KR100812110B1 - 징크 핑거 단백질과 원핵 생물의 전사 인자를 포함하는인공 전사 인자의 제조 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 징크 핑거 단백질과 원핵 생물의 전사 인자를 이용하여 대장균의 유전자 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 인공 전사 인자 및 이를 이용한 형질전환 대장균에 관한 것이다. 구체적으로는, 징크 핑거 도메인 및 대장균의 전사인자를 효과 도메인으로 구성한 인공 전사 인자를 제조하고, 상기 인공 전사 인자 라이브러리를 대장균에 도입하게 되면 대장균 내부(endogenous)의 전사 인자의 작용과 무관하게 인위적으로 유전자의 발현이 효과적으로 조절되어 다양한 형질을 가진 대장균을 유도할 수 있어, 이를 통해 산업적으로 유용한 특성을 가지는 대장균만을 선택적으로 선별하여 이를 이용할 수 있다.

징크 핑거, 원핵 생물, 인공 전사 인자, 대장균

Description

징크 핑거 단백질과 원핵 생물의 전사 인자를 포함하는 인공 전사 인자의 제조 및 이의 이용{A PREPARATION OF AN ARTIFICIAL TRANSCRIPTION FACTOR COMPRISING ZINC FINGER PROTEIN AND TRANSCRIPTION FACTOR OF PROKARYOTE, AND AN USE THEREOF}

도 1은 본 발명의 인공 전사 인자를 통해 대장균에서 다양한 형질전환을 유도하는 발명의 개략도로써, 원은 징크 핑거 도메인을, 사각형은 효과 도메인을 각각 의미하고,

도 2는 대장균의 이화 물질 조절 단백질(catabolite regulatory protein, cyclic AMP receptor protein, CRP)의 기능을 확인하기 위해 제작한 시험 전사 인자에 사용한 징크 핑거 단백질과 그 염기서열을 도식적으로 나타낸 것으로서, 각 징크 핑거 단백질이 인식하는 염기 서열을 각 징크 핑거 밑에 나타내었고,

도 3a 및 도 3b는 본 발명의 인공 전사 인자의 효과 도메인으로써 CRP의 기능을 확인하기 위해 도 2의 시험 전사 인자의 징크 핑거 단백질들이 인식하는 특정 염기서열을 tac 프로모터 상, 하위에 삽입하여 제작한 리포터 플라스미드의 일부를 나타낸 것으로서, 도 3a는 인공 전사인자의 유전자 발현 활성 능력을 확인하기 위한 리포터 플라스미드 pEGFP-A를 나타내고, 도 3b는 유전자 발현 억제 능력을 확인하기 위한 리포터 플라스미드 pEGFP-R를 나타내고,

도 4 는 시험 전사 인자가 pEGFP-A의 향상된 녹색 형광 특성을 갖는 GFP 유도체(EGFP) 리포터 유전자의 전사를 활성화시키는 결과를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통해 확인한 사진이고,

도 5는 도 4의 시험 전사 인자에 의해 이미 활성화된 리포터 유전자 발현의 활성화 정도를 수치화한 도표이고,

도 6은 도 4의 시험 전사 인자에 의해 억제된 리포터 유전자 발현의 활성화 정도를 수치화한 도표이고,

도 7은 pEGFP-R에서 IPTG에 의해 발현이 활성화되어 있는 리포터 유전자가 시험 전사 인자에 의해 발현이 억제되는 것을 수치화한 도표이고,

도 8은 CRP Del 180를 효과 도메인으로 이용하여 제작한 인공 전사 인자를 통해 열에 저항성을 나타낸 대장균을 선별한 사진이고,

도 9는 열에 대한 저항성이 가장 좋은 대장균인 T2의 50℃에서의 성장곡선을 나타내며,

도 10은 CRP Del 180을 효과 도메인으로 이용하여 제작한 인공 전사 인자를 통해 성장이 향상된 대장균을 37℃, LB배지에서의 성장속도를 나타내고,

도 11은 CRP Del 180을 효과 도메인으로 이용하여 제작한 인공 전사 인자를 통해 성장이 향상된 대장균을 37℃, M9배지에서 성장속도를 나타내고,

도 12는 CRP Del 180를 효과 도메인으로 이용하여 제작한 인공 전사 인자를 통해 저온에 대한 저항성을 나타낸 대장균을 선별한 사진이고,

도 13는 저온에 대한 저항성이 가장 좋은 대장균인 CT1 및 대조군의 성장곡 선을 나타내며,

도 14은 CRP Del 180을 효과 도메인으로 이용하여 제작한 인공 전사 인자를 통해 삼투압에 대한 저항성을 나타낸 대장균을 선별하는 사진을 나타내고 있고,

도 15는 pACYC184 플라스미드의 개열지도를 나타내고,

도 16은 pUC19 플라스미드의 개열지도를 나타내고 있다.

본 발명은 징크 핑거 단백질과 원핵 세포 미생물의 전사 인자를 이용하여 대장균의 유전자 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 인공 전사 인자 및 이를 이용한 형질전환 대장균에 관한 것이다.

포스트 게놈 시대의 도래와 함께 많은 생명체의 유전자 정보를 토대로 연구와 분석이 활발하게 진행되고 있다. 그 중 유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 시스템의 개발과 필요성은 초미의 관심사로 활발히 연구되고 있는 분야 중 하나이다. 생물체 내 혹은 세포 내에서 인위적으로 특정 유전자의 발현의 증감을 조절할 수 있다면, 이를 통해 나타나는 생물학적 결과를 분석함으로써 특정 유전자의 기능을 해석하거나 그 유전자의 생물학적 역할을 밝힐 수 있다. 뿐만 아니라 표적으로 하는 유전자의 발현을 적절히 조절할 수 있다면 이는 유전자 치료의 수단으로써 활용될 수 있을 것이다. 또한 자연에서 생명체의 특징은 그 생명체가 가진 특정 유전자의 발현 여부와 정도에 의해 결정됨으로 인위적으로 유전자의 발현을 조절하 여 원하는 형질을 나타내는 생물체를 유도하여 맞춤형 산업 균주의 개발에도 응용할 수 있는 것이다.

최근 징크 핑거 단백질을 이용하여 유전자의 발현을 조절할 수 있을 것이라는 가능성이 대두되면서 이에 대한 긍정적인 연구결과가 있었다. 징크 핑거는 진핵생물에서 가장 흔하게 발견되는 DNA 결합 단백질의 DNA 결합 모티브로 알려져 있다. 징크 핑거는 서열 특이적으로 특정 표적 서열을 인식할 수 있는 활성을 띄는 도메인으로서 그 자체로 전사 억제 인자로 작용할 수 있다. 뿐만 아니라 이 징크 핑거 단백질을 DNA 결합 도메인으로 이용하고 전사 활성화 (또는 억제) 도메인과 연결하여 새로운 전사인자를 제작할 수 있다.

최근에 서열 특이적 징크 핑거 DNA 결합 도메인을 여러가지 종류의 적당한 효과 도메인(활성화 도메인과 또는 억제 도메인)과 융합하여 전사인사의 형태로 세포에서 발현했을 때 표적 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다는 연구가 발표되었다 (Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., and Barb as, C. F., III, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5525-5530; Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas C. F., III, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14628-14633; Beerli R.R., Dreier B. Barbas C.F.3rd, Positive and negative regulation of endogeneous genes by designed transcription factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 Feb. 15:97(4), 1495-500).

그러나, 기존의 원핵 세포에서의 연구는 효과 도메인 없이 징크 핑거 도메인만을 전사인자로 이용함으로써 유전자의 발현을 억제하는 효과만 기대할 수 있었고 그 효과도 미약하였다. 다양한 형질을 보다 효과적으로 얻기 위해서는 유전자 발현의 억제 뿐만 아니라 활성화를 통한 다양한 유전자의 발현 조절이 필요하다.

따라서, 본 발명자들은 징크 핑거 도메인 라이브러리에 효과 도메인으로써 원핵 생물로서 산업적으로 유용한 대장균의 전사 인자를 융합시켜 대장균의 유전자 발현의 억제 뿐만 아니라 활성화할 수 있는 새로운 인공 전사 인자를 개발하고, 이를 대장균에 도입할 경우 대장균의 유전자 발현이 인위적으로 조절됨으로써 다양한 형질을 가지는 형질전환 대장균을 제작할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 징크 핑거 도메인과 원핵 생물의 전사 인자를 효과 도메인으로써 융합시켜 유전자 발현을 인위적으로 억제 또는 활성화할 수 있는 인공 전사 인자의 제조 및 이를 이용한 다양한 형질 특이성을 나타내는 형질전환된 대장균을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1개 내지 3개의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로서 원핵 생물의 전사 인자를 포함하여 인위적으로 유전자 발현을 활성화시키거나 억제시킬 수 있는 인공 전사 인자를 제공한다. 상기 효과 도메인으로서 원핵 생물의 전사 인자는 대장균의 이화 물질 조절 단백질(CRP, catabolite regulatory protein, cyclic AMP receptor protein) 또는 그의 유도체인 야생형(wild type) CRP(CRP W, 잔기 1-209), CRP Del 137 (잔기 137-190) 또는 CRP Del 180 (잔기 1-180)를 이용한다.

또한, 상기 징크 핑거 도메인은 인간 유전체로부터 동정된 것으로서, 서열번호 13 내지 64의 서열에 의해 코딩되는 징크 핑거 도메인으로 구성되는 것으로부터 선택되는 것이다.

또한, 상기 인공전사인자는 유전자 발현을 활성화시키기 위하여는 전사 개시 시점으로부터 -80에서 -30에, 바람직하게는 -67 내지 -50 부위에 삽입되고, 유전자 발현을 억제시키기 위하여는 전사 개시 시점으로부터 -30 하위에, 바람직하게는 +24 내지 +41 부위에 결합된다.

또한, 본 발명은 상기 인공 전사 인자가 도입되어 다양한 형질을 발현하는 형질전환된 대장균을 제공하고, 바람직하게는 열저항성을 갖는 형질전환 대장균, 성장속도가 향상된 형질전환 대장균, 낮은 온도에 대한 저항성을 갖는 형질전환 대장균 및 삼투압에 저항성을 갖는 형질전환 대장균을 제공한다.

이하에서, 본 발명을 상세히 설명한다.

DNA 결합 도메인 - 징크 핑거 도메인

징크 핑거 도메인은 진핵생물에서 가장 흔하게 발견되는 DNA 결합 단백질의 DNA 결합 모티프로서 효모에서 고등 식물 및 인간에 이르는 다양한 종에서 발견된다. 징크 핑거 도메인은 그 자체로 유전자 발현을 억제하는 전사 억제자로 작용할 수 있다고 알려져 있다. 그러므로 이러한 징크 핑거 도메인에 효과 도메인 (활성 또는 억제)을 융합시키면 상기 융합 단백질은 새로운 전사인자로서 징크 핑거가 인 식하는 표적 유전자의 발현을 활성 또는 억제시킬 수 있는 것이다.

본 발명의 징크 핑거 도메인은 Cys2-His2 타입의 징크 핑거 도메인으로 보통 3개 이상이 나란히 배열되어 징크 핑거 단백질을 구성한다. 하나의 징크 핑거 도메인은 3개 혹은 4개의 염기로 구성된 표적서열을 인식할 수 있기 때문에, 여러 징크 핑거 도메인의 적절한 재배열 및 연결을 통해 9-10 염기의 표적 서열을 선택적으로 인식할 수 있는 서열특이적 징크 핑거를 제작할 수 있다. 본 발명에서는 인간 유전체의 징크 핑거 도메인을 1 내지 3개 배열하여 본 발명에서 개발된 새로운 전사인자의 DNA 결합 도메인으로 이용한다. 본 발명의 징크 핑거 도메인은 인간 유전체에서 동정된 징크 핑거 도메인이다. 본 발명의 새로운 전사 인자의 효과 도메인의 기능을 확인하기 위해서 리포터 플라스미드 상의 5’-GCG GCG GGG-3’서열을 표적으로 인식할 수 있는 시험적인 징크 핑거 단백질을 제작, 이용하였다. 징크 핑거로 5’-GCG-3’을 인식하는 ZFP1과 5’-GGG-3’를 인식하는 ZFP2을 이용하여 N-말단에서부터 효과 도메인-ZFP2-ZFP1-ZFP1 C-말단으로 구성된 시험적인 전사 인자를 제작하여 이용하였다.

효과 도메인

원핵 생물에서 전사 인자는 일반적으로 전사 활성과 억제의 두 가지 기능을 동시에 가진다. 전사 활성과 억제의 기능은 전사 인자가 결합하는 유전체 서열 상의 위치에 따라 달라진다. 일반적으로 전사 개시점으로부터 -80에서 -30에 전사 인자가 결합할 경우 유전자 발현을 활성화시키고 -30 하위에 결합할 경우 유전자 발 현을 억제하는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 원핵 생물인 대장균에서 작용 가능한 전사 인자를 개발코자 함으로 진핵생물과 같이 활성과 억제를 위한 각각의 다른 도메인을 필요로 하지 않고 하나의 활성이 좋은 효과 도메인을 이용함으로써 전사 활성과 억제의 두 가지 기능을 동시에 얻을 수 있다.

또한 야생형(wild type)의 전사 인자뿐만 아니라 실제 유전자 발현을 억제 또는 활성화시키는 전사인자 내부의 전사 조절 활성화 도메인(activating domain)만을 효과 도메인으로 이용할 수 있다.

본 발명에서는 원핵 세포 생물의 전사 인자를 효과 도메인으로 이용할 수 있다. 구체적으로, 대장균의 보편적인 전사 인자인 CRP(이화 물질 조절 단백질, catabolite regulatory protein, cyclic AMP receptor protein)와 그 유도체를 효과 도메인으로 이용할 수 있다. CRP는 대장균 유전체의 100개 이상의 프로모터에 작용하여 그 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자로 잘 알려져 있다. CRP는 209개의 아미노산으로 이루어져 있으며 두 가지 도메인으로 구성되어 있다. 즉, CRP의 이합체화물(dimerization)과 cAMP와 결합하여 상호작용하는 N- 말단 도메인과 DNA 결합에 작용하는 C- 말단 도메인으로 구성되어 있다. 그리고 전사를 활성화시키는 3종류의 활성화 도메인이 있으며, 이는 각각 AR1 (잔기 156-164), AR2 (잔기 19, 21, 96 및 101) 및 AR3 (잔기 52, 53, 54, 55, 58)가 CRP의 활성화 도메인이다. 이 중 AR1이 전사 활성에 있어 가장 유력하게 이용되는 활성화 도메인이다(Busby, S., Ebright, R. H., J Mol Biol., 293, 1999, 199-213; Rhodius, V. A., West, D. M., Webster, C. L., Busby, S. J., Savery N., J.Nucleic Acids Res., 25, 326-332, 1997; Rhodius, V. A., Busby, S. J., J. Mol. Biol., 299, 295-310, 2000; Wagner, R., Transcription regulation in prokaryotes., 199-207 및 211-217. Oxford University Press. Oxford., 2000).

본 발명에서의 CRP는 효과 도메인으로써의 기능만 필요로 되고 전사 인자의 DNA 결합 도메인으로 징크 핑거 도메인이 이용되기 때문에 CRP의 DNA 결합 도메인은 불필요하다. 따라서 CRP와 함께 CRP의 DNA 결합 도메인 부분을 제거하거나 AR1부분을 포함하는 CRP 유도체를 효과 도메인으로 이용할 수 있다. 구체적으로는 다음의 3종류를 효과 도메인으로 이용할 수 있다: 야생향(wild type) CRP인 CRP W (잔기 1-209), CRP 유도체로써 CRP Del 137 (잔기 137-190)과 CRP Del 180 (잔기 1-180).

펩티드 링커

DNA 결합 도메인들을 연결하거나 DNA 결합 도메인과 효과 도메인을 연결할 경우 다양한 링커가 사용될 수 있다. 본 발명은 자연계에 존재하는 징크 핑거 단백질에서 징크 핑거 도메인을 연결하는 링커를 사용할 수 있다. 상기 자연계에 존재하는 전형적인 링커로는 Thr-Gly-(Glu-Gln)-(Lys-Arg)-Pro-(Tyr-Phe)가 있다. 본 발명에서는 Thr-Gly-Glu-Lys-Pro-Tyr 을 징크 핑거 도메인들과 징크 핑거 도메인과 효과 도메인을 연결하기 위해 이용할 수 있다.

리포터 플라스미드

본 발명의 인공 전사 인자의 유전자 발현 조절 능력을 확인하기 위하여 두 가지 리포터 플라스미드를 제작하였고, 이는 유전자 발현 활성을 확인하기 위한 리포터 플라스미드, pEGFP-A와 유전자 발현 억제를 확인하기 위한 리포터 플라스미드, pEGFP-R 이다. 각 리포터 플라스미드는 대장균 내부(endogenous) 전사 인자의 활성에 따라 본 발명에서 개발된 전사 인자의 능력이 영향을 받는지 여부를 확인하기 위하여 대장균 내부(endogenous) 전사인자인 lacI에 의해 조절되는 tac 프로모터를 이용하여 변형하였다. tac 프로모터의 변형은 각 리포터 플라스미드의 tac 프로모터의 인접부위에 본 발명의 시험 전사 인자가 표적으로 하여 결합할 수 있는 염기서열인 5’-GCG GCG GGG-3’을 삽입함으로써 완성되었다. 즉, 상기 언급한 바와 같이 원핵생물 전사 인자는 전사 개시점으로부터의 결합 위치에 따라 능력(활성 또는 억제)이 달라지므로 전사 개시점으로부터 시험 전사 인자의 결합 염기 서열을 적합한 위치에 삽입하여 리포터 플라스미드의 프로모터를 완성하였다.

본 발명의 구체예에서, 시험 전사 인자의 유전자 발현 활성 능력을 확인하기 위한 리포터 플라스미드의 프로모터는 전사개시점으로 부터 -67 내지 -50 부위에 5’-GCG GCG GGG-3’의 2 카피를 삽입하여 완성하였다. 시험 전사 인자의 유전자 발현 억제 능력을 확인하기 위한 리포터 플라스미드의 프로모터는 전사 개시점으로부터 +24 내지 +41 부위에 5’-GCG GCG GGG-3’의 2 카피를 삽입하여 완성하였으며, 이는 도 3에서 보는 바와 같다.

리포터 유전자는 유전자 발현 확인과 정량이 용이한 향상된 녹색 형광 특성 을 갖는 GFP 유도체(Clontech Laboratories, Inc., CA)를 이용하였다. GFP 유도체 발현은 여기 후 형광 방출을 측정하여 검출할 수 있으며, 공초점 현미경(confocal microscopy)과 형광분광광도계 (Spectrofluorometer)를 이용하여 검출할 수 있다.

이하, 하기의 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 의하여 제한되지 않는다.

실시예 1. 시험 전사 인자의 제조

본 발명의 전사 인자의 기능을 확인하기 위해서 리포터 플라스미드 상의 5’-GCG GCG GGG-3’서열을 표적으로 인식할 수 있는 시험적인 징크 핑거 도메인은 다음의 징크 핑거 도메인을 이용하여 제작하였다. 징크 핑거로 5’-GCG-3’를 인식하는 ZFP1과 5’-GGG-3’인식하는 ZFP2를 이용하였다. 효과 도메인으로는 CRP W(서열번호 1)와 CRP 유도체 CRP Del 137 (잔기 137-190, 서열번호 3)과 CRP Del 180 (잔기 1-180, 서열번호 5)를 이용하였다. 융합된 각 효과 도메인에 따라 3종류의 시험적인 전사 인자를 제작하였으며, 효과 도메인으로 CRP W를 이용한 경우는 ZFP-CRP W으로, CRP Del 180을 효과도메인으로 이용한 경우는 ZFP-CRP Del 180으로, CRP Del 137을 효과 도메인으로 이용한 경우는 ZFP-CRP Del 137으로 명명하였다. 상기 전사 인자는 N-말단에서부터 효과 도메인-ZFP2-ZFP1-ZFP1 C-말단으로 구성되어 있다(도 2 참조).

상기 효과 도메인은 대장균으로부터 PCR로 증폭 후 NcoI과 EcoRI을 이용하여 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 그 후 합성된 각각의 징크 핑거 도메인을 순서대로 XmaI과 EcoRI을 이용하여 AgeI과 EcoRI으로 절단된 효과 도메인이 클로닝된 발현 플라스미드에 연결하였다.

또한, 상기 시험 전사 인자의 징크 핑거인 ZFP1은 인간 유전체 서열로부터 선별되었으며, 서열번호 9의 인간 핵산 서열에 의해 암호화되는 것이다. 또한, 시험 전사 인자의 징커 핑거인 ZFP2 역시 인간 유전체 서열로부터 선별되었으며, 서열번호 11의 인간 핵산 서열에 의해 암호화된다.

실시예 2. 리포터 플라스미드 제조

유전자 발현의 활성 및 억제를 확인하기 위한 각 리포터 플라스미드는 pACYC184(New England Biolabs, Inc., USA, 도 15)를 변형시켜 사용하였다. 리포터 플라스미드는 리포터 유전자로 향상된 녹색 형광 특성을 갖는 GFP 유도체 (EGFP) 유전자와 tac 프로모터 유전자와 시험 전사 조절 인자의 표적 인식 서열을 PCR로 증폭한 후 pACYC184에 삽입하여 제작하였다. 유전자 발현 활성을 확인하기 위한 리포터 플라스미드인 pEGFP-A는 시험 전사 인자의 표적서열인 5’-GCG GCG GGG-3’두 카피를 전사 개시점으로부터 -67 내지 -50 부위에 삽입하여 제작하였다(도 3a 참조). 또한, 시험 전사 인자의 유전자 발현 억제 능력을 확인하기 위한 리포터 플라스미드로 pEGFP-R의 프로모터는 전사 개시점으로부터 +24 내지 +41 부위에 시험 저사 인자의 표적서열인 5’-GCG GCG GGG-3’두 카피를 삽입하여 제작하였으며(도 3b 참조), pEGFP-A 리포터 플라스미드의 염기서열은 서열번호 7에, pEGFP-R 리포터 플라스미드의 염기서열은 서열번호 8과 같다.

실험예 1. 효과 도메인 기능 확인

본 발명의 전사 인자의 기능이 대장균(E. coli MG1655 K-12 Blattner laboratory) 내부의 전사 인자인 lac I 억제자의 영향을 받지 않고 인위적으로 유전자의 발현을 활성화 또는 억제시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 ZFP-CRP W, ZFP-CRP Del 180 및 ZFP-CRP Del 137 시험 전사 인자를 유전자 발현의 활성화를 알아보기 위하여 상기 실시예 2에서 제조된 pEGFP-A 리포터 플라스미드 및 유전자 발현의 억제를 확인하기 위하여 상기 실시예 2에서 제조된 pEGFP-R 리포터 플라스미드에 각각 도입시키고, 1 mM의 IPTG( Isopropyl- β -D-thiogalactopyranoside)를 첨가한 경우 및 첨가하지 않은 경우로 나누어 본 발명의 전사 인자에 의한 리포터 유전자의 발현의 활성화 또는 억제 여부를 실험하였으며, 상기 리포터 플라스미드 내에는 녹색 형광 특성을 갖는 GFP 유도체 유전자로 인하여 리포터 플라스미드의 발현 정도를 형광 정도로 관찰할 수 있으며, 이는 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통해 관찰하였다.

한편, 본 발명의 시험 전사 인자로 인한 리포터 유전자 발현의 활성화률 또는 억제률을 구한바, 활성률은 상기 실시예 1에서 제조된 시험 전사 인자를 암호화하지 않은 대조군(control) 플라스미드가 도입된 보통 세포에서 리포터 유전자의 발현양을 구하고 이 값으로 시험 전사 인자를 암호화하는 플라스미드가 도입된 세포에서의 리포터 유전자의 발현양을 나누어 수치화하였다. 또한, 억제률은 상기 실시예 1의 시험 전사 인자를 암호화하지 않은 대조군(control) 플라스미드가 도입된 보통 세포에서 리포터 유전자의 발현양을 구하고 이를 시험 전사 인자를 암호화하는 플라스미드가 도입된 세포에서의 리포터 유전자의 발현양으로 나누어 수치화하였다.

상기 실험 수행의 결과는 본 발명의 시험 전사 인자의 리포터 유전자의 전사 활성은 도 4에서 보는 바와 같다. 도 4의 no vector는 리포터 플라스미드와 시험 전사 인자를 암호화하는 플라스미드 모두가 도입되지 않은 야생형(wild type) 대장균을 의미하고, empty vector는 시험 전사 인자를 암호화하는 플라스미드 없이 리포터 플라스미드만이 도입된 대장균을 의미하는 것이며, ZFP-CRP W은 효과 도메인으로 야생형(wild type) CRP가 융합된 시험 전사 인자를 암호화하는 플라스미드와 리포터 플라스미드가 도입된 대장균, ZFP-CRP Del 180은 효과 도메인으로 CRP 유도체 중 CRP 잔기 1-180이 융합된 시험 전사 인자를 암호화하는 플라스미드와 리포터 플라스미드가 도입된 대장균, ZFP-CRP Del 137은 효과 도메인으로 CRP 유도체 중 CRP 잔기 137-190이 융합된 시험 전사 인자를 암호화하는 플라스미드와 리포터 플라스미드가 도입된 대장균을 나타낸다. 도 4에서와 같이, 야생형의 CRP W보다 CRP 유도체인 CRP Del 180 및 CRP Del 137을 효과 도메인으로 가진 전사 인자가 리포터 유전자의 발현을 더욱 탁월하게 활성화시킴을 확인할 수 있었다. 또한, IPTG에 의해 이미 발현이 활성화되어 있는 리포터 유전자의 발현이 시험 전사 인자에 의해 보다 더 강하게 활성화되었으며, ZFP-CRP Del 180와 ZFP-CRP Del 137는 각각 2배, 3배로 EGFP의 발현을 활성화시킴을 확인할 수 있었다 (도 4의 A-E 및 도 5 참조).

또한, IPTG를 첨가하지 않음으로써 발현이 억제되어 있는 리포터 유전자의 발현이 본 발명의 시험 전사 인자에 의해 pEGFP-A의 리포터 유전자의 발현이 활성화되었고, ZFP-CRP W는 2배, ZFP-CRP Del 180와 ZFP-CRP Del 137는 각각 3배, 4배로 EGFP의 발현을 활성화됨을 확인할 수 있었다 (도 4의 F-J 및 도 6 참조).

한편, 리포터 유전자의 억제 여부는 도 7에서 보는 바와 같이, pEGFP-R에서 IPTG에 의해 발현이 활성화되어 있는 리포터 유전자가 시험 전사 인자에 의해 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, ZFP-CRP Del 180와 ZFP-CRP Del 137는 각각 1.5배, 2배 정도로 리포터 유전자의 발현을 억제시킴을 확인할 수 있있다.

따라서, 상기 실험 결과를 종합하여 보면, 본 발명의 시험 전사 인자는 대장균 내부(endogenous) 전사 억제 인자인 lacI 단백질과 무관하게 효과적으로 리포터 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것이다.

실험예 2. 전사 인자 라이브러리 제작

진 뱅크(GenBank) 데이터베이스 검색 결과 선별된 인간 유전체의 26 종류 징크 핑거 도메인을 합성하여 pUC19(New England Biolabs. Inc., USA, 도 16 참고) 클로닝하였다. 본 발명자들은 전사 인자 발현 플라스미드에 효과 도메인으로서 CRP 유도체인 CRP Del 137과 CRP Del 180을 각각 클로닝하여 융합된 효과 도메인에 따 라 두 종류의 다른 전사 인자 라이브러리를 제작하였다. 전사 인자 라이브러리의 제작은 상기 시험적인 전사 인자 제작 방법과 동일하게 이루어졌다. 즉, 효과 도메인이 클로닝된 발현 플라스미드를 AgeI과 EcoRI으로 절단한다. 각기 다른 징크 핑거 도메인이 클로닝된 pUC19을 동일한 양으로 섞은 후, XmaI과 EcoRI으로 절단하였다. 상기 AgeI과 EcoRI으로 절단된 효과 도메인이 클로닝된 발현 플라스미드와 XmaI과 EcoRI으로 절단된 징크 핑거 도메인을 연결하여 효과 도메인과 하나의 징크 핑거 도메인으로 구성된 라이브러리를 제작하였다. 그 후 동일한 방법으로 효과 도메인과 하나의 징크 핑거 도메인이 클로닝된 발현 플라스미드를 상기와 동일한 방법으로 AgeI과 EcoRI으로 절단하고 XmaI과 EcoRI으로 절단된 징크 핑거 도메인과 연결하여 2 번째 징크 핑거 도메인을 연결시켰다. 이와 동일한 방법으로 최종적으로 3개의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로 구성된 전사 인자 라이브러리를 제작하였다.

하기는 진 뱅크(GenBank) 데이터베이스 검색결과 선별된 인간 유전체 서열로부터 선별된 26 종류의 징크 핑거 도메인 Z1 내지 Z26이다:

Z1: 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z2: 서열번호 15 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z3: 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z4: 서열번호 19의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z5: 서열번호 21의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z6: 서열번호 23의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z7: 서열번호 25의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z8: 서열번호 27의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z9: 서열번호 29의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z10: 서열번호 31의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z11: 서열번호 33의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z12: 서열번호 35의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z13: 서열번호 37의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z14: 서열번호 39의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z15: 서열번호 41의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z16: 서열번호 43의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z17: 서열번호 45의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z18: 서열번호 47의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z19: 서열번호 49의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z20: 서열번호 51의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z21: 서열번호 53의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z22: 서열번호 55의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z23: 서열번호 57의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z24: 서열번호 59의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z25: 서열번호 61의 핵산 서열에 의해 암호화되고;

Z26: 서열번호 63의 핵산 서열에 의해 암호화된다.

실험예 3. 새로운 전사 인자를 이용하여 다양한 형질전환 대장균의 유도

상기 실험예 2에서 제작된 전사 인자 라이브러리를 대장균에 도입하여 특정 조건 하에서 원하는 형질을 나타내는 대장균을 유도하고 선별하였다. 원하는 형질을 나타내는 대장균에서 전사 인자를 분리, 확인한 후, 이를 대장균에 재도입하여 동일한 형질이 유도되는지를 확인하여 전사 인자에 의한 특정 형질의 유도를 확인하였다.

3-1. 열 저항성을 갖는 형절전환 대장균의 유도

높은 온도에서 외부 단백질(heterologous protein)의 대량 발현은 그 용해도를 증가시킨다. 따라서 대장균에서 열스트레스 반응(heat shock response)에 대한 이해는 산업 균주 개발에 중요한 이슈가 될 수 있다. 본 발명에서는 전사 인자 라이브러리를 대장균에 도입한 후, CRP Del 180를 효과 도메인으로 이용하여 제작한 인공 전사 인자가 도입된 대장균을 55℃에서 2시간 동안 열충격을 가한 후, LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 배양한 후 자라난 콜로니에서 열에 저항성을 나타내는 대장균을 선별하였다.

선별된 대장균에서 전사 인자를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 전사 인자를 확인하고 이를 재도입하여 열에 대한 저항성이 유도되는지 확인함으로써 전사 인자의 활성을 확인하였다. 대장균의 성장곡선은 100㎖ LB 배지, 50℃에서 대장균의 성장 패턴을 관찰하면서 대략 1시간 30분 간격으로 대장균 샘플을 취해 스펙트 로포토미터(Sepctrophotometer) 600nm에서 광학 밀도(Optical Density, O.D)를 측정하여 구하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 8에서 보는 바와 같다. 도 8의 왼쪽 사진은 열충격을 가하지 않은 대장균의 대조군 사진이고, 오른쪽 사진은 55℃에서 2시간 동안 열충격을 가한 후의 대장균의 생존률을 나타낸 사진이며, C는 인공 전사인자가 암호화되지 않은 대조군(control) 플라스미드가 도입된 보통 대장균이고 T1, T2, T3는 각기 다른 인공 전사 인자에 의해 열에 저항성을 나타낸 대장균이다. 도 8에서 보는 바와 같이, 열충격이 가하지 않은 조건하에서는 모든 대장균이 콜로니를 형성하였으나, 55℃의 열충격이 가해진 조건하에서는 야생형(wild-type) 대장균의 경우는 성장이 저해되는 데 반해 본 발명의 CRP Del 180를 효과도메인으로 이용하여 제작된 전사 인자가 도입된 대장균의 경우 열충격이 있는 조건에서도 잘 성장함을 확인할 수 있었다. 도 8의 상단의 삼각형은 5배율로 희석시킨 세포농도를 나타낸다.

그 중에서는 T2의 전사인자가 도입된 대장균이 열충격에서 가장 잘 성장함을 확인하였고, 이의 50℃에서의 성장곡선을 도 9에서 나타내었다. 상기 열 저항성이 가장 좋은 T2의 전사 인자는 하기와 같다:

T1 = CRP 1~180a.a + Z23 + Z11 + Z19

T2 = CRP 1~180a.a + Z13 + Z2 + Z23

T3 = CRP 1~180a.a + Z9 + Z4 + Z11

3-2 성장 속도가 증가된 형질 전환 대장균의 유도

숙주 세포의 빠른 성장속도는 생산성을 증가시키기 때문에 산업적으로 아주 유용하다. 따라서, 본 발명에서는 효과 도메인으로는 CRP Del 180을 이용하고, 상기 실험예 2에서 제작된 전사 인자 라이브러리를 도입하여 최적의 성장 온도(optimal growth temperature)인 37℃에서 성장 속도가 증가된 대장균을 유도, 스크린하였다.

전사 인자 라이브러리를 대장균에 도입 후 100㎖의 LB 배지 및 M9 배지에서, 37℃에서 계대 배양(7일 동안 24시간 간격으로 새로운 100㎖의 배지에 1㎖ 씩 트랜스퍼시킴)한 후 스트리킹(streaking) 또는 희석시킨 후 도말하여 콜로니를 수득하였다. 각 콜로니를 100㎖의 LB 배지 및 M9 배지, 37℃에서 성장 패턴을 확인하여 최종적으로 성장속도가 향상된 대장균을 선별하였다. 이로 인하여 선별된 대장균에서 전사 인자를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 전사 인자를 확인하고 이를 재도입하여 성장속도가 향상되는지를 확인함으로써 전사 인자에 의한 성장속도의 향상을 확인하였다.

상기 실험 수행의 결과는 도 10 및 도 11에서 보는 바와 같으며, 도10은 37℃, LB배지에서, 도 11은 37℃, M9배지에서 성장속도를 확인한 결과이고, C는 인공 전사인자가 암호화되지 않은 대조군(control) 플라스미드가 도입된 보통 대장균이고 RG#32는 인공 전사 인자에 의해 성장속도가 향상된 대장균을 의미한다. 도 10에서 보는 바와 같이, 인공 전사 인자가 암호화되지 않은 대장균의 경우에는 배양 후 15시간 이후부터는 성장속도가 더 이상 증가하지 않았으며, 본 발명의 전사인자가 도입된 대장균의 경우에는 배양 후 50 시간까지 지속적으로 성장하였으며, 그로 인 하여 대장균의 생산성이 탁월하게 향상됨을 확인할 수 있었다.

RG#32 = CRP1-180a.a + Z26 + Z7

상기에서와 같이 본 발명의 인공 전사 인자의 DNA 결합 도메인인 징크 핑거 단백질은 진핵세포뿐만 아니라 원핵세포에서도 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 본 발명의 인공 전사 인자의 효과 도메인으로 이용한 CRP의 경우 시겔라(shigella)의 CRP와 동일한 염기서열을 가지고, 다양한 원핵세포에 그와 같은 패밀리 단백질들이 존재하므로, 대장균뿐만 아니라 다양한 원핵세포에서 유전자의 발현을 조절하여 다양한 형질을 유도할 수 있는 것으로 기대된다.

3-3. 저온(Cold shock)에 저항성을 갖는 형질전환 대장균의 유도

낮은 온도에서 표적 단백질의 과발현은 단백질의 용해도 및 안정성을 증가시키기 때문에, 낮은 온도에 저항성을 가지며 성장을 잘하는 대장균은 산업균주로써 큰 가치를 지닌다. 따라서, Cold shock에 저항성을 갖는 형질전환 대장균을 유도하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 본 실험에서는 효과 도메인으로는 CRP Del 180을 이용하고, 상기 실험예 2에서 제작된 전사 인자 라이브러리를 도입하여 낮은 온도에서도 성장이 가능한 대장균을 유도, 스크린하였다.

상기 실험예 2에서 수득한 인공 전사 인자 라이브러리를 대장균 XL1-Blue (Sambrook and Rusell, 2001)에 도입한 후, LB 플레이트에 도말하여 15℃에서 배양 한 후 성장한 콜로니에서 낮은 온도에 저항성을 나타내는 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균에서 전사 인자를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 전사 인자를 확인하고 이를 재도입하여 낮은 온도에 대한 저항성이 유도되는지 확인함으로써 전사 인자의 활성을 확인하였다.

대장균의 성장곡선은 100㎖ LB 배지, 15℃에서 대장균의 성장 패턴을 관찰하면서 대략 5시간 간격으로 대장균 샘플을 취해 스펙트로포토미터(Sepctrophotometer) 600nm에서 광학 밀도(Optical Density, O.D)를 측정하여 구하였다. 대조군으로서 100㎖ LB 배지에서 최적의 성장온도인 37℃에서 대장균의 성장패턴을 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 12에서 보는 바와 같으며, 도 12의 C는 인공 전사인자가 암호화되지 않은 대조군(control) 플라스미드가 도입된 보통 대장균이고 CT1 및 CT2는 각기 다른 인공 전사 인자에 의해 낮은 온도에 저항성을 나타낸 대장균이며, 도 12 상단의 삼각형은 5 배율로 희석시킨 세포농도를 나타낸다. 대조군의 경우에는 모든 대장균이 콜로니를 형성하였으나, 15℃의 낮은 온도 조건하에서는 야생형(wild-type) 대장균의 경우는 성장이 저해된 반면, 본 발명의 CRP Del 180를 효과도메인으로 이용하여 제작된 전사 인자가 도입된 대장균의 경우 낮은 온도에서도 잘 성장함을 확인할 수 있었다.

그 중에서 CT1과 CT2의 전사인자가 도입된 대장균이 낮은 온도에서 가장 잘 성장함을 확인하였고, CT1의 15℃에서의 성장곡선을 도 13에서 보는 바와 같다. 상기 낮은 온도에 저항성을 나타내는 CT1과 CT2의 전사 인자는 하기와 같았다:

CT1 = CRP 1~180a.a + Z19 + Z6 + Z22

CT2 = CRP 1~180a.a + Z15 + Z4 + Z2

3-4. 삼투압( 고염 농도)에 저항성을 갖는 형질전환 대장균의 유도

발효시에 과도한 열의 발생과 함께 삼투압의 증가는 미생물에서 표적 단백질의 발현시에 그 생산성을 저해시킨다. 따라서 삼투압에 저항성을 가지며 성장을 잘 하는 대장균은 산업균주로 아주 유용하다. 본 실험에서는 삼투압에 저항성을 가지는 대장균을 선별하기 위해 고염 농도의 0.6M Nacl이 첨가된 최소 A 배지(K₂HPO₄ 10.5g/ℓ, KH₂PO₄ 4.5g/ℓ,(NH₄)₂SO₄ 1g/ℓ, sodium citrate 2H₂O 0.5g/ℓ, 20% 글루코스 10㎖/ℓ, 1M MgSO₄ 7H₂O 1㎖/ℓ)를 이용하였다. 효과도메인으로서 CRP Del 180을 이용하고, 상기 실시예 2의 전사 인자 라이브러리를 대장균 XL1-Blue (Sambrook and Rusell, 2001)에 도입한 후, 플레이트에 도말하여 37℃에서 배양한 후 자라난 콜로니에서 삼투압에 저항성을 나타내는 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균에서 전사 인자를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 전사 인자를 확인하고 이를 재도입하여 삼투압에 대한 저항성이 유도되는지 확인함으로써 전사 인자의 활성을 확인하였다.

상기 실험 수행의 결과는 도 14에서 보는 바와 같다. 도 14의 왼쪽 사진은 삼투압이 주어지지 않은 최소 A 배지에서 성장을 확인한 대장균의 사진(대조군)이며, 오른쪽 사진은 상기의 삼투압이 주어진 최소 A 배지에서 대장균의 생존률을 나 타낸 사진이며, 사진의 C는 인공 전사인자가 암호화되지 않은 대조군(control) 플라스미드가 도입된 보통 대장균이고 OT1, OT2, OT3, OT4는 각기 다른 인공 전사 인자가 도입된 대장균으로서, 삼투압에 저항성을 나타낸 대장균이다. 또한, 도 14 상단의 삼각형은 5배율로 희석시킨 세포농도를 나타낸다.

도 14에서 보는 바와 같이, 최적 성장 조건하에서는 모든 대장균이 콜로니를 형성하였으나, 삼투압의 조건하에서는 야생형(wild-type) 대장균의 경우는 성장이 저해되는 데 반해 본 발명의 CRP Del 180를 효과 도메인으로 이용하여 제작된 전사 인자가 도입된 대장균의 경우 삼투압의 조건에서도 잘 성장함을 확인할 수 있었으며, 삼투압에 저항성을 나타내는 OT1, OT2, OT3, OT4의 인공 전사 인자는 하기와 같다:

OT1 = CRP 1~180a.a + Z24 + Z2 + Z2

OT2 = CRP 1~180a.a + Z8 + Z4 + Z19

OT3 = CRP 1~180a.a + Z5 + Z23 + Z17

OT4 = CRP 1~180a.a + Z9 + Z24 + Z23

상술한 바와 같이, 본 발명은 징크 핑거 도메인 및 원핵생물 유래의 이화물질 조절 단백질을 효과도메인으로 이용한 인공 전사 인자에 대한 것으로서, 본 발명의 징크 핑거 도메인은 진핵생물로부터 유래되었다 하더라도 원핵생물에서도 활성을 가지고, 또한 다양한 원핵생물의 이화물질 조절단백질을 효과도메인으로 이용함으로써 다양한 원핵생물의 활성을 조절할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 전 사인자가 도입되면 대장균 내부의 전사 인자의 작용과는 무관하게 유전자의 발현을 활성화시키거나 억제시킴으로써, 사용자가 원하는 형질을 나타내는 다양한 형질전환 대장균을 유도할 수 있으며, 이로 인하여 현재까지 밝혀지지 않은 유전자의 기능을 분석하거나 원하는 유용한 특성을 갖는 형질전환 대장균을 유도할 수 있고, 그 중에서 열 저항성, 저온 저항성, 고염 저항성 및 현저하게 성장 속도가 향상된 형질전환 대장균을 유도할 수 있어 산업에 아주 유용하게 이용할 수 있는 효과를 갖는다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (23)

1 내지 3개의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로서 원핵 생물의 전사 인자를 포함하여 인위적으로 유전자 발현을 활성화시키거나 억제시킬 수 있는 인공 전사 인자 폴리펩타이드로서,

상기 징크 핑거 도메인은 서열번호 13(Z1), 15(Z2), 17(Z3), 19(Z4), 21(Z5), 23(Z6), 25(Z7), 27(Z8), 29(Z9), 31(Z10), 33(Z11), 35(Z12), 37(Z13), 39(Z14), 41(Z15), 43(Z16), 45(Z17), 47(Z18), 49(Z19), 51(Z20), 53(Z21), 55(Z22), 57(Z23), 59(Z24), 61(Z25) 및 63(Z26)의 핵산 서열에 의해 코딩되는 징크 핑거 도메인으로 구성된 군에서 선택되고,

상기 원핵 생물의 전사 인자는 서열번호 1에 의해 코딩되는 야생형 CRP(catabolite regulatory protein)(CRP W, 잔기 1-209), 서열번호 3에 의해 코딩되는 CRP Del 137(잔기 137-90) 및 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180(잔기 1-180)으로 구성된 군에서 선택되는 것인 인공 전사 인자 폴리펩타이드.

삭제

삭제

삭제

삭제

제1항에 있어서, 상기 유전자 발현을 활성화시키기 위하여는 전사 개시 시점으로부터 -67 내지 -50 부위에 삽입되는 것인 인공 전사 인자 폴리펩타이드.

제1항에 있어서, 상기 유전자 발현을 억제시키기 위하여는 전사 개시 시점으로부터 +24 내지 +41 부위에 삽입되는 것인 인공 전사 인자 폴리펩타이드.

제1항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항의 인공 전사 인자가 도입되어 형질전환된 대장균.

제8항에 있어서, 상기 대장균은 열저항성, 성장속도향상, 저온에 대한 저항성 또는 고염에 대한 저항성을 갖는 것인 형질전환된 대장균.

Z13(서열번호 37), Z2(서열번호 15) 및 Z23(서열번호 57)의 징크 핑거 도메 인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 열 저항성을 갖는 인공 전사 인자 폴리펩타이드.

Z23(서열번호 57), Z11(서열번호 33) 및 Z19(서열번호 49)의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 열 저항성을 갖는 인공 전사 인자 폴리펩타이드.

Z9(서열번호 29), Z4(서열번호 19) 및 Z11(서열번호 33)의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 열 저항성을 갖는 인공 전사 인자 폴리펩타이드.

제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 인공 전사 인자가 도입되어 열 저항성을 갖는 형질전환 대장균.

Z26(서열번호 63) 및 Z7(서열번호 25)의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 성장속도를 향상시키는 인공 전사 인자 폴리펩타이드.

제14항의 인공 전사 인자가 도입되어 성장속도가 향상된 형질전환 대장균.

Z19(서열번호 49), Z6(서열번호 23) 및 Z22(서열번호 55)의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 저온에 대한 저항성을 갖도록 하는 인공 전사 인자 폴리펩타이드.

Z15(서열번호 41), Z4(서열번호 9) 및 Z2(서열번호 15)의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 저온에 대한 저항성을 갖도록 하는 인공전사인자 폴리펩타이드.

제16항 또는 제17항의 인공 전사 인자가 도입되어 저온 저항성을 갖게된 형질전환 대장균.

Z24(서열번호 59), Z2(서열번호 15) 및 Z2(서열번호 15)의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 고염에 대한 저항성을 갖도록 하는 인공전사인자 폴리펩타이드.

Z8(서열번호 27), Z4(서열번호 19) 및 Z19(서열번호 49)의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 고염에 대한 저항성을 갖도록 하는 인공전사인자 폴리펩타이드.

Z5(서열번호 21), Z23(서열번호 57) 및 Z17(서열번호 45)의 징크 핑거 도메 인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 고염에 대한 저항성을 갖도록 하는 인공전사인자 폴리펩타이드.

Z9(서열번호 29), Z24(서열번호 59) 및 Z23(서열번호 57)의 징크 핑거 도메인과 효과 도메인으로써 서열번호 5에 의해 코딩되는 CRP Del 180을 포함하는 고염에 대한 저항성을 갖도록 하는 인공전사인자 폴리펩타이드.

제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 인공 전사 인자가 도입되어 고염 저항성을 갖게된 형질전환 대장균.

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