스를 탄소원으로 이용하지 못하는 미생물을 의미하고, "수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 미생물"은 수크로오스를 탄소원으로 대사하여 L-아미노산을 생산할 수 있는 미생물을 의미한다.
본 발명에서 "수크로오스 대사 효소"는 수크로오스를 탄소원으로 이용하기 위해 필요한 효소를 의미하며, 프럭토키나아제(fructokinase), 수크로오스 포린(sucrosre porin), 수크로오스 PTS 퍼미아제(sucrosre PTS permease), 수크로오스 히드롤라아제(sucrose hydrolase), 인버타아제(invertase) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, "수크로오스 대사 효소"는 "Scr-PTS 효소"로도 지칭된다.
수크로오스를 탄소원으로 이용할 수 있는 대사계(metabolic system)는 세포 내로 유입된 수크로오스의 인산화를 위한 포스페이트의 제공원(source)에 따라, 크게 PTS(phosphoenolpyruvate dependent sucrose phosphotransferase)-기반 수크로오스 대사계(Scr-PTS 시스템)와 비-PTS 기반 수크로오스 대사계(Scr-non PTS 시스템)으로 나눌 수 있다. 대부분의 수크로오스를 이용할 수 있는 미생물은 Scr-PTS 시스템을 갖는다.
포스포에놀피루베이트(PEP)를 수크로오스의 인산화를 위한 포스페이트의 제공원으로 이용하는 PTS에 기반한 Scr-PTS 시스템의 대표적인 예는 그람 음성 미생물인 살모렐라 타이프뮤리움(Salmonella typhmurium)의 접합 플라스미드 pUR400이나 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)의 염색체 상에 존재하는 scr 레귤론 등이 있다. scr 레귤론은 scrK(프럭토키나아제), scrY(수크로오스 포린), scrA(수크로오스-특이적 EIIBC 성분), scrB(수크로오스-6-포스페이트 히드롤라아제) 및 scrR(LacI-관련 수크로오스-특이적 리프레서)의 5개의 유전자로 구성되며, 두 개의 오페론인 scrK와 scrYAB는 ScrR 리프레서(represser)에 의하여 음성적으로 조절된다(Mol. Microbiol. (1993) 9:195-209). scr 레귤론의 작용 기작에 따르면, 외부막 단백질(OMP, outer membrane protein)인 ScrY를 통해서 외부의 수크로오스가 세포외질(periplasmic space)로 유입되고, 유입된 수크로오스는 ScrA가 포함된 수크로오스 PTS 회로(cycle)를 통해 수크로오스-6-포스페이트(sucrose-6-phosphate)의 형태로 세포내부로 들어오게 된다. 수크로오스-6-포스페이트는 ScrB에 의해 글루코오스-6-포스페이트와 프럭토오스로 가수분해되고, 프럭토오스는 ATP 의존적 ScrK에 의해 프럭토오스-6-포스페이트로 전환되어 글루코오스-6-포스페이트와 함께 해당과정을 통해 대사된다(J. Biotechnol. (2001) 92:133-158). 수크로오스를 수크로오스-6-포스페이트의 형태로 세포 내로 운반하는 작용을 하는 수크로오스 PTS 회로는 효소 I(EI, Enzyme I), 히스티딘 단백질(HPr, histidine protein), 글루코오스-특이적 효소 IIA(EIIAcrr Glc , enzyme IIA) 및 수크로오스-특이적 효소 IIBC EIIBC scr , enzyme IIBC)로 구성된다(J. Biotechnol. (2001) 92:133-158/ J. Biotechnol. (2004) 110:181-199).
그람 양성균의 Scr-PTS 시스템은 스트렙토콕코스 뮤탄스 (Streptococcus mutans)의 scr 레귤론이 있으며, scrK, scrA, scrB, scrR 유전자로 구성된다(J. Bacteriol. (2003) 185:5791-5799).
수크로오스의 세포 내로의 유입을 위해 PTS에 기반하지 않는 수크로오스 대사계인 Scr-non PTS 시스템으로는 csc 레귤론이 잘 알려져 있다. csc 레귤론은 주로 수크로오스 자화성을 갖는 대장균에서 유래되며, 예를 들면, 야생형 대장균 중 EC3132의 csc 레귤론(Mol. Gen. Genet. (1992) 235:22-32, 미국등록특허 제6960455 호), 대장균 KO11 csc 레귤론 (Biotechnol. Lett. (2004) 26:689-693), 병원성 대장균 O157:H7의 csc 레귤론 (J. Bacteriol. (2002) 184:5307-5316), 및 ATCC13281의 csc 레귤론 (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 74:1031-1040) 등이 알려져 있다. csc 레귤론은 cscB (양성자 공수송(proton symport)-타입 수크로오스 퍼미아제), cscK (프럭토키나아제), cscA (수크로오스 히드롤라아제) 및 cscR (LacI-관련 수크로오스-특이적 리프레서)로 구성되며, 2개의 오페론, cscKB와 cscA는 CscR에 의해 음성적으로 조절을 받는다 (J. Bacteriol. (2002) 184: 5307-5316).
Scr-non PTS 시스템은 낮은 농도의 수크로오스를 효율적으로 이용할 수 없다는 단점을 갖는다. csc 레귤론이 도입된 대장균은 0.2 % 이하의 수크로오스가 포함된 배지에서 대수 증식기(doubling time)가 20시간에 이르는 것으로 보고되었다(J. Bacteriol. (2002) 184:5307-5316). 그러나 Scr-PTS 시스템은 Scr-non PTS 시스템과는 달리 낮은 농도의 수크로오스까지 세포내로 효율적으로 유입할 수 있다. 그 이유는 Scr-PTS 시스템에서 수크로오스 PTS 퍼미아제 역할을 하는 ScrA가 세포외질로 유입된 수크로오스를 세포 내로 유입할 때, 포스포에놀피루베이트(PEP)가 피루베이트로 전환되면서 생성된 유리 포스페이트를 효소 I, 히스티딘 단백질, 및 글루코오스 특이적 효소 IIA로 구성된 수크로오스 PTS 회로를 통해서 최종적으로 전달 받아서 수크로오스-6-포스페이트로 최종 전환하는 역할을 하기 때문이다. 즉, 수소의 농도 구배에 의해 외부의 수크로오스를 세포 내로 유입하는 Scr-non PTS의 CscB와는 달리, 에너지원으로 이용되는 PEP를 사용하여 수크로오스를 세포 내로 유입하므로 낮은 농도의 수크로오스까지 세포 내로 효율적으로 유입할 수 있다. 실제 수 소의 농도 구배에 의해 외부의 수크로오스를 세포내로 유입하는 Scr-non PTS의 CscB는 수크로오스에 대한 Km 값이 1.0 mM (Biochem. BiophysRes. Commun. (1995) 208:1116-1123)인 반면, ScrA의 Km 값은 10 ㎛ (J. Bacteriol. (1982) 151:68-76)로 CscB에 비해 100배 낮은 값을 보여준다. Scr-PTS 시스템에는, ScrA 이외에도 낮은 농도의 수크로오스를 효율적으로 이용할 수 있게 해주는 단백질인 ScrY가 있다. ScrY는 수크로오스 포린으로 세포 외부의 수크로오스를 세포외질로 유입하는 역할을 하고, 수크로오스 포린이 정상적으로 발현되지 않을 경우에 수크로오스 수송이 크게 감소하는 것으로 알려져 있다(J. Bacteriol. (1991) 173:449-456). 즉, Scr-PTS 시스템에서는 ScrY가 외부의 수크로오스를 세포외질로 유입하고, 유입된 수크로오스를 ScrA가 PTS 시스템을 통하여 빠른 속도로 세포 내로 유입할 수 있어서, 낮은 농도의 수크로오스까지 효율적으로 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 수크로오스 자화성 미생물 유래의 수크로오스 대사 효소를 코딩하는 유전자는 수크로오스 자화성을 갖는 미생물에서 유래된 유전자이며, 바람직하게는, PTS에 기반한 Scr-PTS 시스템을 갖는 미생물로부터 유래되는 유전자이다.
본 발명의 일 구체예에서, 수크로오스 자화성 미생물 유래의 수크로오스 대사 효소를 코딩하는 유전자는 수크로오스 자화성 클렙시엘라(Klebsiella) 속 미생물 또는 어위니아(Erwinia) 속 미생물로부터 유래된 유전자를 말하며, 보다 바람직하게는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) ATCC700721 또는 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora) ATCCBAA-672에서 유래된 유전자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 수크로오스 자화성 미생물 유래의 수크로오스 대사 효소를 코딩하는 유전자는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 유래의 프럭토키나아제, 수크로오스 포린, 수크로오스 PTS 퍼미아제, 수크로오스 히드롤라아제 및 수크로오스 전사 조절자를 코딩하는 유전자로 구성된 조합일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 수크로오스 자화성 미생물 유래의 프럭토키나아제, 수크로오스 포린, 수크로오스 PTS 퍼미아제, 수크로오스 히드롤라아제 및 수크로오스 전사 조절자를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 6의 scrK, 서열번호 7의 scrY, 서열번호 8의 scrA, 서열번호 9의 scrB, 및 서열번호 10의 scrR일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 수크로오스 비자화성 에스케리시아 속 미생물은 ScrA를 제외한 효소 I(EI, Enzyme I), 히스티딘 단백질(HPr, histidine protein) 및 글루코오스-특이적 효소 IIA(EIIAcrr Glc , enzyme IIA)로 구성된 수크로오스 PTS 회로의 활성을 가져야 한다. 바람직하게는, 수크로오스 에스케리시아 속 미생물에서 효소 I을 코딩하는 유전자(ptsI, 서열번호 19), 히스티딘 단백질을 코딩하는 유전자(ptsH, 서열번호 20) 및 글루코오스-특이적 효소 IIA를 코딩하는 유전자(crr, 서열번호 21)의 발현이 정상적으로 이루어져야 한다.
본 발명에 따른 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물의 제조를 위해, 수크로오스 비자화성 에스케리시아 속 미생물에 수크로오스 자화성 미생물에서 유래된 수크로오스 포린, 수크로오스 PTS 퍼미아제, 수크로오스 히드롤라아제, 프럭토키나아제, 및 수크로오스 전사 조절자를 코딩하는 유전자를 도입하는 것은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 수크로오스 포린, 수크로오스 PTS 퍼미아제, 수크로오스 히드롤라아제, 프럭토키나아제 및 수크로오스 전사 조절자를 코딩하는 염기서열을 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 작제하고, 작제된 재조합 벡터로 수크로오스 비자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물을 형질전환하는 것에 의해 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물을 수득할 수 있다.
본 발명의 에스케리시아 속 미생물을 수득하기 위해 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되지 않으며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, 또는 pMW118 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "형질전환"이라는 용어는 유전자를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있다면, 세포 내에서 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 존재하거나, 또는 염색체와 독립적으로 존재할 수 있다. 또한, 형질전환 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 정의되며 DNA 및 RNA를 포함한다. 형질전환 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 적합한 형태일 수 있다. 예를 들면, 형질전환 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 발현 카세트는 통상적으로 형질전환 유전자에 작동 가능 하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 형질전환 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되는 것일 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에서, L-아미노산 생산능을 갖는, 수크로오스 비자화성 에스케리시아 속 미생물은 수크로오스 자화성을 얻기 위해 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 Scr-PTS 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, L-아미노산 생산능을 갖는 수크로오스 비자화성 에스케리시아 속 미생물은 수크로오스 자화성을 얻기 위해 서열번호 17의 서열을 포함하는 재조합 플라스미드에 의해 형질전환될 수 있다. 구체적으로, 서열번호 17의 재조합 플라스미드는 클렙시엘라 뉴모니애(ATCC700721)로부터 유래된 scrKYABR, 즉, 프럭토키나아제를 코딩하는 서열번호 6의 scrK, 수크로오스 포린을 코딩하는 서열번호 7의 scrY, 수크로오스 PTS 퍼미아제를 코딩하는 서열번호 8의 scrA, 수크로오스 히드롤라아제를 코딩하는 서열번호 9의 scrB, 및 수크로오스 전사 조절자를 코딩하는 서열번호 10의 scrR을 포함한다.
본 발명에 따른 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물은 L-아미노산을 생산할 수 있고, 동시에 수크로오스 포린, 수크로오스 PTS 퍼미아제, 수크로오스 히드롤라아제, 프럭토키나아제 및 수크로오스 전사 조절자의 활성을 보유하면서 수크로오스 PTS 사이클의 활성이 유지되는 에스케리시아 속 미생물이며, 바람직하게는 대장균(Escheichia coli)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, L-아미노산은 L-쓰레오닌, O-숙시닐-호모세린, O-아세틸-호모세린, L-메티오닌, L-라이신, L-호모세린, L-이소루신, L-발린, 또는 L-트립토판일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, L-아미노산은 L-쓰레오닌일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물은 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 ABA5G을 scrKYABR 유전자군을 포함한 서열번호 17의 염기서열을 갖는 벡터로 형질전환하여 수득된 대장균 CA03-0207(KCCM 10993)일 수 있다.
또한, 본 발명은 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물을 수크로오스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 배양액으로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, L-아미노산은 L-쓰레오닌, O-숙시닐-호모세린, O-아세틸-호모세린, L-메티오닌, L-라이신, L-호모세린, L-이소루신, L-발린, 또는 L-트립토판일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, L-아미노산은 L-쓰레오닌일 수 있다.
본 발명에 따른 L-아미노산을 생산하는 방법은 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물을 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 에스케리시아 속 미생물을 배양하는 단계는 해당 미생물에 적당한 배지와 배양조건에서 수행될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 주어진 균주에 적당한 배지 및 배양조건을 용이하게 선택할 수 있고 조정할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 에스케리시아 속 미생물을 배양하는 단계는 균주를 수크로오스를 포함한 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.
본 발명에서 사용되는 배지는 수크로오스 또는 수크로오스를 다량으로 포함한 당밀도 주탄소원으로 포함하며, 주탄소원 외에 다양한 탄소원을 적정량으로 포함할 수 있다. 배지에 포함될 수 있는 질소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원을 포함한다. 배지 내에 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 또는 그의 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 배지의 주요 성분들은 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 배양 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃일 수 있다. 배양은 목적 물질인 L-아미노산의 생성량이 주어진 조건 하에서 증가되는 한 지속될 수 있고, 예를 들면, 10 내지 100 시간일 수 있다.
본 발명에 따른 L-아미노산을 생산하는 방법은 미생물의 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함한다. 배양물로부터 L-아미노산의 회수는 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 수크로오스 자화성을 갖는, L-아미노산 생산 미생물을 이용하면, 값싼 수크로오스를 탄소원으로 이용하여 경제적으로 L-아미노산을 생산할 수 있다.
실시예 1: 수크로오스 이용성 유전자
scr
레귤론의 클로닝 및 염기서열 결정
(1) 수크로오스 자화성 미생물 유래의 scr 레귤론의 클로닝
수크로오스 비자화성 에스케리시아 속 미생물에 수크로오를 자화성을 부여하기 위해 수크로오스 이용성 유전자군인 scr 레귤론을 수크로오스 자화성 미생물로부터 수득하였다. scr 레귤론은 scrK(프럭토키나아제), scrY(수크로오스 포린), scrA(수크로오스-특이적 EIIBC 성분), scrB(수크로오스-6-포스페이트 히드롤라아제) 및 scrR(LacI-관련 수크로오스-특이적 리프레서)의 5개의 유전자로 구성되며, 두 개의 오페론인 scrK와 scrYAB는 ScrR 리프레서에 의하여 음성적으로 조절된다(Mol. Microbiol. (1993) 9:195-209).
Scr-PTS 시스템인 scrKYABR 유전자를 미국생물자원센터(American Type Culture Collection)로부터 구매한 클렙시엘라 뉴모니애(ATCC700721D-5) 및 어위니아 카로토보라(Erwinia carotobora)(ATCCBAA-672D)의 각 염색체를 주형으로 한 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통해 수득하였다. 클렙시엘라 뉴모니애의 scr 레귤론인 scrKYABR은 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하고, 어위니아 카로토보라의 scrKYABR는 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통해 각각 게놈 상에 연속적으로 존재하는 5종의 유전자 전부를 단일 폴리뉴클레오티드로 증폭시켜 수득하였다. 서열번호 1과 3의 프라이머는 제한 효소 ApaLI 부위를 가지며, 서열번호 2와 4의 프라이머는 StuI 부위를 갖는다. 이 때 이용한 프라이머는 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록된 클렙시엘라 뉴모니애(KEGG organism, kpn)와 어위니아 카로토보라(KEGG organism, eca)의 scrKYABR 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 제작하였다.
PCR은 94℃에서의 3분의 변성 후, 94℃에서의 30초 변성, 56℃에서의 30초 어닐링(annealing) 및 72℃에서의 5분 중합으로 구성된 사이클을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 클렙시엘라 뉴모니애로부터 7046 bp의 폴리뉴클레오티드를 수득하였으며, 어위니아 카로토보라로부터 7223 bp의 폴리 뉴클레오티드를 수득하였다. PCR에 의해 수득된 각각의 폴리뉴클레오티드를 ApaLI 및 FspI에 의해 처리한 후, pACYC177 벡터의 ApaLI, FspI 위치에 클로닝하고, 대장균 DH5α에 형질전환하여 1 % 수크로오스를 함유한 맥콘키 고체배지(MacConkey agar plate)에 도말하였다. 형성된 콜로니 중 진한 보라(purple)색을 띠는 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 미니프렙(mini-prep)법을 이용하여 클렙시엘라 뉴모니애 및 어위니아 카로토보라 유래의 플라스미드를 수득하였다.
(2) scrKYABR 유전자의 염기서열 결정
(2-1) 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 scr 레귤론
상기 (1)에서 수득된 클렙시엘라 뉴모니애의 scr 레귤론이 포함된 플라스미드를 pAscrKP로 명명하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 염기서열 결정 방법을 이용하여 ApaLI, FspI 위치에 클로닝된 scrKYABR의 염기서열을 결정하였다(서열번호 5). 도 1은 클렙시엘라 뉴모니애(ATCC700721) 유래의 scrKYABR을 포함하는 재조합 플라스미드 pAscrKP의 작제도이다. 서열번호 5의 scrKYABR 서열에서 307번째부터 1230번째 염기서열은 scrK 유전자(서열번호 6), 1395번째부터 2912번째 염기서열은 scrY 유전자(서열번호 7), 3017번째부터 4387번째 염기서열은 scrA 유전자(서열번호 8), 4387번째부터 5787번째 염기서열은 scrB 유전자(서열번호 9), 및 5817번째부터 6821번째 염기서열은 scrR 유전자(서열번호 10)로 확인하였다.
(2-2) 어위니아 카로토보라 유래의 scr 레귤론
상기 (1)에서 수득된 어위나아 카로토보라의 scr 레귤론이 포함된 플라스미드를 pAscrEC로 명명하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 염기서열 결정 방법을 이용하여 ApaLI, FspI 위치에 클로닝된 scrKYABR의 DNA 염기서열을 결정하였다(서열번호 11). 서열번호 11의 scrKYABR 서열에서 412번째부터 1347번째 염기서열은 scrK 유전자(서열번호 12), 1538번째부터 3073번째 염기서열은 scrY 유전자(서열번호 13), 3153번째부터 4523번째 염기서열은 scrA 유전자(서열번호 14), 4523번째부터 5932번째 염기서열은 scrB 유전자(서열번호 15), 및 5963번째부터 6982번째 염기서열은 scrR 유전자(서열번호 16)로 확인하였다.
실시예 2. 수크로오스 자화성, L-아미노산 생산 미생물의 작제
(1) 재조합 플라스미드에 의한 형질전환
실시예 1에서 수득된, 수크로오스 이용성 유전자군인 scr 레귤론을 포함하는 pAscrKP(서열번호 17)와 pAscrEC(서열번호 18)를 각각 쓰레오닌을 생산하는 대장균에 도입하였을 때, 수크로오스를 이용하여 성장하고, 실제로 효율적인 쓰레오닌 생산이 가능한지 여부를 확인하기 위해 통상적인 형질전환 방법을 통해 상기 플라스미드를 대장균 ABA5G에 도입하였다. pAscrKP 또는 pAscrEC로 형질전환된 대장균 ABA5G를 1% 수크로오스를 함유한 맥콘키 고체배지(MacConkey agar plate)에 도말하고, 형성된 콜로니 중 진한 보라색(purple)을 띠는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니에 대해 PCR을 통해 수크로오스 이용성 유전자가 포함된 플라스미드를 갖는 것을 확인하였다.
(2) pAscrKP 및 pAscrEA 형질전환 미생물에 의한 쓰레오닌 생산
상기 (1)에서 수득한 콜로니를 33℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지(트립톤 1 g, NaCl 1g, 효모 추출물 0.5g/100ml, 1.5% 한천) 중에 밤새 배양한 후, 하기 표 1에 표시된 조성을 갖는 수크로오스를 주 탄소원으로 포함하는 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 33℃, 200 rpm의 배양기에서 70 시간 배양했다.
[표 1]
| 조성물 | 농도 (리터당) |
| 수크로오스 | 70 g |
| KH2PO4 | 2 g |
| (NH4)2SO4 | 25 g |
| MgSO4·7H2O | 1 g |
| FeSO4·7H2O | 5 mg |
| MnSO4·4H2O | 5 mg |
| 효모 추출물 | 2 g |
| 탄산칼슘 | 30 g |
| pH | 6.8 |
대조군은 플라스미드에 의해 형질전환되지 않은 모균주인 대장균 ABA5G였고, 글루코오스 대비 수크로오스의 이용율 및 쓰레오닌 생산성을 비교하기 위해, 수크로오스를 글루코오스로 치환한 표 1의 조성의 배지에서도 배양을 수행하였다. 배양 결과가 하기 표 2에 요약된다.
[표 2]
| 글루코오스 (70 g/L) | 수크로오스 (70 g/L) | |||
| OD | L-쓰레오닌(g/L) | OD | L-쓰레오닌(g/L) | |
| ABA5G | 14.7 | 21.5 | - | - |
| ABA5G/pAscrEC | 14.4 | 21.6 | 8.4 | 12.2 |
| ABA5G/pAscrKP | 14.6 | 21.2 | 15.0 | 26.5 |
표 2에 표시된 바와 같이 pAscrEC를 포함하는 대장균 ABA5G/pAscrEC는 44.3 g/L(데이터 미포함)의 수크로오스를 이용하고 12.2 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였으며, pAscrKP를 포함하는 대장균 ABA5G/pAscrKP는 70시간 배양시 배양액 내의 수크로오스 70 g/L를 전부 이용하고, 26.5 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. pAscrEC나pAscrKP를 포함한 대장균 ABA5G의 경우 수크로오스 이용성을 보이는 반면 플라스미드가 포함되지 않은 모균주인 대장균 ABA5G의 경우 수크로오스를 전혀 이용하지 못함을 확인하였다. 또한 pAscrKP가 포함된 ABA5G의 경우 pAscrEC가 포함된 ABA5G에 비해 수크로오스 이용성과 쓰레오닌 생산성이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 특히 pAscrKP가 포함된 ABA5G의 경우 글루코오스가 포함된 역가 배지 조건에서 L-쓰레오닌 농도가 21.2 g/L인 반면 수크로오스가 포함된 역가 배지에서는 L-쓰레오닌 농도가 26.5 g/L로 L-쓰레오닌 생산성이 약 1.3배 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, pAscrKP가 포함한 재조합 균주의 경우, 수크로오스 이용성 및 L-쓰레오닌의 생산성이 우수함을 확인할 수 있었으며, 상기 형질전환된 미생물을 CA03-0207로 명명하고, 2009년 2월 23일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM 10993으로 기탁하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않으면서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 클렙시엘라 뉴모니애(ATCC700721) 유래의 scrKYABR을 포함하는 재조합 플라스미드 pAscrKP의 작제도이다.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> L-amino acid producing microorganisms and process for producing
L-amino acids using the same
<160> 21
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of scrKYABR from Klebsiella pneumoniae
<400> 1
cctcgtgcac agatgcgtag tcagcgtcag 30
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of scrKYABR from Klebsiella pneumoniae
<400> 2
aaccaggcct actagtggat gttaagccgg gcgctg 36
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of scrKYABR from Erwinia carotovora
<400> 3
gccagtgcac ccctgaccgt aatagtgaag g 31
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of scrKYABR from Erwinia carotovora
<400> 4
gccgaggcct actagtcagg cagataaaag cgtcga 36
<210> 5
<211> 7038
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae(ATCC700721)
<400> 5
gtgcacagat gcgtagtcag cgtcagcttc tggtaccgat cgtaaatatc gccaaaactg 60
gggttcatcg cgctacgcac tcctttacct ttggccaccg cggcggggct aaccgcgacc 120
tggtgaacta tacctaagcg ggtggggaag gaaaagtcca gatctggagt ggcgaaatat 180
tccgcctggc tcacattttt taccctcgcc tccctgtttc gtgacccaat cgttccgctt 240
accggtgggc tgtgctttaa tgagctaaac cggtttaata aagtttagct tagaggagct 300
tgtcgtatga atggaaaaat ctgggtactc ggcgatgcgg tcgtcgatct cctgcccgat 360
ggagagggcc gcctgctgca atgccccggc ggcgcgccgg ccaacgtggc ggtcggcgtg 420
gcgcggctcg gcggtgacag cgggtttatc ggccgcgtcg gcgacgatcc cttcggccgt 480
tttatgcgtc acaccctggc gcaggagcaa gtggatgtgg actatatgcg cctcgatgcg 540
gcgcagcgca cctccacggt ggtggtcgat ctcgatagcc acggggagcg cacctttacc 600
tttatggtcc gtccgagcgc cgacctgttc cttcagcccg aggatctccc gccgtttgcc 660
gccggtcagt ggctgcacgt ctgctccatc gctctcagcg cggagccgag ccgcagcacg 720
acattcgcgg cgatggaggc gataaagcgc gccgggggct atgtcagctt cgaccccaat 780
atccgcagcg acctgtggca ggatccgcag gaccttcgcg actgtctcga ccgggcgctg 840
gccctcgccg acgccataaa actttcggaa gaggagctgg cgtttatcag cggcagcgac 900
gacatcgtca gcggcaccgc ccggctgaac gcccgcttcc agccgacgct actgctggtg 960
acccagggta aagcgggggt ccaggccgcc ctgcgcgggc aggttagcca cttccctgcc 1020
cgcccggtgg tggccgtcga taccaccggc gccggcgatg cctttgtcgc cgggctactc 1080
gccggcctcg ccgcccacgg tatcccggac aacctcgcag ccctggctcc cgacctcgcg 1140
ctggcgcaaa cctgcggcgc cctggccacc accgccaaag gcgccatgac cgccctgccc 1200
tacagggacg atcttcagcg ctcgctgtga tccccttggg ccggttaacg gcccactttg 1260
ctggcgacat cacaattctt aaaccggttt agcaattttt attttcaccg cgttaccgac 1320
atgtttacca tatcaactaa accggtttag caaacgttag cacactcact gatttacctt 1380
tggatgtcac caacatgtat aaaaaacgga agttagccat tcttattgct ttgctaaccg 1440
gcaccgccgc cgcccatggg cagacagacc tgaacagcat tgaagcgcgt ctcgccgccc 1500
tggaaaaacg cctgcaggac gccgagaccc gcgccagcac tgccgaaagc cgcgccgcct 1560
cagcggagca gaaagttcag cagttaaccc agcagcagca gcaaacccag gccaccaccc 1620
agcaggtggc caggcgcacc actcaactgg aagaaaaagc cgaacggccc ggcggctttg 1680
agttccacgg ctatgcgcgt tccggggtga tcatgaacga ctcggccgcc agtaccaaat 1740
ccggcgctta tatgaccccc gccggggaga ccggcggcgc cattggtcgc ctgggcaacc 1800
aggccgacac ctatgtggaa atgaacctcg aacataaaca gaccctggac aacggggcga 1860
ccacccgttt caaagtgatg gtggccgacg gacagaccac ttataacgac tggacggcaa 1920
gcagcagcga tctgaacgtg cgccaggcgt tcgtcgagct gggcaacctg ccgaccttcg 1980
aaggcccgtt cagaggctcg accctgtggg ccgggaaacg ctttgaccgc gacaacttcg 2040
acatccactg gattgactcg gatgtggtgt tcctcgccgg gaccggcggc gggatctacg 2100
acgtgaaatg gaacgacagc ctgcgcagca acttctcgtt atacggccgc aactttggcg 2160
atatcgccga cagcagcaac agcgtgcaga actatatcgt cagcatgaat aactttgccg 2220
gcccggtgcg gatgatggtc agcgggatgc gggcgaaaga taatgacgac cgccaggacg 2280
cgaacggcaa tctggtgaaa ggcgatgccg ctaacaccgg ggttcatgcc ctgctgggcc 2340
tgcacaatga gagcttctat ggcctgcgcg acgggaccag caaaacggcc ctgctgtacg 2400
gccacgggct gggcgccgag gttaaaggca tcggctccga cggcgcgctg cgcccggggg 2460
ccaatacctg gcgcttcgcc agctatggca ccacgccgct gagcgatcgc tggtttattg 2520
ccccggccgt gctggcgcag agcagtaaag atcgttatgt cgatggcgac agctatcagt 2580
gggccaccct caacctgcgt ctgattcagg aagtgacgca gaacttcgcc ctcgcctggg 2640
agggcagcta tcagtacatg gatctgcagc ctgaaggcta caacgatcgc catgcggtca 2700
atggcagctt ctacaagctg accttcgccc cgaccttcaa ggtgggcagc atcggcgact 2760
tcttctcgcg gccggagatc cgcttctata catcgtggat ggactggagc aaaaaactgg 2820
acaactacgc caacgatgac gcgttaggca gcaacggatt caaatcgggc ggcgaatggt 2880
cgttcggtat gcaaatggag acctggttct gacggcaacc ggggcgacag ggtaaataac 2940
acataaatat aaggttcgcg gcgcctgcca cggctggcgc cgcccacgcc atatcatcat 3000
gcatttagag ggtactatgg attttgaaca gatttcccgc tcactgcttc ccctgctggg 3060
cggcaaggaa aatatcgcca gcgccgcgca ctgcgccacc cgcctgcggc tggtgctggt 3120
cgacgacgcg ctcgccgatc agcaggcgat tggcaaaatc gacggggtga aaggctgctt 3180
tcgcaatgcc ggacagatgc agatcatctt cggcaccggg gtggtcaata aagtctatgc 3240
cgcctttatc caggccgcag gcatcagcga atcgagcaaa tccgaagccg ccgacctggc 3300
ggcgaaaaag ctgaacccgt tccagcgcat cgcccgcctg ctgtccaaca tcttcgtgcc 3360
gattattccg gccatcgtcg cctccggcct gctgatgggc ctgctgggga tggtgaaaac 3420
ctacggttgg gtcgacccga gcaacgctct ctatatcatg ctggatatgt gcagttcggc 3480
ggcgtttatc attctgccga tcctgatcgg ctttaccgcc gcacgcgaat ttggcggtaa 3540
cccctatctg ggcgcgaccc tcggcgggat cctcacccat ccggcgctga ccaacgcctg 3600
gggcgtcgcc gccggcttcc acaccatgaa tttcttcggc atcgaagtgg cgatgatcgg 3660
ctaccagggc accgtcttcc cggtgctgct ggcggtgtgg tttatgagca tggtcgagaa 3720
gcggctgcgc cgcgtgatcc ctgacgcgct ggacctgatc ctcactccgt tcctgacggt 3780
gattatctcc ggctttatcg ccctgctgct gatcggcccg gccggtcgcg cgctcggcga 3840
cggcatttcg tttatcctca gcacgcttat cagccatgcc ggctggctgg cgggcctgct 3900
gttcggcggc ctctattcgg tgatcgtcat taccggtatc catcacagct tccatgccat 3960
cgaggccgga ctgctgggca acccatcgat tggcgtcaac ttcctgctgc cgatctgggc 4020
gatggccaac gtcgcccagg gcggcgcctg ctttgcggtg tggtttaaaa ccaaagatgc 4080
caaaataaaa gccatcaccc tgccgtcggc gttttcggcg atgctgggga tcaccgaggc 4140
ggcaatcttc gggattaacc tgcgctttgt gaaaccgttt atcgccgcgc tggtgggcgg 4200
tgccgccggc ggcgcctggg tggtgtcgat gcacgtctac atgaccgcgg tgggcctgac 4260
ggcgatcccg gggatggcta tcgtgcaggc cagctcgctg ctgaactaca ttatcggaat 4320
ggcgatcgcc ttcgccgtgg ccttcgcgct ctctctgacg ctgaaataca aaacggacgc 4380
tgaataatgt cattaccgtc acgcctgcct gcgatcctgc aggccgttat gcagggccag 4440
ccgcaggcgc tggccgacag ccattatccg caatggcatc tggcgccggt caacggactg 4500
ctgaacgatc ctaacggctt ttgccaggtc gccgggcgtt accacctgtt ttatcagtgg 4560
aacccgctcg cccgcgacca tacctataag tgctggggac actggagctc tgccgatctg 4620
ctgcactggc ggcacgaacc tatcgccctg atgccggatg aagagtatga ccgcaacggc 4680
tgctactctg gcagcgcggt cgagttcgag ggcgccctga ctctgtgcta caccggcaac 4740
gtgaaattcc ccgacggcgg gcgcaccgcc tggcaatgtc tggcgaccga gaatgccgat 4800
ggcaccttcc gcaagctggg gccggtgctg ccgctgccag aaggctatac cggccatgtg 4860
cgcgacccta aagtgtggcg gcaggacggg cgctggtaca tggttcttgg ggcgcaggat 4920
gtgcaacagc gcggcaaagt gctgctgttt accgccagcg acctgcggga gtggcgcctg 4980
gtgggcgaga ttgccgggca cgacgtaaac ggcctggcga acgccggcta catgtgggag 5040
tgcccggatc tctttccgct ggcggacacc cacctgctga tctgctgccc gcaggggctg 5100
gcccgcgaag cgcagcgctt tctcaatacc tatccggcgg tgtggatggc aggccgcttc 5160
gacgccgaac gcgggatctt cgaccacggc ccgctgcacg agctggacag cggatttgag 5220
ttctacgcgc cgcagaccat gcaggccgat gatggccgcc gcctgctggt tggctggatg 5280
ggcgtccccg acggggacga gatgcatcag cccacccgcg cgcagggctg gatccatcag 5340
atgacctgcg tgcgtgagct ggagtggcag gctggcactc tgtatcagcg tccgctgcgc 5400
gagctggtcg ccctgcgcgg ggaagcccag ggctggtgcg gacagaccct gcccctcgcc 5460
ccgatggagc tggcctttga catcgccccc aacagcacgc tggggctgga ctttgccggc 5520
gccctgcagc tcaccgtcaa tcgcgacggc ctgcgtctgt cgcgtcgcgg cctgcagacg 5580
gcggagctgc atcaccgcta ctggcgcggc gaggcgcgac gcctgcggat ctttatcgac 5640
cgctccagcg tggagatttt catcaacgat ggcgaggggg tgatgagcag ccgcttcttc 5700
ccgggctatc cggggcagct catcttcagc ggtgcgacgc cggtagcatt ctgccgctgg 5760
ctgctgcggc catgcatggt agaataagcg ttttgctttc aggctcccgg gtgctgatga 5820
aaaccaaacg cgtaactatc aaagatatcg ccgaactggc gggcgtctcc aaagcgaccg 5880
ccagcctggt actcaacggt cgtggtaaag agctgcgcgt ggcgcaggag acgcgcgagc 5940
gcgtactggc gatcgctcgc gaacagcact atcagccgag cattcacgcg cgctcgctgc 6000
gcgataaccg cagccatacc attggtctgg tggtgccgga gatcaccaac tacgggtttg 6060
ccgttttctc ccacgagctt gagacgctct gccgggaagc cggcgtgcag ctgcttatct 6120
cctgcaccga cgaaaaccct ggccaggaga gcgtggtggt caataacatg atcgcccgcc 6180
aggtcgacgg cctgattgtc gccccttgta tgcacagcga tgccgactat cagaaactca 6240
gcgaacagct gccggtggtg ctgtttgacc gctcccccag cgacagcgcc ctgccgctgg 6300
tgatgaccga ctcggtcacc ccaacggccg agctgatctc ccgtatcgcg cctcagcatg 6360
cggacgagtt ctggtttctc ggcggccagc cgcggctgtc gccgtcgcgc gaccggctgg 6420
cggggttcac ccagggcctg gcccaggcgg ggatcacgct gcgccctgag tgggtgatca 6480
acggcaacta ccaccccagc tccggctatg agatgttcgc ggcgctctgc gcgcggctgg 6540
ggcgtccgcc gaaggcgctc ttcaccgcgg cctgcgggct gctcgaaggg gtgctgcgct 6600
atatgagcca gcatcatctg ctggattcca atattcatct cgccagcttc gacgatcact 6660
atctgtatga ttcgctttcc ctgcgcattg ataccgtgca gcaggataat cgccagctgg 6720
cctggcactg ctacgatctg ctcagccagc tgatcgacgg tcaggccccg gagccgcttc 6780
agcgctacct gcccgccacc ctgcagattc gccatccctg acggcgcggt tggcaattag 6840
cgttttcgcc tagcgcgcgc cgcttgcctc agcgccagca gcgcgctggc gagcacccgc 6900
caaggccgat cgttaccggc cagcggtaag ccaccagcaa cgagggcaat ccaccatccg 6960
gcgccagcat caccagattc cagcccgcca gccccgcgtt gccgttcagc gcccggctta 7020
acatccacta gtagggca 7038
<210> 6
<211> 924
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae(ATCC700721)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(924)
<223> scrK
<400> 6
atgaatggaa aaatctgggt actcggcgat gcggtcgtcg atctcctgcc cgatggagag 60
ggccgcctgc tgcaatgccc cggcggcgcg ccggccaacg tggcggtcgg cgtggcgcgg 120
ctcggcggtg acagcgggtt tatcggccgc gtcggcgacg atcccttcgg ccgttttatg 180
cgtcacaccc tggcgcagga gcaagtggat gtggactata tgcgcctcga tgcggcgcag 240
cgcacctcca cggtggtggt cgatctcgat agccacgggg agcgcacctt tacctttatg 300
gtccgtccga gcgccgacct gttccttcag cccgaggatc tcccgccgtt tgccgccggt 360
cagtggctgc acgtctgctc catcgctctc agcgcggagc cgagccgcag cacgacattc 420
gcggcgatgg aggcgataaa gcgcgccggg ggctatgtca gcttcgaccc caatatccgc 480
agcgacctgt ggcaggatcc gcaggacctt cgcgactgtc tcgaccgggc gctggccctc 540
gccgacgcca taaaactttc ggaagaggag ctggcgttta tcagcggcag cgacgacatc 600
gtcagcggca ccgcccggct gaacgcccgc ttccagccga cgctactgct ggtgacccag 660
ggtaaagcgg gggtccaggc cgccctgcgc gggcaggtta gccacttccc tgcccgcccg 720
gtggtggccg tcgataccac cggcgccggc gatgcctttg tcgccgggct actcgccggc 780
ctcgccgccc acggtatccc ggacaacctc gcagccctgg ctcccgacct cgcgctggcg 840
caaacctgcg gcgccctggc caccaccgcc aaaggcgcca tgaccgccct gccctacagg 900
gacgatcttc agcgctcgct gtga 924
<210> 7
<211> 1518
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae(ATCC700721)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1518)
<223> scrY
<400> 7
atgtataaaa aacggaagtt agccattctt attgctttgc taaccggcac cgccgccgcc 60
catgggcaga cagacctgaa cagcattgaa gcgcgtctcg ccgccctgga aaaacgcctg 120
caggacgccg agacccgcgc cagcactgcc gaaagccgcg ccgcctcagc ggagcagaaa 180
gttcagcagt taacccagca gcagcagcaa acccaggcca ccacccagca ggtggccagg 240
cgcaccactc aactggaaga aaaagccgaa cggcccggcg gctttgagtt ccacggctat 300
gcgcgttccg gggtgatcat gaacgactcg gccgccagta ccaaatccgg cgcttatatg 360
acccccgccg gggagaccgg cggcgccatt ggtcgcctgg gcaaccaggc cgacacctat 420
gtggaaatga acctcgaaca taaacagacc ctggacaacg gggcgaccac ccgtttcaaa 480
gtgatggtgg ccgacggaca gaccacttat aacgactgga cggcaagcag cagcgatctg 540
aacgtgcgcc aggcgttcgt cgagctgggc aacctgccga ccttcgaagg cccgttcaga 600
ggctcgaccc tgtgggccgg gaaacgcttt gaccgcgaca acttcgacat ccactggatt 660
gactcggatg tggtgttcct cgccgggacc ggcggcggga tctacgacgt gaaatggaac 720
gacagcctgc gcagcaactt ctcgttatac ggccgcaact ttggcgatat cgccgacagc 780
agcaacagcg tgcagaacta tatcgtcagc atgaataact ttgccggccc ggtgcggatg 840
atggtcagcg ggatgcgggc gaaagataat gacgaccgcc aggacgcgaa cggcaatctg 900
gtgaaaggcg atgccgctaa caccggggtt catgccctgc tgggcctgca caatgagagc 960
ttctatggcc tgcgcgacgg gaccagcaaa acggccctgc tgtacggcca cgggctgggc 1020
gccgaggtta aaggcatcgg ctccgacggc gcgctgcgcc cgggggccaa tacctggcgc 1080
ttcgccagct atggcaccac gccgctgagc gatcgctggt ttattgcccc ggccgtgctg 1140
gcgcagagca gtaaagatcg ttatgtcgat ggcgacagct atcagtgggc caccctcaac 1200
ctgcgtctga ttcaggaagt gacgcagaac ttcgccctcg cctgggaggg cagctatcag 1260
tacatggatc tgcagcctga aggctacaac gatcgccatg cggtcaatgg cagcttctac 1320
aagctgacct tcgccccgac cttcaaggtg ggcagcatcg gcgacttctt ctcgcggccg 1380
gagatccgct tctatacatc gtggatggac tggagcaaaa aactggacaa ctacgccaac 1440
gatgacgcgt taggcagcaa cggattcaaa tcgggcggcg aatggtcgtt cggtatgcaa 1500
atggagacct ggttctga 1518
<210> 8
<211> 1371
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae(ATCC700721)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1371)
<223> scrA
<400> 8
atggattttg aacagatttc ccgctcactg cttcccctgc tgggcggcaa ggaaaatatc 60
gccagcgccg cgcactgcgc cacccgcctg cggctggtgc tggtcgacga cgcgctcgcc 120
gatcagcagg cgattggcaa aatcgacggg gtgaaaggct gctttcgcaa tgccggacag 180
atgcagatca tcttcggcac cggggtggtc aataaagtct atgccgcctt tatccaggcc 240
gcaggcatca gcgaatcgag caaatccgaa gccgccgacc tggcggcgaa aaagctgaac 300
ccgttccagc gcatcgcccg cctgctgtcc aacatcttcg tgccgattat tccggccatc 360
gtcgcctccg gcctgctgat gggcctgctg gggatggtga aaacctacgg ttgggtcgac 420
ccgagcaacg ctctctatat catgctggat atgtgcagtt cggcggcgtt tatcattctg 480
ccgatcctga tcggctttac cgccgcacgc gaatttggcg gtaaccccta tctgggcgcg 540
accctcggcg ggatcctcac ccatccggcg ctgaccaacg cctggggcgt cgccgccggc 600
ttccacacca tgaatttctt cggcatcgaa gtggcgatga tcggctacca gggcaccgtc 660
ttcccggtgc tgctggcggt gtggtttatg agcatggtcg agaagcggct gcgccgcgtg 720
atccctgacg cgctggacct gatcctcact ccgttcctga cggtgattat ctccggcttt 780
atcgccctgc tgctgatcgg cccggccggt cgcgcgctcg gcgacggcat ttcgtttatc 840
ctcagcacgc ttatcagcca tgccggctgg ctggcgggcc tgctgttcgg cggcctctat 900
tcggtgatcg tcattaccgg tatccatcac agcttccatg ccatcgaggc cggactgctg 960
ggcaacccat cgattggcgt caacttcctg ctgccgatct gggcgatggc caacgtcgcc 1020
cagggcggcg cctgctttgc ggtgtggttt aaaaccaaag atgccaaaat aaaagccatc 1080
accctgccgt cggcgttttc ggcgatgctg gggatcaccg aggcggcaat cttcgggatt 1140
aacctgcgct ttgtgaaacc gtttatcgcc gcgctggtgg gcggtgccgc cggcggcgcc 1200
tgggtggtgt cgatgcacgt ctacatgacc gcggtgggcc tgacggcgat cccggggatg 1260
gctatcgtgc aggccagctc gctgctgaac tacattatcg gaatggcgat cgccttcgcc 1320
gtggccttcg cgctctctct gacgctgaaa tacaaaacgg acgctgaata a 1371
<210> 9
<211> 1401
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae(ATCC700721)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1401)
<223> scrB
<400> 9
atgtcattac cgtcacgcct gcctgcgatc ctgcaggccg ttatgcaggg ccagccgcag 60
gcgctggccg acagccatta tccgcaatgg catctggcgc cggtcaacgg actgctgaac 120
gatcctaacg gcttttgcca ggtcgccggg cgttaccacc tgttttatca gtggaacccg 180
ctcgcccgcg accataccta taagtgctgg ggacactgga gctctgccga tctgctgcac 240
tggcggcacg aacctatcgc cctgatgccg gatgaagagt atgaccgcaa cggctgctac 300
tctggcagcg cggtcgagtt cgagggcgcc ctgactctgt gctacaccgg caacgtgaaa 360
ttccccgacg gcgggcgcac cgcctggcaa tgtctggcga ccgagaatgc cgatggcacc 420
ttccgcaagc tggggccggt gctgccgctg ccagaaggct ataccggcca tgtgcgcgac 480
cctaaagtgt ggcggcagga cgggcgctgg tacatggttc ttggggcgca ggatgtgcaa 540
cagcgcggca aagtgctgct gtttaccgcc agcgacctgc gggagtggcg cctggtgggc 600
gagattgccg ggcacgacgt aaacggcctg gcgaacgccg gctacatgtg ggagtgcccg 660
gatctctttc cgctggcgga cacccacctg ctgatctgct gcccgcaggg gctggcccgc 720
gaagcgcagc gctttctcaa tacctatccg gcggtgtgga tggcaggccg cttcgacgcc 780
gaacgcggga tcttcgacca cggcccgctg cacgagctgg acagcggatt tgagttctac 840
gcgccgcaga ccatgcaggc cgatgatggc cgccgcctgc tggttggctg gatgggcgtc 900
cccgacgggg acgagatgca tcagcccacc cgcgcgcagg gctggatcca tcagatgacc 960
tgcgtgcgtg agctggagtg gcaggctggc actctgtatc agcgtccgct gcgcgagctg 1020
gtcgccctgc gcggggaagc ccagggctgg tgcggacaga ccctgcccct cgccccgatg 1080
gagctggcct ttgacatcgc ccccaacagc acgctggggc tggactttgc cggcgccctg 1140
cagctcaccg tcaatcgcga cggcctgcgt ctgtcgcgtc gcggcctgca gacggcggag 1200
ctgcatcacc gctactggcg cggcgaggcg cgacgcctgc ggatctttat cgaccgctcc 1260
agcgtggaga ttttcatcaa cgatggcgag ggggtgatga gcagccgctt cttcccgggc 1320
tatccggggc agctcatctt cagcggtgcg acgccggtag cattctgccg ctggctgctg 1380
cggccatgca tggtagaata a 1401
<210> 10
<211> 1005
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae(ATCC700721)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1005)
<223> scrR
<400> 10
atgaaaacca aacgcgtaac tatcaaagat atcgccgaac tggcgggcgt ctccaaagcg 60
accgccagcc tggtactcaa cggtcgtggt aaagagctgc gcgtggcgca ggagacgcgc 120
gagcgcgtac tggcgatcgc tcgcgaacag cactatcagc cgagcattca cgcgcgctcg 180
ctgcgcgata accgcagcca taccattggt ctggtggtgc cggagatcac caactacggg 240
tttgccgttt tctcccacga gcttgagacg ctctgccggg aagccggcgt gcagctgctt 300
atctcctgca ccgacgaaaa ccctggccag gagagcgtgg tggtcaataa catgatcgcc 360
cgccaggtcg acggcctgat tgtcgcccct tgtatgcaca gcgatgccga ctatcagaaa 420
ctcagcgaac agctgccggt ggtgctgttt gaccgctccc ccagcgacag cgccctgccg 480
ctggtgatga ccgactcggt caccccaacg gccgagctga tctcccgtat cgcgcctcag 540
catgcggacg agttctggtt tctcggcggc cagccgcggc tgtcgccgtc gcgcgaccgg 600
ctggcggggt tcacccaggg cctggcccag gcggggatca cgctgcgccc tgagtgggtg 660
atcaacggca actaccaccc cagctccggc tatgagatgt tcgcggcgct ctgcgcgcgg 720
ctggggcgtc cgccgaaggc gctcttcacc gcggcctgcg ggctgctcga aggggtgctg 780
cgctatatga gccagcatca tctgctggat tccaatattc atctcgccag cttcgacgat 840
cactatctgt atgattcgct ttccctgcgc attgataccg tgcagcagga taatcgccag 900
ctggcctggc actgctacga tctgctcagc cagctgatcg acggtcaggc cccggagccg 960
cttcagcgct acctgcccgc caccctgcag attcgccatc cctga 1005
<210> 11
<211> 7219
<212> DNA
<213> Erwinia carotovora(ATCCBAA-672)
<400> 11
gtgcaccccc tgaccgtaat agtgaaggga aaattcgcta taaatatcaa caagccagac 60
gacaaccaat aaagcccata tcgcccatat tccccaaagc aggttgtaat tacgcaccgg 120
gataaaccca gaaagaggtg gggtaacgca tatccttctc cattcgtcct ttttgcagct 180
taatttccag attaattctg gccacgcccc ataactatcg gatggtaagc ccttttgttt 240
agtcctatga ccgtggcaac gtgatgacta tcgcataaat tttcaccaac acggtgtgga 300
aatgtaagtt ttattgatgt gggtgcgtct ctgcggtgaa gggtattgct tagctaaacc 360
gattcttcta ttttagcaaa tagtctgact atcgttgata agagtaactt tatggcaaac 420
aaaatttggg tcatgggcga cgccgttgtc gatctcatcc cggaagatac ggaacgctat 480
ctgaaatgtc ctggcggtgc gccagccaat gtcgcggttg gcattgccag actgggggga 540
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ctggaagaag aaaacgtcga tacccactac atggcgtacg acagacacca ccgcacatca 660
accgtggtcg tgagcctcga tgacgcgggt gaacgcacct tcacgtttat ggtacgcccg 720
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catctctgtt ctatcgcact gtcgcaggaa ccgtcgcgca gtaccgcgtt tgaggcaatg 840
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gtgaaactgt cgtgtgaaga gctgaccttt ctctgtccaa catctgatgt tgaagaaggg 1020
atccagcaat tcatgctgcg ctaccccact cggctattgc tggtgacact gggcagcgaa 1080
ggtgtctggc tgcacgatcg ccaccagcta caacactttg ctgccccctc ggtgacacct 1140
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tatgatgatt tgtcacagcc gctgagctgg gatccgatta tcgagcaggc gcaacggtgc 1260
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tttgtagtca ggatcacagt tacagaatcg ggtgagtgaa atttcttgct aacccttctg 1440
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gtcattctcc gatggattcg aattccacgg ctacgcgcgt tccggcctgt cgatcaatga 1860
ttccgccacc agtgccaaaa ccgatatcgg gccgggcatg tcccctgccg gtcagacagg 1920
cgggcatatt ggtcgtttgg gtaatgaaga cgacacctac gtcgagctca aactagagca 1980
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cgccggtact ggcggcggga tctatgacgt gaaatgggca gatagcgcca agagtaactt 2280
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cgcctttcct gacggtcatc atctccggct tcgtcgcgat gctgctcatc ggcccagcag 3960
gacgcgcgct tggcgatggt atttctctcg tcctcagcac gttgattgct catgctggct 4020
ggttcgcggg tttactgttc ggtggcctct actccgtcat cgtgatcacc ggcgttcacc 4080
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<212> DNA
<213> Erwinia carotovora(ATCCBAA-672)
<220>
<221> gene
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<212> DNA
<213> Erwinia carotovora(ATCCBAA-672)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1536)
<223> scrY
<400> 13
atgaaaccaa gccaccttgc tgtgacgata ggattattac tctccgcccc gttttatgtt 60
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<212> DNA
<213> Erwinia carotovora(ATCCBAA-672)
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<221> gene
<222> (1)..(1371)
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<400> 14
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<212> DNA
<213> Erwinia carotovora(ATCCBAA-672)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1410)
<223> scrB
<400> 15
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gatccgaacg gatttattca tcacaacggg cgttaccatc tgttttatca gtggaatcct 180
ttggcctgtg cccacggagc aaaattctgg gggcactgga gttccgccga tctggtgaac 240
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tccggttctg ccgtcgtaga tcacggtgcg atcacgctga tttacacggg taacgtcaaa 360
tacgacgatg gctcacgcac cgcgtttcag tgtctcgccc gcgaaaatcc taacggtgaa 420
tacgacaagc tgggagcggt tctgacgctc ccagacggct acactggcca cgttcgcgat 480
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gagatcgccg gctctcgttt gggcgggctc ggtgattttg gttatatgtg ggagtgtcca 660
gacttgttcc cgctggatgg cgaagacata ctgatttgct gcccacaagg cgttcccgct 720
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cgaacaaaaa acccagcagg tggagcagcg cacaacggcg ctggccaaac agaagtcatt 1800
ctccgatgga ttcgaattcc acggctacgc gcgttccggc ctgtcgatca atgattccgc 1860
caccagtgcc aaaaccgata tcgggccggg catgtcccct gccggtcaga caggcgggca 1920
tattggtcgt ttgggtaatg aagacgacac ctacgtcgag ctcaaactag agcacaaaca 1980
gaagctggat aacggcgcaa ccacccgatt caaggtgatg atggcggacg gtcagcgcag 2040
ctataacgac tggacggcga ccaccagcga tctgaacatc cgcgaagcct tcgtcgagct 2100
gggctcactg ccgactttca ccgatgtctt taaggacact acgctgtggg cgggtaaacg 2160
cttcgatcgc gataacttcg atatccactg gctggatagc gatgtcgtgt tcctcgccgg 2220
tactggcggc gggatctatg acgtgaaatg ggcagatagc gccaagagta acttctcgct 2280
gtatggccgc agcctcggtg aaatcacctc gctggataac gacatcaaaa actacgtctt 2340
taccgccaac aactacgttg ggccattcca gttcatgctg agcggattaa ccgcgaagaa 2400
caatgatgta aaagagaaca ctggcacaag ccgcgataac atcaccgtca ccaataccaa 2460
tgcgggcggc aaaggctatc acgcgatggt ggcttaccac ggcgacagct tctacggctt 2520
acgcgacggg acatcgaaaa ctgcgatcct ctacggccac gggctaggcg gcgaagtgaa 2580
gagtatcggt tccgacggta acctcaccaa cgacgccaac acatggcgct ttgcgaccta 2640
cggcacaaca gcgctgaaca agacctggag cttcgcaccg tccattctgg cgcaaaccag 2700
caaagaccgt tacgtcagcg gcgatagcta cgaatgggtg acctttaatg cgcgcctgat 2760
tcaggaaatc accgaaaact ttgcactggc ctatgaaggc agctatcaat acatgggcct 2820
cgatccgcgc ggttatcgga gcctgaatca ggtgagcggc ggcttctata aactgacctt 2880
cgcgcctaca ttcaaggttg gcgatatcgg caacttcttc agccgtcctg aactacgcgt 2940
gtttgccagc tacatggact gggataaacg actggataac tactccaacg atgatacgtt 3000
cggctccacc ggctttaaag caggcggcga atggaacttt ggcatccaga tggaaacctg 3060
gttctgatca ttggctagcc ttggcgtcga tgacacgcta atcgacgcca aagaaactgc 3120
atatcctatt gaaaaagagg aataacatgg atatcaatgc tactgccgcc gcgctaatcc 3180
cccttctcgg tgggaaagaa aacatcgcca gcgcggccca ctgtgcgacc cgtctacgtc 3240
tggtattgaa tgacgacagc ctggccgaca agaaagcgat cgagaacgtt gacggcgtga 3300
aaggatgctt ccagaacgcc ggacaaatgc agattatttt cggcaccgga ctggttaaca 3360
aagtgtatgc cgagttcatt aaagccgcag gtatcagcga atcaagcaaa tctgaagccg 3420
cctctatcgc ggcgagaaag ctgaatccgc tgcaacgtct ggcgcgtctg ctatcgaaca 3480
tcttcgtccc tataatgcca gcgattatcg cttccggcct gttgatgggg ctgctcggca 3540
tgatcaagac ctacggctgg gtagatgcca acagcgcgat ctttgtgatg ctggatatgt 3600
tcagctccgc tgcctttatt atcctgcctg ttctgatcgg ttttaccgct gcacgggaat 3660
tcggcggcaa cccctatctg ggtgcaacgc tgggcggcat tctgacccat cctgcgctga 3720
ccaacgcttg gggcgtggcg gggggcttcc agaccatgca tttcttcggc atggacattg 3780
ccatgattgg ctatcagggt accgtattcc cagtactgct ggccgtctgg ttcatgagtc 3840
ttgtggaaaa acgcctgcgt aaagtcgtac cggacgcact ggacatcatc gttacgcctt 3900
tcctgacggt catcatctcc ggcttcgtcg cgatgctgct catcggccca gcaggacgcg 3960
cgcttggcga tggtatttct ctcgtcctca gcacgttgat tgctcatgct ggctggttcg 4020
cgggtttact gttcggtggc ctctactccg tcatcgtgat caccggcgtt caccacagct 4080
tccatgcgat tgaagccgga ctactcggca acccgaatat cggcgtcaac ttcctgctgc 4140
caatttgggc aatggcgaac gtggcgcagg gcggcgcgtg tctggcggtc tactttaaaa 4200
cgcgtgacgc caaaaccaga gcgattgccg ttccggcggg gctttcctgt ctgctgggta 4260
tcaccgaagc agcgatcttt ggtatcaacc tgcgtttcat taagccgttc ctcgcagcac 4320
tggcgggtgg tgcgctcggt ggcgcatggg tcgtcttcaa tcacgtcaat atgacggcgg 4380
tcgggctgac cggttttccg gggctagcca ttgtgcaagg tggctcgatg cttaactacc 4440
tgattgggat gttgattgca ttcggtgccg cctttgtcat ttccttattg ctgaaataca 4500
aaacggatag cgaataatga aggaagtcca cttagtaaaa cgcatggcgc acgccctgat 4560
gtcaggtcac tcacggaaac aggaagaccc atatcgcccg gaatggcatc tgtcaccgtg 4620
tgtgggtctg cttaacgatc cgaacggatt tattcatcac aacgggcgtt accatctgtt 4680
ttatcagtgg aatcctttgg cctgtgccca cggagcaaaa ttctgggggc actggagttc 4740
cgccgatctg gtgaactgga agcatgaacc cgtcgcgctg gtgccgagcg aaagctatga 4800
aagccacggc tgctactccg gttctgccgt cgtagatcac ggtgcgatca cgctgattta 4860
cacgggtaac gtcaaatacg acgatggctc acgcaccgcg tttcagtgtc tcgcccgcga 4920
aaatcctaac ggtgaatacg acaagctggg agcggttctg acgctcccag acggctacac 4980
tggccacgtt cgcgatccga aagtgtggcg tcatggtgac cactggtaca tggtgctcgg 5040
cgcacaggat ctcgatcttc aggggaaggt cgtgctctat cgttctgccg atctgctggc 5100
gtgggaaaag atcgccgaga tcgccggctc tcgtttgggc gggctcggtg attttggtta 5160
tatgtgggag tgtccagact tgttcccgct ggatggcgaa gacatactga tttgctgccc 5220
acaaggcgtt cccgctgaag atgaacgcta cctgaatacc tttcaggcgg gctatttcat 5280
tggctcactc gactacgaaa acggcgatta ctcgcatcag ggtttccatg aactggatct 5340
cggctttgag ttttacgccc cacaaaccac gctgagtgaa gacgggcgac gcctgctgtt 5400
tggctggatg tcgattcctg acgacaatga attttttgaa ccgacgatcg agcacggctg 5460
gattcatact atgacctgcg cgcgtgaact cacgctgcat gacgatcgcg tttatcaacg 5520
tcctgcgcgc gaattacaac agttgcgcag acagcattac acctggcgtg gtgcagcaga 5580
ctacgcgtcg ccgctaccca ttagtagcgc agaagtgctc atcaccgttc agggggaatt 5640
ccagctcaat cttgcctccc agcttgttct ctgttgggac ggtgaacgcg taacgataag 5700
ccgacgcaac cgacgcacag gcgaacctga acatcgctac tggcgcggcg acctgcgtca 5760
attacagata ttgtgcgatc gctccagcgt tgaaattttt atcaacgatg gcgaggccgt 5820
gatgtctgca cgaactttcc cggaaagcga ggcgaccatg acgttcagcg gctctgggca 5880
attaacgcta caacactggc tgttagcgcc atgcgtgata gaataacttt ccttttttct 5940
gatagcagac ctcgcggtga aaccgactaa acgcataaca atcagtgaca tcgccgcgct 6000
ggccggtgta tcaaaatcta ccgccagcct ggtgctgaac ggccgcagca aagagttccg 6060
cgtttctgat gaaacgcgcg atcgcatttt agccgtcgca cacgagcagc gttatcagcc 6120
cagtattcac gcacgttcac tgcgttcctc acgcagtaac acgctggggc tggtggtgcc 6180
agaaatgacc aactacggct ttgccgtgat ttcccgcgaa ctggagatgc ggtgccgcga 6240
agctgggcta cagttgctaa ttgcctgtac cgatgaaaat gccagtcagg agatgatggc 6300
ggtcaacagt ctggtacagc gccaggtcga tggcctgatt gtcgcttcca gcctgctgag 6360
tgatatcgag tatcagaaaa ttaatcagca gctgcccgtc gtgcaatttg accggattat 6420
tggtgattcc acactgccga tggtcatttc cgaagcggta gaatccacag cagaaatggt 6480
cgagcgtatc gcccgccagc atcgtgatga attttatttc cttggcggcc agccgcgaat 6540
ttccccgact cgccaccgtc tggaaggctt tcagcttggg ttgacgcgtg ccggtatcga 6600
gtgccagccg gagtggattc ttcatggcaa ctaccacccc agcgcaggtt atgaaatgtt 6660
tgctcaactg tgtgcgacgc tgggtcgccc gccaaaagca ctgtttgttg ccgcctgtgg 6720
cctgatggaa ggcgtgctgc gttatatgaa ccagcataac ctgatggaaa gcggcatccg 6780
tctgtgctgc tttgacgatc actatctgtt tgattgttta ccgctgaaga tcgataccgt 6840
ggcgcaggat tgtgaaaatc tggcacgcaa cagctttgaa atgattacga gtttgattgc 6900
acaacagccg cttgaagaag atcggcgcta tatcccgacg cggattcact ggcgtcatcc 6960
tgactcgcgg gcatgactcg cgacatagcc caacacactt caccagcagg tagaacgtaa 7020
aaagggaacg cggttagcgt cgcttcttag agcatcgcac cacattccct tttgaatcga 7080
tcagccgtta cttagcggcg gcagattccg cgccaaccag acccaccttg aggtagcccg 7140
ctttacgcag tgaatccatc acgctcatga tggtttcata atcgacgctt ttatctgcct 7200
gactagtagg gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 7260
atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 7320
ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 7380
gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 7440
gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 7500
tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 7560
taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 7620
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccttaataa gatgatcttc ttgagatcgt 7680
tttggtctgc gcgtaatctc ttgctctgaa aacgaaaaaa ccgccttgca gggcggtttt 7740
tcgaaggttc tctgagctac caactctttg aaccgaggta actggcttgg aggagcgcag 7800
tcaccaaaac ttgtcctttc agtttagcct taaccggcgc atgacttcaa gactaactcc 7860
tctaaatcaa ttaccagtgg ctgctgccag tggtgctttt gcatgtcttt ccgggttgga 7920
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcggac tgaacggggg gttcgtgcat 7980
acagtccagc ttggagcgaa ctgcctaccc ggaactgagt gtcaggcgtg gaatgagaca 8040
aacgcggcca taacagcgga atgacaccgg taaaccgaaa ggcaggaaca ggagagcgca 8100
cgagggagcc gccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 8160
actgatttga gcgtcagatt tcgtgatgct tgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 8220
gctttgccgc ggccctctca cttccctgtt aagtatcttc ctggcatctt ccaggaaatc 8280
tccgccccgt tcgtaagcca tttccgctcg ccgcagtcga acgaccgagc gtagcgagtc 8340
agtgagcgag gaagcggaat atatcctgta tcacatattc tgctgacgca ccggtgcagc 8400
cttttttctc ctgccacatg aagcacttca ctgacaccct catcagtgcc aacatagtaa 8460
gccagtatac actccgctag cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat 8520
accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag 8580
ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg 8640
cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac 8700
aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 8760
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 8820
ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 8880
atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 8940
atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 9000
atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 9060
tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 9120
aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc 9180
tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 9240
atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 9300
gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 9360
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 9420
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 9480
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 9540
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 9600
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 9660
gcattacgct gacttgacgg gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt 9720
gaaggatcag atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt 9780
caaaatcacc aactggtcca cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt 9840
ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg 9900
cagacctcag cgctcaaaga tgcaggggta aaagctaacc gcatctttac cgacaaggca 9960
tccggcagtt caacagatcg ggaagggctg gatttgctga ggatgaaggt ggaggaaggt 10020
gatgtcattc tggtgaagaa gctcgaccgt cttggccgcg acaccgccga catgatccaa 10080
ctgataaaag agtttgatgc tcagggtgta gcggttcggt ttattgacga cgggatcagt 10140
accgacggtg atatggggca aatggtggtc accatcctgt cggctgtggc acaggctgaa 10200
cgccggagga tcctagagcg cacgaatgag ggccgacagg aagcaaagct gaaaggaatc 10260
aaatttggcc gcaggcgtac cgtggacagg aacgtcgtgc tgacgcttca tcagaagggc 10320
actggtgcaa cggaaattgc tcatcagctc agtattgccc gctccacggt ttataaaatt 10380
cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 10440
tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 10500
tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 10560
ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 10620
ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 10680
aagatgctga agatcagttg ggtgcac 10707
<210> 19
<211> 1728
<212> DNA
<213> Escherichia coli K-12 W3110
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1728)
<223> ptsI
<400> 19
atgatttcag gcattttagc atccccgggt atcgctttcg gtaaagctct gcttctgaaa 60
gaagacgaaa ttgtcattga ccggaaaaaa atttctgccg accaggttga tcaggaagtt 120
gaacgttttc tgagcggtcg tgccaaggca tcagcccagc tggaaacgat caaaacgaaa 180
gctggtgaaa cgttcggtga agaaaaagaa gccatctttg aagggcatat tatgctgctc 240
gaagatgagg agctggagca ggaaatcata gccctgatta aagataagca catgacagct 300
gacgcagctg ctcatgaagt tatcgaaggt caggcttctg ccctggaaga gctggatgat 360
gaatacctga aagaacgtgc ggctgacgta cgtgatatcg gtaagcgcct gctgcgcaac 420
atcctgggcc tgaagattat cgacctgagc gccattcagg atgaagtcat tctggttgcc 480
gctgacctga cgccgtccga aaccgcacag ctgaacctga agaaggtgct gggtttcatc 540
accgacgcgg gtggccgtac ttcccacacc tctatcatgg cgcgttctct ggaactacct 600
gctatcgtgg gtaccggtag cgtcacctct caggtgaaaa atgacgacta tctgattctg 660
gatgccgtaa ataatcaggt ttacgtcaat ccaaccaacg aagttattga taaaatgcgc 720
gctgttcagg agcaagtggc ttctgaaaaa gcagagcttg ctaaactgaa agatctgcca 780
gctattacgc tggacggtca ccaggtagaa gtatgcgcta acattggtac ggttcgtgac 840
gttgaaggtg cagagcgtaa cggcgctgaa ggcgttggtc tgtatcgtac tgagttcctg 900
ttcatggacc gcgacgcact gcccactgaa gaagaacagt ttgctgctta caaagcagtg 960
gctgaagcgt gtggctcgca agcggttatc gttcgtacca tggacatcgg cggcgacaaa 1020
gagctgccat acatgaactt cccgaaagaa gagaacccgt tcctcggctg gcgcgctatc 1080
cgtatcgcga tggatcgtag agagatcctg cgcgatcagc tccgcgctat cctgcgtgcc 1140
tcggctttcg gtaaattgcg cattatgttc ccgatgatca tctctgttga agaagtgcgt 1200
gcactgcgca aagagatcga aatctacaaa caggaactgc gcgacgaagg taaagcgttt 1260
gacgagtcaa ttgaaatcgg cgtaatggtg gaaacaccgg ctgccgcaac aattgcacgt 1320
catttagcca aagaagttga tttctttagt atcggcacca atgatttaac gcagtacact 1380
ctggcagttg accgtggtaa tgatatgatt tcacaccttt accagccaat gtcaccgtcc 1440
gtgctgaact tgatcaagca agttattgat gcttctcatg ctgaaggcaa atggactggc 1500
atgtgtggtg agcttgctgg cgatgaacgt gctacacttc tgttgctggg gatgggtctg 1560
gacgaattct ctatgagcgc catttctatc ccgcgcatta agaagattat ccgtaacacg 1620
aacttcgaag atgcgaaggt gttagcagag caggctcttg ctcaaccgac aacggacgag 1680
ttaatgacgc tggttaacaa gttcattgaa gaaaaaacaa tctgctaa 1728
<210> 20
<211> 258
<212> DNA
<213> Escherichia coli K-12 W3110
<220>
<221> gene
<222> (1)..(258)
<223> ptsH
<400> 20
atgttccagc aagaagttac cattaccgct ccgaacggtc tgcacacccg ccctgctgcc 60
cagtttgtaa aagaagctaa gggcttcact tctgaaatta ctgtgacttc caacggcaaa 120
agcgccagcg cgaaaagcct gtttaaactg cagactctgg gcctgactca aggtaccgtt 180
gtgactatct ccgcagaagg cgaagacgag cagaaagcgg ttgaacatct ggttaaactg 240
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<210> 21
<211> 510
<212> DNA
<213> Escherichia coli K-12 W3110
<220>
<221> gene
<222> (1)..(510)
<223> crr
<400> 21
atgggtttgt tcgataaact gaaatctctg gtttccgacg acaagaagga taccggaact 60
attgagatca ttgctccgct ctctggcgag atcgtcaata tcgaagacgt gccggatgtc 120
gtttttgcgg aaaaaatcgt tggtgatggt attgctatca aaccaacggg taacaaaatg 180
gtcgcgccag tagacggcac cattggtaaa atctttgaaa ccaaccacgc attctctatc 240
gaatctgata gcggcgttga actgttcgtc cacttcggta tcgacaccgt tgaactgaaa 300
ggcgaaggct tcaagcgtat tgctgaagaa ggtcagcgcg tgaaagttgg cgatactgtc 360
attgaatttg atctgccgct gctggaagag aaagccaagt ctaccctgac tccggttgtt 420
atctccaaca tggacgaaat caaagaactg atcaaactgt ccggtagcgt aaccgtgggt 480
gaaaccccgg ttatccgcat caagaagtaa 510
Claims (8)
- L-아미노산 생산능 및 수크로오스 PTS(phosphoenolypyruvate dependent sucrose phosphotransferase system) 활성을 갖는, 수크로오스 비자화성(non-assimilative) 에스케리시아(Escherichia) 속 미생물에 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)에서 유래된 프럭토키나아제, 수크로오스 포린, 수크로오스 PTS 퍼미아제, 수크로오스 히드롤라아제, 및 수크로오스 전사 조절자를 코딩하는 유전자를 도입하여 수득되고, 상기 수크로오스 PTS는 효소 I(EI), 히스티딘 단백질(Histidine protein), 및 글루코오스 특이적 효소 IIA(EIIAcrrGlc , EII)로 구성된 것인 수크로오스 자화성 및 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리시아 속 미생물로서, 상기 에스케리시아 속 미생물은 대장균 CA03-0207(KCCM 10993)인 것인 에스케리시아 속 미생물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌인 것인 에스케리시아 속 미생물.
- 제1항에 따른 에스케리시아 속 미생물을 수크로오스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및상기 배양액으로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌인 것인 방법.
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