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JP6694037B2 - 膵内分泌細胞へのヒト胚性幹細胞の分化 - Google Patents

膵内分泌細胞へのヒト胚性幹細胞の分化 Download PDF

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JP6694037B2
JP6694037B2 JP2018205547A JP2018205547A JP6694037B2 JP 6694037 B2 JP6694037 B2 JP 6694037B2 JP 2018205547 A JP2018205547 A JP 2018205547A JP 2018205547 A JP2018205547 A JP 2018205547A JP 6694037 B2 JP6694037 B2 JP 6694037B2
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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年６月８日に出願された、米国特許仮出願第６１／６５７，１６０
号の利益を主張するものであり、その全体が、あらゆる目的について参照により本明細書
に組み込まれる。
（発明の分野）
本発明は、細胞分化の分野にある。より具体的には、本発明は、内分泌細胞への多能性
幹細胞の分化の調節因子として、エフリンリガンド及びスフィンゴシン−１−リン酸塩の
使用を開示する。
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着
に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つ
の手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成する
ことがある。
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として既知のプロセスにて、３つ
の胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺
、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。こ
のプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ３
β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４、及びＳＯＸ１７などの多数のマーカーを発現
する。
原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマ
ークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割さ
れる。例えば、Ｈｈｅｘ及びＳｏｘ２は内胚葉の前領域を特定し、Ｃｄｘ１、２及び４は
後半分を特定する。
内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる
。これは、例えば、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ−Ｂ、レチノイン酸（ＲＡ）、及びＢＭＰリ
ガンド、並びにそれらのアンタゴニストのような多数の分泌された因子によって達成され
る。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣｄｘ２の発現を促進し、前
方の遺伝子Ｈｈｅｘ及びＳＯＸ２の発現を阻害する（２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
，１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前
腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている
（２００７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉に
よって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する（２００２ Ｃｕｒｒ
Ｂｉｏｌ，１２：１２１５〜１２２０）。
特異的転写因子の発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる
可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パ
ターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、
腸管で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ−１の非常に高い発現及びＣＤＸ２並びにＳ
ＯＸ２の非常に低い発現を示す。同様に、Ｆｏｘｅ１の高レベルの存在は、食道組織の指
標である。肺組織において高度に発現されるのはＮＫＸ２．１である。ＳＯＸ２／Ｏｄｄ
１（ＯＳＲ１）は胃組織において高度に発現される。ＰＲＯＸ１／Ｈｈｅｘ／ＡＦＰの発
現は肝組織において高い。ＳＯＸ１７は胆管構造の組織で高度に発現される。ＰＤＸ１、
ＮＫＸ６．１／ＰＴｆ１ａ、及びＮＫＸ２．２は膵臓組織において高度に発現される。Ｃ
ＤＸ２の発現は、腸組織において高い。上記要約は、Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２００９，２３８
：２９〜４２及びＡｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２００９，２５：２
２１〜２５１からの引用である。
膵臓の形成は、膵臓内胚葉への胚体内胚葉の分化から生じる（２００９ Ａｎｎｕ Ｒ
ｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２５：２２１〜２５１；２００９ Ｄｅｖ Ｄｙｎ
，２３８：２９〜４２）。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前
腸は、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓、膵臓、及び胆管系を生じさせる。
膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ
１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって
、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、
他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、
膵臓内胚葉の分化によって生じる。
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹（ＥＳ）
細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の生産を記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号）。マ
ウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した
細胞への分化をもたらした（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の
胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分
化することができる（米国特許公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。免疫不全マウ
スの脂肪パッドにおけるこれらの膵臓前駆細胞のその後の移植は、３〜４ヶ月の成熟期の
後に、機能的膵内分泌細胞の形成をもたらした（米国特許第７，９９３，９２０号及び米
国特許第７，５３４，６０８号）。
Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステムを報告している
（米国特許第７，０３３，８３１号）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。
ヒト胚性幹細胞は、最初に、酪酸ナトリウムとアクチビンＡとの組み合わせを用いて内胚
葉に分化された（米国特許第７，３２６，５７２号）。次に細胞をノギンなどのＢＭＰア
ンタゴニストと共に、ＥＧＦ又はベータセルリンと組み合わせて培養して、ＰＤＸ１陽性
細胞を生成した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
小分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧ
Ｆ−Ｂ受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１，１
３８：８６１〜８７１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１１，６０：２３９〜２４７）は、有意
に膵内分泌細胞の数を増すために使用されている。加えて、小分子活性化剤もまた、胚体
内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９，２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ
ｌ ２００９，５：２５８〜２６５）。
ヒト多能性幹細胞から膵臓細胞を産生するためのプロトコルの改善において、優れた研
究が行われてきたが、機能性内分泌細胞及び特定のベータ細胞をもたらすプロトコルを作
成する必要が依然として存在する。本出願では、エフリンリガンド及びスフィンゴシン−
１−リン酸塩のクラス又はスフィンゴシン受容体のアゴニストが内分泌細胞の生成を強化
し、内分泌ホルモン及び内分泌腺前駆細胞のクラスタリングを加速することを実証する。
一実施形態において、本発明は、エフリンＡ４又はエフリンＡ３を含む培地において膵
内胚葉細胞集団を培養することによって、インスリン及びＮＫＸ６．１の発現を増強する
方法に関する。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞集団は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ
２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞集団は、多能性細
胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト
胚性多能性細胞である。
一実施形態において、本発明は、アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む培地において膵
内胚葉細胞を培養することによって、インスリン、グルカゴン、及びグレリンの発現を抑
制する一方、ソマトスタチンの発現を増強する方法に関する。いくつかの実施形態におい
て、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した膵内胚葉細胞集団は、アクチビンＡ又はア
クチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団としてより多くのソマトスタチンを発現す
る。いくつかの実施形態において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した膵内胚葉細
胞集団におけるインスリンの発現は、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵
臓内胚葉細胞集団におけるインスリンの発現と比較して抑制される。いくつかの実施形態
において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した膵臓内胚葉細胞集団におけるグルカ
ゴンの発現は、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけ
るグルカゴンの発現と比較して抑制される。いくつかの実施形態において、アクチビンＡ
又はアクチビンＣで処理した膵内胚葉細胞集団におけるグレリンの発現は、アクチビンＡ
又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるグレリンの発現と比較して
抑制される。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実
質的に発現しない。いくつかの実施形態において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理
した膵内胚葉細胞は、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態
において、膵臓内胚葉細胞の由来元である多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
一実施形態において、本発明は、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地において膵
内胚葉細胞を処理することによって、ＮＫＸ６．１の発現を増強する方法を参照する。い
くつかの実施形態において、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した膵内胚
葉細胞集団は、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理していない膵内胚葉細胞
と比較して、強化された量のＮＫＸ６．１を発現する。いくつかの実施形態において、セ
マフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した膵内胚葉細胞におけるインスリン、グ
ルカゴン、及びグレリン等のホルモンの発現レベルは、セマフォリン３ａ又はエピゲンを
含む培地で処理していない膵内胚葉細胞と比較して、影響を受けない。いくつかの実施形
態において、膵内分泌細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの
実施形態において、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した膵内胚葉細胞は
、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、膵内胚葉
細胞の由来元である多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
いくつかの実施形態において、本発明は、エフリンＡ４、エフリンＡ３、アクチビンＡ
、アクチビンＣ、セマフォリン３ａ、又はエピゲンを含む培地において膵内胚葉細胞を培
養することを含む、多能性細胞を分化する段階的な方法に関する。いくつかの実施形態に
おいて、膵内胚葉細胞は、エフリンＡ４又はエフリンＡ３を含む培地において培養される
。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む
培地において培養される。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、セマフォリン
３ａ、又はエピゲンを含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、膵内
胚葉細胞の由来元である多能性幹細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。
一実施形態において、本発明は、スフィンゴシン−１受容体アゴニストで膵内分泌細胞
を処理することによって、内分泌腺の発現を誘発する方法に関する。いくつかの実施形態
において、膵内分泌細胞を処理するために使用されるスフィンゴシン−１受容体アゴニス
トは、スフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）である。
本発明の実施形態として、本発明の方法によって調製される方法、及び本発明の細胞を
使用する方法も意図される。
実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、インスリンの遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。 実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、ソマトスタチンの遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。 実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、グレリンの遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。 実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、グルカゴンの遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。 実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、ＰＤＸ−１の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。 実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、ＮＫＸ６．１の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。 実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、ＮＧＮ３の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。 インスリンに対して免疫染色した細胞の画像を示す。図２Ａは対照、図２Ｂは５０ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ３で処理した細胞、図２Ｃは、実施例２に記載のように、１００ｎｇ／ｍＬのエフリン−Ａ３で処理した細胞を示す。 インスリンに対して免疫染色した細胞の画像を示す。図３Ａは対照、図３Ｂは５０ｎｇ／ｍＬのエフリン−Ａ４で処理した細胞、図３Ｃは、実施例２に記載のように、１００ｎｇ／ｍＬのエフリン−Ａ４で処理した細胞を示す。 スフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）で処理した細胞のＳ６培養物を、１日目（図４Ａ）、７日目（図４Ｂ）、及び１０日目に２つの異なる拡大率（図４Ｃ及び図４Ｄ）で撮像した位相差画像を表す。これらの画像は、７日目に、内分泌細胞のクラスタリングの明確な証拠が存在したこと、１０日目に、クラスターが膵内胚葉上皮の薄層によって相互に分離したことを示す。 Ｓ１Ｐで処理し、Ｈｂ９（図５Ａ）及びＮＫＸ６．１（図５Ｂ）に対して免疫染色した細胞、又はインスリン（図５Ｃ）及びＨｂ９（図５Ｄ）に対して免疫染色した細胞の画像を示す。 図６Ａ及び図６Ｂは、１０μＭのＳ１Ｐで処理し、ステージ６の開始後３日間培養した細胞の、異なる拡大率の位相差画像を表す。図６Ｃ及び図６Ｄは、ＮＫＸ２．２に対して免疫染色した細胞の画像を表す。図６Ｃは対照細胞、図６ＤはＳ１Ｐで処理した細胞を示す。
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形
態」を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明又は例示する下記の小項目に分
割する。
定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化
細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む
子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚
葉）から様々な細胞系統の機能性細胞へとインビトロで分化する能力を特徴とする。幹細
胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではない
としても）ほとんどの組織に寄与する。
幹細胞は、発生能によって、（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能
性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系の小集合を生じるが
、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性（例
えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された寡能性前駆
細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む後
代を産生できる）、（４）複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を
生じる能力を意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系（例えば、精子形成幹細胞）を
生じる能力を意味する単能性に分類される。
分化は、特殊化されていない（「コミットされていない」）又は比較的専門化されてい
ない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロ
セスである。「分化した細胞」又は「分化誘導された細胞」とは、細胞の系統内でより特
殊化した（「コミットした」）位置にある細胞である。分化プロセスに適用された際の用
語「コミットした」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け
、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすること
ができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞
系統内で比較的特殊化されて（又はコミットして）いない状況に戻るプロセスを指す。本
明細書で使用するとき、細胞系統は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来た
か、またどの細胞を生じ得るかを規定する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の
遺伝体系内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系
統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、コミットされていない細胞の、対象と
する系統への分化を評価するために使用することができる。
本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核
酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現とは、未分化細胞と比
較して、陽性マーカーのレベルの増加、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マ
ーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞
において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のい
ずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
本明細書で使用するとき、細胞は、特異的マーカーが細胞内で検出されたとき、特異的
マーカー「について陽性」又は「陽性」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞
内で検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」又は「陰性」である。
本明細書で使用するとき、「細胞密度」及び「播種密度」は、本明細書において互換的
に使用され、固体又は半固体平面又は湾曲基質の単位面積あたりに播種された細胞の数を
指す。
本明細書で使用するとき、「ステージ１」及び「Ｓ１」は、胚体内胚葉（ＤＥ）に特徴
的なマーカーを発現する細胞を同定するために互換的に使用される。
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸
管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を有する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下の
マーカーの少なくとも１つを発現する：ＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ
４、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１。
本明細書で使用するとき、「腸管」は、以下のマーカーのうちの少なくとも一つを発現
する胚体内胚葉に由来する細胞を指す：ＨＮＦ３β、ＨＮＦ１β、又はＨＮＦ４α。腸管
細胞は、肺、肝臓、膵臓、胃、腸などの全ての内胚葉臓器を生じさせ得る。
本明細書で使用するとき、原腸管に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定する「ステ
ージ２」及び「Ｓ２」は互換的に使用される。
「前腸内胚葉」とは、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、十二指腸の一部を生じさせる
内胚葉細胞を指す。
「後方前腸」は、後方胃、膵臓、肝臓、及び十二指腸の一部を生じさせることができる
内胚葉細胞を指す。
「中腸内胚葉」は、腸、十二指腸の一部、虫垂、及び上行結腸を生じさせることができ
る内胚葉細胞を指す。
「後腸内胚葉」は、横行結腸の遠位３分の１、下行結腸、Ｓ状結腸、及び直腸を生じさ
せることができる内胚葉細胞を指す。
「ステージ３」及び「Ｓ３」の双方は、前腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞
を特定するために互換的に使用される。「前腸系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」
は、本明細書で使用するとき、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：
ＰＤＸ−１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びＨＮＦ４α。
「ステージ４」及び「Ｓ４」は、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞
を特定するために互換的に使用される。本明細書で使用するとき、「膵臓前腸前駆細胞系
統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する
細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ２、ＰＴＦ１ａ、Ｐｒｏｘ
１、及びＨＮＦ４α。
本明細書で使用するとき、「ステージ５」及び「Ｓ５」は、膵臓内胚葉及び膵内分泌前
駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定するために互換的に使用される。本明細
書で使用するとき、「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマ
ーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、
ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１。膵臓内胚葉系
統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。
「膵内分泌細胞」、又は「膵臓ホルモン発現細胞」、又は「膵臓内分泌系統に特徴的な
マーカーを発現する細胞」、又は「ステージ６細胞」、又は「Ｓ６細胞」は、本明細書に
おいて互換的に使用され、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することが可能な細胞
を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチド。
「膵臓インスリン陽性細胞」は、インスリン、ＨＢ９、ＮＫＸ２．２、及びＮＫＸ６．
１を発現する細胞の内分泌腺集団を指す。
「膵内分泌前駆細胞（precursor cell）」又は「膵内分泌前駆細胞（progenitor cell
）」は、細胞を発現する膵臓ホルモンになり得る膵臓内胚葉細胞を指す。そのような細胞
は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現し得る：ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、Ｎｅｕｒ
ｏＤ、ＩＳＬ−１、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、又はＡＲＸ。
本明細書では、「ｄ１」、「ｄ１」、及び「１日目」、「ｄ２」、「ｄ２」、及び「２
日目」、「ｄ３」、「ｄ３」及び「３日目」等は互換的に使用される。これらの数字の組
み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおけるインキュベーショ
ンの特定の日を指す。
「グルコース」及び「Ｄ−グルコース」は、本明細書で互換的に使用され、天然に一般
に見出される糖、デキストロースを指す。
膵内分泌前駆細胞において発現されるタンパク質及びそれをコードする遺伝子を特定す
る「ＮｅｕｒｏＤ」及び「ＮｅｕｒｏＤ１」は、本明細書で互換的に使用される。
「ＬＤＮ」及び「ＬＤＮ−１９３１８９」は本明細書で互換的に使用され、米国カリフ
ォルニア州のＳｔｅｍｇｅｎｔから入手可能なＢＭＰ受容体阻害剤を示す。
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞は、段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及
びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を使用して検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発
現することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５
〜１１４７）。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０
、及びＴｒａ−１−８１の発現の消失をもたらす。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカ
リホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者（米国カリフォルニア州のＶｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により説明されているように、細胞を４％パラホルムアル
デヒドで固定した後、基質としてＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを使用して現像することにより検
出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるよう
に、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉のすべて、すなわち、内
胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば
、細胞をＳＣＩＤマウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇
形腫を固定した後、それらを３つの胚葉からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査する
ことにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を
３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる
。
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表
されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」
を有することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がす
べて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性細胞は、種々のフィーダ
ー層を用いて培養中に、又はマトリックスタンパク質コート容器を用いることによって、
簡単に増殖しうる。あるいは、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（カナダ国バンクーバーの
ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような明確な培地との組み合わせで、
化学的に明確な表面を、細胞の常用増殖のために使用してよい。多能性細胞は、酵素的、
機械的、又はＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）のような種々のカルシウムキレー
ターの利用を用いて、培養プレートから簡単に取り除くことができる。あるいは、多能性
細胞を、任意のマトリックスタンパク質又はフィーダー層がない状態で、懸濁液中で増殖
させてよい。
多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではな
いが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）
、胚性組織、又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立
株が含まれる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）又はヒト胚生殖細胞の樹
立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（米国ウィスコンシン州Ｍ
ａｄｉｓｏｎのＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）などである。フ
ィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である
。また、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２等の多数の多能性
に関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体細胞から誘導することができる誘導性多
能性細胞（ＩＰＳ）又は再プログラム化された多能性細胞も好適である（Ａｎｎｕ Ｒｅ
ｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２０１１，１２：１６５〜１８５）。本発
明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記述されたように調
製してもよい（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：
１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８，３８：１３３〜
１６５；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４
４〜７８４８）。
多能性幹細胞からの、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同
定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ＡＢＣ
Ｇ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣ
Ｔ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳ
ＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、Ｔｒａ １−８１の１つ以上の発現が挙げられる。
本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（Ｎ
ＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性
幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌ
ａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すな
わち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮ
ＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２
、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、及びＴｒａ １−８１のうちのすく
なくとも１つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、
ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧ
Ｆ４、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６
、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内
胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞は本発明での使用
に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細
胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現
している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカー
を発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１
α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、及びＰＲＯＸ１からなる群から選択され
る。膵臓内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞が
本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマー
カーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞であり、ＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１の発現はＣ
ＤＸ２及びＳＯＸ２の発現より実質的に高い。
膵内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、
ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、及びＰＡＸ６からなる群から選択され
る。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマ
トスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。本
発明で使用するに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現
する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現してい
る細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。
あるいは、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
本発明の膵内分泌細胞は、細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。細胞系
統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１、並びに以下の転写因子、すなわち、
ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ
４、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様において、細胞系
統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、細胞である。
一実施形態において、本発明は、エフリンＡ４又はエフリンＡ３を含む培地においてス
テージ５の集団を培養することによって、インスリン及びＮＫＸ６．１の発現を増強する
方法に関する。いくつかの実施形態において、インスリン及びＮＫＸ６．１の発現は、こ
の細胞集団において、未処理細胞集団におけるインスリン及びＮＫＸ６．１の発現の少な
くとも２倍に増強される。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞集団は、ＣＤＸ
２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞集
団は、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能
性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
一実施形態において、本発明は、アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む培地においてス
テージ５細胞を培養することによって、インスリン、グルカゴン、及びグレリンの発現を
抑制する一方、ソマトスタチンの発現を増強する方法に関する。いくつかの実施形態にお
いて、処理した細胞集団は、未処理培養の少なくとも２倍のソマトスタチンを発現する。
いくつかの実施形態において、インスリンの発現は、未処理培養におけるインスリンの発
現の約半分に抑制される。いくつかの実施形態において、グルカゴンの発現は、未処理培
養におけるグルカゴンの発現の約１０分の１に抑制される。いくつかの実施形態において
、グレリンの発現は、未処理培養におけるグレリンの発現の約３分の１に抑制される。い
くつかの実施形態において、ステージ５細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現し
ない。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、多能性細胞の段階的分化によっ
て取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である
。
一実施形態において、本発明は、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地においてス
テージ５細胞を処理することによって、ＮＫＸ６．１の発現を増強する方法を参照する。
いくつかの実施形態において、処理した細胞集団は、処理していない培養の少なくとも２
倍のＮＫＸ６．１を発現する。いくつかの実施形態において、処理した培養におけるホル
モンの発現レベルは、未処置培養と比較して影響を受けない。いくつかの実施形態におい
て、ステージ５細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの実施形
態において、ステージ５細胞は、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつか
の実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
いくつかの実施形態において、本発明は、エフリンＡ４、エフリンＡ３、アクチビンＡ
、アクチビンＣ、セマフォリン３ａ、又はエピゲンを含む培地においてステージ５細胞を
培養することを含む、多能性細胞を分化する段階的な方法に関する。いくつかの実施形態
において、ステージ５細胞は、エフリンＡ４又はエフリンＡ３を含む培地において培養さ
れる。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、アクチビンＡ又はアクチビンＣ
を含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、セマ
フォリン３ａ、又はエピゲンを含む培地において培養される。いくつかの実施形態におい
て、多能性細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。
一実施形態において、本発明は、エフリンリガンドを用いて膵内胚葉細胞を培養するこ
とを含む、インスリン発現を誘導する方法に関する。いくつかの実施形態において、エフ
リンリガンドは、エフリンＡ３及びエフリンＡ４から選択される。いくつかの実施形態に
おいて、エフリンリガンドを用いて膵内胚葉細胞を培養することによって、インスリン及
びＮＫＸ６．１の発現を増強する。いくつかの実施形態において、エフリンリガンドを用
いて膵内胚葉細胞を培養することは、膵内胚葉細胞におけるインスリン及びＮＫＸ６．１
の発現を、未処理の膵内胚葉細胞におけるインスリン及びＮＫＸ６．１の発現の少なくと
も２倍に増強する。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ
２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、多能性幹細胞
の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、本発明の方法において
使用される多能性幹細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。
一実施形態において、本発明は、本発明の方法によって調製される、インスリン及びＮ
Ｋ６．１を発現する細胞に関する。
一実施形態において、本発明は、スフィンゴシン−１受容体アゴニストを用いて膵内胚
葉細胞を培養することを含む、内分泌腺クラスター形成を誘発するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、多能性幹細胞の段階的分化によって取得
される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込む
ものとする。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例に
より限定されるものではない。
（実施例１）
インスリン発現の強力な誘発因子としてのエフリンＡ４の確認
本実施例は、ヒトＥＳ細胞の分化から膵内胚葉／内分泌培養の産出に関する多様なタン
パクの役割を理解するために実施された。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ｈＥＳＣ Ｈ１、継代４０）の細胞は、１０μＭのＹ２７６３
２（ロック阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ
Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（カナダ国バンクーバーのＳ
ｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１
：３０希釈；米国ニュージャージー州のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で被覆された皿
上に、１×１０5細胞／ｃｍ2で、単一細胞として播種した。播種の４８時間後に、培養物
を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。培
養物は、以下のように膵内胚葉／内分泌系に分化した：
ａ）ステージ１（胚体内胚葉（ＤＥ）−３日）：細胞は、ステージ１培地（０．１％の
無脂肪酸ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，米国アイオワ州アンケニーのＰｒｏｌｉａｎ
ｔ）、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７、米国ミズー
リ州セントルイスのＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭのＤ−グルコース
（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８
（米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭのＭＣＸ化合物（
ＧＳＫ３Ｂ阻害剤、１４−Ｐｒｏｐ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２
３，２７−へプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］へ
プタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナ
エン−１６−オン、米国特許出願公開第２０１０−００１５７１１号；参照によりその全
体を本明細書に組み入れる）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地（カタログ番号１０３７２
−０１９、米国カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において１日
間培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭
酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、１００
ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８、及び０．１μＭのＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地
でもう１日培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍ
Ｌの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース
、及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地でもう１日培養し、
次いで、
ｂ）ステージ２（前駆腸管−２日）：細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１
２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グ
ルコース、０．２５ｍＭのアスコルビン酸（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）
、及び２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理し、次いで、
ｃ）ステージ３（前腸−２日）：細胞は、１日目は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）
、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳ
ＡＮＴ−１（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビン
−Ａ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＭレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ）、２５
ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、２００ｎＭのＴＰＢ（ＰＫＣ賦
活体；カタログ番号５６５７４０；米国ニュージャージー州ギブスタウンのＥＭＤ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）、１０μＭのフォルスコリン（ＦＳＫ、Ｓｉｇｍａ）、及び１００ｎＭ
のＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤；カタログ番号０４−００１９；米国カリフォルニア州サ
ンディエゴのＳｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で処理した。２日目、
細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａ
ｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２
５μＭのＳＡＮＴ−１、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、１μＭのＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬ
のＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、２００ｎＭのＴＰＢ、１０μＭのフォルス
コリン、及び１０ｎＭのＬＤＮを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で処理し、次いで、
ｄ）ステージ４（膵臓前腸前駆細胞−２日）：細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、
４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重
炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ
、５０μＭのＬＤＮ−１９３１８９、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコ
ルビン酸、及び１００ｎＭのＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で２日間処理し、次
いで、
ｅ）ステージ５（膵内胚葉／内分泌−３日）：ステージ４細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２
００希釈、２０ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／
ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎ
ＭのＲＡ、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコルビン酸を補充し、２〜３
日目のみ、１００ｎＭのＡＬｋ５阻害剤ＳＤ−２０８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌｏｇｙ ２００７，７２：１５２〜１６１に開示される）を添加したＭＣＤＢ−
１３１培地で３日間処理した。
ステージ５の１日目に、以下の表Ｉに列挙された因子が培地内に混合され、Ｓ５（ステ
ージ５の３日目）が完了した後、関連の膵内胚葉／内分泌遺伝子のＰＣＲ分析のためにｍ
ＲＮＡが収集された。対照として、培養物は、上記に列挙したＳ５培地のみで処理された
。トータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州バレンシ
アのＱｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、製造元の指示に従ってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ
ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（米国カリフォルニ
ア州フォスターシティのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して逆転写した
。ｃＤＮＡは、カスタムのＴａｑｍａｎ Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）に予め充填されたＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
及びＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを使用して増幅した
。データは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析し、ΔΔＣｔメソッドを使用して、未分化ヒ
ト胚性幹（ｈＥＳ）細胞に正規化した。全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓから購入された。
Figure 0006694037
Figure 0006694037
図１Ａ〜図１Ｇは、実施例１に記載のように、表Ｉに列挙されたインスリン（図１Ａ）
、ソマトスタチン（図１Ｂ）、グレリン（図１Ｃ）、グルカゴン（図１Ｄ）、ＰＤＸ−１
（図１Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図１Ｆ）、及びＮＧＮ３（図１Ｇ）の因子の存在下において
、ステージ５に分化されたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアル
タイムＰＣＲ分析からのデータを表す。
図１に示されるように、エフリン−Ａ４は、対照培養（図１Ｆ）に比較すると、ＮＫＸ
６．１及びインスリンのｍＲＮＡ発現を増強する一方、ＰＤＸ−１（図１Ｅ）及びＮＧＮ
３発現（図１Ｇ）に関して最小限の影響を示す。アクチビン−Ａ及びアクチビン−Ｃ等の
因子は、ソマトスタチン（図１Ｂ）の発現を有意に増強する一方、インスリン（図１Ａ）
、グルカゴン（図１Ｄ）、及びグレリン（図１Ｃ）の発現を抑制した。更に、セマフォリ
ン３ａ及びエピゲン等の因子は、ＮＫＸ６．１の発現を増強する一方、未処理培養に比較
すると、ホルモンの発現に影響を与えなかった。図１において、対照培養の異なるマーカ
ーの発現の平均レベルは、グラフ上で破線によって示される。
（実施例２）
Ｓ５でのインスリン発現に関するエフリンの影響の検証
この実施例は、実施例１において特定された該当点の検定を説明する。具体的には、プ
ロトコルのＳ５でのエフリン−Ａ３又はエフリン−Ａ４の添加の影響を以下に列挙する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ｈＥＳＣ Ｈ１、継代４０）の細胞は、１０μＭのＹ２７６３
２が補充されたｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１
：３０希釈；米国ニュージャージー州のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で被覆された皿
上に、１×１０5細胞／ｃｍ2で、単一細胞として播種した。播種の４８時間後に、培養物
を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。培
養物は、以下のように膵内胚葉／内分泌系統に分化した：
ａ）ステージ１（胚体内胚葉（ＤＥ）−３日）：細胞は、ステージ１の培地（上記の実
施例１を参照）で１日間培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．０
０１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ
−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８、及び０．１μＭのＭＣＸ化合物を補充した
ＭＣＤＢ−１３１倍地でもう１日培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ
、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５
ｍＭのＤ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１倍
地でもう１日培養し、次いで、
ｂ）ステージ２（前駆腸管−２日）：細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１
２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グ
ルコース、０．２５ｍＭのアスコルビン酸（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、及び２５ｎ
ｇ／ｍＬのＦＧＦ７（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＭＣＤ
Ｂ−１３１培地で２日間処理し、次いで、
ｃ）ステージ３（前腸−２日）：細胞は、１日目、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ（米国
カリフォルニア州のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ Ｇｌｕｔ
ａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、
０．２５μＭのＳＡＮＴ−１（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチ
ビン−Ａ（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＭのレチノイン酸（米
国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン
酸、２００ｎＭのＴＰＢ（ＰＫＣ賦活体、カタログ番号５６５７４０、米国ニュージャー
ジー州ギブスタウンのＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１０μＭのフォルスコリン、及び
１００ｎＭのＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅ
ｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で処理した。２日目、細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：
２００希釈、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７
ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、１
０ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ、１μＭのＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍ
Ｍのアスコルビン酸、２００ｎＭのＴＰＢ、１０μＭのフォルスコリン、及び１０ｎＭの
ＬＤＮを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で処理し、次いで、
ｄ）ステージ４（膵臓前腸前駆細胞−２日）：細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、
４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重
炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ
、５０μＭのＬＤＮ−１９３１８９、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコ
ルビン酸、及び１００ｎＭのＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で２日間処理し、次
いで、
ｅ）ステージ５（膵内胚葉／内分泌−３日）：ステージ４細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２
００希釈；４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／
ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎ
ＭのＲＡ、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＡ
Ｌｋ５阻害剤（２〜３日目のみ）（ＳＤ−２０８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌｏｇｙ ２００７，７２：１５２〜１６１に開示）、及び＋／−０〜１００ｎｇ／ｍ
Ｌのエフリン−Ａ３又はエフリン−Ａ４（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ
）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で３日間処理した。
ステージ５の終了時、対照及びエフリン処理の培養物は、（米国マサチューセッツ州ケ
ンブリッジのＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのモルモットアンチインスリン抗体を使用して）イ
ンスリンタンパク質発現に対して固定染色された。図２は、インスリンに対して免疫染色
した細胞の画像を表す。図２Ａは対照細胞、図２Ｂは５０ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ３で処
理した細胞、図２Ｃは、１００ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ３で処理した細胞を示す。図３は
、インスリンに対して免疫染色した細胞の画像を表す。図３Ａは対照細胞、図３Ｂは５０
ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ４で処理した細胞、図３Ｃは、１００ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ４
で処理した細胞を示す。これらのデータは、実施例１のデータと一致して、ステージ５で
のエフリン−Ａ３及びエフリン−Ａ４両方の添加が、インスリンのタンパク質発現を有意
に増強したことを示す。
（実施例３）
Ｓ６でのスフィンゴシン−１−リン酸塩の添加は、内分泌ホルモンを含む細胞クラスタ
ー形成を大幅に加速
この実施例では、ステージ６での内分泌腺クラスター形成の進行、及び内分泌腺リッチ
クラスターの形成の加速化におけるスフィンゴシン−１−リン酸塩の影響を説明する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ｈＥＳＣ Ｈ１、継代４０）の細胞は、１０μＭのＹ２７６３
２を補充したｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（カナダ国バンクーバーのＳｔｅｍＣｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；米
国ニュージャージー州のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で被覆された皿上に、１×１０
5細胞／ｃｍ2で、単一細胞として播種した。播種の４８時間後に、培養物を、不完全なＰ
ＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。培養物は、以下の
ように膵内胚葉／内分泌系統に分化した：
ａ）ステージ１（胚体内胚葉（ＤＥ）−３日）：細胞は、ステージ１の培地（上記の実
施例１を参照）で１日間培養された。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．
００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭの
Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８、及び０．１μＭのＭＣＸ化合物を補充し
たＭＣＤＢ−１３１倍地でもう１日培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳ
Ａ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．
５ｍＭのＤ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１
倍地でもう１日培養し、次いで、
ｂ）ステージ２（前駆腸管−２日）：細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１
２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グ
ルコース、０．２５ｍＭのアスコルビン酸（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）及び２５ｎｇ
／ｍＬのＦＧＦ７（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＭＣＤＢ
−１３１培地で２日間処理し、次いで、
ｃ）ステージ３（前腸−２日）：細胞は、１日目、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈（米国
カリフォルニア州のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ Ｇｌｕｔ
ａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、
０．２５μＭのＳＡＮＴ−１（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチ
ビン−Ａ（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＭのレチノイン酸（米
国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン
酸、２００ｎＭのＴＰＢ（ＰＫＣ賦活体、カタログ番号５６５７４０、米国ニュージャー
ジー州ギブスタウンのＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１０μＭのフォルスコリン（ＦＳ
Ｋ、米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、及び１００ｎＭのＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カ
タログ番号０４−００１９、米国カリフォルニア州のＳｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣ
ＤＢ−１３１培地で処理した。２日目、細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍ
Ｍのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナト
リウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、１０ｎｇ／ｍＬのアクチ
ビン−Ａ、１μＭのＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、
２００ｎＭのＴＰＢ、及び１０ｎＭのＬＤＮを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で処理し、
次いで、
ｄ）ステージ４（膵臓前腸前駆細胞−２日）：細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、
４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重
炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ
、５０μＭのＬＤＮ−１９３１８９、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコ
ルビン酸、２ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、１ｎｇ／ｍＬのＡＡ、及び１００ｎＭのＴＰＢを補
充したＭＣＤＢ−１３１倍地で２日間処理し、次いで、
ｅ）ステージ５（膵内胚葉／内分泌−３日）：ステージ４細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２
００希釈、１５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／
ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎ
ＭのＲＡ、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、及び１ｎｇ／ｍ
ＬのＦＧＦ７、２〜３日目のみ１００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８を添加して補充し
たＭＣＤＢ−１３１培地で３日間処理し、次いで、
ｆ）ステージ６（膵内胚葉−３〜１０日）：ステージ５細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２０
０希釈、１５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍ
Ｌの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ
のＲＡ、０．２５ｍＭのアスコルビン酸を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で３〜１０日間
処理した。一部の培養物は、１０μＭのスフィンゴシン−１−リン酸塩（米国ミズーリ州
のＳｉｇｍａ）を３日間添加した。
図４Ａ〜図４Ｄは、スフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）で処理し、１日目（図４
Ａ）、７日目（図４Ｂ）、及び１０日目に２つの異なる拡大率（図４Ｃ及び図４Ｄ）で撮
像した細胞のＳ６培養の位相差画像を表す。画像は、７日目に、内分泌細胞のクラスタリ
ングの明確な証拠が存在すること、１０日目に、クラスターが膵内胚葉上皮の薄層によっ
て相互に分離したことを示す。
図５Ａ〜図５Ｄは、Ｈｂ９（図５Ａ）及びＮＫＸ６．１（図５Ｂ）に対して免疫染色、
又はインスリン（図５Ｃ）及びＨｂ９（図５Ｄ）に対して免疫染色した細胞の画像を表す
。図５Ａ及び図５Ｂは、内分泌腺クラスタリングではＨｂ９が濃縮した一方、クラスター
周囲の膵臓上皮ではＮＫＸ６．１が濃縮したことを示す。Ｈｂ９が濃縮したクラスター内
の細胞の一部は、ＮＫＸ６．１にも陽性であった。図５Ｃ及び図５Ｄに示されるように、
クラスターではインスリン及びＨｂ９が濃縮した。この形態的変化は、ＮＫＸ６．１＋Ｐ
ＤＸ−１＋リッチ上皮が内分泌腺クラスターを生じさせる膵臓の発達と密接に類似する。
それぞれの実例において、１対の画像は、同じ視野の細胞で異なるフィルターを使用して
取得された。
図６Ａ及び図６Ｂは、１０μＭのスフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）で処理し、
ステージ６の開始後３日間培養した細胞の、異なる拡大率の位相差画像を表す。これらの
画像は、ステージ６の開始後３日間だけで、内分泌腺クラスターが発現したことを示す。
これは、対照培養のクラスター形成よりも約７日間早い。
図６Ｃ及び図６Ｄは、対照細胞（図６Ｃ）、及びＳ１Ｐで処理し、ＮＫＸ２．２に対して免疫染色した細胞（図６Ｄ）を表す。Ｓ１Ｐで処理した培養において、内分泌クラスターでは、ＮＫＸ２．２＋細胞が培養全体で均一に分布された対照培養（図６Ｄ）と比較して、ＮＫＸ２．２＋細胞でも濃縮（図６Ｃ）した。

上記の開示によって提供される発明の例として、以下のものが挙げられる。
[１] エフリンリガンドを用いて膵内胚葉細胞を培養することを含む、ホルモン発現細胞におけるインスリン発現を誘発する方法。
[２] 前記エフリンリガンドを用いて前記膵内胚葉細胞を培養することが、ＮＫＸ６．１の発現も強化する、[２]に記載の方法。
[３] エフリンリガンドを用いて前記膵内胚葉細胞を培養することが、非処理の膵内胚葉細胞におけるインスリン及びＮＫＸ６．１の発現と比較して、前記膵内胚葉細胞におけるインスリン及びＮＫＸ６．１の発現を強化する、[２]に記載の方法。
[４] 前記膵内胚葉細胞が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない[３]に記載の方法。
[５] 前記膵内胚葉細胞が、ほぼ約１０％未満のＣＤＸ２又はＳＯＸ２を発現する、[４]に記載の方法。
[６] 前記エフリンリガンドが、エフリンＡ３又はエフリンＡ４である、[１]〜[５]のいずれか１項に記載の方法。
[７] 前記膵内胚葉細胞が、多能性幹細胞の段階的分化によって取得される、[６]に記載の方法。
[８] 前記多能性幹細胞が、ヒト胚性多能性幹細胞である、[７]に記載の方法。
[９] 請求項１の方法によって調製されたインスリン及びＮＫＸ６．１発現細胞。
[１０] エフリンリガンドを用いて膵内胚葉細胞を培養することによって調製された細胞集団であって、前記細胞集団が、エフリンリガンドで処理していない膵内胚葉細胞と比較して、強化されたインスリン及びＮＫＸ６．１を発現する、細胞集団。
[１１] 前記エフリンリガンドが、エフリンＡ３又はエフリンＡ４である、[１０]に記載の細胞集団。
[１２] アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む培地において膵内胚葉細胞を培養することを含む、ホルモン発現細胞における成長ホルモン分泌抑制ホルモンの発現を増強する方法。
[１３] インスリン、グルカゴン、及びグレリンの発現が抑制される、[１２]に記載の方法。
[１４] アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団より多くの成長ホルモン分泌抑制ホルモンを発現する、[１２]に記載の方法。
[１５] インスリンの前記発現が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるインスリンの前記発現と比較して抑制される、[１４]に記載の方法。
[１６] グルカゴンの前記発現が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるグルカゴンの前記発現と比較して抑制される、[１２]に記載の方法。
[１７] グレリンの前記発現が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるグレリンの前記発現と比較して抑制される、[１２]に記載の方法。
[１８] 前記膵内胚葉細胞が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない、[１２]〜[１８]のいずれか１項に記載の方法。
[１９] アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理された前記膵内胚葉細胞が、多能性細胞の段階的分化によって取得される、[１８]に記載の方法。
[２０] 前記膵内胚葉細胞の由来元である前記多能性細胞が、ヒト胚性多能性細胞である、[１９]に記載の方法。
[２１] セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地において膵内胚葉細胞を処理することによって、ＮＫＸ６．１の発現を増強する方法。
[２２] セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した前記膵内胚葉細胞集団が、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理されていない膵内胚葉細胞に比較して強化された量のＮＫＸ６．１を発現する、[２１]に記載の方法。
[２３] インスリン、グルカゴン、及びグレリンの発現レベルが、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した膵内胚葉細胞において、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理していない膵内胚葉細胞に比較して影響を受けない、[２１]に記載の方法。
[２４] スフィンゴシン−１受容体アゴニストを用いて膵内分泌細胞を培養することを含む、内分泌クラスターの形成を誘導するための方法。
[２５] 膵内分泌細胞を処理するために使用された前記スフィンゴシン−１受容体アゴニストが、スフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）である、[２４]に記載の方法。
[２６] 前記膵内分泌細胞が、多能性幹細胞の段階的分化によって取得される、[２４]に記載の方法。
[２７] 前記多能性幹細胞が、ヒト胚性多能性幹細胞である、[２６]に記載の方法。

Claims (19)

  1. アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む培地において膵内胚葉細胞を培養することを含む、ホルモン発現細胞において、ソマトスタチンの発現を増強し、インスリン、グルカゴン及びグレリンの発現を抑制する、方法。
  2. アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団より多くのソマトスタチンを発現する、請求項１に記載の方法。
  3. アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団におけるインスリンの発現が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるインスリンの発現と比較して抑制される、請求項２に記載の方法。
  4. アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団におけるグルカゴンの発現が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるグルカゴンの発現と比較して抑制される、請求項１に記載の方法。
  5. アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団におけるグレリンの発現が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるグレリンの発現と比較して抑制される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記膵内胚葉細胞が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を発現しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. アクチビンＡを含む培地において膵内胚葉細胞を培養することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  8. アクチビンＣを含む培地において膵内胚葉細胞を培養することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  9. セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地において膵内胚葉細胞を処理することによって、ＮＫＸ６．１の発現を増強する方法。
  10. セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した前記膵内胚葉細胞集団が、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理されていない膵内胚葉細胞に比較して強化された量のＮＫＸ６．１を発現する、請求項９に記載の方法。
  11. インスリン、グルカゴン、及びグレリンの発現レベルが、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した膵内胚葉細胞において、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理していない膵内胚葉細胞に比較して影響を受けない、請求項９に記載の方法。
  12. セマフォリン３ａを含む培地で膵内胚葉細胞を処理することを含む、請求項９に記載の方法。
  13. エピゲンを含む培地で膵内胚葉細胞を処理することを含む、請求項９に記載の方法。
  14. 前記膵内胚葉細胞が多能性幹細胞の段階的分化によって取得される、請求項１又は９に記載の方法。
  15. 前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞に由来する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性多能性幹細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させること、
    前記胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させること、
    前記原腸管細胞を前腸細胞に分化させること、
    前記前腸細胞を膵前腸前駆細胞に分化させること、および
    前記膵前腸前駆細胞を前記膵内胚葉細胞に分化させること
    をさらに含む、請求項１又は９に記載の方法。
  18. 前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記膵内胚葉細胞がヒト膵内胚葉細胞である、請求項１又は９に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
CN101952415B (zh) 2007-07-31 2017-06-27 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
CA2706560C (en) 2007-11-27 2017-02-28 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells
KR101731474B1 (ko) 2008-02-21 2017-05-11 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
JP5734183B2 (ja) 2008-06-30 2015-06-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞の分化
BRPI0919885A2 (pt) 2008-10-31 2015-08-11 Centocor Ortho Biotech Inc Diferenciação de células-tronco embrionárias humanas para a linhagem endócrina pancreática
KR101687344B1 (ko) 2008-11-20 2016-12-16 얀센 바이오테크 인코포레이티드 평면 기재상의 세포 부착 및 배양을 위한 방법 및 조성물
WO2010059775A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Centocor Ortho Biotech Inc. Pluripotent stem cell culture on micro-carriers
BR112012001480A2 (pt) 2009-07-20 2015-09-01 Janssen Biotech Inc Diferenciação de células-tronco embriônicas humanas
BR112012017761A2 (pt) 2009-12-23 2015-09-15 Centocor Ortho Biotech Inc diferenciação das células-tronco embrionárias humanas
CN107189979B (zh) 2010-03-01 2021-05-04 詹森生物科技公司 纯化衍生自多能干细胞的细胞的方法
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
SG185511A1 (en) 2010-05-12 2012-12-28 Centocor Ortho Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
WO2012030538A2 (en) * 2010-08-31 2012-03-08 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
JP6441080B2 (ja) 2011-12-22 2018-12-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化
EP2823037A4 (en) 2012-03-07 2015-09-16 Janssen Biotech Inc DEFINED MEDIA FOR THE EXPANSION AND CARE OF PLURIPOTENTAL STEM CELLS
EP2859091B1 (en) * 2012-06-08 2018-08-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
SG11201505119UA (en) 2012-12-31 2015-07-30 Janssen Biotech Inc Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
CN105073979B (zh) 2012-12-31 2020-03-06 詹森生物科技公司 使用hb9调节子使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
RU2658488C2 (ru) * 2012-12-31 2018-06-21 Янссен Байотек, Инк. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
KR102232650B1 (ko) 2013-06-11 2021-03-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법
SG10201810739VA (en) 2014-05-16 2019-01-30 Janssen Biotech Inc Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells
EP3147353B1 (en) * 2014-05-21 2022-03-30 Kyoto University Method for producing pancreatic blast cells and pancreatic disease treatment agent containing pancreatic blast cells
CN113249297A (zh) 2014-05-28 2021-08-13 儿童医院医疗中心 用于经由定向分化将前体细胞转化为胃组织的方法和系统
ES2985135T3 (es) 2014-12-18 2024-11-04 Harvard College Procedimientos para generar células ß derivadas de células madre y usos de las mismas
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
WO2016100930A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived b cells and methods of use thereof
EP3411471B1 (en) * 2016-02-04 2021-01-06 Société des Produits Nestlé S.A. In vitro production of pancreatic beta cells
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
MA45502A (fr) * 2016-06-21 2019-04-24 Janssen Biotech Inc Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases
CN115645621B (zh) 2016-11-10 2024-08-13 韦尔赛特公司 含有pdx1胰腺内胚层细胞的细胞递送装置及其方法
WO2018229179A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
MX2020004939A (es) 2017-11-15 2020-11-11 Semma Therapeutics Inc Fabricacion de composiciones de celulas islote y metodos de uso de las mismas.
CN112533618A (zh) * 2018-05-16 2021-03-19 华盛顿大学 用于生成内胚层谱系细胞和β细胞的方法和组合物及其用途
EP3833365A4 (en) 2018-08-10 2022-05-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
CN111848743B (zh) * 2018-09-03 2021-05-11 吉林省汇融生物科技有限公司 表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法
US20200080107A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US11013723B1 (en) 2018-10-16 2021-05-25 Celgene Corporation Solid forms of a thiazolidinone compound, compositions and methods of use thereof
US11014897B1 (en) 2018-10-16 2021-05-25 Celgene Corporation Solid forms comprising a thiazolidinone compound, compositions and methods of use thereof
US11014940B1 (en) 2018-10-16 2021-05-25 Celgene Corporation Thiazolidinone and oxazolidinone compounds and formulations
US11186556B1 (en) 2018-10-16 2021-11-30 Celgene Corporation Salts of a thiazolidinone compound, solid forms, compositions and methods of use thereof
WO2020243663A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
EP3975926A1 (en) 2019-05-31 2022-04-06 W.L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
JP2022534545A (ja) 2019-05-31 2022-08-01 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
WO2020243668A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
AU2020340622A1 (en) 2019-09-05 2022-03-03 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US11118195B2 (en) 2019-09-05 2021-09-14 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
JPWO2021079874A1 (ja) * 2019-10-21 2021-04-29
JP2024503290A (ja) 2020-12-31 2024-01-25 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ユニバーサルドナー細胞
CN114634904B (zh) * 2022-05-17 2022-09-13 天津外泌体科技有限公司 高纯度胰腺祖细胞的产生方法
CN116162587A (zh) * 2023-02-20 2023-05-26 杭州瑞普晨创科技有限公司 Hippo-Yap通路调控剂在促进诱导性多能干细胞向胰腺前体细胞定向分化中的应用

Family Cites Families (273)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US5804178A (en) 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
SU1767433A1 (ru) 1989-11-27 1992-10-07 Пермский государственный медицинский институт Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
KR100249937B1 (ko) 1991-04-25 2000-04-01 나가야마 오사무 인간 인터루킨-6 수용체에 대한 재구성 인간 항체
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
JP2813467B2 (ja) 1993-04-08 1998-10-22 ヒューマン・セル・カルチャーズ・インコーポレーテッド 細胞培養法および培地
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ja) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
ATE214602T1 (de) 1994-12-29 2002-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verstärker eines anti-tumoragens beinhaltend einen il-6 antagonisten
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5681561A (en) 1995-06-07 1997-10-28 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for improving autologous fat grafting
AU5734998A (en) 1997-01-10 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
IL132318A0 (en) 1997-04-24 2001-03-19 Ortho Mcneil Pharm Inc Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
DK1028737T3 (da) 1997-07-03 2007-08-13 Osiris Therapeutics Inc Humane mesenchymale stamceller fra perifert blod
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
PT1538206E (pt) 1997-09-16 2010-04-12 Centocor Ortho Biotech Inc Método para a síntese química e construção completa de genes e genomas
WO1999020741A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
CO4980885A1 (es) 1997-12-29 2000-11-27 Ortho Mcneil Pharm Inc Compuestos de trifenilpropanamida utiles en el tratamiento de inflamaciones y metodos para preparar dicho compuesto
ES2258329T3 (es) 1998-03-18 2006-08-16 Osiris Therapeutics, Inc. Celulas madre mesenquimaticas para la prevencion y tratamiento de respuestas inmunes en trasplantes.
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
NZ513598A (en) 1999-01-21 2001-09-28 Vitro Diagnostics Inc Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
WO2001023528A1 (en) 1999-09-27 2001-04-05 University Of Florida Research Foundation Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
WO2001042789A1 (en) 1999-12-13 2001-06-14 The Scripps Research Institute MARKERS FOR IDENTIFICATION AND ISOLATION OF PANCREATIC ISLET α AND β CELL PROGENITORS
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
AU2001274624A1 (en) 2000-06-26 2002-01-08 Renomedix Institute Inc. Cell fraction containing cells capable of differentiating into nervous system cells
ES2372028T3 (es) 2000-10-23 2012-01-13 Glaxosmithkline Llc Nuevo compuesto de 8h-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona trisustituida para el tratamiento de enfermedades mediadas por la csbp/p38 quinasa.
CA2431187A1 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors
EP1362047B1 (en) 2000-12-08 2006-05-17 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Indazolyl-substituted pyrroline compounds as kinase inhibitors
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
WO2002059278A2 (en) 2001-01-24 2002-08-01 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Department Of Health & Human Services Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
EP1355910B1 (en) 2001-01-25 2011-03-09 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
JP2004527249A (ja) 2001-04-19 2004-09-09 デヴェロゲン アクチエンゲゼルシャフト フュア エントヴィックルングスビオローギッシェ フォルシュング 幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法
JP4296781B2 (ja) 2001-04-24 2009-07-15 味の素株式会社 幹細胞及びその分離方法
CA2447015A1 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
US7432104B2 (en) 2001-08-06 2008-10-07 Bresgen Inc. Methods for the culture of human embryonic stem cells on human feeder cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
WO2003033697A1 (en) 2001-10-18 2003-04-24 Ixion Biotechnology, Inc. Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
EP1442115B9 (en) 2001-11-15 2009-12-16 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
EP2264146A1 (en) 2001-12-07 2010-12-22 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells
CA2849201A1 (en) 2001-12-07 2003-07-03 Macropore Biosurgery, Inc. Adipose-derived cell processing unit
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
CN1671835A (zh) 2001-12-28 2005-09-21 塞拉提斯股份公司 一种建立多能人胚泡衍生的干细胞的方法
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
GB0207440D0 (en) * 2002-03-28 2002-05-08 Ppl Therapeutics Scotland Ltd Tolerogenic antigen-presenting cells
EP1498478A1 (en) 2002-04-17 2005-01-19 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
US7125878B2 (en) 2002-05-08 2006-10-24 Janssen Pharmaceutica Substituted pyrroline kinase inhibitors
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
CN1662643A (zh) 2002-05-28 2005-08-31 贝克顿·迪金森公司 人腺泡细胞的扩增和转分化
KR20050008787A (ko) 2002-06-05 2005-01-21 얀센 파마슈티카 엔.브이. 키나제 저해제로서의 비스인돌릴-말레이미드 유도체
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
WO2004011621A2 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Es Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
WO2004016747A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
US7371576B2 (en) 2002-09-06 2008-05-13 Reneuron, Inc. CD56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
WO2004044158A2 (en) 2002-11-08 2004-05-27 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004050827A2 (en) 2002-12-05 2004-06-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
AU2003303071B2 (en) 2002-12-16 2009-04-23 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of preparing feeder cells-free, xeno-free human embryonic stem cells and stem cell cultures prepared using same
US20050118148A1 (en) 2002-12-20 2005-06-02 Roland Stein Compositions and methods related to mammalian Maf-A
MXPA05007883A (es) 2003-01-29 2005-09-21 Takeda Pharmaceutical Proceso para producir una preparacion recubierta.
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
US20070154981A1 (en) * 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
WO2004073633A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
US20070020242A1 (en) 2003-03-27 2007-01-25 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
KR20060021908A (ko) * 2003-06-23 2006-03-08 프라운호퍼-게젤샤프트 추르 푀르데룽 데어 안제반텐 포르슝 에 파우 췌장 호르몬을 생산하는 세포로 줄기세포를 분화시키는방법
US9579351B2 (en) 2003-06-27 2017-02-28 DePuy Synthes Products, Inc. Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making and using the same
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
WO2005017117A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
JP2007503815A (ja) 2003-08-27 2007-03-01 ステムセルズ・カリフォルニア・インコーポレイテッド 富化された膵臓幹細胞および前駆細胞集団、ならびにこれらの集団の同定、単離および富化方法
US7468391B2 (en) 2003-12-17 2008-12-23 Allergan, Inc. Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of CYP26A and CYP26B
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
CN1946838A (zh) 2003-12-23 2007-04-11 赛瑟拉公司 定形内胚层
JP4819697B2 (ja) 2003-12-23 2011-11-24 ヴィアサイト，インコーポレイテッド 胚体内胚葉
US7541185B2 (en) 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US20050233446A1 (en) 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
JP4901471B2 (ja) 2004-02-19 2012-03-21 国立大学法人京都大学 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
US20060281174A1 (en) * 2004-03-09 2006-12-14 Gang Xu Methods for generating insulin-producing cells
EP1730261A4 (en) 2004-03-10 2007-11-28 Univ California COMPOSITIONS AND METHODS FOR GROWING EMBRYONIC STEM CELLS
EP1734112B1 (en) 2004-03-23 2017-08-23 Toshihiro Akaike Method of proliferating pluripotent stem cell
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
CA2555571C (en) 2004-04-01 2012-10-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
CN103103158B (zh) 2004-04-27 2016-08-03 韦尔赛特公司 细胞培养基
JP5687816B2 (ja) 2004-07-09 2015-03-25 ヴィアサイト，インコーポレイテッド 胚体内胚葉を分化させるための因子を同定する方法
EP1791952A4 (en) 2004-08-13 2008-06-11 Univ Georgia Res Found COMPOSITIONS AND METHODS OF SELF-RENEWAL AND DIFFERENTIATION IN HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
US20080268533A1 (en) 2004-08-25 2008-10-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
GB2432835B (en) 2004-09-08 2009-04-08 Wisconsin Alumni Res Found Culturing human embryonic stem cells
MX2007002390A (es) 2004-09-08 2007-04-23 Wisconsin Alumni Res Found Medio y cultivo de celulas progenitoras embrionarias.
JP2008538276A (ja) 2005-01-28 2008-10-23 ノヴァセラ・リミテッド 胚幹細胞培養のための方法
CA2613812A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
US20060182724A1 (en) 2005-02-15 2006-08-17 Riordan Neil H Method for expansion of stem cells
SG160373A1 (en) 2005-03-04 2010-04-29 John Oaeneil Adult pancreatic derived stromal cells
US20060212476A1 (en) 2005-03-18 2006-09-21 Bogle Phillip L Method and apparatus for tracking candidate referrers
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
WO2006113470A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
EP1874367B1 (en) 2005-04-26 2011-07-06 Arhus Universitet Biocompatible material for surgical implants and cell guiding tissue culture surfaces
JP5092124B2 (ja) 2005-05-24 2012-12-05 国立大学法人 熊本大学 Ｅｓ細胞の分化誘導方法
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
CN101238129A (zh) 2005-06-10 2008-08-06 Irm责任有限公司 维持胚胎干细胞多能性的化合物
EP1893746A2 (en) * 2005-06-13 2008-03-05 Novo Nordisk A/S Modulation of cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
WO2006137787A1 (en) 2005-06-21 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell culture
AU2006262369B2 (en) 2005-06-22 2012-07-05 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
BRPI0612888B8 (pt) 2005-06-30 2022-12-27 Janssen Pharmaceutica Nv anilino-piridinotriazinas cíclicas como inibidoras de gsk-3, seus usos e composição farmacêutica, intermediário, seu uso e composição farmacêutica
AU2006274438A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007016485A2 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Athersys, Inc. Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
SG177946A1 (en) 2005-08-29 2012-02-28 Technion Res & Dev Foundation Media for culturing stem cells
EP1943334A1 (en) 2005-09-02 2008-07-16 Agency for Science, Technology and Research Method of deriving progenitor cell line
GB2444686B (en) 2005-09-12 2010-08-25 Es Cell Int Pte Ltd Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins
AU2006292203A1 (en) * 2005-09-21 2007-03-29 Dask Technologies, Llc Methods and compositions for organ and tissue functionality
US7807459B2 (en) * 2005-09-27 2010-10-05 Reneuron, Inc. EphA4-positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
NZ567082A (en) 2005-10-14 2012-08-31 Univ Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
US7732202B2 (en) 2005-10-21 2010-06-08 International Stem Cell Corporation Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells
JP5404047B2 (ja) 2005-10-27 2014-01-29 ヴィアサイト，インコーポレイテッド Ｐｄｘ１発現背側及び腹側前腸内胚葉
UA96139C2 (uk) * 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
BRPI0619794B8 (pt) 2005-12-13 2022-06-14 Univ Kyoto Uso de um fator de reprogramação, agente para a preparação de uma célula-tronco pluripotente induzida a partir de uma célula somática e métodos para preparar uma célula- tronco pluripotente induzida método e para preparar uma célula somática e uso de células-tronco pluripotentes induzidas
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
SG170021A1 (en) 2006-02-23 2011-04-29 Novocell Inc Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
US7695965B2 (en) * 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
CA3147112A1 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Viacyte, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
ES2725601T3 (es) 2006-04-28 2019-09-25 Lifescan Inc Diferenciación de células madre embriónicas humanas
GB2452186B (en) 2006-05-02 2011-01-26 Wisconsin Alumni Res Found Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
WO2007136673A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Medistem Laboratories, Inc. Treatment of disc degenerative disease and compositions for same
US7964402B2 (en) 2006-05-25 2011-06-21 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
CA2654196A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
WO2007149182A2 (en) * 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
CA2656175C (en) 2006-06-26 2018-08-28 Lifescan, Inc. Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
US8968994B2 (en) 2006-07-06 2015-03-03 Jeremy Micah Crook Method for stem cell culture and cells derived therefrom
WO2008013664A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
ES2874223T3 (es) 2006-08-02 2021-11-04 Technion Res & Dev Foundation Métodos de expansión de células madre embrionarias en un cultivo en suspensión
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
BRPI0718310A2 (pt) 2006-10-17 2013-11-19 Stiefel Laboratories Metabólitos de talarozol
US20100323442A1 (en) 2006-10-17 2010-12-23 Emmanuel Edward Baetge Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
US8835163B2 (en) 2006-10-18 2014-09-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
EP2088190A4 (en) 2006-11-09 2011-01-05 Japan Government METHOD FOR THE CULTURE AND PASSING OF AN EMBRYONAL PRIMATIVE STEM CELL AND METHOD FOR INDUCING THE DIFFERENTIATION OF THE EMBRYONAL STEM CELL
TW200836749A (en) 2007-01-09 2008-09-16 Vioquest Pharmaceuticals Inc Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
EP1947193A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-23 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Screening method for anti-diabetic compounds
CN103627671A (zh) 2007-01-30 2014-03-12 佐治亚大学研究基金会 产生中内胚层细胞及多能游走细胞的方法与细胞群及用途
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
WO2008148105A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
US8815585B2 (en) 2007-06-29 2014-08-26 Cellular Dynamics International, Inc. Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
EP3957716A1 (en) * 2007-07-18 2022-02-23 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CN101952415B (zh) 2007-07-31 2017-06-27 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
EP2185691B1 (en) 2007-07-31 2018-03-14 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells
AU2008291930B2 (en) 2007-08-24 2014-04-17 Slotervaart Participaties Bv Compositions for the treatment of neoplastic diseases
US20110151447A1 (en) 2007-11-06 2011-06-23 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells
CA2706560C (en) 2007-11-27 2017-02-28 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
KR101731474B1 (ko) 2008-02-21 2017-05-11 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
JPWO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2011-07-14 独立行政法人科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
US8716018B2 (en) 2008-03-17 2014-05-06 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
RU2359030C1 (ru) 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
DK2727998T3 (da) 2008-04-21 2019-08-26 Viacyte Inc Fremgangsmåder til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
WO2009132083A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
DK2993226T3 (da) 2008-06-03 2021-02-22 Viacyte Inc Vækstfaktorer til fremstilling af en definitiv endoderm
AU2009267167A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
JP5734183B2 (ja) 2008-06-30 2015-06-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞の分化
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
US9683215B2 (en) 2008-08-22 2017-06-20 President And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
KR102025158B1 (ko) * 2008-10-31 2019-09-25 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화
BRPI0919885A2 (pt) 2008-10-31 2015-08-11 Centocor Ortho Biotech Inc Diferenciação de células-tronco embrionárias humanas para a linhagem endócrina pancreática
CA2907326A1 (en) 2008-11-04 2010-05-14 Chad Green Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
JP2012508584A (ja) 2008-11-14 2012-04-12 ヴィアサイト，インコーポレイテッド ヒト多能性幹細胞由来膵臓細胞のカプセル化
WO2010059775A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Centocor Ortho Biotech Inc. Pluripotent stem cell culture on micro-carriers
DK2356218T3 (en) 2008-12-05 2017-08-21 Inserm (Institut Nat De La Santé Et De La Rech Médicale) METHOD AND MEDIUM FOR NEURAL DIFFERENTIZATION OF PLURIPOTENT CELLS
US9109245B2 (en) * 2009-04-22 2015-08-18 Viacyte, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
AU2010276440B2 (en) * 2009-07-20 2014-07-03 Janssen Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CA2768720C (en) 2009-07-20 2018-12-18 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
BR112012001480A2 (pt) 2009-07-20 2015-09-01 Janssen Biotech Inc Diferenciação de células-tronco embriônicas humanas
US20110104805A1 (en) 2009-10-29 2011-05-05 Centocor Ortho Biotech Inc. Pluripotent Stem Cells
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
RU2664864C1 (ru) 2009-12-23 2018-08-23 Янссен Байотек, Инк. Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы
BR112012017761A2 (pt) * 2009-12-23 2015-09-15 Centocor Ortho Biotech Inc diferenciação das células-tronco embrionárias humanas
EP2505639B1 (en) * 2009-12-29 2018-09-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells
JP5812492B2 (ja) 2010-02-03 2015-11-11 国立研究開発法人国立がん研究センター 誘導肝幹細胞及びその製造方法、並びに、該細胞の応用
SG183400A1 (en) 2010-03-02 2012-09-27 Univ Singapore Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response
EP2553086B1 (en) 2010-03-31 2017-04-19 The Scripps Research Institute Reprogramming cells
US9234170B2 (en) 2010-04-25 2016-01-12 Mount Sinai School Of Medicine Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells
SG185511A1 (en) 2010-05-12 2012-12-28 Centocor Ortho Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
US9085757B2 (en) * 2010-06-17 2015-07-21 Regents Of The University Of Minnesota Production of insulin producing cells
CN103180434A (zh) 2010-08-05 2013-06-26 威斯康星校友研究基金会 用于人多能细胞培养的简化基础培养基
US9040062B2 (en) * 2010-08-06 2015-05-26 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Preparation for treatment of spinal cord injury
CN103154239B (zh) 2010-08-31 2018-05-15 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
EP2611907B1 (en) 2010-08-31 2016-05-04 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
MY177150A (en) 2011-02-28 2020-09-08 Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
WO2013055834A2 (en) 2011-10-11 2013-04-18 The New York Stem Cell Foundation Er stress relievers in beta cell protection
WO2013055397A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Children's Medical Center Corporation Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes
JP6441080B2 (ja) 2011-12-22 2018-12-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
EP2859091B1 (en) 2012-06-08 2018-08-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
WO2014033322A1 (en) 2012-09-03 2014-03-06 Novo Nordisk A/S Generation of pancreatic endoderm from pluripotent stem cells using small molecules
CN105073979B (zh) 2012-12-31 2020-03-06 詹森生物科技公司 使用hb9调节子使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
EP2970892A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 The Jackson Laboratory Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof
CN105233291A (zh) * 2014-07-09 2016-01-13 博笛生物科技有限公司 用于治疗癌症的联合治疗组合物和联合治疗方法
US20180258400A1 (en) * 2015-09-15 2018-09-13 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Derivation of liver organoids from human pluripotent stem cells
JP7389980B2 (ja) * 2018-12-06 2023-12-01 国立大学法人 琉球大学 ヒト膵臓組織特異的幹／前駆細胞の人工作製方法

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