RU2003677C1 - Штамм бактерий ESCHERICHIA COLI - продуцент L-гистидина - Google Patents

Description

ретроингибировани  первого этапа биосинтеза гистидином.

Усваивает азот в форме аммони , нитратов , а также азот некоторых органических соединений.

Растет при температуре 43°С и ниже. Оптимальной дл  роста  вл етс  температура 37°С. а дл  продукции гистидина 29-30°С.

Растет нэ жидких средах с рН от 6,0 до 8,0, Оптимальное значение рН 7,0.

Хранение штамма. Посевной материал смешивают с равным объемом 80%-ного глицерина и хран т при -70°С.

П р и м е р 1. Введение мутации hfsT.

В штамм E.coli(hisG) с нечувствительной к гистидину АТФ-фосфорибозилтранс- феразой трансдукцией ввод т мутантный ген.ЫзТ. Ген hisT кодирует псевдоуридилат- синтазу 1 - фермент, который превращает уридиновые остатки в антикодоновой области тРНК в псевдоуридиновые. Использованна  мутаци  в гене hisT приводит к накоплению тРНК с пониженным содержанием псевдоуридиновых остатков. Наличие в клетках Е. coll измененной тРНК his вызывает усиление транскрипции гистидинового оперона. Активаци  транскрипции происходит , по-видимому, из-за замедлени  трансл ции лидерного пептида аттенюаторной области his-оперона.

Трзнсдукцию провод т с помощью фага Р1 так, как рекомендовано в руководстве Миллера. У трансдуктантов определ ют уровень накоплени  гистидина в культу- ральной жидкости через 72 ч культивировани . Культивирование провод т так, как описано ниже в примере 3. Среда дл  культивировани  содержит компоненты, перечисленные в примере 3, за исключением стрептомицина, который в данном случае в среду не добавл етс . Данные по накоплению гистидина в культуральной жидкости исходным штаммом и штаммом с glsT-мута- цией приведены в табл.1.

П р и м е р 2. Эффект введени  мутации по гену rpsL который придает клеткам устойчивость к стрептомицину (strR),

В штамм E.coli gfsGr hisT трансдукцией ввод т мутантный ген rpsL. Трансдуктанты станов тс  устойчивыми к 1-2 мг/мл стрептомицина . Эффект этой мутации на продукцию гистидина провер ют, культивиру  Трансдуктанты так, как описано ниже в примере 3. Данные по накоплению гистидина в культуральной жидкости приведены в табл.2.

П р и м е р 3. Отбор устойчивых к арсе- нату натри  мутантов. Накопление гистидина в культуральной жидкости му антного штамма-продуцента.

Биосинтез гистидина - энергоемкий процесс, требующий участи  АТФ и фосфо- 5 рибозилпирофосфата. Дл  стимул ции образовани  макроэргических метаболитов, подобных АТФ, используют арсенат натри  - токсический аналог неорганического фосфата . Клетки, устойчивые к ( , обрэзу- 0 ют большее количество макроэрготических метаболитов, чем обычные.

Отбирают спонтанные мутации, обеспечивающие устойчивость к 4 мМ арсената Na. Затем среди отобранных спонтанных му- 5 тантов вы вл юттакие, которые при культивировании накапливают в культуральной жидкости гистидина больше, чем родительский штамм.

Культивирование провод т следующим 0 образом.

Посевную среду инокулируют бактери ми , выращенными на минимальной агаризо- ванной среде при 29°С в течение 48ч. Посевной материал получают выращивани- 5 ем в пробирках объемом 50 мл, содержащих 2 мл среды, помещенных на термостатируе- мую круговую качалку (200-240 об/ мин), при 29°С в течение 20 ч. Состав посевной среды, г/л:

0Глюкоза56

Аммоний

сернокислый28

Калий фосфорнокислый одно5 замещенный2,25

Магний сернокислый , 7-водный1.125, Железо (II) сернокислое , 7-водное 0,01, 0 Марганец (() сернокислый,

4-водный0,01,

Тиамин0,001,

Аатолизэт дрожжей 2,8, 5Пролил0,5

Стрептомицин1,0

Вода дистиллированна , лДо 1, рН7,0 0 Затем в колбу объемом 250 мл, содержащую 10 мл ферментационной среды, в лос т 5% посевного материала и инкубирую1 нэ круговой качалке (300 об /мин) при 30°С. Ферментационна  среда отличаетс  от по- 5 севной среды только добавлением 22 г мела на 1 л посевной среды, По окончании ферментации клетки отдел ют центрифугарова- нием, а гистидин определ ют колориметрически в культуральной жидкости после хроматографии на пластинках Силуфол . Через 72 ч ферментации культураль- на  жидкость содержит 11,6-11,8 г/л гисти- дина. Данные по накоплению гистидина родительским и арсенат-устойчивым штаммом в культуральной жидкости приведены в табл.3.

(56) 1. Патент США Мг 3713977, кл. 195-29. 1973.

2. Патент США № 4388405, кл. С 12 N 1/20, 1983.

3.Аствацатур нц Г.В.. Лисенков А.Ф., Смирнов Ю.В., Шакулов Р.С. Генетика, т. XXIV.1988, с. 1928-1934.

4.Лисенков В.Ф.. Аствацатур нц Г.В., Смирнов Ю.В., Ежель С.А.. Шакулов Р.С.

Молекул рна  генетика, микробиологи  и вирусологи , 1988, с. 37-43.

5.Миллер Дж. Эксперименты в молекул рной генетике. М.: Мир, 1976.

Ф ормула изобретени  Штамм бактерий Escherlchla coti ВКПМ

Т а б л и ца 1

Таблица2

ТаблицаЗ

В-5945 - продуцент L-гистидина.