KR101991206B1 - cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 - Google Patents
cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101991206B1 KR101991206B1 KR1020180151042A KR20180151042A KR101991206B1 KR 101991206 B1 KR101991206 B1 KR 101991206B1 KR 1020180151042 A KR1020180151042 A KR 1020180151042A KR 20180151042 A KR20180151042 A KR 20180151042A KR 101991206 B1 KR101991206 B1 KR 101991206B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- amino acid
- crp
- protein
- microorganism
- pcc1bac
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 44
- 108091006374 cAMP receptor proteins Proteins 0.000 title claims description 67
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 87
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 47
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 47
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 47
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 42
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 42
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 39
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 32
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 32
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 claims description 4
- 101150006779 crp gene Proteins 0.000 description 63
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 51
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 Aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CRWFEKLFPVRPBV-CIUDSAMLSA-N Ala-Gln-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O CRWFEKLFPVRPBV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SFNFGFDRYJKZKN-XQXXSGGOSA-N Ala-Gln-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C)N)O SFNFGFDRYJKZKN-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 2
- OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N Ala-His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CN=CN1 OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- GFEDXKNBZMPEDM-KZVJFYERSA-N Ala-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GFEDXKNBZMPEDM-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBFJESQBIWCWRL-DCAQKATOSA-N Arg-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VBFJESQBIWCWRL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- VDBKFYYIBLXEIF-GUBZILKMSA-N Arg-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VDBKFYYIBLXEIF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N Arg-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- GMFAGHNRXPSSJS-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GMFAGHNRXPSSJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- WLKVEEODTPQPLI-ACZMJKKPSA-N Asp-Gln-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WLKVEEODTPQPLI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N Asp-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- BLOXULLYFRGYKZ-GUBZILKMSA-N Gln-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O BLOXULLYFRGYKZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- MFJAPSYJQJCQDN-BQBZGAKWSA-N Gln-Gly-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFJAPSYJQJCQDN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- DOQUICBEISTQHE-CIUDSAMLSA-N Gln-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DOQUICBEISTQHE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- VOUSELYGTNGEPB-NUMRIWBASA-N Gln-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VOUSELYGTNGEPB-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- ZHNHJYYFCGUZNQ-KBIXCLLPSA-N Glu-Ile-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZHNHJYYFCGUZNQ-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- JLCYOCDGIUZMKQ-JBACZVJFSA-N Glu-Trp-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N JLCYOCDGIUZMKQ-JBACZVJFSA-N 0.000 description 2
- KIEICAOUSNYOLM-NRPADANISA-N Glu-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KIEICAOUSNYOLM-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N Gly-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(=O)O WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UQTKYYNHMVAOAA-HJPIBITLSA-N His-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N UQTKYYNHMVAOAA-HJPIBITLSA-N 0.000 description 2
- IGJWJGIHUFQANP-LAEOZQHASA-N Ile-Gly-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N IGJWJGIHUFQANP-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- LPFBXFILACZHIB-LAEOZQHASA-N Ile-Gly-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N LPFBXFILACZHIB-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- FCWFBHMAJZGWRY-XUXIUFHCSA-N Ile-Leu-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N FCWFBHMAJZGWRY-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 2
- KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N Leu-Ala-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- RFUBXQQFJFGJFV-GUBZILKMSA-N Leu-Asn-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O RFUBXQQFJFGJFV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N Leu-Asp-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- AUBMZAMQCOYSIC-MNXVOIDGSA-N Leu-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O AUBMZAMQCOYSIC-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N Lys-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- FHIAJWBDZVHLAH-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FHIAJWBDZVHLAH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N Lys-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N Lys-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- VSTNAUBHKQPVJX-IHRRRGAJSA-N Lys-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VSTNAUBHKQPVJX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N Lys-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- IEIHKHYMBIYQTH-YESZJQIVSA-N Lys-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O IEIHKHYMBIYQTH-YESZJQIVSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AWOMRHGUWFBDNU-ZPFDUUQYSA-N Met-Gln-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCSC)N AWOMRHGUWFBDNU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- WPTDJKDGICUFCP-XUXIUFHCSA-N Met-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WPTDJKDGICUFCP-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- QAVZUKIPOMBLMC-AVGNSLFASA-N Met-Val-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QAVZUKIPOMBLMC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- XWBJLKDCHJVKAK-KKUMJFAQSA-N Phe-Arg-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N XWBJLKDCHJVKAK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- KYYMILWEGJYPQZ-IHRRRGAJSA-N Phe-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KYYMILWEGJYPQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N Pro-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- FDMCIBSQRKFSTJ-RHYQMDGZSA-N Pro-Thr-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FDMCIBSQRKFSTJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 2
- IDCKUIWEIZYVSO-WFBYXXMGSA-N Ser-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C)C(O)=O)=CNC2=C1 IDCKUIWEIZYVSO-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 2
- YUSRGTQIPCJNHQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YUSRGTQIPCJNHQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)CC1=CN=CN1 LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 2
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N Thr-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N Thr-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N 0.000 description 2
- FJBCEFPCVPHPPM-STECZYCISA-N Tyr-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FJBCEFPCVPHPPM-STECZYCISA-N 0.000 description 2
- ZOBLBMGJKVJVEV-BZSNNMDCSA-N Tyr-Lys-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O ZOBLBMGJKVJVEV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IDKGBVZGNTYYCC-QXEWZRGKSA-N Val-Asn-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O IDKGBVZGNTYYCC-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- NXRAUQGGHPCJIB-RCOVLWMOSA-N Val-Gly-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NXRAUQGGHPCJIB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- OXGVAUFVTOPFFA-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N OXGVAUFVTOPFFA-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 108010076756 leucyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 2
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 101710154303 Cyclic AMP receptor protein Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000004470 DL Methionine Substances 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- ITZWDGBYBPUZRG-KBIXCLLPSA-N Gln-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ITZWDGBYBPUZRG-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N Leu-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102100023515 NAD kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010084634 NADP phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 101150094831 cysK gene Proteins 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 101150093502 galR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N methionine Chemical compound CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 101150110679 tehB gene Proteins 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/227—Tryptophan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
- C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 출원은 cAMP 수용 단백질 변이체, 이를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 cAMP 수용 단백질 변이체, 이를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법에 관한 것이다.
CRP(cyclic AMP receptor protein)는 대장균에서 가장 많이 알려진 전사조절인자로, CAP(catabolite activator protein)이라고도 불린다. CRP는 탄소원에 의존적인 조절 기작을 특징적으로 가지는데 대표적인 것이 '대사산물 억제작용(catabolite repression)'이다. 이 작용은 세포내의 cyclic AMP (이하'cAMP')의 농도에 의해 촉발되는데, 포도당과 같은 선호되는 탄소원이 있을 때에는 adenylate cyclase의 활성이 저해되어 cAMP가 낮아지고, 이 신호를 통하여서 catabolite 대사 유전자들의 발현이 억제된다. 반대의 경우 adenylate cyclase의 활성이 증가되고, 그 결과 repressor들을 억제하여 catabolite 대사 유전자들의 발현이 시작된다. 그 외에도 CRP는 cAMP를 통한 세포내 신호전달, 삼투조절, 세포의 긴급상황발생시 대처, 바이오필름 생성, 질소고정, 철분 수송등의 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
보고된 바에 따르면, 418개의 대장균 유전자가 CRP에 의해 조절을 받는 것으로 알려져 있으나, 해당 기작은 아직 상세히 밝혀지지 않았다(J Biol Eng. (2009) 24;3:13). 이처럼 광범위한 조절 능력으로 CRP는 돌연변이에 의하여 다양한 표현형을 보일 수 있는 가능성을 가지고 있고, 그러한 장점으로 인해 다양한 환경에서 적용 가능한 세포수준의 균주 재설계에 적합한 대상으로 연구되고 있다. 최근에는 생물정보학적인 방법으로 선별된 CRP의 아미노산 변이에 의해 DNA의 결합정도를 변화시켜 조절 대상 유전자의 발현을 변화시킨 방법 (Nucleic Acids Research, (2009) 37: 2493-2503)과 zinc finger DNA결합부위와 CRP를 융합하여 인공적인 전사인자(ATF, artificial transcription factor)를 만든 것으로 열, 삼투 및 저온에 내성을 가지는 대장균을 선별((Nucleic Acids Research, (2008) 36: e102) 하는 등 다양한 실험이 이루어지고 있다. 즉, CRP의 발현변화는 광범위한 수준의 하위 단계 유전자 발현 변화를 촉진하여 유용한 형질을 가진 미생물을 제작하는데 좋은 도구가 될 가능성이 크다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 신규한 변이형 단백질을 발굴하고, 상기 변이형 단백질이 L-아미노산의 생산능을 증가시킴을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 cAMP 수용 단백질 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 cAMP 수용 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 변이체를 포함하는, 에스케리키아 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지에서 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 L-아미노산 제조방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 cAMP 수용 단백질 변이체를 제공하는 것이다. 구체적으로, 본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 cAMP 수용 단백질 변이체를 제공하며, 상기 아미노산 치환은 N-말단으로부터 196번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 것을 포함한다. 더욱 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 196번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 것을 포함하는, cAMP 수용 단백질 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "cAMP 수용 단백질(cAMP receptor protein, CRP)"은 대장균에서 가장 많이 알려진 전사조절인자로서 그 자체로 활성인자와 저해인자의 기능을 함께 가지고 있어 'dual regulator'라고도 불린다. 일반적으로 구조유전자의 앞쪽에 위치한 22개의 염기를 가지는 대칭형 DNA서열에 결합하여 DNA의 구부러짐을 유도하고, 카르복시 말단에 있는 첫 번째 활성부위와 아미노 말단에 있는 두번 째 활성부위가 전사를 담당하는 RNA중합효소와 상호작용하도록 하여 활성인자의 역할을 하고, 억제인자의 역할을 할 경우에는 활성단백질이 활성부위에 결합하지 못하도록 그 위치를 선점하거나, 활성단백질과 결합하여 활성부위에 결합하지 않는 구조로 변환시키는 방법을 취하는 것으로 알려져 있다. 상기 cAMP 수용 단백질은 crp 유전자에 의해 코딩되는 cAMP 수용 단백질이다.
본 출원의 "cAMP 수용 단백질(cyclic AMP receptor protein, CRP)"는 이화대사물 활성화 단백질(catabolite activator protein, CAP), CRP 단백질, CAP 단백질 등과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 상기 CRP는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 에스케리아 속(Escherichia sp.) 유래 CRP일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드/단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않다. 또한 상기 아미노산 서열과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한없이 포함될 수 있다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 아미노산은 서열번호 1 및 상기 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이형 폴리펩티드는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이형은 일반적으로 상기 폴리펩티드 서열 중 하나를 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이형의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 이러한 변이형은 일반적으로 상기 폴리펩티드 서열 중 하나를 변형하고, 변형된 폴리펩티드의 반응성을 평가하여 식별될 수 있다. 또한, 일부 변이형은 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형을 포함할 수 있다. 다른 변이형은 성숙 단백질 (mature protein)의 N- 및/또는 C- 말단으로부터 일부분이 제거된 변이형을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이형은 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 글리신 및 트립토판을 포함한다.
또한, 변이형은 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, "cAMP 수용 단백질 변이체"는 cAMP 수용 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 cAMP 수용 단백질 변이체로서, 상기 아미노산 치환은 N-말단으로부터 196번째 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함한다. 구체적으로는 AMP 수용 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 196번째 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 196번째 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 포함한다. 예를 들어, 상기 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 내 N-말단으로부터 196번째 위치의 변이가 일어난 단백질 변이체를 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 196번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질일 수 있다. 상기 '다른 아미노산'은 196번째 아미노산인 L-류신을 제외한 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 196번째 아미노산이 친수성 아미노산으로 치환된 단백질일 수 있다. 상기 친수성 아미노산은 L-글루타민, L-세린, L-트레오닌, L-티로신, L-시스테인 및 L-아스파라진 중 하나 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 196번째 아미노산이 글루타민(Glutamine)으로 치환된 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 변이체는 위에서 설명한 서열번호 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산에서 N-말단으로부터 196번째 위치의 아미노산이 변이된 것을 의미한다.
본 출원에서 용어, "cAMP 수용 단백질 변이체"는 상기 cAMP 수용 단백질 변이체는 변이형 CRP 단백질, CRP 변이체, 변이형 cAMP 수용 단백질, 변이형 CAP 단백질, CAP 변이체, 변이형 이화대사물 활성화 단백질, 이화대사물 활성화 단백질 변이체 등과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 목적상 상기 cAMP 수용 단백질 변이체를 포함하는 미생물의 경우, L-아미노산 생산량이 상기 cAMP 수용 단백질 변이체가 존재하지 않는 미생물에 비하여 증가하는 것을 특징으로 한다. 상기 CRP 변이체는 천연의 야생형 또는 비변이 cAMP 수용 단백질에 비하여 L-아미노산 생산능이 증가되도록 유전자 조절 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 이는 본 출원의 CRP 변이체가 도입된 미생물을 통해 L-아미노산 생산량을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있다. 구체적으로, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판일 수 있으나, 상기 변이형 cAMP 수용 단백질이 도입 또는 포함되어 생산될 수 있는 L-아미노산이면 제한없이 포함된다.
상기 cAMP 수용 단백질 변이체는 그 예로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 내 196번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는, 변이체로 서열번호 3으로 이루진 것일 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 196번째 아미노산이 글루타민(Glutamine)으로 치환된 변이체는, 서열번호 3으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 CRP 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 출원의 상기 CRP 변이체는 서열번호 3 및 상기 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 196번째 위치의 아미노산 서열 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 '이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 CRP변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 CRP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 cAMP 수용 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 CRP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 196번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 196번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 CRP변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 서열번호 4로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다.
또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 196번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 CRP 변이체를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원에서 사용된 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 변이형 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 변이형 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 변이형 단백질을 포함하거나, 상기 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여, L-아미노산을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다. 구체적으로 변이형 단백질 및/또는 상기 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 cAMP 수용 단백질 변이체를 포함하는, 에스케리키아 속(Escherichia sp.) 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "CRP 변이체를 포함하는 미생물"이란, 본 출원의 CRP 변이체가 발현되도록 재조합된 미생물을 의미할 수 있다. 예를 들어 CRP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 CRP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 상기 변이체를 발현할 수 있는 숙주세포 또는 미생물을 의미한다. 본 출원의 목적상 구체적으로 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 cAMP 수용 단백질 변이체를 발현하는 미생물로서, 상기 아미노산 치환은 N-말단으로부터 196번째 아미노산이 글루타민으로 치환되어, cAMP 수용 단백질 활성을 갖는, 변이형 단백질을 발현하는 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 CRP변이체를 포함하는 미생물은, 상기 CRP 변이체를 포함하여 L-아미노산, 그 예로, L-쓰레오닌 또는 L-트립토판을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 CRP변이체를 포함하는 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 L-아미노산을 생산하는 미생물에 CRP 변이체가 발현되어, L-아미노산 생산능이 증가된 재조합 미생물일 수 있다. 상기 L-아미노산 생산능이 증가된 재조합 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물에 비하여 L-아미노산 생산능이 증가된 미생물일 수 있으며, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "L-아미노산을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-아미노산 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물 일 수 있다. 본 출원의 목적상 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 상기 변이형 단백질을 포함하여, 목적하는 L-아미노산의 생산능이 증가된 것일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 L-아미노산을 생산하는 미생물 또는 L-아미노산 생산능을 갖는 미생물은, L-아미노산 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, L-아미노산 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물일 수 있다.
상기 '비변형 미생물'은 천연형 균주 자체이거나, 상기 CRP 변이체를 포함하지 않는 미생물, 또는 상기 CRP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다. 상기 '미생물'은 L-아미노산을 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로는 에스케리키아속 미생물일 수 있으며, 보다구체적으로는 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 하나의 양태로서, 상기 cAMP 수용 단백질 변이체를 포함하는 L-아미노산을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지에서 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 L-아미노산 제조방법을 제공한다.
상기 용어 'cAMP 수용 단백질 변이체', 및 'L-아미노산'은 앞에서 설명한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 L-아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-아미노산을 수집(collect)할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-아미노산을 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 L-아미노산은 정제된 형태 또는 L-아미노산을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
본 출원의 cAMP 수용 단백질 변이체를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배양하는 경우, 고수율의 L-아미노산 생산이 가능하다. 이에, 산업적인 면에서 생산의 편의성과 함께 제조원가 절감 등의 효과를 기대할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1. 재조합 벡터 pCC1BAC-
crp
의 제작
1-1. 유전자
crp
단편의 준비
유전자 crp와 발현조절부위 부위를 포함하는 서열번호 5의 DNA 단편 약 0.96kb를 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 대장균 야생주인 W3110의 염색체 DNA (gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하였다. 유전자 crp 단편 부위를 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 6 및 7의 프라이머를 사용하여 95℃에서 30초의 변성(denaturation), 56℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 2분의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 27회 반복 수행하였다.
상기 PCR 결과물을 EcoR I으로 절단하여 0.96 Kb 크기의 DNA 단편(이하, "crp 단편"이라 명명함)을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리하여 수득하였다.
| 서열번호 | 프라이머명 | 서열(5'-3') |
| 6 | crp-F | CACGAATTCTTTGCTACTCCACTGCGTCA |
| 7 | crp-R | ACACGAATTCTTAACGAGTGCCGTAAACG |
1-2. 재조합 벡터 pCC1BAC-
crp
의 제작
Copycontrol pCC1BAC vector (EPICENTRE, USA)를 EcoR I으로 처리하여 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리하여 수득하고, 실시예 1-1에서 얻어진 crp 단편을 라이게이션(ligation)시켜 pCC1BAC-crp 플라스미드를 제작하였다.
실시예 2. 재조합 벡터 pCC1BAC-
crp
변이체 라이브러리의 제작
2-1. error-prone PCR을 이용한 돌연변이
crp
단편의 준비
야생형 대장균인 W3110 염색체 DNA를 주형으로 clonetech사의 diversify PCR random mutagenesis kit(catalog #: K1830-1, Table Ⅲ, mutagenesis reactions 4)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로, PCR은 실시예 1-1에서 사용된 서열번호 6 및 7의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 68℃에서 1분의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 27회 반복 수행하였다.
상기 PCR 결과물을 EcoR I으로 절단하여 0.96Kb 크기의 돌연변이된 crp 단편(이하, " crp m 단편"이라 명명함)들을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리하여 수득하였다.
2-2. 재조합 벡터 pCC1BAC-
crp
변이체 라이브러리의 제작
벡터 pCC1BAC을 제한효소 EcoR I으로 처리한 후, 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase (NEB))를 처리하여 준비하였다. 준비된 벡터에 실시예 2-1에서 수득한 crp m 단편들을 라이게이션(ligation)시켜 TransforMax EPI300 Electrocompetent E.coli (EPICENTRE, USA)에 전기천공법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환시킨 균주는 클로람페니콜을 포함하는 LB고체배지(15ug/ml) 에서 콜로니(colony)를 선별하였다. 이렇게 획득된 콜로니들을 모아 플라스미드 프랩(plasmid prep)을 수행하여 pCC1BAC-crp m library를 제작하였다.
실시예 3.
crp
변이체 라이브러리의 쓰레오닌 생산균주 도입 및 성장이 개선된 균체의 선별
3-1. pCC1BAC-
crp
m
library의 쓰레오닌 생산 균주 도입
실시예 2에서 수득된 pCC1BAC-crp m library를 쓰레오닌을 생산하는 미생물 KCCM10541의 electro-competent cell에 전기천공법을 이용하여 형질전환(transformation)시켜 도입하였다. 본 실시예에서 사용된 대장균 KCCM10541(대한민국등록특허 제10-0576342호)은 L-쓰레오닌을 생산하는 대장균 KFCC10718(대한민국등록특허 제10-0058286호)로부터 galR 유전자가 불활성화된 대장균이다.
pCC1BAC-crp m library가 도입된 미생물의 대조군으로서, KCCM10541에 pCC1BAC-crp를 위와 같은 방법으로 형질전환하여 KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT)을 제작하였다.
3-2. 재조합 미생물의 성장 속도 비교
1% 포도당(glucose), 0.2 g/L의 효모 추출물(yeast extract)이 포함된 M9 최소배지를 deep well microplate에 분주한 후, 상기 실시예 3-1에서 만들어진 형질전환체 및 대조군 균주를 접종하였다. 마이크로 크기 항온 배양기 쉐이커(Micro size constant temperature incubator shaker, TAITEC, Japan)를 이용(37℃, 200 rpm 조건)하여 HTS (High Throughput Screening) 방법으로 20시간동안 상기 균주를 배양시켜 성장이 개선된 균주들을 선별하였고, 그 중 최종적으로 1종의 균주를 선별하였다(표 2).
야생형 crp유전자가 도입된 KCCM10541 균주의 경우 crp 추가 도입에 의하여 약간의 OD 증가를 보이나, 성장이 개선된 형질전환체의 경우 OD가 동일 배양 시간후 야생형 crp 대비 높게 측정됨을 확인하였다. 또한, 선별된 crp 변이체에 대해 플라스미드 미니-프랩(plasmid mini-prep)후 서열 분석을 진행하였으며, 그 결과는 표 2에 정리하였다.
| 균주 | OD600 | 변이 |
| KCCM10541/pCC1BAC | 2.3 | - |
| KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT) | 2.8 | - |
| KCCM10541/pCC1BAC-crpTM9 | 3.5 | L196Q |
3-3. 재조합 미생물의 쓰레오닌 역가 비교
상기 실시예 3-2에서 선별된 재조합 미생물의 쓰레오닌 역가를 측정하기 위하여 하기 표 3의 조성대로 제조된 쓰레오닌 역가 배지에서 배양하여 L-쓰레오닌 생산성 향상을 확인하였다.
| 조성물 | 농도 (리터당) |
| Glucose | 70 g |
| KH2PO4 | 2 g |
| (NH4)2SO4 | 25 g |
| MgSO4·7H2O | 1 g |
| FeSO4·7H2O | 5 mg |
| MnSO4·4H2O | 5 mg |
| 효모액기스 | 2 g |
| 탄산칼슘 | 30 g |
| pH | 6.8 |
구체적으로, 33℃ 배양기(incubator) 내 LB 고체 배지에서 밤새 배양한 대장균 KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT) 및 대장균 KCCM10541/pCC1BAC-crpTM9를 각각 상기 표 3의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하여 당 소모속도 및 쓰레오닌 농도를 비교하였다.
그 결과, 하기 표 4에 기재된 바와 같이, 대조군인 KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT) 균주는 24시간에서 소모당이 26.1 g/L이지만, 돌연변이 crpTM9를 도입한 균주는 모균주 대비 약 16%, 야생형 crp를 추가도입한 균주 대비 약 11 % 개선된 당 소모속도를 보임을 확인하였다.
또한, L-쓰레오닌 생산량의 경우 48시간 배양하였을 때, 야생형 crp를 추가도입한 균주의 경우는 29.0 g/L 를 생산하였으나, 상기에서 수득된 돌연변이 균주는 배양 속도가 증가함에도 불구하고, L-쓰레오닌의 생산량이 30.8 g/L까지 증가되어, 모균주 대비 약 7%, 야생형 crp를 추가도입한 균주 대비 약 6% 증가된 농도를 나타냄을 확인하였다.
이는 crp 변이형의 도입에 의하여 수율이 증가하며 균체의 당 소모능을 증가시킬 수 있는 좋은 변이형질로 보여, 발효시 생산효율 향상에 크게 기여할 수 있을 것으로 보인다.
| 균주 | 소모당 (g/L)* |
쓰레오닌 (g/L)** |
| KCCM10541/pCC1BAC | 25.0 | 28.8 |
| KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT) | 26.1 | 29.0 |
| KCCM10541/pCC1BAC-crpTM9 | 29.0 | 30.8 |
* 24시간 측청치, ** 48시간 측청치
실시예 4. pCC1BAC-
crpTM9
변이체의 트립토판 생산균주 도입
4-1. pCC1BAC-
crpTM9
의
스크리닝 균주 도입
실시예 3에서 수득된 pCC1BAC-crpTM9 를 트립토판을 생산하는 균주 KCCM11166P의 electro-competent cell에 전기천공법을 이용하여 형질전환(transformation)시켜 도입하였다. 본 실시예에서 사용된 KCCM11166P는 tehB 유전자가 결실되고, NAD 키나아제의 활성이 강화된 L-트립토판 생산 대장균 이다 (대한민국등록특허 제10-1261147호).
pCC1BAC-crpTM9 가 도입된 미생물의 대조군으로서, KCCM11166P에 pCC1BAC-crp(WT)를 위와 같은 방법으로 형질전환하여 KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT)을 제작하였다.
4-2. 재조합 미생물의 성장 속도 비교
1% 포도당, 0.2 g/L의 효모 추출물이 포함된 M9 최소배지를 deep well microplate에 분주 한 후, 상기 실시예 4-1에서 기술된 대로 만들어진 형질전환체 및 대조군 균주를 접종하였다. 하여 마이크로 크기 항온 배양기 쉐이커(Micro size constant temperature incubator shaker, TAITEC, Japan)를 이용(37℃, 200 rpm 조건)하여 HTS (High Throughput Screening) 방법으로 16시간 동안 상기 균주를 배양시켜 KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM9 형질전환체의 성장이 개선되는 것을 확인하였다(표 5).
야생형 crp 유전자가 도입된 KCCM11166P 균주의 경우 crp 추가 도입에 의하여 동일 배양 시간후 측정하였을 때, 동등 수준의 OD를 보이나, 성장이 개선된 형질 전환체의 경우 OD가 야생형 crp 대비 높게 측정됨을 확인하였다.
| 균주 | OD600 | 변이 |
| KCCM11166P/pCC1BAC | 3.4 | - |
| KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT) | 3.5 | - |
| KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM9 | 3,7 | L196Q |
4-3. 재조합 미생물의 트립토판 역가 비교
상기 실시예 4-2에서 제조한 재조합 미생물의 트립토판 역가를 측정하기 위하여 하기 표 6의 조성대로 제조된 트립토판 역가 배지에서 배양하여 L-트립토판 생산효율 향상을 확인하였다.
| 조성물 | 농도 (리터당) |
| Glucose | 60 g |
| K2HPO4 | 1 g |
| (NH4)2SO4 | 10 g |
| NaCl | 1 g |
| MgSO4·7H2O | 1 g |
| 구연산나트륨 | 5 g |
| 효모액기스 | 2 g |
| 탄산칼슘 | 40 g |
| 구연산나트륨 | 5 g |
| 페닐알라닌 | 0.15 g |
| 타이로신 | 0.1 g |
| pH | 6.8 |
구체적으로, 37℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지상에 밤새 배양한 대장균 KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT) 및 대장균 KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM9를 각각 상기 표 6의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하여 당 소모속도 및 트립토판 농도를 비교하였다.
그 결과, 하기 표 7에 기재된 바와 같이, 대조군인 KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT) 균주는 22시간에서 소모당이 30.2 g/L이지만, 돌연변이형 crpTM9를 도입한 균주는 모균주 대비 약 7%, 야생형 crp를 추가 도입한 균주 대비 약 6 %까지 개선된 당 소모속도를 보임을 확인하였다.
L-트립토판 생산량의 경우 48시간 배양하였을 때, 야생형 crp를 추가 도입한 균주의 경우는 8.4 g/L 를 생산하였으나, 상기에서 수득된 돌연변이 균주들은 배양 속도가 증가함에도 불구하고, L-트립토판의 생산량이 9.1 g/L까지 증가되어, 모균주 대비 약 8 %, 야생형 crp를 추가 도입한 균주 대비 약 10% 증가된 농도를 보임을 확인 하였다.
이는 crp 변이형의 도입에 의하여 균체의 당 소모능이 증가되며, 수율도 향상 시킬 수 있는 좋은 변이형질로 보여, 발효시 생산성 향상에 크게 기여할 수 있을 것으로 보인다.
| 균주 | 소모당 (g/L)* |
트립토판 (g/L)** |
| KCCM11166P/pCC1BAC | 29.0 | 8.2 |
| KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT) | 30.2 | 8.4 |
| KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM9 | 32.1 | 9.1 |
*22시간 측정치, ** 48시간 측정치
실시예 5. 유효
crp
변이형 내재 벡터의 야생형 대장균 도입
5-1. 유효 pCC1BAC-
crp
변이형의 야생형 유래 쓰레오닌 생산균주 도입
상기 실시예 3에서 스크리닝된 crp 변이형을 포함한 벡터가 야생형 균주에서도 동등한 효과를 보이는지 확인해 보기 위하여, pCC1BAC-crp(WT) 및 pCC1BAC-crpTM9의 벡터를 쓰레오닌을 생산할 수 있는 야생형 유래 균주에 전기천공법을 이용하여 형질전환(transformation)시켜 도입하였다. 또한 대조군으로 pCC1BAC-crp(WT)를 도입한 균주도 제작하였다.
본 실시예에 사용된 쓰레오닌을 생산할 수 있는 야생형 유래 균주는 W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC이며, W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC는 염색체상의 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈를 코딩하는 ppc 유전자의 native 프로모터를 cysK 유전자의 프로모터로 치환하고, 쓰레오닌 생합성 오페론 유전자를 벡터 형태로 도입하여 카피수를 증가시켜 쓰레오닌 생성량을 증가시킨 균주이다. 구체적으로는, 대한민국 등록특허 제10-0966324호에 기재된 방법대로, pUCpcycKmloxP를 이용하여 W3110::PcycK-ppc 균주를 제작 한 후, 상기 균주에 pACYC184-thrABC(대한민국 등록특허 제10-1865998호)를 전기천공법을 이용하여 형질전환하였다.
상기 제조된 균주들은 하기 표 8의 조성대로 제조된 쓰레오닌 평가 배지에서 배양하여 성장속도와 L-쓰레오닌 생산능을 비교하였다.
| 조성물 | 농도 (리터당) |
| Glucose | 70 g |
| KH2PO4 | 2 g |
| (NH4)2SO4 | 25 g |
| MgSO4·7H2O | 1 g |
| FeSO4·7H2O | 5 mg |
| MnSO4·7H2O | 5 mg |
| DL-메티오닌 | 0.15 g |
| 효모엑기스 | 2 g |
| 탄산칼슘 | 30 g |
| pH | 6.8 |
구체적으로, 33℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 W3110, 각각의 균주를 표 8의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하였으며, 이의 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 하기 결과에서 알 수 있듯이, 야생형 균주에서도 본 출원에서 선별한 변이형 단백질이 쓰레오닌을 고수율로 효율적으로 생산할 수 있음을 시사하는 것이다.
| 균주 | OD | 쓰레오닌 (g/L)** |
| W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC/pCC1BAC | 10.8 | 1.5 |
| W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC/ pCC1BAC-crp(WT) | 11.0 | 1.6 |
| W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC/pCC1BAC-crpTM9 | 13.0 | 2.4 |
5-2. 유효 pCC1BAC-
crp
변이형의 야생형 유래 트립토판 생산균주 도입
상기 실시예 4에서 스크리닝된 crp 변이형을 포함한 벡터가 야생형 균주에서도 동등한 효과를 보이는지 확인 하기 위하여, pCC1BAC-crp(WT) 및 pCC1BAC-crpTM9의 벡터를 트립토판을 생산할 수 있는 야생형 유래 균주로 형질전환(transformation)시켜 도입하였다.
본 실시예 사용된 트립토판을 생산할 수 있는 야생형 유래 균주는 W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA로서, 트립토판 오페론 조절 부위의 조절 기작이 해제되고, 트립토판을 과량 생산할 수 있도록 트립토판 오페론 발현이 강화된 벡터가 도입된 균주이다 (대한민국 등록특허 제10-1532129호). 벡터가 도입된 균주들은 하기 표 10의 조성대로 제조된 트립토판 평가 배지에서 배양하여 L-트립토판 생산능을 비교하였다.
| 조성물 | 농도 (리터당) |
| Glucose | 2 g |
| K2HPO4 | 1 g |
| (NH4)2SO4 | 12 g |
| NaCl | 1 g |
| Na2HPO4·H2O | 5 g |
| MgSO4·H2O | 1 g |
| MnSO4·H2O | 15 mg |
| CuSO4·H2O | 3 mg |
| ZnSO4·H2O | 30 mg |
| 구연산나트륨 | 1 g |
| 효모액기스 | 1 g |
| 페닐알라닌 | 0.15 g |
| pH | 6.8 |
구체적으로, 37℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지 상에 밤새 배양한 균주들을 각각 상기 표 9의 25 ㎖ 평가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하여 OD 및 트립토판 농도를 비교하여 표 11에 나타내었다. 하기 결과에서 알 수 있듯이, 야생형 균주에서도 본 출원에서 선별한 변이형 단백질이 트립토판을 고수율로 효율적으로 생산할 수 있음을 시사하는 것이다.
| 균주 | OD | 트립토판 (g/L)** |
| W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA/pCC1BAC | 10.8 | 0.5 |
| W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA/pCC1BAC-crp(WT) | 11.0 | 0.6 |
| W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA/pCC1BAC-crpTM9 | 12.3 | 0.8 |
본 발명자들은 KCCM11166P 균주 기반, pCC1BAC-crpTM9가 도입되어 트립토판 생산능 및 당 소모속도가 개선된 균주(KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM9)를 "CA04-2808"로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2018년 11월 07일자에 기탁하여 수탁번호 KCCM12374P를 부여받았다.
상기와 같은 결과들은, 본 출원의 crp 변이체가 도입된 에스케리키아속 미생물에서 당 소모 속도가 개선되면서 L-아미노산 생성능이 증가되어 결과적으로 비변형 균주보다 L-아미노산의 생산능이 증가되는 것을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> cAMP receptor protein variant and method for producing L-amino
acid using the same
<130> KPA181249-KR
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 210
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> CRP
<400> 1
Met Val Leu Gly Lys Pro Gln Thr Asp Pro Thr Leu Glu Trp Phe Leu
1 5 10 15
Ser His Cys His Ile His Lys Tyr Pro Ser Lys Ser Lys Leu Ile His
20 25 30
Gln Gly Glu Lys Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ile Val Lys Gly Ser Val
35 40 45
Ala Val Leu Ile Lys Asp Glu Glu Gly Lys Glu Met Ile Leu Ser Tyr
50 55 60
Leu Asn Gln Gly Asp Phe Ile Gly Glu Leu Gly Leu Phe Glu Glu Gly
65 70 75 80
Gln Glu Arg Ser Ala Trp Val Arg Ala Lys Thr Ala Cys Glu Val Ala
85 90 95
Glu Ile Ser Tyr Lys Lys Phe Arg Gln Leu Ile Gln Val Asn Pro Asp
100 105 110
Ile Leu Met Arg Leu Ser Ala Gln Met Ala Arg Arg Leu Gln Val Thr
115 120 125
Ser Glu Lys Val Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asp Val Thr Gly Arg Ile
130 135 140
Ala Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ala Met Thr His
145 150 155 160
Pro Asp Gly Met Gln Ile Lys Ile Thr Arg Gln Glu Ile Gly Gln Ile
165 170 175
Val Gly Cys Ser Arg Glu Thr Val Gly Arg Ile Leu Lys Met Leu Glu
180 185 190
Asp Gln Asn Leu Ile Ser Ala His Gly Lys Thr Ile Val Val Tyr Gly
195 200 205
Thr Arg
210
<210> 2
<211> 633
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> crp
<400> 2
atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 60
attcataagt acccatccaa gagcaagctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 120
tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 180
atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 240
caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 300
aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 360
atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 420
acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 480
ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 540
cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 600
ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 633
<210> 3
<211> 210
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> modified CRP
<400> 3
Met Val Leu Gly Lys Pro Gln Thr Asp Pro Thr Leu Glu Trp Phe Leu
1 5 10 15
Ser His Cys His Ile His Lys Tyr Pro Ser Lys Ser Lys Leu Ile His
20 25 30
Gln Gly Glu Lys Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ile Val Lys Gly Ser Val
35 40 45
Ala Val Leu Ile Lys Asp Glu Glu Gly Lys Glu Met Ile Leu Ser Tyr
50 55 60
Leu Asn Gln Gly Asp Phe Ile Gly Glu Leu Gly Leu Phe Glu Glu Gly
65 70 75 80
Gln Glu Arg Ser Ala Trp Val Arg Ala Lys Thr Ala Cys Glu Val Ala
85 90 95
Glu Ile Ser Tyr Lys Lys Phe Arg Gln Leu Ile Gln Val Asn Pro Asp
100 105 110
Ile Leu Met Arg Leu Ser Ala Gln Met Ala Arg Arg Leu Gln Val Thr
115 120 125
Ser Glu Lys Val Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asp Val Thr Gly Arg Ile
130 135 140
Ala Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ala Met Thr His
145 150 155 160
Pro Asp Gly Met Gln Ile Lys Ile Thr Arg Gln Glu Ile Gly Gln Ile
165 170 175
Val Gly Cys Ser Arg Glu Thr Val Gly Arg Ile Leu Lys Met Leu Glu
180 185 190
Asp Gln Asn Gln Ile Ser Ala His Gly Lys Thr Ile Val Val Tyr Gly
195 200 205
Thr Arg
210
<210> 4
<211> 633
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> modified crp
<400> 4
atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 60
attcataagt acccatccaa gagcaagctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 120
tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 180
atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 240
caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 300
aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 360
atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 420
acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 480
ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 540
cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaaccagat ctccgcacac 600
ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 633
<210> 5
<211> 933
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> crp and expression control region
<400> 5
tttgctactc cactgcgtca attttcctga cagagtacgc gtactaacca aatcgcgcaa 60
cggaaggcga cctgggtcat gctgaagcga gacaccagga gacacaaagc gaaagctatg 120
ctaaaacagt caggatgcta cagtaataca ttgatgtact gcatgtatgc aaaggacgtc 180
acattaccgt gcagtacagt tgatagcccc ttcccaggta gcgggaagca tatttcggca 240
atccagagac agcggcgtta tctggctctg gagaaagctt ataacagagg ataaccgcgc 300
atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 360
attcataagt acccatccaa gagcaagctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 420
tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 480
atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 540
caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 600
aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 660
atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 720
acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 780
ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 840
cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 900
ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 933
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crp-F
<400> 6
cacgaattct ttgctactcc actgcgtca 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crp-R
<400> 7
acacgaattc ttaacgagtg ccgtaaacg 29
Claims (9)
- 서열번호 1의 아미노산 서열에서 196번째 아미노산이 글루타민으로 치환된, cAMP 수용 단백질(cAMP receptor protein) 변이체.
- 제1항의 cAMP 수용 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 cAMP 수용 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제1항의 cAMP 수용 단백질 변이체를 포함하는, 에스케리키아 속(Escherichia sp.) 미생물.
- 제4항에 있어서, 상기 에스케리키아속 미생물은 대장균인, 에스케리키아 속 미생물.
- 제4항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 L-아미노산을 생산하는 것인, 에스케리키아속 미생물.
- 제6항 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것인, 에스케리키아 속 미생물.
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 미생물 또는 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것인, L-아미노산을 생산하는 방법.
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180151042A KR101991206B1 (ko) | 2018-11-29 | 2018-11-29 | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 |
| EP19845572.7A EP3686215A4 (en) | 2018-11-29 | 2019-07-25 | CAMP RECEPTOR PROTEIN MUTANT AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID USING THE SAME |
| MX2021004610A MX2021004610A (es) | 2018-11-29 | 2019-07-25 | Variante proteica receptora de ampc y procedimiento de produccion de l-aminoacido mediante el uso de la misma. |
| US16/633,461 US11473113B2 (en) | 2018-11-29 | 2019-07-25 | cAMP receptor protein variant, coding sequence and method of producing L-amino acid using the same |
| PCT/KR2019/009295 WO2020111438A1 (ko) | 2018-11-29 | 2019-07-25 | Camp 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산 제조방법 |
| JP2020512642A JP6935584B2 (ja) | 2018-11-29 | 2019-07-25 | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 |
| BR112020002790-1A BR112020002790B1 (pt) | 2018-11-29 | 2019-07-25 | Variante de proteína receptora de camp, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo do gênero escherichia, método para produzir um l-aminoácido e uso de uma variante de proteína receptora de camp ou de um microorganismo do gênero escherichia incluindo a variante na produção de laminoácido |
| RU2020102456A RU2743745C1 (ru) | 2018-11-29 | 2019-07-25 | Вариант белка рецептора цАМФ и способ получения L-аминокислоты с его применением |
| CA3070377A CA3070377C (en) | 2018-11-29 | 2019-07-25 | Camp receptor protein variant and method of producing l-amino acid using the same |
| CN201980004432.0A CN111491946B (zh) | 2018-11-29 | 2019-07-25 | cAMP受体蛋白变体和使用其生产L-氨基酸的方法 |
| PH12020500113A PH12020500113A1 (en) | 2018-11-29 | 2020-01-16 | Camp receptor protein variant and method of producing l-amino acid using the same |
| ZA2020/00593A ZA202000593B (en) | 2018-11-29 | 2020-01-29 | Camp receptor protein variant and method of producing l-amino acid using the same |
| MYPI2020000783A MY200992A (en) | 2018-11-29 | 2020-02-13 | Camp Receptor Protein Variant and Method of Producing L-Amino Acid using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180151042A KR101991206B1 (ko) | 2018-11-29 | 2018-11-29 | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101991206B1 true KR101991206B1 (ko) | 2019-06-19 |
Family
ID=67104312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180151042A Active KR101991206B1 (ko) | 2018-11-29 | 2018-11-29 | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11473113B2 (ko) |
| EP (1) | EP3686215A4 (ko) |
| JP (1) | JP6935584B2 (ko) |
| KR (1) | KR101991206B1 (ko) |
| CN (1) | CN111491946B (ko) |
| CA (1) | CA3070377C (ko) |
| MX (1) | MX2021004610A (ko) |
| MY (1) | MY200992A (ko) |
| PH (1) | PH12020500113A1 (ko) |
| RU (1) | RU2743745C1 (ko) |
| WO (1) | WO2020111438A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA202000593B (ko) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020111438A1 (ko) * | 2018-11-29 | 2020-06-04 | 씨제이제일제당 (주) | Camp 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산 제조방법 |
| JP2021509574A (ja) * | 2018-11-29 | 2021-04-01 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 |
| WO2022158647A1 (ko) * | 2021-01-25 | 2022-07-28 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 타우토머레이즈 ppta 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 |
| WO2022158648A1 (ko) * | 2021-01-25 | 2022-07-28 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 단백질 htrl 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 |
| WO2022163928A1 (ko) * | 2021-01-29 | 2022-08-04 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 |
| US11697673B2 (en) | 2018-11-29 | 2023-07-11 | Cj Cheiljedang Corporation | Camp receptor protein variant and method of producing L-amino acid using the same |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102527895B1 (ko) * | 2021-01-11 | 2023-04-28 | 씨제이제일제당 (주) | GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법 |
| EP4463466A1 (de) | 2022-03-01 | 2024-11-20 | Wacker Chemie AG | Verbesserte cystein produzierende stämme |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080286760A1 (en) * | 2003-11-26 | 2008-11-20 | Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Means and Methods for the Determination of Camp In Vitro and In Vivo |
| KR101261147B1 (ko) * | 2011-01-18 | 2013-05-06 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 |
| CN103114069A (zh) * | 2013-02-22 | 2013-05-22 | 新疆梅花氨基酸有限责任公司 | 混糖发酵生产l-色氨酸的细菌及发酵方法 |
| KR20160135025A (ko) * | 2015-05-14 | 2016-11-24 | 씨제이제일제당 (주) | L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 |
| KR20160135026A (ko) * | 2015-05-14 | 2016-11-24 | 씨제이제일제당 (주) | L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 |
| US20160362456A1 (en) * | 2015-06-12 | 2016-12-15 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Modified microorganisms for chemical production |
| KR101865998B1 (ko) * | 2014-09-05 | 2018-06-11 | 씨제이제일제당 (주) | L-쓰레오닌 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR920009598B1 (ko) | 1990-10-11 | 1992-10-21 | 주식회사삼성전자 | 풀림방지용 체결기구 |
| DE19630617A1 (de) | 1996-07-29 | 1998-02-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Positiver Selektionsvektor auf Basis des caps-Gens, pCAPs-Vektor und seine Verwendung |
| US8283148B2 (en) * | 2002-10-25 | 2012-10-09 | Agilent Technologies, Inc. | DNA polymerase compositions for quantitative PCR and methods thereof |
| KR100576342B1 (ko) | 2004-02-05 | 2006-05-03 | 씨제이 주식회사 | ｇａｌＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물,그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| GB0410983D0 (en) * | 2004-05-17 | 2004-06-16 | El Gewely Mohamed R | Molecules |
| JP2008529558A (ja) * | 2005-02-18 | 2008-08-07 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド | 髄膜炎／敗血症に関連する大腸菌由来のタンパク質および核酸 |
| KR100812110B1 (ko) | 2006-10-24 | 2008-03-12 | 한국과학기술원 | 징크 핑거 단백질과 원핵 생물의 전사 인자를 포함하는인공 전사 인자의 제조 및 이의 이용 |
| KR100966324B1 (ko) | 2008-01-08 | 2010-06-28 | 씨제이제일제당 (주) | 향상된 ｌ－쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 및 이를 이용한ｌ－쓰레오닌의 생산 방법 |
| KR101058893B1 (ko) * | 2009-03-03 | 2011-08-23 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 생산방법 |
| KR101058286B1 (ko) | 2009-07-13 | 2011-08-22 | 강동선 | 주물사 분말을 사용한 고 내화도을 가지는 탕도 및 제조 방법 |
| RU2471868C2 (ru) * | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
| HUE057864T2 (hu) | 2012-01-10 | 2022-06-28 | Cj Cheiljedang Corp | Fokozott L-triptofán termeléssel rendelkezõ Escherichia coli mikroorganizmusok és eljárás L-triptofán elõállítására azok alkalmazásával |
| KR20140017213A (ko) | 2012-07-31 | 2014-02-11 | 건국대학교 산학협력단 | 카르도 구조를 갖는 황산화 고분자 전해질막 및 이를 포함하는 연료전지 |
| EP3050970B1 (en) | 2015-01-28 | 2019-09-18 | Metabolic Explorer | Modified microorganism for optimized production of 1,4-butanediol |
| EP3280694B1 (en) * | 2015-04-07 | 2021-11-24 | Metabolic Explorer | Modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxyburyrate |
| KR101795912B1 (ko) | 2016-03-14 | 2017-11-08 | 주식회사 야스 | 하나의 진공 증착 챔버에서 두 장의 기판에 순차 증착하는 시스템 |
| KR101996767B1 (ko) | 2018-11-29 | 2019-07-04 | 씨제이제일제당 (주) | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 |
| KR101991207B1 (ko) * | 2018-11-29 | 2019-06-19 | 씨제이제일제당 (주) | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 |
| KR101991206B1 (ko) | 2018-11-29 | 2019-06-19 | 씨제이제일제당 (주) | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 |
-
2018
- 2018-11-29 KR KR1020180151042A patent/KR101991206B1/ko active Active
-
2019
- 2019-07-25 MX MX2021004610A patent/MX2021004610A/es unknown
- 2019-07-25 JP JP2020512642A patent/JP6935584B2/ja active Active
- 2019-07-25 CA CA3070377A patent/CA3070377C/en active Active
- 2019-07-25 RU RU2020102456A patent/RU2743745C1/ru active
- 2019-07-25 WO PCT/KR2019/009295 patent/WO2020111438A1/ko unknown
- 2019-07-25 US US16/633,461 patent/US11473113B2/en active Active
- 2019-07-25 CN CN201980004432.0A patent/CN111491946B/zh active Active
- 2019-07-25 EP EP19845572.7A patent/EP3686215A4/en active Pending
-
2020
- 2020-01-16 PH PH12020500113A patent/PH12020500113A1/en unknown
- 2020-01-29 ZA ZA2020/00593A patent/ZA202000593B/en unknown
- 2020-02-13 MY MYPI2020000783A patent/MY200992A/en unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080286760A1 (en) * | 2003-11-26 | 2008-11-20 | Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Means and Methods for the Determination of Camp In Vitro and In Vivo |
| KR101261147B1 (ko) * | 2011-01-18 | 2013-05-06 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 |
| CN103114069A (zh) * | 2013-02-22 | 2013-05-22 | 新疆梅花氨基酸有限责任公司 | 混糖发酵生产l-色氨酸的细菌及发酵方法 |
| KR101865998B1 (ko) * | 2014-09-05 | 2018-06-11 | 씨제이제일제당 (주) | L-쓰레오닌 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법 |
| KR20160135025A (ko) * | 2015-05-14 | 2016-11-24 | 씨제이제일제당 (주) | L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 |
| KR20160135026A (ko) * | 2015-05-14 | 2016-11-24 | 씨제이제일제당 (주) | L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 |
| US20160362456A1 (en) * | 2015-06-12 | 2016-12-15 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Modified microorganisms for chemical production |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020111438A1 (ko) * | 2018-11-29 | 2020-06-04 | 씨제이제일제당 (주) | Camp 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산 제조방법 |
| JP2021509573A (ja) * | 2018-11-29 | 2021-04-01 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 |
| JP2021509574A (ja) * | 2018-11-29 | 2021-04-01 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 |
| US11473113B2 (en) | 2018-11-29 | 2022-10-18 | Cj Cheiljedang Corporation | cAMP receptor protein variant, coding sequence and method of producing L-amino acid using the same |
| US11697673B2 (en) | 2018-11-29 | 2023-07-11 | Cj Cheiljedang Corporation | Camp receptor protein variant and method of producing L-amino acid using the same |
| WO2022158647A1 (ko) * | 2021-01-25 | 2022-07-28 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 타우토머레이즈 ppta 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 |
| WO2022158648A1 (ko) * | 2021-01-25 | 2022-07-28 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 단백질 htrl 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 |
| WO2022163928A1 (ko) * | 2021-01-29 | 2022-08-04 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6935584B2 (ja) | 2021-09-15 |
| JP2021509573A (ja) | 2021-04-01 |
| PH12020500113A1 (en) | 2020-09-14 |
| US11473113B2 (en) | 2022-10-18 |
| EP3686215A1 (en) | 2020-07-29 |
| EP3686215A4 (en) | 2022-01-19 |
| RU2743745C1 (ru) | 2021-02-25 |
| US20210317488A1 (en) | 2021-10-14 |
| MY200992A (en) | 2024-01-29 |
| MX2021004610A (es) | 2021-07-07 |
| CA3070377A1 (en) | 2020-05-29 |
| CN111491946A (zh) | 2020-08-04 |
| CN111491946B (zh) | 2021-11-19 |
| CA3070377C (en) | 2023-09-19 |
| WO2020111438A1 (ko) | 2020-06-04 |
| BR112020002790A2 (pt) | 2021-07-20 |
| ZA202000593B (en) | 2021-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101991206B1 (ko) | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 | |
| KR101996767B1 (ko) | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 | |
| US11667936B2 (en) | Modified polypeptide with attenuated activity of citrate synthase and method for producing L-amino acid using the same | |
| US11746130B2 (en) | Polypeptide and method of producing IMP using the same | |
| KR101991207B1 (ko) | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 | |
| KR102112208B1 (ko) | 신규한 o-숙시닐 호모세린 트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 o-숙시닐 호모세린의 제조방법 | |
| KR102112232B1 (ko) | 신규한 o-숙시닐 호모세린 트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 o-숙시닐 호모세린의 제조방법 | |
| CA3070470A1 (en) | Camp receptor protein variant and method of producing l-amino acid using the same | |
| CN111032874A (zh) | 表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物以及生产活性d-脯氨酸还原酶的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20181129 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| A302 | Request for accelerated examination | ||
| PA0302 | Request for accelerated examination |
Patent event date: 20190510 Patent event code: PA03022R01D Comment text: Request for Accelerated Examination Patent event date: 20181129 Patent event code: PA03021R01I Comment text: Patent Application |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20190521 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20190613 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20190613 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20220223 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240222 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20250224 Start annual number: 7 End annual number: 7 |