KR101731474B1

KR101731474B1 - 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물

Info

Publication number: KR101731474B1
Application number: KR1020167003806A
Authority: KR
Inventors: 벤자민 프라이어; 셸리 넬슨; 빌리 닐센; 토마스 브레빅; 티나 그리스텐센 마르우드
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2008-02-21
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2017-05-11
Anticipated expiration: 2029-02-19
Also published as: CA2959401A1; RU2010138801A; US20190249138A1; US10066203B2; KR20100125311A; EP2254990B1; JP2011512797A; CN102046779A; KR101597731B1; EP2254990A2; MX2010009251A; CN105886459A; WO2009105570A3; CA2959401C; RU2551772C2; US20090215177A1; AU2009215516A1; BRPI0908033A2; JP5733986B2; KR20160023920A

Abstract

본 발명은 포유류 세포 배양 분야에 관한 것이며, 적어도 약 0.5%의 N, 17.2% 이상의 O와 N의 합계 및 적어도 약 13.9도의 접촉각을 가지며, 영양 세포층(feeder cell layer)이 결여되고, 흡착층(adlayer)이 결여된 고형 기재 표면에의 세포 부착, 상기 표면 상에서의 세포 배양, 및 상기 표면으로부터의 세포 탈리를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 세포는 로 키나아제(Rho kinase) 활성을 저해할 수 있는 화합물로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 세포는 로 활성을 저해할 수 있는 화합물로 처리된다.

Description

세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물{METHODS, SURFACE MODIFIED PLATES AND COMPOSITIONS FOR CELL ATTACHMENT, CULTIVATION AND DETACHMENT}

본 출원은 2008년 2월 21일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/030,544호에 대한 우선권을 주장한다.

포유류 세포의 배양은 생명 과학 및 보건 과학에서 많은 공정들 중 하나이다. 고정-의존성 세포를 수반하는 포유류 세포 배양 및 분석을 위한 용기는 흔히 예를 들어 폴리스티렌과 같은 중합체 또는 유리로 만들어지며, 이는 빈번하게는 세포가 용기 표면에 부착되게 하는 추가의 표면 처리를 필요로 한다. 그러한 처리는 예를 들어 흡착, 그래프팅 또는 플라스마 중합 기술에 의해 표면 상에 흡착층을 적용하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 표면 처리는 용기 표면 그 자체의 화학적 개질을 통한 것일 수 있으며, 이는 예를 들어 대기 코로나, 무선 주파수 진공 플라스마(radio frequency vacuum plasma), DC 글로우 방전(glow discharge), 및 마이크로파 플라스마 처리(microwave plasma trea™ents)에 의해 성취될 수 있다. 이들 표면 처리는 표면에서의 화학적 기 및 원소의 조성을 변화시킨다. 결과로서 생긴 특정한 화학적 특성은 사용된 가스의 조성뿐만 아니라 표면 처리 방법, 에너지 및 시간에도 의존적이다.

예를 들어, 미국 특허 제5449383호에는 벌크 중합체 물질; 및 세포 성장의 지지에 적합한 중합체 박층 - 이는 세포의 부착을 위한 아미드기를 제시하는 플라스마-중합된 아미드 단량체를 포함하는 재배향 내성 중합체를 포함함 - 을 포함하는 기재가 개시되어 있으며, 여기서 상기 아미드 단량체는 다이메틸 포름아미드 및 화학식 R¹-CO-N(R²)R³ (여기서, R¹은 각각이 할로겐 원자 또는 하이드록실 기로 선택적으로 치환될 수 있는 지방족, 지환족 또는 방향족 기이며, R²및 R³은 각각 독립적으로 수소 또는 알킬기임)을 갖는 아미드의 군으로부터 선택되며, 상기 중합체 박층은 상기 세포의 부착 및 증식을 촉진한다.

다른 예에서, 유럽 특허 제0348969A1호에는 중합체 표면을 질소를 포함하는 가스질 물질로부터 생성되는 플라스마와 접촉시키고 그에 의해 상기 중합체 표면을 표면 아미노기를 포함하도록 개질시키는 단계, 및 상기 개질된 표면에 충분한 내피 세포를 적용하여 세포 증식에 대한 요구 없이 상기 아미노기-함유 표면 상에 융합성 세포층을 형성하는 단계를 포함하는, 중합체 표면의 내피화 방법이 개시되어 있다.

다른 예에서, 유럽 특허 제0092302A2호에는, 탄소, 수소, 산소, 질소, 황, 인, 할로겐, 또는 이들 원소 중 임의의 하나의 화합물로부터 생성되는 플라스마로 기재 표면을 처리함으로써 기재 표면의 화학적 특성을 변경시키는 것을 특징으로 하는, 기재 상에서 성장 배지 중 세포 배양물의 성장에 영향을 미치는 방법이 개시되어 있다.

다른 예에서, 미국 특허 제6,617,152B2호에는 중합체 기재 표면 처리용 장치가 개시되어 있으며, 이 장치는 (a) 가스 유입구, 마이크로파 에너지원 및 플라스마 혼합 챔버 - 플라스마 혼합 챔버는 가스 유입구 및 마이크로파 에너지원 둘 모두와 유체 연통함 - 와; (b) 내부 처리 챔버가 외부 처리 챔버 내에 포함된 이중 챔버형 처리 영역 - 상기 내부 처리 챔버는 상기 외부 챔버와 유체 연통하는 개구를 가지고, (c) 상기 플라스마 혼합 챔버는 구멍(aperture)에 의해 상기 외부 처리 챔버와 유체 연통됨 - 과; (d) 상기 외부 챔버에 부착된 진공 배출 라인을 포함하며, (e) 그에 의해 상기 내부 처리 챔버 내의 상기 개구가 상기 구멍과 정렬되고, 상기 개구는 상기 구멍과 소정의 거리로 이격되어 있다.

일례에서, 미국 특허 출원 공개 제2003/0180903A1호는 세포가 상부에서 배양될 수 있는 실제 표면(working surface)을 갖는 중합체 기재가 개시되어 있으며, 여기서 표면 산소 함량은 약 50 옹스트롬의 깊이에서 화학적 분석을 위하여 전자 현미경법에 의해 측정할 때 적어도 25%이다.

일례에서, 국제특허 공개 WO2006114098호에는 외과용 임플란트와 세포 안내형 조직 배양용 표면(cell guiding tissue culture surfaces)을 위한 미세-구조화 생체적합성 재료가 개시되어 있다. 생체재료(biomaterial) 표면의 미세 구조는 미분화 ES 세포의 성장을 촉진하거나; ES 세포의 신경 분화(neuronal differentiation)를 촉진하거나; 또는 ES 세포의 분화를 촉진하도록 선택된다.

다른 예에서, 문헌[Bigdeli et al., J. Biotechnol. 133:146-153, 2008]에는 영양 세포가 없는 조건 하에서 분화 없이 그리고 고형 기재 표면을 세포외 매트릭스 단백질로 사전 처리하지 않고서 배양될 인간 ES 세포의 적응 및/또는 선발 방법이 기재되어 있으며, 이는 (i) 인간 이배체 배아 폐 섬유아세포로 조절된 배지로부터 신생아 연골세포로 조절된 배지로 배지를 교환하고; (ii) 이어서 생쥐 배아 영양 세포층으로부터 매트리젤(Matrigel)™-처리된 플레이트로, 이어서 코스타(Costar)™ 플레이트로, 그리고 마지막으로 프리마리아(Primaria)™ 플레이트로 세포를 효소에 의해 계대하고; (iii) 처음에 사용한 배지로 다시 교환하는 것을 포함한다. 이 방법에 처해지는 인간 ES 세포 중 매우 적은 것은 확립된 세포주를 생성하였으며, 이는 이 방법이 배양 조건에 대한 인간 ES 세포의 선발을 포함함을 시사한다.

표면 그 자체에서 화학적 기 및 원소의 조성을 변화시키는 표면 처리는 많은 유형의 포유류 세포의 배양을 위한 중합체 고형 기재의 제조에 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, 소정의 유형의 포유류 세포, 예를 들어 만능 줄기 세포 및 인간 배아 신장(human embryonic kidney, HEK) 293 세포를 사용하면 배양 및/또는 부착이 불량하다는 견지에서 상당한 제한이 있다.

문헌[Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977]에는 세포주 HEK293의 생성이 개시되어 있다.

HEK293 세포 부착은, HEK293 세포를 배양 용기에 첨가하기 전에, 예를 들어 세포외 매트릭스 단백질, 폴리라이신, 폴리오르니틴, 또는 폴리에틸렌이민을 사용하여 고형 기재 표면 상에 흡착층을 만듦으로써 향상시킬 수 있다. 그러나, 흡착층을 만드는 것은 시간이 많이 걸리며, 전형적으로 있는 그대로의 고형 기재보다 더 짧은 저장 수명을 갖는 비-살균 고형 기재로 이어진다. 따라서, 흡착층이 결여된 고형 기재에 대한 HEK293 세포의 부착을 향상시키기 위한 방법 및 재료가 상당히 필요하다.

만능 줄기 세포, 특히 배아 줄기(embryonic stem, ES) 세포를 배양하는 현재의 방법은 복잡한 배양 조건들, 예를 들어 영양 세포층을 갖는 고형 기재 표면 상에서 또는 세포외 매트릭스 단백질의 흡착층을 갖는 고형 기재 표면 상에서 배아 줄기 세포를 배양하는 것을 필요로 한다. 이들 방법을 이용하는 배양 시스템에서는 흔히 배양되고 있는 줄기 세포의 종과는 다른 종으로부터 얻어지는 세포외 매트릭스 단백질 (이종(xenogeneic) 물질) 또는 영양 세포가 사용된다. 영양 세포에의 노출에 의해 얻어지는 배지, 즉 미분화 ES 세포 이외의 세포에 의해 조절된 배지를 사용하여 ES 세포를 배양할 수 있으며, 배지는 동물 혈청으로 보충될 수 있다.

예를 들어, 문헌[Reubinoff et al., Nature Biotechnol. 18:399-404, 2000] 및 문헌[Thompson et al., Science 282:1145-1147, 1998]에는 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층을 사용한 인간 배반포 유래의 ES 세포주의 배양이 개시되어 있다.

다른 예에서, 문헌[Xu et al., Nature Biotechnology 19:971-974, 2001]에는 분화 없이 인간 ES 세포를 영양 세포 없이 배양하기 전에 고형 기재 표면을 처리하기 위한 매트리젤™ 및 라미닌의 사용이 개시되어 있다.

다른 예에서, 문헌[Vallier et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005]에는 분화 없이 인간 ES 세포를 영양 세포 없이 배양하기 전에 고형 기재 표면을 처리하기 위한 소 태아 혈청의 사용이 개시되어 있다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제특허 공개 WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 쥐과 세포, 특히 MMH(Met 쥐과 간세포(Met Murine Hepatocyte))로 불리는, 분화되고 불멸화된 트랜스제닉(transgenic) 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다"고 진술한다.

다른 예에서, 와나타베(Wanatabe) 등 문헌[Nature Biotechnol. 35:681-686, 2007]은 "ROCK 저해제는 해리된 인간 배아 줄기 세포의 생존을 가능케 한다"고 진술하며, 해리-유도된 아폽토시스(apoptosis)의 감소, 클로닝 효율의 증가 (대략 1%로부터 대략 27%로 증가), 및 유전자 전달 후 서브클로닝(subcloning)의 촉진 - 생쥐 배아 섬유아세포를 영양 세포로서 사용하고, 콜라겐 및 매트리젤™을 세포외 매트릭스 단백질로 사용하고, Y-27632 또는 파수딜(Fasudil)을 ROCK의 저해를 위하여 사용함 - 을 입증한다. 더욱이, Y-27632로 처리된 해리된 인간 ES 세포는 무혈청 현탁 배양에서 아폽토시스로부터 보호되었다.

다른 예에서, 피라니(Peerani) 등 문헌[EMBO Journal 26:4744-4755, 2007]은 "인간 배아 줄기 세포(hESC) 배양의 공간적 구성의 복잡성은 hESC 운명에 영향을 주는 이질적인 미시환경(microenvironments) (니치(niches))을 생성한다. 이 연구는 hESC 분화의 속도 및 진행 경로(trajectory)가 hESC 니치 특성의 엔지니어링에 의해 제어될 수 있음을 입증한다. 니치 크기 및 조성은 분화 유도 인자와 분화 저해 인자 사이의 균형을 조절한다. 기계적으로는, Smad1 시그널링(signaling)의 니치 크기-의존적인 공간적 구배는 hESC와 hESC-유래된 배외 내배엽(extra-embryonic endoderm, ExE) 사이의 길항적 상호작용의 결과로서 생성된다. 이들 상호작용은 ExE에 의한 골형성 단백질-2(bone morphogenetic protein-2, BMP2)의 그리고 hESC에 의한 그의 길항제인 성장 분화 인자-3(growth differentiation factor-3, GDF3)의 국소화된 분비에 의해 매개된다. 로-결부된 키나아제(Rho-associated kinase, ROCK)의 저해제를 이용한 처리뿐만 아니라 GDF3, BMP2 및 Smad1에 대한 siRNA(small interfering RNA)로 처리된 hESC의 미세패터닝(micropatterning)도 Smad1 활성화의 독립적인 제어가 hESC의 콜로니 크기-의존적 분화를 구제할 수 있음을 보여준다. 우리의 결과는, 공간 정보의 통합에서 그리고 hESC 자기-재생 및 분화의 니치-크기 의존적 제어에서 Smad1의 역할을 예시한다."고 진술한다.

다른 예에서, 코야나기, 엠(Koyanagi, M) 등 문헌[J Neurosci Res. 2007 Sep 7 [Epub ahead of print]]은 "로-GTPase는 뉴런을 비롯한 많은 세포 유형의 아폽토시스에 연루되어 있지만, 그가 작용하는 기작이 완전히 이해되고 있는 것은 아니다. 여기서, 우리는 배아 줄기 세포-유래된 신경 전구 세포의 이식 동안의 아폽토시스에서의 로 및 ROCK의 역할을 조사하였다. 우리는 신경 전구체의 해리가 로를 활성화시켜 아폽토시스를 유도함을 알아내었다. 로 저해제 C3 세포외효소(exoenzyme) 및/또는 ROCK 저해제 Y-27632를 이용한 처리에 의해 해리-유도된 아폽토시스(아노이키스(anoikis))의 양이 20-30% 감소된다. 아폽토시스의 초기의 형태적 징후인 막 수포형성(Membrane blebbing); 카스파아제(caspase)-3의 절단; 및 미토콘드리아로부터의 사이토크롬(cytochrome) c의 방출이 또한 ROCK 저해에 의해 감소된다. 이들 결과는 신경 전구 세포의 해리가 로/ROCK 경로를 통하여 적어도 부분적으로 매개되는 고유 세포 사멸 경로를 이끌어낸다. 게다가, 동물 이식 모델에서, 로 및/또는 ROCK의 저해는 이식된 세포의 급성 아폽토시스를 억제한다. 이식 후, 종양 괴사 인자-알파 및 프로-신경 성장 인자가 이식편 주위에서 강하게 발현된다. ROCK 저해는 이들 염증성 사이토카인에 의해 향상되는 아폽토시스를 또한 억제한다. 종합해 보면, 이들 결과는 로/ROCK 시그널링의 저해가 세포 대체 요법에서 이식된 세포의 생존을 개선시킬 수 있음을 나타낸다."고 진술한다.

다른 예에서, 요네다(Yoneda) 등 문헌[J. Cell Biol. 170: 443-453, August 3, 2005]은 "상동성 포유류 로 키나아제류 (ROCK I 및 II)는 기능적으로 불필요한 것으로 가정되며, 이는 주로 키나아제 제작물 과다발현에 기초한 것이다. 로 GTPase의 하류 이펙터로서, 이들의 주요 기질은 마이오신 경쇄 및 마이오신 포스파타아제이다. 둘 모두의 키나아제는 미세필라멘트 다발 조립 및 평활근 수축에 연루되어 있다. 여기서, 피브로넥틴에 대한 섬유아세포 유착의 분석에 의하면 ROCK II가 더욱 풍부하지만 그의 활성은 항상 ROCK I보다 낮았다. siRNA에 의한 ROCK I의 특이적 감소는, 지속성 ROCK II 및 구아닌 트라이포스페이트-결합된 RhoA에도 불구하고, 국소 유착 및 스트레스 섬유의 손실로 이어진다. 이와는 대조적으로, 미세필라멘트 세포골격(cytoskeleton)은 ROCK II 하향-조절에 의해 향상되었다. 피브로넥틴-코팅된 비드의 식세포 작용에 의한 흡수(phagocytic uptake)는 ROCK II-고갈된 세포에서는 강하게 하향 조절되었지만 ROCK I이 결여된 것에서는 그렇지 않았다. 이들 효과는 부분적으로는 ROCK 플렉스트린(pleckstrin) 상동 도메인의 특유한 지질-결합 선호에서 생긴 것이었다. ROCK II는 포스파티딜이노시톨 3,4,5P₃에 결합하였으며, 그의 수준에 민감하였는데, 이 특성들은 ROCK I에 의해 공유되지 않았다. 따라서, 내인성 ROCK류는 특유하게 조절되며 이는 다시 상이한 마이오신 구획들과 관계가 있다."고 진술한다.

다른 예에서, 문헌[Harb et al., PloS ONE 3(8): e3001. oi:10.1371/journal.pone.0003001, August 2008]에는 생쥐 및 인간 ES 세포 둘 모두에서 기본적인 세포-세포 소통의 조절에 있어서 로-Rock-마이오신 시그널링 축의 필수적인 역할을 개시하며 이는 인간 만능 줄기 세포를 위한 의학적으로 양립가능한 제노-프리(xeno-free) 환경의 진보에 기여할 것이다.

이종 재료의 사용은 만능 줄기 세포를 이용하는 소정의 응용에 부적당할 수 있다. 대안적인 재료가 사용될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Stojkovic et al., Stem Cells 23:895-902, 2005]에는 분화 없이 인간 ES 세포를 영양 세포 없이 배양하기 전에 고형 기재 표면을 처리함에 있어서 인간 혈청을 사용하는 것이 개시되어 있다.

대안적인 배양 시스템은 ES 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다.

예를 들어, 천(Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870; 19 Oct 2005]은 ES 세포 자가-재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체 배지에서 ES 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무-혈청 배양 시스템을 개시한다.

다른 예에서, 레벤스타인(Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)로 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 ES 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며 적어도 약 100 ng/㎖의 FGF 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 FGF를 함유하며, 여기서 상기 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는 데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는 데 필요한 양의 염기성 FGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.

다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시 형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다."고 진술한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는(바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."고 진술한다.

추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 염기성 섬유아세포 성장 인자; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호는 미분화 줄기 세포의 유지 방법을 개시하며, 상기 방법은 원하는 결과를 성취하기에 충분한 시간 동안 미분화 상태의 세포를 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타(transforming growth factor-beta, TGFβ) 패밀리 단백질의 구성원, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 패밀리 단백질의 구성원, 또는 니코틴아미드(NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.

만능 줄기 세포는 연구 및 약물 스크리닝을 위한 잠재적인 자원을 제공한다. 현재, 인간 ES 세포주의 대규모 배양은 문제가 있으며, 상당한 난제를 제공한다. 이들 난제에 대한 가능한 해법은 인간 ES 세포를 단일 세포로서 계대 및 배양하는 것이다. 단일 세포는 예를 들어 계수, 트랜스펙션(transfection) 등과 같은 표준 조직 배양 기술에 더욱 기꺼이 따른다.

예를 들어, 니콜라스(Nicolas) 등은 렌티바이러스(lentivirus) 벡터에 의한 유전자 변형 이후 형광-활성화 세포 분류에 의해 단리된 단일 세포로부터 인간 ES 세포주를 생성 및 확장시키는 방법을 제공한다 (문헌[Stem Cells Dev. 16:109-118, 2007]).

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제2005158852호에는 "단일 인간 배아 줄기 세포의 성장 및 생존을 개선시키는" 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 단일 미분화 hES 세포를 얻는 단계; 단일 미분화 세포를 세포외 매트릭스와 혼합하여 상기 세포를 둘러싸는 단계; 및 상기 혼합물을 성장 환경에서 영양 배지를 이용하여 영양 세포 상에 접종하는 단계를 포함한다.

다른 예에서, 문헌[Sidhu et al, Stem Cells Dev. 15:61-69, 2006]에는 유세포 분석법에 의해 단일 세포 제제의 분류에 의해 모 주(parent line)인 hES3로부터 유래되는 세 가지 인간 ES 세포 클론, hES 3.1, 3.2 및 3.3를 처음으로 보고하는 것이 기재되어 있다.

그러나, 인간 ES 세포를 단일 세포로서 계대 및 배양하는 것은 유전자 이상 및 만능성의 손실에 이르게 된다. 배양 조건이 유전자 안정성 및 만능성의 유지에서 중요하다. 일반적으로, 인간 ES 세포주의 계대는 수동으로 행해지거나 또는 콜라게나아제, 리버라아제 또는 디스파아제와 같은 효소 에이전트(agent)를 이용하여 행해진다.

예를 들어, 드레이퍼(Draper) 등은 "다섯 가지 독립적인 경우에 세 가지 독립적인 인간 배아 줄기 세포주에서 염색체 17q의 획득을 포함하는 핵형 변화"의 존재를 언급하고 있다 (문헌[Nature Biotechnol. 22:53-54, 2004]).

다른 예에서, 버자드(Buzzard) 등은 "우리는 단지 하나의 핵형 변화 이벤트를 여하튼 탐지하였다. 사용된 배양 방법은, 우리의 방법이 대부분의 다른 군에 의해 사용된 것과 명백히 상이하다면, 우리의 결과와 약간의 관계가 있었을 수 있다. 전형적으로 우리는 파쇄된 피펫의 에지를 이용하여 먼저 콜로니를 절개함으로써 7일 후에 인간 ES 세포를 계대한다. 효소적 또는 화학적 세포 해리 방법은 이 방법에 전혀 포함되지 않는다. 우리는 이것이 우리 수중의 hES(인간 ES) 세포의 상대적인 세포유전학적 탄력성을 설명할 수 있다고 추측한다."고 진술한다 (문헌[Nature Biotechnol. 22:381-382, 2004]).

다른 예에서, 미타리포바(Mitalipova) 등은 "벌크 계대 방법은 배양물에서의 장기간 계대 후 이수성(aneuploid) 세포 집단을 영속시킬 수 있지만, 핵형을 손상시키지 않고서 보다 짧은 기간 동안 (최대 적어도 15회의 계대) 사용될 수 있으며, 장기간 수동 번식 조건 하에서, 이어서 수동 계대 단독보다 더 많은 양의 hES 세포를 필요로 하는 실험에서 한정된 벌크 계대 하에서 hES 세포에서 정상 핵형을 유지할 수 있다."고 진술한다 (문헌[Nature Biotechnol. 23:19-20, 2005]).

다른 예에서, 헹(Heng) 등은 "당해 결과는 두 번째 프로토콜(온화한 피펫팅을 이용한 트립신 처리)이 첫 번째 프로토콜 (스크래칭을 이용한 콜라게나아제 처리)보다 세포 생육성에 훨씬 덜 해롭다. 이는 다시 보다 큰 동결-해동 생존률로 바뀌어졌다."고 진술한다 (문헌[Biotechnology and Applied Biochemistry 47:33-37, 2007]).

다른 예에서, 하세가와(Hasegawa) 등은 "우리는 완전한 해리를 용인하는 hESC 하위주(subline)를 확립하였다. 이들 세포는 높은 재도말 효율과, 또한 높은 클로닝 효율을 나타내며, 상기 세포는 삼배엽층(three germ layers)으로 분화되는 그의 능력을 유지한다."고 진술한다 (문헌[Stem Cells 24:2649-2660, 2006]).

따라서, 영양 세포 및 흡착층의 부재 하에 만능 줄기 세포를 이 세포의 만능성을 유지하면서 배양하는 것을 포함하는, 포유류 세포의 배양을 위한 방법 및 조성물이 상당히 필요하다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 적어도 약 0.5%의 N, 17.2% 이상의 O와 N의 합계 및 적어도 약 13.9도의 접촉각을 가지며, 영양 세포층이 결여되고, 흡착층이 결여된 고형 기재 표면에 세포 부착, 배양, 및 탈리를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 적어도 약 0.5%의 N, 17.2% 이상의 O와 N의 합계 및 적어도 약 13.9도의 접촉각을 가지며, 영양 세포층이 결여되고, 흡착층이 결여된 표면에 세포 부착을 향상시키는 방법을 제공하며, 이 방법은

a. 세포 현탁물을 얻는 단계,

b. 세포 현탁물을 로 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물 및 로 활성을 저해할 수 있는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물로 처리하는 단계, 및

c. 세포 현탁물을 상기 표면에 첨가하여 세포가 부착되게 하는 단계를 포함한다.

일 실시 형태에서, 세포는 표면에의 세포 부착 후 배양으로 유지된다. 다른 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 화합물은 제거된다.

일 실시 형태에서, 세포는 상기 적어도 하나의 화합물의 제거에 의해 표면으로부터 탈리된다.

일 실시 형태에서, 세포 현탁물은 세포 클러스터의 현탁물이다. 다른 실시 형태에서, 세포 현탁물은 단일 세포의 현탁물이다.

일 실시 형태에서, 세포는 만능 줄기 세포이다. 다른 실시 형태에서, 세포는 줄기 세포이다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 적어도 약 0.9%의 N, 22.3% 이상의 O와 N의 합계 및 적어도 약 13.9도의 접촉각을 가지며, 영양 세포층이 결여되고, 흡착층이 결여된 표면에 세포 부착을 향상시키는 방법을 제공하며, 이 방법은

a. 세포 현탁물을 얻는 단계, 및

b. 세포 현탁물을 표면에 첨가하여 세포가 부착되게 하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법 및 조성물은 효율적인 포유류 세포의 배양에 사용될 수 있다.

<도 1>
도 1은 표면 개질 플레이트 2, 3 또는 4 상에서 리버라아제를 이용하여 클러스터로서 2회 계대된 인간 ES 세포주 H1의 세포의 위상차 현미경 사진을 보여준다. 매트리젤™의 1:30의 희석물로 처리된 플레이트, 넝클론 델타(Nunclon Delta)™ 플레이트 상에서 배양된 인간 ES 세포주 H1의 세포의 이미지도 예시되어 있다.
<도 2>
도 2는 표면 개질 플레이트에 인간 ES 세포가 부착하는 것에 대한 10 μM Y-27632의 영향을 보여준다. 이 도면은 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에서 클러스터로서 2회 계대된 인간 ES 세포주 H1의 세포의 위상차 현미경 사진 (4x)을 보여준다. 이어서 세포는 10 μM Y-27632를 포함하는 MEF 조절 배지에서 표면 개질 플레이트 2, 3 또는 4 상에 계대되었다. 세포를 4일 동안 배양한 후 사진을 촬영하였다. Y-27632의 부재 하에 배양된 세포를 대조군으로 포함시켰다.
<도 3>
도 3은 본 발명의 표면 개질 플레이트 상에서 배양된 인간 ES 세포에서의 화합물 처리의 시간 경과에 대한 개략도를 보여준다. 인간 ES 세포주 H1의 세포는 표면 개질 플레이트 3 또는 4 상에서 리버라아제 처리를 이용하여 클러스터로서 4회 계대되고, MEF 조절 배지에서 배양되었다. 세포는 계대한 후 처음 2일 동안 10 μM의 로 키나아제 저해제, Y-27632, 또는 0.5 ng/㎖의 로 저해제 - 세포 투과성 형태의 세포외효소 C3 트랜스퍼라아제 - 를 이용하여 처리되었다. 로 키나아제 저해제, Y-27632로 처리하고 그 후 표면 개질 플레이트 3 상에서 각각의 계대 후 처음 2일 동안 Y-27632로 처리한 세포를 "7s"로 지칭한다. 로 키나아제 저해제, Y-27632로 처리하고 그 후 표면 개질 플레이트 4 상에서 각각의 계대 후 처음 2일 동안 Y-27632로 처리한 세포를 "3s"로 지칭한다. 로 저해제로 2일 동안 처리하고 이어서 각각의 계대 후 로 키나아제 저해제, Y-27632로 처리하고 그 후 표면 개질 플레이트 3 상에서 계대 후 처음 2일 동안 Y-27632로 처리한 세포를 "5s"로 지칭한다. 로 저해제로 2일 동안 처리하고 이어서 각각의 계대 후 로 키나아제 저해제, Y-27632로 2일 동안 처리하고 그 후 표면 개질 플레이트 4 상에서 계대 후 처음 2일 동안 Y-27632로 처리한 세포를 "1s"로 지칭한다.
<도 4>
도 4는 qRT-PCR로 결정할 때, 도 6에 약술된 프로토콜에 따라 처리한 인간 ES 세포에서 만능성 및 분화와 관련된 마커의 발현을 보여준다.
<도 5>
도 5는 계대 4(p4), 계대 9(p9), 및 또한 계대 10, 11, 또는 12(p10, p11, 또는 p12)에서 유세포 분석법에 의해 결정할 때 인간 ES 세포주 H1의 세포에서의 만능성 마커의 발현을 보여준다.
<도 6>
도 6은 표면 개질 플레이트 4 상에서 리버라아제 처리를 이용하여 클러스터로서 연속적으로 계대되고, MEF 조절 배지에서 배양된 인간 ES 세포주 H1의 세포의 면역-형광 이미지를 보여준다. 만능성의 마커와 관련된 단백질의 발현은 표면 개질 플레이트 4 상에서 11회의 계대 동안 배양된 세포에서 탐지되었다. 세포는 각각의 계대 후 2일 동안 10 μM Y-27632로 처리되었다.
<도 7>
도 7은 인간 ES 세포가 표면 개질 플레이트 상에서 배양 후 완성 내배엽을 형성하는 능력을 보여준다. 인간 ES 세포주 H1의 세포는 표면 개질 플레이트 3 또는 4 상에서 리버라아제 처리를 이용하여 클러스터로서 11회 계대되고, MEF 조절 배지에서 배양되었다. 계대 8(p8) 및 또한 계대 10 또는 11(p10-11)에서 세포를 0.5% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A, 및 20ng/㎖ Wnt3a를 포함하는 DMEM:F12 배지로 2일 동안 처리하고, 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A를 포함하는 DMEM:F12 배지로 추가로 3일 동안 처리하였다. 그래프 상의 y-축은 유세포 분석법에 의해 얻어지는 양성 CXCR4 세포의 퍼센트를 보여준다. 표 5를 또한 참조하라.
<도 8>
도 8은 인간 ES 세포가 표면 개질 플레이트 상에서 배양 후 췌장 내배엽을 형성하는 능력을 보여준다. 인간 ES 세포주 H1의 세포는 표면 개질 플레이트 3 또는 4 상에서 리버라아제 처리를 이용하여 클러스터로서 8회 계대되고, MEF 조절 배지에서 배양되었다. 계대 8(p8)에서 세포를 0.5% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A, 및 20 ng/㎖ Wnt3a를 포함하는 DMEM:F12 배지로 2일 동안 처리함으로써 완성 내배엽으로 분화시키고, 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A를 포함하는 DMEM:F12 배지로 추가로 3일 동안 처리하였다. 이어서 세포를 2% FBS, 100 ng/㎖ FGF-10, 및 1 μM 사이클로파민-KAAD를 포함하는 DMEM:F12 배지로 4일간 처리하여 배아 전장(embryonic foregut)으로 추가로 분화시켰다. 이어서 세포를 1% B-27, 100 ng/㎖ FGF-10, 1 μM 사이클로파민-KAAD 및 2 μM 레틴산을 포함하는 DMEM:F12 배지로 4일간 처리하여 췌장 내배엽으로 분화시켰다. 세포를 PDX-1 (녹색) 및 E-카드헤린 (적색)에 대하여 면역형광에 의해 염색하고, 총 세포수를 훽스트(Hoechst) 염료 (청색)로 확인하였다.
<도 9>
도 9는 표면 개질 플레이트 상에서 배양된 인간 ES 세포가 배양체(embryoid bodies)를 형성하는 능력을 보여준다.
<도 10>
도 10은 표면 개질 플레이트 4 상에서 배양된 인간 ES 세포의 핵형을 보여준다.
<도 11>
도 11은 표면 개질 플레이트에 인간 ES 세포가 부착하는 것에 대한 로 키나아제 저해제 (이엠디 바이오사이언시즈(EMD biosciences)로부터의 Y-27632, 시그마(Sigma)로부터의 Y-27632, 파수딜, 및 하이드록시파수딜)를 이용한 처리의 영향을 보여준다. 세포는 나타낸 화합물을 열거된 농도로 포함하는 배지에서 3일 동안 배양되었다. 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 이미지를 촬영하였다.
<도 12>
도 12는 표면 개질 플레이트에 인간 ES 세포가 부착하는 것에 대한 Y-27632의 용량-응답성을 보여준다. 다양한 농도의 로 키나아제 저해제, Y-27632를 특정 농도로 (0, 1, 2, 4, 또는 10 μM Y-27632) 첫 날 동안 배양물에 첨가하였다. 이어서 세포를 2일째 이후로부터 10 μM Y-27632를 포함하는 배지에서 유지하였으며, 이때 5일 동안 매일 배지를 교환하였다. 배지를 5일째에 플레이트로부터 제거하고, 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 촬영하였다.
<도 13>
도 13은 10 μM Y-27632의 존재 또는 부재 하에 표면 개질 플레이트 2, 3 또는 4 상에서의 계대 4일 후 인간 ES 세포 콜로니의 형성을 보여준다.
<도 14>
도 14는 10 μM Y-27632의 존재 또는 부재 하에 매트리젤™ 처리된 플레이트 상에서의 계대 4일 후 인간 ES 세포 콜로니의 형성을 보여준다.
<도 15>
도 15는 표면 개질 플레이트에의 세포의 부착시에 인간 ES 세포를 Y-27632로 계속적으로 처리하는 것과 간헐적으로 처리하는 것 사이의 차이를 보여준다.
<도 16>
도 16은 단일 세포로 계대되고, (B)를 포함하거나 또는 (A) 10 μM Y-27632가 없는 MEF 조절 배지에서 표면 개질 플레이트 3에 접종한 인간 ES 세포주 H9 유래의 세포의 이미지를 나타낸다. 이미지는 접종한지 24시간 후에 촬영하였다.
<도 17>
도 17은 트립엘이(TrypLE)™ 익스프레스(Express)를 사용하여 5회의 계대에 있어서 단일 세포로서 계대하고, 10 μM의 Y-27632 (Y)의 존재 또는 부재 하에 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에 도말한 인간 ES 세포주 H9 유래의 세포에서 만능성과 관련된 마커들의 발현을 도시한다. 만능성 마커들은 x-축 상에 열거되어 있으며, 양성 세포의 백분율은 y-축 상에 도시되어 있다.
<도 18>
도 18은 단일 세포로서 계대하고, 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에 도말한 인간 ES 세포주 H9 유래의 세포의 총 세포수를 도시한다. 세포수에 대한 10 μM의 Y-27632 (Y)의 영향을 매트리젤™ 상에 계대한 세포 (나이브(

), N), 및 표면 개질 플레이트 상에 10회 계대한 세포 (순응(acclimated), A)에서 조사하였다. 상이한 세포 조건들이 x-축 상에 열거되어 있으며, 세포수를 10⁴로 나눈 것이 y-축 상에 예시되어 있다.
<도 19>
도 19는 연구 이전에 매트리젤™ 처리된 플레이트 상에 단일 세포로서 계대된 인간 ES 세포주 H9 유래의 세포의 성장 속도를 도시한다. 세포는 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에 10 μM의 Y-27632를 포함하거나 포함하지 않는 MEF 조절 배지에서 10⁴/㎠로 접종하여 배양하였다. y-축은 접종한지 2일, 3일 또는 4일 후 수집된 세포수 (10⁴로 나눔)를 보여준다.
<도 20>
도 20은 연구 이전에 표면 개질 플레이트 상에 10회의 계대에 있어서 단일 세포로서 계대된 인간 ES 세포주 H9 유래의 세포의 성장 속도를 도시한다. 세포는 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에 10 μM의 Y-27632를 포함하거나 포함하지 않는 MEF 조절 배지에서 10⁴/㎠로 접종하여 배양하였다. y-축은 접종한지 2일, 3일 또는 4일 후 수집된 세포수 (10⁴로 나눔)를 보여준다.
<도 21>
도 21은 단일 세포로 계대되고, 표면 개질 플레이트 2-4 및 13 상에 96-웰 포맷으로 접종된 인간 ES 세포주 H9 유래의 세포의 이미지를 나타낸다. MEF 조절 배지는 10 μM의 Y-27632를 포함하였다. 이미지를 접종한지 48시간 후에 촬영하였다.
<도 22>
도 22는 단일 세포로서 계대되고, 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에 접종된 인간 ES 세포주 H9 유래의 세포가 완성 내배엽으로 분화되는 능력을 보여준다. 완성 내배엽 형성 정도는 유세포 분석법에 의해 CXCR 발현을 측정함으로써 결정하였다. 완성 내배엽 형성에 대한 10 μM Y-27632의 영향을 연구하였다. 세포를 확장 동안 Y-27632로 처리하였다. 매트리젤™ 상에서 확장 및 분화시킨 세포를 대조군으로 포함시켰다. y-축은 유세포 분석법에 의해 얻어지는 양성 CXCR4 세포의 퍼센트를 보여준다.
<도 23>
도 23은 단일 세포로서 계대되고, 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에 접종된 인간 ES 세포주 H9 유래의 세포가 췌장 내배엽으로 분화되는 능력을 보여준다. 세포를 표면 개질 플레이트 상에 도말하고, 10 μM Y-27632를 포함하는 MEF 조절 배지에서 배양하고, 표면 개질 플레이트 상에 8회 계대한 후 분화시켰다. y-축은 후부 전장 단계(posterior foregut stage) (PF) 및 호르몬 발현 내분비 세포 단계(hormone expressing endocrine cell stage) (EN)에서 q-PCR에 의한 췌장 분화 마커 발현((Ngn3, Pdx1, 인슐린(Insulin))의 증가 배수를 보여준다.
<도 24>
도 24는 표면 개질 플레이트에 인간 ES 세포가 부착하는 것을 보여준다. 계대 50의 H9 인간 ES 세포를 표면 3 및 4, 셀바인드™, 및 프리마리아™ 상에 1:2의 희석비로 도말하였다. 배지를 도말한지 24시간 후에 플레이트로부터 제거하고, 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 촬영하였다. 화살표는 콜로니를 나타낸다.
<도 25>
도 25는 표면 개질 플레이트에 인간 ES 세포가 부착하는 것을 보여준다. 다양한 농도의 Y-27632 (0, 1, 2, 4, 10 및 20 마이크로몰)의 존재 하에 계대 50의 H9 인간 ES 세포를 표면 3 및 4, 셀바인드™, 및 프리마리아™ 상에 1:2의 희석비로 도말하였다. 배지를 도말한지 24시간 후에 플레이트로부터 제거하고, 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 촬영하였다. 콜로니는 웰 상에서 짙은 반점(spot)이다. 화살표는 미처리 웰 상의 콜로니를 강조하기 위하여 사용된다.
<도 26>
도 26은 표면 개질 플레이트에 인간 ES 세포가 부착하는 것을 보여준다. 계대 53의 H9 인간 ES 세포를 Y-27632 (0 또는 20 마이크로몰)의 부재 또는 존재 하에 표면 2-4 및 13, 셀바인드™, 및 프리마리아™ 상에 1:3의 희석비로 도말하였다. 배지를 도말한지 48시간 후에 플레이트로부터 제거하고, 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 촬영하였다. 콜로니는 웰 상에서 짙은 반점이다. 화살표는 미처리 웰 상의 콜로니를 강조하기 위하여 사용된다.
<도 27>
도 27은 인간 H9 ES 세포를 표면 개질 플레이트 14 및 15에 부착시키기 위한 첫 번째 시도 (10월) 및 두 번째 시도 (12월)와, 인간 H1 ES 세포를 표면 개질 플레이트 14 및 15에 부착시키기 위한 시도를 보여준다. 계대 42 및 계대 53의 H9 인간 ES, 및 계대 57의 H1 인간 ES 세포를 20 마이크로몰의 Y-27632의 존재 하에서 1:2 또는 1:3의 희석비로 개질된 표면에 도말하였다. 도말한지 24-48시간 후에 배지를 플레이트로부터 제거하고, 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 촬영하였다. 콜로니는 웰 상에서 짙은 반점이다. 화살표는 플레이트 상의 콜로니를 강조하기 위하여 사용된다.
<도 28>
도 28은 규명 배지, mTeSR™ 중에서 인간 ES 세포의 표면 개질 플레이트 4에의 부착을 보여준다. 계대 50의 H9 인간 ES 세포를 미처리되거나 단백질 (0.1% 젤라틴, 2% BSA, 0.34 ㎎/㎖의 쥐 콜라겐 I, 1:1000으로 희석된 매트리젤™, 또는 1:5000으로 희석된 매트리젤™)로 처리된 웰에서 Y-27632의 부재 또는 존재 하에서 (0 또는 20 마이크로몰) 개질된 표면에 1:2의 희석비로 도말하였다. 배지를 도말한지 48시간 후에 플레이트로부터 제거하고, 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 촬영하였다. 콜로니는 웰 상에서 짙은 반점이다.
<도 29>
도 29는 정적 세실 드롭법(static sessile drop method)을 사용하여 11주에 걸쳐 측정한 표면 개질 플레이트의 물 접촉각을 보여준다. 첫 번째 측정은 표면 처리 및 살균한지 1주일 후에 행하였다. 각각의 데이터점은 평균 접촉각을 나타낸다 (7개의 드롭 각각에서 1회의 측정). 누클론 델타™ 및 셀바인드™플레이트 상에서의 접촉각은 표면 1-4 및 13과 동일한 실험 조건 하에 측정되었지만, 표면 처리 및 살균은 첫 번째 측정 12주 전보다 더 이전에 행해졌다 (누클론 델타™ *는 첫 번째 측정 1주 전에 살균됨).
<도 30>
도 30은 양으로 하전된 크리스탈 바이올렛과의 표면의 반응성으로 측정된 표면 개질 플레이트 상에서의 음전하의 밀도를 보여준다. 각각의 표면의 3개의 샘플을 시험하였으며, 각각의 샘플로부터 탈착된 크리스탈 바이올렛의 흡광도 측정을 삼중으로 수행하였다. 9개의 측정치의 평균 및 표준 편차가 주어져 있다.
<도 31>
도 31은 화학적으로 규명된 무혈청 Pro293a-CDM™ 배지 (A) 또는 10% 소 태아 혈청이 보충된 EMEM 배지 (B)에서의 HEK293 세포의 부착 및 성장에 대한 Y-27632 및 고형 기재 표면의 영향을 보여준다. HEK293 세포는 셀바인드™ 표면, 넝클론 델타™ 표면 또는 표면 4를 갖는 96-웰 플레이트에 접종되었다. 이들 표면에 부착되는 HEK293 세포의 수는 배양 조건 및 Y-27632의 함수로서 예시된다. 세포는 (i) 배양에서 Y-27632를 이용한 96시간 동안의 계속적인 처리 (Y-27632 96h on); 또는 (ii) 배양에서 Y-27632를 이용한 48시간 동안의 계속적인 처리, 이어서 배지 교환 및 그 후 배양에서 Y-27632 없이 48시간 (Y-27632 48h on/48h off) 중 어느 하나를 받았다. 배지 중에 Y-27632 없이 배양된 HEK293 세포 (No Y-27632)는 Y-27632를 이용하여 배양된 세포와 동일한 방식으로 취급되었다 - 즉, 배지 교환 없이 96시간, 또는 48시간 후 배지 교환 - . Y-27632는 2.0 및 5.0 μM의 농도로 적용될 때 표면 4 및 셀바인드™ 표면 상에서의 HEK293 세포의 부착을 향상시켰다. 48시간의 인큐베이션 후 Y-27632를 제거하면 유의한 개수의 세포가 표면 4 및 셀바인드™ 표면으로부터 탈리되었다. 3개의 측정치의 평균 및 표준 편차가 예시되어 있다.
<도 32>
도 32는 10% 소 태아 혈청으로 보충된 EMEM 배지에서의 HEK293 세포의 성장에 대한 고형 기재 표면과 로 키나아제 저해제인 Y-27632 및 H-1152의 영향을 보여준다. HEK293 세포는 표면 4 (A) 또는 비-처리된 (그러나 감마선 조사됨; 25 kGy) 폴리스티렌 표면 (B) 중 어느 하나를 갖는 멀티디쉬(Multidish) 24-웰 플레이트에 접종되었다.
<도 33>
도 33은 HEK293-세포 부착 및 형태에 대한 H-1152 및 표면 4의 영향을 보여준다. HEK293 세포는 멀티디쉬 12-웰 플레이트에 10% 소 태아 혈청 및 H-1152로 보충된 EMEM 배지에 접종되었으며, 인큐베이터 내장형 자동 현미경(automated, in-incubator microscope)에서 67시간 동안 인큐베이션하였다. A에서의 성장 곡선 및 B에서의 현미경 사진은 표면 4 상에서의 HEK293 세포의 부착 및 성장에 대한 H-1152의 일반적인 영향, 및 H-1152의 존재 또는 부재 하에 표면 4 상에서의 HEK293 세포의 부착 및 형태에 대한 배지 교환의 영향을 보여준다.
<도 34>
도 34는 2.5 μM Y-27632의 부재 또는 존재 하에 표면 4 및 넝클론 델타™ 표면 상에서 성장시킨 HEK293 세포에 있어서 3회 계대에 걸친 성장 곡선을 보여준다. 10% 소 태아 혈청으로 보충된 EMEM 배지 중 HEK293 세포를 트립신 처리에 의해 3회 계대하였다.
<도 35>
도 35는 표면 개질 플레이트 4, 18 및 19와, 프리마리아™에 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포가 부착하는 것에 대한 로 키나아제 저해의 영향을 보여준다. 웰 A 및 B는 모든 표면 상에서의 대조 웰이었다. 웰 C 및 D는 10 μM Y-27632를 포함하였다. 웰 E 및 F는 3 μM H1152-글리실을 포함하였다. 웰 G 및 H는 10 μM H1152-글리실을 포함하였다.
<도 36>
도 36은 표면 개질 플레이트 30에 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포가 부착하는 것에 대한 로 키나아제 저해의 영향을 보여준다. (--) = 처리하지 않음. (RI) = 3 μM H1152-글리실. (MG) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층. (MG+RI) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층 + 3 μM H1152-글리실.
<도 37>
도 37은 표면 개질 플레이트 31에 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포가 부착하는 것에 대한 로 키나아제 저해의 영향을 보여준다. (--) = 처리하지 않음. (RI) = 3 μM H1152-글리실. (MG) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층. (MG+RI) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층 + 3 μM H1152-글리실.
<도 38>
도 38은 표면 개질 플레이트 32에 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포가 부착하는 것에 대한 로 키나아제 저해의 영향을 보여준다. (--) = 처리하지 않음. (RI) = 3 μM H1152-글리실. (MG) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층. (MG+RI) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층 + 3 μM H1152-글리실.
<도 39>
도 39는 표면 개질 플레이트 33에 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포가 부착하는 것에 대한 로 키나아제 저해의 영향을 보여준다. (--) = 처리하지 않음. (RI) = 3 μM H1152-글리실. (MG) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층. (MG+RI) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층 + 3 μM H1152-글리실.
<도 40>
도 40은 표면 개질 플레이트 34에 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포가 부착하는 것에 대한 로 키나아제 저해의 영향을 보여준다. (--) = 처리하지 않음. (RI) = 3 μM H1152-글리실. (MG) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층. (MG+RI) = 1:30 희석비의 매트리젤의 흡착층 + 3 μM H1152-글리실.
<도 41>
도 41은 정적 세실 드롭법을 사용하여 40주에 걸쳐 측정한 표면 개질 플레이트의 물 접촉각을 보여준다.
<도 42>
도 42는 정적 세실 드롭법을 사용한 표면 개질 플레이트의 물 접촉각을 보여준다.
<도 43>
도 43은 양으로 하전된 크리스탈 바이올렛과의 표면의 반응성으로 측정된 표면 개질 플레이트 상에서의 음전하의 밀도를 보여준다.
<도 44>
도 44는 양으로 하전된 크리스탈 바이올렛과의 표면의 반응성으로 측정된 표면 개질 플레이트 4, 22-24 및 29 상에서의 음전하의 밀도를 보여준다. 각각의 표면의 3개의 샘플을 시험하였으며, 각각의 샘플로부터 탈착된 크리스탈 바이올렛의 흡광도 측정을 삼중으로 수행하였다. 표면 4, 22-24 및 29의 음전하 밀도를 넝클론 델타™ 표면의 음전하 밀도에 대하여 정상화시켰다. 9개의 측정치의 평균 및 표준 편차가 주어져 있다.

개시 내용의 명확함을 위하여, 그리고 제한하지 않고서, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정의 특징, 실시 형태, 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.

정의

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "흡착층"은 공유 (그래프팅으로도 공지됨) 또는 비-공유 (흡착으로도 공지됨) 결합 중 어느 하나에 의해 표면에 분자를 부착시킴으로써 고형 기재의 표면 상에 형성되는 층을 말한다. 예를 들어, 흡착층을 만드는 데 사용되는 분자는 예를 들어 세포외 매트릭스 단백질, 아미노산 등을 포함할 수 있는 단백질성 분자, 및 예를 들어 폴리에틸렌이민과 같은 비-생물 분자일 수 있다.

"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1 및 하기 전사 인자들 중 적어도 하나에 대해 양성 유전자 발현을 갖는 세포를 말한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, 노달(Nodal), FGF-8, 브라키우리(Brachyury), Mix-유사 호메오박스 단백질(Mix-like homeobox protein), FGF-4 CD48, 에오메소데르민 (eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF-17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "완성 내배엽"은 낭배형성동안 상배엽으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하며 위장관 및 그 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: CXCR4, HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드(goosecoid), c-Kit, CD99, 및 Mixl1.

"세포외 매트릭스 단백질"은 체내 또는 태반에서 세포들 사이에서 보통 발견되는 단백질성 분자를 말한다. 세포외 매트릭스 단백질은 조직, 체액, 예를 들어 혈액, 또는 비-재조합 세포 또는 재조합 세포 또는 박테리아로 조절된 배지로부터 유래될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "배아외 내배엽"은 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 및 SPARC.

"HEK293 세포"는 문헌[Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977]에 기재된 바와 같이 정상 인간 배아 신장 세포의 배양물의 형질전환에 의해 생성된 세포주, 및 이 모 세포주로부터 유래되는 임의의 세포를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 관심있는 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 관심있는 세포는 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 식별되고 구별될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "매트릭스"는 세포가 부착될 수 있는 3차원 지지체를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소데르민 (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF-17, GATA-6.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포", 또는 ,"췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전(pre)-원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달, 또는 FGF-8.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질 또는 FGF-4.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "표면"은 세포 배양 또는 분석에서 사용하려고 하는 고형 기재 용기 또는 매트릭스의 분자의 최외층을 말한다. 표면의 원소 조성, 조도(roughness) 및 습윤성은 각각 X-선 광전자 분광법(X-Ray Photoelectron Spectroscopy, XPS), 원자력 현미경법(Atomic Force Microscopy, AFM), 및 접촉각 측정에 의해 분석될 수 있다.

"표면 개질 플레이트"는 실시예 16, 실시예 17 및 실시예 26에 설명된, 표면 1-34 중 임의의 하나를 포함하는 용기, 또는 상표명 넝클론 델타™, 코스타(Costar) ™, 팔콘(Falcon)™, 셀바인드(CellBIND)™, 및 프리마리아™로 판매되는, 표면을 포함하는 플레이트를 말한다. 용기는, 예를 들어 중합체, 예컨대 폴리스티렌(PS), 환형 올레핀 공중합체(COC), 폴리카르보네이트(PC), 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA), 또는 스티렌 아크릴로니트릴 공중합체(SAN)로 만들어질 수 있다.

줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가-재생하고 분화하여 자가-재생 조상세포(progenitors), 비-재생 조상세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cells)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서(in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.

줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (i) 모든 배아 및 배아외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (ii) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (iii) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (iv) 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 v) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.

분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화할 것이며 정상 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(dedifferentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통-특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.

다양한 용어가 배양 중인 세포를 설명하기 위하여 사용된다. "유지"는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 성장 배지에 세포를 두는 것을 말하며, 이는 보다 큰 세포 집단으로 이어질 수도 있고 이어지지 않을 수도 있다. "계대"는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 세포를 하나의 배양 용기로부터 꺼내어 이 세포를 제2 배양 용기에 두는 과정을 말한다.

세포의 특정 집단, 또는 세포주는 때로는 그가 계대된 횟수를 말하거나 또는 상기 횟수에 의해 특성화된다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단은 P10 배양물로서 지칭될 수 있다. 일차 배양물, 즉 조직으로부터의 세포의 단리 후 첫 번째 배양물은 P0으로 표기된다. 첫 번째 계대배양(subculture) 후, 세포를 2차 배양물(P1 또는 계대 1)로서 기재한다. 두 번째의 계대배양 후, 세포는 3차 배양물(P2 또는 계대 2)이 되며, 기타 등등이다. 당업자라면 계대 기간 동안 많은 집단의 배가가 있을 수 있으며, 따라서 배양물의 집단 배가 수는 계대 수보다 크다는 것을 이해할 것이다. 계대 사이의 기간 동안 세포의 확장(즉, 집단 배가 수)은 접종 밀도, 기질, 배지, 성장 조건, 및 계대 사이의 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 의존적이다.

a. 세포 현탁물을 얻는 단계, 및

a. 세포 현탁물을 얻는 단계,

c. 세포 현탁물을 표면에 첨가하여 세포가 부착되게 하는 단계를 포함한다.

일 실시 형태에서, 표면은 흡착층을 갖는다. 일 실시 형태에서, 흡착층은 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시 형태에서, 흡착층은 매트리젤 (벡톤 디켄슨)로 만들어진다. 매트리젤은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈 스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다. 단백질성 흡착층은 또한 단독의 또는 다양하게 조합된 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등으로부터 형성될 수 있다.

일 실시 형태에서, 세포는 표면에의 세포 부착 후 배양으로 유지된다. 다른 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 화합물은 표면에의 세포 부착 후 제거된다. 일 실시 형태에서, 세포는 상기 적어도 하나의 화합물의 제거에 의해 표면으로부터 제거된다.

일 실시 형태에서, 세포 현탁물은 로 키나아제 활성을 저해할 수 있는 적어도 하나의 화합물로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 세포 현탁물은 로 활성을 저해할 수 있는 적어도 하나의 화합물로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 세포 현탁물은 로 키나아제 활성을 저해할 수 있는 적어도 하나의 화합물 및 로 활성을 저해할 수 있는 적어도 하나의 화합물로 처리된다.

로 키나아제 활성을 저해할 수 있는 상기 적어도 하나의 화합물은 Y-27632, 파수딜, 및 하이드록시파수딜로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시 형태에서, 로 키나아제 활성을 저해할 수 있는 상기 적어도 하나의 화합물은 Y-27632이다.

로 키나아제 활성을 저해할 수 있는 상기 적어도 하나의 화합물은 약 0.1 μM 내지 약 100 μM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 로 키나아제 활성을 저해할 수 있는 상기 적어도 하나의 화합물은 약 10 μM의 농도로 사용된다.

일 실시 형태에서, 로 활성을 저해할 수 있는 상기 적어도 하나의 화합물은 로 GTPase 저해제이다.

일 실시 형태에서, 로 활성을 저해할 수 있는 상기 적어도 하나의 화합물은 세포외효소 C3 트랜스퍼라아제이다.

로 활성을 저해할 수 있는 상기 적어도 하나의 화합물은 약 0.01㎍/㎖ 내지 약 5㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 로 활성을 저해할 수 있는 상기 적어도 하나의 화합물은 약 0.5 ㎍/㎖의 농도로 사용된다.

표면 개질 플레이트

본 발명에서 사용하기에 적합한 표면 개질 플레이트는 그의 표면이 적어도 약 0.5%의 N, 17.2% 이상의 O와 N의 합계 및 적어도 약 13.9도의 접촉각을 가지도록 개질된 용기일 수 있다. 대안적으로, 표면은 3차원 매트릭스, 예를 들어 다공성 지지체 - 여기에 세포가 부착될 수 있음 - 일 수 있다.

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트는 표면이 적어도 약 0.5%의 N, 17.2% 이상의 O와 N의 합계 및 적어도 약 13.9도의 접촉각을 갖는 플레이트를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트는 표면이 적어도 약 0.5%의 N, 19.5% 이상의 O와 N의 합계 및 적어도 약 13.9도의 접촉각을 갖는 플레이트를 포함한다.

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트는 표면이 적어도 약 1.3%의 N, 적어도 약 24.9%의 O와 N의 합계 및 적어도 약 20.7도의 접촉각을 갖는 플레이트를 포함하며, 이는 본 명세서에서 표면 개질 플레이트 1로 지칭된다.

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트는 표면이 적어도 약 1.7%의 N, 적어도 약 29.6%의 O와 N의 합계 및 적어도 약 14.3도의 접촉각을 갖는 플레이트를 포함하며, 이는 본 명세서에서 표면 개질 플레이트 2로 지칭된다.

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트는 표면이 적어도 약 2.0%의 N, 적어도 약 30.7%의 O와 N의 합계 및 적어도 약 18.4도의 접촉각을 갖는 플레이트를 포함하며, 이는 본 명세서에서 표면 개질 플레이트 3으로 지칭된다.

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트는 표면이 적어도 약 2.1%의 N, 적어도 약 30.2%의 O와 N의 합계 및 적어도 약 17.4도의 접촉각을 갖는 플레이트를 포함하며, 이는 본 명세서에서 표면 개질 플레이트 4로 지칭된다.

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트는 표면이 적어도 약 1.8%의 N, 적어도 약 28.2%의 O와 N의 합계 및 적어도 약 18.8도의 접촉각을 갖는 플레이트를 포함하며, 이는 본 명세서에서 표면 개질 플레이트 13으로 지칭된다.

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트는 표면이 적어도 약 1.0%의 N, 적어도 약 27.8%의 O와 N의 합계 및 적어도 약 44.3도의 접촉각을 갖는 플레이트를 포함하며, 이는 상표명 셀바인드로 판매된다.

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트는 표면이 적어도 약 10.2%의 N, 적어도 약 23.0%의 O와 N의 합계 및 적어도 약 39.5도의 접촉각을 갖는 플레이트를 포함하며, 이는 상표명 프리마리아로 판매된다.

표면 개질 플레이트의 특성화

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트의 표면의 원소 조성은 X-선 광전자 분광법(XPS)에 의해 분석될 수 있다. 화학분석용 전자 분광법(Electron Spectroscopy for Chemical Analysis, ESCA)으로도 공지된 XPS는 어떤 원소가 고형 기재 표면에 존재하는지를 결정하고 (수소 및 헬륨을 제외한, 0.1 원자 퍼센트 미만의 농도의 모든 원소가 검출될 수 있음), 그러한 원소 또는 원자의 결합 환경을 결정하기 위한 방법으로서 사용된다. 일례로서, 폴리스티렌 (단지 탄소 및 수소를 포함함) 고형 샘플의 분석에 의하면 전형적으로 97% 초과의 탄소, 3% 미만의 산소, 및 0%의 질소 (수소는 검출되지 않으며; 상이한 수준의 산소가 표면에서의 폴리스티렌 사슬의 산화로 인하여 검출될 수 있음 - 예를 들어, 조사에 의한 살균의 결과로서 - )가 제공된다 (문헌[Brevig et al., Biomaterials 26:3039-3053, 2005; Shen and Horbett, J. Biomed. Mater. Res. 57:336-345, 2001]).

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트의 표면의 조도는 원자력 현미경법(AFM)에 의해 분석될 수 있다. 1Å까지의 측면 해상도 및 0.1Å까지의 수직 해상도를 갖는 표면 원자 또는 분자는 AFM에 의해 이미지화될 수 있다.

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트의 표면의 습윤성은 접촉각의 측정에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 정적 세실 드롭법에 의한 접촉각 측정은 고형 기재 표면과 액체 사이의 상호작용에 대한 정보를 제공한다. 접촉각은 고형 기재의 표면 상에 있는 액체 드롭의 형상을 설명하며, 고형 기재의 표면 상의 액체의 접촉각이고, 이는 액체, 고체 및 기체가 만나는 접촉 라인에서 액체 내에서 측정된다. 물 접촉각이 90°보다 큰 표면은 소수성이라고 하며, 물 접촉각이 90°보다 작은 표면은 친수성이라고 한다. 극도로 친수성인 표면, 즉 물에 대한 친화도가 높은 표면 상에서, 물 소적은 완전히 퍼지게 된다 (0°의 유효 접촉각).

일 실시 형태에서, 표면 개질 플레이트의 표면의 음전하 밀도는 이 표면의 크리스탈 바이올렛과의 반응성을 측정함으로써 분석될 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 양전하를 지니는데, 상기 양전하는 크리스탈 바이올렛이 음으로 하전된 분자 및 분자의 부분, 예를 들어 중합체 표면 상에 존재하는 음으로 하전된 작용기에 결합하는 것을 가능하게 한다. 높은 크리스탈 바이올렛 반응성을 갖는 표면과 낮은 크리스탈 바이올렛 반응성을 갖는 표면이 동일한 조도 및 그에 따라 동일한 면적을 갖는다면, 높은 크리스탈 바이올렛 반응성을 갖는 표면은 낮은 크리스탈 바이올렛 반응성을 갖는 표면보다 더 높은 밀도의 음전하를 갖는다.

만능 줄기 세포

만능 줄기 세포의 특성화

만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson 등., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, Oct-4 및 TERT를 발현한다.

번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배양체의 형성 및 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정할 수 있다.

번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.

만능 줄기 세포의 공급원

사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 인간 ES 세포 또는 인간 배아 배 세포의 확립된 주, 예를 들어, 인간 ES 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 그러한 세포의 초기 확립 또는 안정화 동안 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단과, 영양 세포의 존재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 ES 세포주, 예를 들어, BG01v (미국 조지아주 아텐스 소재의 브레사젠(BresaGen))가 또한 적합하다. 성인 체세포, 예를 들어 문헌[Takahashi et al, Cell 131: 1-12 (2007)]에 개시된 세포로부터 유래된 세포가 또한 적합하다.

일 실시 형태에서, 인간 ES 세포는 톰슨 등 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998];문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995])에 개시된 바와 같이 제조된다.

만능 줄기 세포의 배양

일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따른 배양 이전에 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 세포외 매트릭스 단백질 또는 영양 세포의 층 상에서 배양된다. 예를 들어, 만능 줄기 세포는 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 영양 세포 층 상에서 배양된다. 분화 없이 영양 세포 층 상에서의 만능 줄기 세포의 성장은 (i) 영양 세포 층을 포함하는 배양 용기를 얻는 것; 및 (ii) 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지, 또는 비-조절 배지 - 예를 들어, 무혈청 배지 또는 심지어 화학적 규명 배지 - 를 이용하여 지지된다.

다른 예에서, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양 세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 (i) 하나 이상의 세포외 매트릭스 단백질을 포함하는 고형 기재 표면 상의 흡착층; 및 (ii) 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지, 또는 비-조절 배지 - 예를 들어, 무혈청 배지 또는 심지어 화학적 규명 배지 - 를 이용하여 지지된다.

다른 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 적어도 약 0.5% N, 17.2% 이상의 O와 N의 합계 및 적어도 약 13.9도의 접촉각을 갖는 표면 개질 플레이트 상에서, 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지, 또는 비-조절 배지 - 예를 들어, 무혈청 배지 또는 심지어 화학적 규명 배지 - 에서 배양된다.

배양 배지: 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 일례를 미국 특허 출원 공개 제20020072117호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예를 미국 특허 제6642048호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예를 국제특허 공개 WO2005014799호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예를 문헌[Xu et al., Stem Cells 22: 972-980, 2004]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20070010011호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 문헌[Cheon et al., BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870; 19 Oct 2005]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 문헌[Levenstein et al., Stem Cells 24: 568-574, 2006]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20050148070호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20050233446호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 제6800480호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20050244962호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 국제특허 공개 WO2005065354호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 국제특허 공개 WO2005086845호에서 찾아볼 수 있다.

적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), 깁코(Gibco) # 11965-092; 넉아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 # 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마 # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 깁코 # 13256-029로부터 또한 제조될 수 있다.

만능 줄기 세포의 분화

본 발명의 일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 그들의 만능성을 유지하면서 배양에서 번식된다. 시간에 따른 세포의 만능성의 변화는 만능성과 관련된 마커의 발현 수준의 변화를 검출하여 결정할 수 있다. 대안적으로, 만능성의 변화는 분화와 관련된 마커, 또는 다른 세포 유형과 관련된 마커의 발현 수준의 변화를 검출하여 모니터할 수 있다.

다른 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 배양에서 번식되며, 이어서 다른 세포 유형으로의 그 분화를 촉진하는 방식으로 처리된다. 다른 세포 유형은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포 유형은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포 유형은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포 유형은 β-세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 적합한 방법에 의해 다양한 다른 세포 유형으로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 신경 세포, 심장 세포, 간세포 등으로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2007030870호에 개시된 방법에 따라 신경 전구체 및 심근세포로 분화될 수 있다.

다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6,458,589호에 개시된 방법에 따라 간세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D' Amour et al., Nature Biotechnol. 23:1534-1541, 2005]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131: 1651 - 1662, 2004]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25: 29 - 38, 2007]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D' Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, Hnf-3베타, GSC, Cer1, 노달, FGF-8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF-4 CD48, 에오메소데르민(EOMES), DKK4, FGF-17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D' Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 Pdx1, HNF-1베타, PTF1a, HNF-6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.

만능 줄기 세포는 본 기술 분야의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D' Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D' Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006]에 개시된 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.

본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 Pdx1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.

실시예

실시예 1

세포 클러스터로서의 인간 배아 줄기 세포의 계대 및 유지

인간 ES 세포주 H1 및 H9를 처음에 미토마이신 C 불활성화 일차 생쥐 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 상에서 유지하였다. 인간 ES 세포를 반복된 계대에 걸쳐 MEF 영양세포로부터 매트리젤™(미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 벡톤-디킨슨)로 옮겼다.

매트리젤™을 이용한 표면의 처리: 성장 인자 감소된 매트리젤™을 4℃에서 해동시키고, 이어서 냉 DMEM/F12 (미국 캘리포니아 칼스배드 소재의 인비트로젠(Invitrogen))에서 1:30으로 희석시켰다. 표면을 덮기에 충분한 부피를 각각의 6-㎝ 디쉬 (2 ㎖) 또는 6-웰 플레이트의 각각의 웰 (1 ㎖)에 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 처리된 표면을 수시간 내에 사용하거나 최대 2주까지 4℃에서 보관하였다.

인간 ES 세포 배양: 미분화 인간 ES 세포 콜로니 (H9 또는 H1 주 중 어느 하나로부터 유래)는 DMEM/F12 중 1 ㎎/㎖의 콜라게나아제 IV (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에서 10분 동안 인큐베이션하고 이어서 피펫으로 긁어 냄으로써 영양세포층으로부터 수확하였다. 세포 덩어리(clump)를 600 x g에서 4분 동안의 원심분리에 의해 펠렛화하고, 펠렛을 2-㎖ 피펫으로 부드럽게 분산시켜 콜로니를 작은 세포 클러스터로 파괴하였다. bFGF (8 ng/㎖; 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 알앤디 시스템즈(R&D Systems)로 추가로 보충된, 생쥐 배아 섬유아세포로 조절된 배지(MEF-CM)에서 매트리젤™-처리된 디쉬 상에 이들 세포 클러스터를 5 ㎖ 성장 배지 중 6-㎝ 디쉬 당 50-150개의 콜로니로 접종하였다. 배지를 매일 교환하였다. MEF-CM 중 매트리젤™ 상의 콜로니는 커졌으며, 이들이 표면 영역의 70-80%를 점유하였을 때 - 대략 매 3-4일 - 계대하였다. 콜로니 형태의 인간 ES 세포는 핵 대 세포질 비가 높았으며, 뚜렷한 핵인(nucleoli)을 가졌고, 이는 영양세포 상에서 유지된 인간 ES 세포와 유사하였다 (도 1). 분화된 세포는 배양에서 총 세포의 5% 미만을 나타내었다.

매트리젤™ 상에서 MEF-CM 중 세포의 통상적인 계대에 있어서, 세포를 DMEM/F12 중 1 ㎎/㎖의 콜라게나아제 IV에서 최대 60분 동안 인큐베이션하고, 긁어 내면서 DMEM/F12의 힘찬 스트림에 의해 디쉬로부터 제거하였다. 세포를 펠렛화하고, 분산시키고, 1:3 또는 1:4의 비로 접종하였다.

실시예 2

단일 세포로서의 인간 배아 줄기 세포의 계대

라이프스캔 인크.(LifeScan Inc.)에 양도된 미국 특허 출원 제LFS5163USPSP호에 개시된 방법에 따라 세포주 H9의 인간 ES 세포를 단일 세포로서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5분 동안 트립엘이™ 익스프레스를 이용하여 처리함으로써 계대하고, 기질 표면 1 ㎠당 10,000개의 세포로 접종하였다.

실시예 3

세포외 매트릭스 단백질/성분 및 영양 세포가 결여된 표면 개질 플레이트를 사용한 인간 배아 줄기 세포의 부착, 배양 및 만능성의 유지

연구 전에, 성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물로 처리된 넝클론 델타™ 플레이트 상에서 계대 49의 주 H1의 인간 ES 세포를 MEF 조절 배지에서 유지하였다. 1 ㎎/㎖ 콜라게나아제에 의한 해리에 의해 또는 수동적으로 긁어 냄에 의해 계대를 위하여 표면으로부터 세포를 해리시켰다.

이어서 이들 세포를 표면 개질 플레이트(6-웰 포맷)의 2개의 미처리 웰 상에 접종하였다. 부가적으로, 대조군으로서 각각의 플레이트의 하나의 웰을 0.1%의 제노-프리(xeno-free) 인간 젤라틴으로 처리하였다. 또한, 세포를 음성 대조군을 위하여 코스타™(카탈로그 번호 3516; 미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝(Corning)), 팔콘™ (카탈로그 번호 351146; 미국 뉴저지주 프랭클린 레익스 소재의 벡톤 딕킨슨) 및 넝클론 델타™ (카탈로그 번호 140675; 덴마크 로스킬데 소재의 서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)) 6-웰 플레이트의 미처리 및 젤라틴-처리 웰 상에 직접적으로 도말하고, 양성 대조군으로서 제공하기 위하여 세포를 성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물로 처리된 웰 상에 도말하였다. 모든 처리에서 세포를 MEF 조절 배지에서 유지하였다.

2회의 계대 후, 표면 개질 플레이트 2, 3, 및 4에 ES 세포 콜로니가 부착되었으며, 이는 효소적 해리 이후 플레이트에 재부착되어 성장함을 관찰하였다. 표면 개질 플레이트 2, 3 또는 4로부터의 젤라틴 또는 미처리 웰에서의 부착 또는 성장 속도에서 명백한 차이는 없었다.

성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물로 처리된 플레이트로부터 기계적으로 해리시킨 세포는 표면 개질 플레이트 2, 3 및 4에 불량하게 부착되었으며, 반면 1 ㎎/㎖의 콜라게나아제로 효소에 의해 해리시킨 세포는 표면 개질 플레이트 2, 3 또는 4로부터의 젤라틴 또는 미처리 웰에서 잘 부착되었다.

표면 개질 플레이트 1 및 5-12에 첨가된 그리고 미처리 또는 젤라틴 처리 넝클론 델타™ 플레이트, 팔콘™ 플레이트, 및 코스타™ 플레이트에 첨가된 H1p49 ES 세포는 부착되지 않았다. 상기 세포는 성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물로 처리된 플레이트에 부착되었으며, 이는 상기 세포가 기재 표면에 부착되는 능력이 있음을 나타낸다.

성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물 상에 도말된 H1 주의 ES 세포의 정상적인 계대 시간은 3-4일이었지만, 표면 개질 플레이트 2, 3 및 4 상에 도말된 세포는 상기 세포가 계대에 대하여 준비가 되기 전에 배양에 7일이 걸렸다. 이는 아마도 처리된 표면 상에의 부착 속도 감소로 인한 것이었으며, 그 이유는 더 많은 출발 콜로니가 표면 2, 3 및 4 상에서보다 도말 직후 매트리젤™-처리된 표면 상에서 보였기 때문이다.

계대 (p) 50의 세포를 1 대 2의 비로 분주하고 이 샘플의 절반을 RNA 정제를 위하여 수집하고, 만능성 마커의 발현에 대하여 시험하였다 (표 1). 각각의 샘플의 다른 하나의 절반을 표면 개질 플레이트에 재도말하였다. 이 계대 (p51)에서 형성된 콜로니는 또한 상기 콜로니가 계대될 준비가 되기 전에 7일간의 배양을 필요로 하였으며, 단지 4일의 배양 후 발달한 작은 콜로니가 도 1에 예시되어 있다. 이들 콜로니는 고전적인 ES 세포 콜로니 형태를 유지하였다.

표면 개질 플레이트 2, 3 및 4 상에서 계대 4에서 배양을 중단하고, 샘플을 qRT-PCR에 의해 만능성 마커에 대하여 분석하고 (표 2), 완성 내배엽 운명(DE)으로 분화시켰다. 계대 4의 세포는 고전적인 만능성 마커, 즉, Oct4, Nanog, Sox2, 및 TERT의 발현을 유지하였다. 더욱이, 이 세포는 DMEM/F12, 100ng/㎖ 액티빈 A, 20 ng/㎖ Wnt3a, 및 0.5-2.0% FBS를 포함하는 배지에의 노출시에 완성 내배엽 운명으로 분화될 수 있었으며 (표 3), 이는 만능성이 계대 4 내내 세포에서 유지되었음을 나타낸다.

실시예 4

세포외 매트릭스 단백질/성분 및 영양 세포가 결여된 표면 개질 플레이트 상에서의 인간 배아 줄기 세포의 부착, 배양 및 만능성의 유지 로 저해 및 로 키나아제 저해의 영향

연구 전에, 성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물로 처리된 넝클론 델타™ 플레이트 상에서 계대 49의 주 H1의 인간 ES 세포를 MEF 조절 배지에서 유지하였다. 1 ㎎/㎖ 콜라게나아제에 의한 해리에 의해 계대를 위하여 표면으로부터 세포를 해리시켰다.

이어서 이들 세포를 표면 개질 플레이트(6-웰 포맷)의 미처리 웰 상에 접종하였다. 또한 세포를 음성 대조군의 경우 코스타™^, 팔콘™, 및 넝클론 델타™ 6-웰 플레이트의 미처리 및 젤라틴-처리 웰 상에 직접적으로 도말하고, 양성 대조군으로서 제공하기 위하여 세포를 성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물로 처리된 웰 상에 도말하였다. 모든 처리에서 세포를 MEF 조절 배지에서 유지하였다.

표면 개질 플레이트 1 및 5-12에 첨가된 그리고 미처리 또는 젤라틴 처리 넝클론 델타™ 플레이트 및 코스타™ 플레이트에 첨가된 계대 49의 주 H1의 인간 ES 세포는 부착되지 않았지만, 상기 세포는 표면 개질 플레이트 2, 3 및 4에는 부착되었다. 상기 세포는 성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물로 처리된 플레이트에 부착되었으며, 이는 상기 세포가 기재 표면에 부착되는 능력이 있음을 나타낸다.

성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물 상에 도말된 H1 ES 세포의 정상적인 계대 시간은 3-4일이었지만, 표면 개질 플레이트 2, 3 및 4 상에 도말된 세포는 상기 세포가 계대에 대하여 준비가 되기 전에 배양에 7일이 걸렸다. 이는 아마도 표면 개질 플레이트 상에의 부착 속도 감소로 인한 것이었으며, 그 이유는 더 많은 출발 콜로니가 표면 개질 플레이트 2, 3 및 4 상에서보다 도말 직후 매트리젤™-처리된 표면 상에서 보였기 때문이다.

계대에서의 지연으로 인하여, 세포를 1 대 2의 비로 분주하고, 계대 4의 샘플 중 절반을 10 μM의 농도의 로 키나아제(ROCK) 저해제, Y-27632로 보충된 MEF 조절 배지 또는 MEF 조절 배지 중에서 도말하여 세포 성장의 동력학적 특성을 향상시켰다. 계대 후 48시간 동안 세포를 도말 배지에서 유지하였으며, 이때 배지는 신선한 미보충 MEF 조절 배지로 교환하였다.

Y-27632를 10μM 농도로 첨가하면 세포 (p52)의 도말 효율이 유의하게 증가되었으며, 콜로니 성장의 향상이 도말 후 4일 후에 명백하였다 (도 2). 대안적으로, 콜라게나아제에 의한 해리 이전에, 주 H1의 인간 ES 세포를 또한 0.5 ng/㎖의 세포 투과성 형태의 로 저해제, C3 엑소트랜스퍼라아제로 처리하였는데, 이는 세포의 도말 효율을 또한 증가시켰다.

10 μM Y-27632 중에서 도말한 세포는 도말한지 4일 후 계대할 수 있었던 반면, ROCK 저해제 없이 도말한 세포는 도말한지 4일 후 분주될 준비가 되지 않았다. 로 저해제, C3 엑소트랜스퍼라아제로 처리한 세포는 도말한지 4일 후 계대에 대하여 또한 준비가 되지 않았으며, 세포는 섬유아세포-유사 형태로의 분화 증가를 나타내었다. 그 결과로서, 계대 4에서 로 저해제로 처리한 세포를 모든 후속 계대에서 Y-27632로 처리하였다 (도 3).

세포를 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에서 적어도 10회의 계대로 추가로 계대하고 만능성 유전자와 관련된 마커의 존재에 대하여, 즉 유전자에 대하여 qRT-PCR에 의해, 세포 표면 마커 발현에 대하여 유세포 분석법에 의해, 그리고 세포 표면 및 핵 단백질의 면역형광에 대하여 시험하였다 (도 4 내지 도 6). 또한, 세포 만능성은 완성 내배엽, 췌장 내배엽으로 분화되고 삼배엽층으로 구성된 배양체를 형성하는 그의 능력을 시험함으로써 확인하였다 (도 7 내지 도 9). 또한 세포를 핵형 안정성에 대하여 시험하였으며, 본 발명자는 세포가 정상적인 핵형을 유지할 수 있음을 관찰하였다 (도 10).

실시예 5

로 키나아제 저해를 통한 인간 배아 줄기 세포의 부착 및 탈리

연구 전에, 성장 인자 감소된 매트리젤™의 1:30의 희석물로 처리된 넝클론 델타™ 플레이트 상에서 계대 40의 주 H9의 인간 ES 세포를 MEF 조절 배지에서 유지하였다. 1 ㎎/㎖ 콜라게나아제에 의한 해리에 의해 또는 수동적으로 긁어 냄에 의해 계대를 위하여 표면으로부터 세포를 해리시켰다.

이어서 이들 세포를 증가하는 양의 하기 로 키나아제 저해제: Y-27632 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 또는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 이엠디), 파수딜 (시그마), 또는 하이드록시파수딜 (시그마) 중 하나의 존재 하에 표면 개질 플레이트 2, 3, 4 및 13 (12-웰 포맷) 상에 접종하고, 3일 동안 유지하였으며, 매일 배지 및 화합물을 교환하였다. 3일의 마지막에, 배지를 제거하고, 플레이트를 크리스탈 바이올렛 (물 중 0.5%)으로 염색시켜 콜로니를 가시화하였다.

증가하는 양의 로 키나아제 저해제의 존재 하에 표면 개질 플레이트 2, 3, 4 및 13에 ES 세포 콜로니가 3일에 부착되었다. 몇몇 콜로니가 로 키나아제 저해제, 파수딜 및 하이드록시파수딜을 이용했을 때 부착 및 성장하는 것으로 관찰될 수 있지만 최상의 결과는 Y-27632 (10 μM)의 사용을 통하여 얻어졌다 (도 11).

배양 첫째날 동안 일련의 도말 농도의 Y-27632로 세포를 처리함으로써 세포 결합을 촉진하는 Y-27632의 최적 용량을 결정하려고 시도되었다. 배양 첫째날 후 세포를 후속일에 10 μM 농도의 Y-27632로 처리하였다. ES 세포의 부착 및 성장을 촉진하는 최대 농도가 10 μM이며 (도 12) 이는 표면 개질 플레이트 2, 3, 4, 13 및 셀바인드™ (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝)에서 일어났음이 관찰되었다.

세포를 단일 용량의 Y-27632로 연속적으로 처리하는 것의 부착 및 성장에 대한 영향을 또한 시험하였다. 세포에 0, 1, 4, 또는 10 μM의 Y-27632를 4일 동안 투입 처리하였다. 약간의 결합이 처리 없이 (0 μM) 표면 개질 플레이트에서 관찰되었지만, ES 세포의 부착 및 성장을 촉진하는 최적 농도는 표면 개질 플레이트 2, 3, 4, 13에서 10 μM Y-27632이었다 (표 4).

ROCK 저해제를 첨가하면 미처리 세포에 비하여 표면 개질 플레이트 2, 3, 및 4에서 도말 및 성장에 대한 동력학적 특성이 유의하게 향상되기 때문에 (도 13), 본 발명자는 이것이 적당한 세포 부착의 유지로 인한 것인지 또는 증가된 세포 증식으로 인한 것인지를 결정하기를 원하였다. 로 키나아제 저해가 세포 증식을 증가시키지 않으며, 그 이유는 Y-27632로 처리된 세포가 미처리 세포와 유사한 밀도로 성장하기 때문임이 관찰되었다 (도 14). 대신, Y-27632 처리는 세포가 표면에 부착하는 것을 유지하여 세포가 정상적인 증식 동력학을 이용하여 성장하는 것을 허용한다 (도 15). 로 키나아제 저해제의 존재 하에 도말된 ES 세포의 성장 배지로부터 로 키나아제 저해제를 제거하면 상기 세포가 표면으로부터 탈리된다. 삼배엽 계통으로 분화되는 배양체의 형성은 ES 세포를 현탁물 상태로 배양함으로써 달성한다. 그 결과로서, 예상되는 바와 같이, 로 키나아제 저해제의 이후의 재적용에 의해 세포 부착이 회복되지만 (도 15), 로 키나아제 저해제를 24시간의 배양 동안 사용중지하고 세포를 탈리시키고, 24시간 동안 현탁물 상태로 성장시키고 이어서 로 키나아제 저해제를 재적용한 샘플에서 ES 세포 배양물의 실질적인 분화가 관찰되었다.

실시예 6

표면 개질 플레이트 상에서 트립엘이 ™ 익스프레스를 이용하여 계대한 H9 인간 ES 세포는 Y-27632를 이용했을 때 향상된 유착성을 나타낸다

표면 개질 플레이트 상으로의 H9 인간 ES 세포의 초기 계대 유착을 계속적인 10 μM의 Y-27632를 이용하여 향상시킨다. 이는 시험한 4개의 표면 개질 플레이트 2, 3, 4 및 13에 있어서 그러하다. 표면 3 상에 접종한지 24시간 후 H9 세포의 이미지가 도 16에 예시되어 있다.

실시예 7

표면 개질 플레이트 상에서 트립엘이 ™ 익스프레스를 이용하여 계대한 H9 단일 인간 배아 줄기 세포는 만능성인 채 남아있다

인간 ES 세포는 만능성이며 모든 세포 계통으로 분화되는 능력을 갖는다. 상기 세포의 만능 상태는 세포가 성장하는 표면에 의해 유지되어야 한다. 표면 개질 플레이트가 인간 ES 세포의 만능성을 유지할 수 있는지를 결정하기 위하여, 인간 ES 세포를 콜라게나아제를 이용하여 38회, 그리고 트립엘이™ 익스프레스를 이용하여 38회 계대하고 이어서 표면 개질 플레이트 3 (표면 3), 표면 개질 플레이트 4 (표면 4) 또는 매트리젤™ - 1:30의 희석비 - 상에 5회 계대하였다. 10 μM의 Y-27632를 지시된 샘플의 배지에 첨가하였다. 만능성 마커인 Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3 및 SSEA-4의 발현을 유세포 분석법에 의해 평가하였다. 결과가 도 17에 예시되어 있다. 양성 세포의 백분율이 y-축 상에 나타내어져 있다. 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에서 성장시킨 단일 인간 ES 세포는 그의 만능성을 유지할 수 있다.

실시예 8

로 키나아제 저해는 매트리젤 ™ 로부터의 이전시에 표면 개질 플레이트 상에서 단일 세포로서 성장시킨 인간 배아 줄기 세포주 H9 유래의 세포의 유착 및 성장을 촉진한다

인간 ES 세포의 유착 및 세포 성장에서의 Y-27632의 역할을 표면 개질 플레이트와 관련하여 연구하였다. H9 인간 ES 세포를 콜라게나아제를 이용하여 38회 그리고 트립엘이 ™ 익스프레스를 이용하여 50회 계대하고 이어서 표면 개질 플레이트 3 또는 4 상에 접종하였다 (나이브 세포). 대안적으로, H9 인간 ES 세포를 콜라게나아제를 이용하여 38회 그리고 트립엘이 익스프레스를 이용하여 38회 계대하고, 이어서 표면 개질 플레이트 3 (표면 3, 순응시킨 세포), 또는 표면 개질 플레이트 4 (표면 4, 순응시킨 세포) 상에 9회 계대하였다. 10 μM의 Y-27632의 존재 또는 부재 하에 MEF 조절 배지에 10⁴/㎠의 밀도로 세포를 접종하여 2일 동안 성장시켰다. 결과가 도 18에 예시되어 있다. Y-27632는 표면 개질 플레이트 3 및 4에 나이브 세포가 부착하는 것을 향상시킨다. Y-27632는 순응 세포가 표면 개질 플레이트 3 또는 4에 부착하는 것은 개선시키지 못하였다. 표면 개질 플레이트 3은 나이브 세포의 부착 및/또는 성장을 향상시켰다. 표면 개질 플레이트 4는 순응 인간 ES 세포의 부착 및/또는 성장을 향상시켰다. 세포는 총 4일 동안 이것을 따랐다 (도 19 및 20). 나이브 단일 세포는 표면 개질 플레이트 3을 이용하여 10 μM Y-27632를 이용하여 배양할 때 성장 속도 증가를 나타냈으며, 이는 약간의 이점을 보여주는 것이다 (도 19). 순응 단일 세포는 10 μM의 Y-27632를 이용하지 않고서도 향상된 성장 속도를 나타냈다 (도 20).

실시예 9

표면 개질 플레이트를 사용하여 화합물을 스크리닝할 수 있다

96-웰 구성의 그리고 생체분자 스크리닝 협회(Society for Biomolecular Screening, SBS) 표준 포맷의 표면 개질 플레이트를 10 μM Y-27632의 존재 하에 단일 인간 ES 세포의 성장을 위하여 사용할 수 있다. 96-웰 플레이트의 웰에 도말한 H9 단일 세포의 이미지가 도 21에 예시되어 있다. 이는 각각 생쥐 배아 섬유아세포 또는 매트리젤™과 같은 세포 또는 흡착층을 방해하지 않고 96-웰 플레이트에서 직접적으로 화합물을 스크리닝하는 것을 허용할 것이다.

실시예 10

표면 개질 플레이트 상에서 배양한 단일 배아 줄기 세포는 완성 내배엽으로 분화될 수 있다

한 가지 목적은 인간 ES 세포를 상이한 세포 계통으로 분화시키는 것이다. 표면 개질 플레이트가 분화를 지지할 수 있는지를 결정하기 위하여, 인간 ES 세포를 콜라게나아제를 이용하여 38회 그리고 트립엘이™ 익스프레스를 이용하여 38회 계대하고, 이어서 표면 개질 플레이트 3 (표면 3) 또는 표면 개질 플레이트 4 (표면 4) 상에서 9회 계대하였다. 양성 대조군으로서, 인간 ES 세포를 1:30의 희석비의 매트리젤™ 상에서 성장시켰다. 10 μM의 Y-27632를 지시된 세포 샘플의 확장 동안 배지에 첨가하였다. 세포 확장 후, 배양한 세포가 완성 내배엽을 형성하는 능력을 평가하였다. 간략하게는, 70% 융합성의 배양물을 DMEM-F12 배지 중 100 ng/㎖ 액티빈 A, 10 ng/㎖ Wnt3a 및 0.5% FBS로 2일 동안 처리하였다. 이 처리에 이어 DMEM/F12 중 100 ng/㎖ 액티빈 A 및 2% FBS로 3일간 처리하였다. 완성 내배엽으로 분화된 세포를 유세포 분석법에 의해 CXCR4 단백질 발현으로 확인한다 (도 22). 양성 세포의 백분율이 y-축 상에 나타내어져 있다. 단일 세포로서 배양한 인간 ES 세포를 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에서 Y-27632의 존재 또는 부재 하에 완성 내배엽으로 분화시킬 수 있다.

실시예 11

표면 개질 플레이트 상에서 배양한 단일 배아 줄기 세포는 췌장 내배엽으로 분화될 수 있다

완성 내배엽 프로토콜의 완료 후, 세포를 DMEM-F12 배지 중 FGF-7 (50 ng/㎖; 알앤디 시스템즈), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog) 저해제, KAAD 사이클로파민 (2.5 μM; 시그마-알드리치) 및 2% FBS를 이용하여 3일 동안 인큐베이션하였다. 이 시점에서, 확장 동안 Y-27632로 처리하지 않은 세포는 표면 개질 플레이트 3 및 4로부터 탈리되었다. 확장 동안 Y-27632로 처리한 세포를 DMEM-F12 중 FGF-7 (50 ng/㎖), KAAD 사이클로파민 (2.5 μM), 레틴산 (1 μM; 시그마-알드리치) 및 1% B27 (인비트로젠(Invitrogen))을 이용하여 추가로 4일간 인큐베이션하였다 (후방 전장 단계, PF). 이 시간 후, 세포를 DMEM-F12 중 엑센딘(Exendin) 4 (50 ng/㎖; 시그마-알드리치), DAPT (1 μM; 칼바이오켐(Calbiochem)), 및 1% B27에서 추가로 4일간 인큐베이션하였다. 분화가 췌장 내배엽 단계(EN)까지 계속되었다. 이는 50ng/㎖, HGF, IGF (알앤디 시스템즈), 및 엑센딘 4 (50ng/㎖)와, 1% B27을 포함하는 CMRL 배지 (인비트로젠)를 이용한 3일간의 처리를 수반하였다. RNA 샘플을 표면 개질 플레이트 3 및 4의 하나의 웰로부터 단계 PF 및 EN에서 취하였다. 이어서 이들 샘플을 이 단계에서 췌장 마커인 Pdx1, Nkx6.1, Nkx2.2, Pax4, NeuroD, HNF3b, Ptf1a, 인슐린 및 AFP에 대하여 실시간 PCR로 분석하였다. 상기 췌장 내배엽 마커의 평가를 이 단계에서 반복하였다. 상기 주의 미처리 인간 ES 세포 유래의 RNA 샘플을 처리 샘플과 동시에 실시간 PCR에 처하였다. 처리한 샘플을 1의 배수 변화로 설정한 미처리 대조군에 대하여 정상화하였다. Pdx1 및 인슐린 발현을 모니터하고 표면 개질 플레이트들 사이에서 비교하였다.

췌장 내배엽 마커의 유도를 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에서 처리한 세포로부터 관찰하였지만, 발현은 표면 개질 플레이트 3 상에서 처리된 세포보다 높았다 (도 23). 확장 동안 Y-27632의 존재 하에서 둘 모두의 표면 처리된 플레이트는 단일 인간 ES 세포가 후방 전장 및 췌장 내배엽으로 분화하는 것을 지지할 수 있으며, 반면, 확장 동안 Y-27632로 처리되지 않은 단일 세포는 후방 전장 분화 이전에 탈리되었다.

실시예 12

H1 및 H9 인간 ES 세포는 표면 개질 플레이트에 유착되며 유착은 세포를 Y-27632로 처리함으로써 향상된다

이전에 1:30의 매트리젤™ 처리 플라스틱 제품에 도말하고 8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지에서 성장시킨 계대 49의 H9 인간 ES 세포를 리버라아제로 처리하고, 8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지 중에서 표면 개질 플레이트에 도말하였다 - 그리고 그렇지 않다면 처리하지 않거나 또는 증가하는 농도의 Y-27632로 보충함 -. 표면 개질 플레이트에 H9 인간 ES 세포를 도말한지 24시간 후 및 48시간 후에 작은 콜로니가 표면 2-4 및 13과, 셀바인드™, 및 프리마리아™ (카탈로그 번호 353846, 미국 뉴저지주 프랭클린 레익스 소재의 벡톤 디킨슨) 상에서 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 관찰될 수 있음을 관찰하였다 (도 24-26). 더욱이, H9 인간 ES 세포 콜로니의 유착은 Y-27632에 의해 향상되었으며, 그 효과는 용량 응답성이었다 (도 25). 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 측정할 때 낮은 농도의 Y-27632 (1 내지 2 마이크로몰)는 미처리 인간 ES 세포에 비하여 인간 ES 세포 부착에서 최소 개선을 나타낸 반면 (도 25), 보다 높은 농도의 Y-27632 (4 내지 20 마이크로몰)는 표면 개질 플레이트에 인간 ES 세포가 유착하는 것을 촉진하였다 (도 25 및 26).

Y-27632를 세포 배양 배지에 첨가함으로써 인간 ES 세포 부착을 동적으로 조절하는 것 외에, Y-27632의 존재 하에 다양한 표면 개질된 플라스틱에의 인간 ES 세포의 상이한 유착 속도가 관찰되었다. 예를 들어, 세포는 셀바인드™ 플레이트에 대한 유착성이 덜하였으며 심지어 지속적인 Y-27632 처리의 존재 하에서도 시간이 지남에 따라 셀바인드™ 플레이트로부터 탈리될 가능성이 더 커진 반면, 세포는 로 키나아제 저해제, Y-27632로 처리할 때 표면 개질 플레이트 3, 4, 또는 13 또는 프리마리아™에 대한 유착성이 더 커지고 상기로부터 탈리될 가능성이 덜해졌다 (도 25 및 26).

실시예 13

인간 배아 줄기 세포주 H1 및 H9 유래의 세포는 Y-27632의 존재 하에 표면 개질 플레이트 상에 상이한 속도로 부착되어 콜로니를 형성한다

이전에 1:30 매트리젤™-처리 플라스틱 제품에 도말하고 8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지에서 성장시킨 H1 및 H9 인간 ES 세포를 리버라아제로 처리하고, 8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지 중에서 표면 개질 플레이트에 도말하였다 - 그리고 그렇지 않다면 처리하지 않거나 또는 20 마이크로몰의 Y-27632로 보충함 - . 표면 개질 플레이트 14 및 15에 H9 인간 ES 세포를 도말한지 48시간 후에, 배지를 20 마이크로몰의 Y-27632로 보충했을 때는 작은 콜로니가 관찰되었다 (부착 및 콜로니 형성은 실험마다 가변적이었음) (도 27). H1 인간 ES 세포는 또한 20 마이크로몰의 Y-27632로 보충된 배지 중에서 표면 14 및 15 둘 모두에 부착되었고 상기 표면 상에서 콜로니를 형성하였으며, 이는 H9 인간 ES 세포에서 관찰된 결합보다 더 우세하였다. 이들 데이터는 고형 기재 표면에의 부착 및 상기 표면 상에서의 콜로니 형성에서 인간 ES 세포주마다 가변성이 있음을 나타낸다.

실시예 14

규명 배지를 사용한 표면 개질 플레이트에의 인간 ES 세포의 부착

계대 49의 H9 인간 ES 세포를 규명 배지, mTeSR™ 중에서, 매트리젤™-처리 플라스틱 제품 상에서 2회 계대하였다. 이어서 세포를 리버라아제로 처리하고 mTeSR™ 배지 중에서 표면 개질 플레이트 Nunc4 상에 도말하였다. 세포를 20 마이크로몰의 Y-27632를 포함하거나 또는 포함하지 않는 배지 중에서 도말하였다. 또한 웰을 다양한 단백질로 30분 동안 처리한 후 세포를 접종하여 (처리 없음, 0.1% 젤라틴, 2% BSA, .34 ㎎/㎖ 쥐 콜라겐 I, 1:1000 매트리젤™, 또는 1:5000 매트리젤™) 이들 단백질이 Y-27632를 포함하거나 또는 포함하지 않는 규명된 배지 중에서 인간 ES 세포 유착을 촉진할 수 있는지를 결정하였다 (도 28). Y-27632의 부재 하에, 규명 배지에서 표면 개질 플레이트 상에 도말된 인간 ES 세포가 심지어 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어 콜라겐 I 또는 1:1000의 매트리젤™의 존재 하에서도 부착되지 않았음을 관찰하였다. 그러나, 20 마이크로몰의 Y-27632를 규명 mTeSR™ 배지에 첨가했을 때, 인간 ES 세포는 표면 Nunc4에 유착하였다. 더욱이, 이 유착은 미처리 웰과, 0.1% 젤라틴, 2% BSA, 및 0.34 ㎎/㎖의 쥐 콜라겐 I로 처리한 웰에서 동등하였다. 낮은 농도의 매트리젤™ (1:1000 및 1:5000의 희석)을 포함하는 웰에서 인간 ES 세포 부착이 중간 정도로 증가하였지만, 이들 농도의 매트리젤™은 Y-27632의 부재 하에서 유착을 촉진하기에는 불충분하였다. 이들 결과는 ROCK 저해제, Y-27632의 존재 하에서 인간 ES 세포가 개질된 플라스틱 기재 상에서 규명된 배지 중에서 배양될 수 있으며 약 1:1000 또는 1:5000의 낮은 농도의 매트리젤™이 이 유착을 향상시킬 수 있음을 입증한다.

실시예 15

플라스크 포맷의 표면 개질 플레이트는 인간 ES 세포의 부착과 완성 내배엽 및 췌장 내배엽으로의 분화를 촉진할 수 있다

이전에 1:30의 매트리젤™ 처리 플라스틱 제품에 도말하고 8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지에서 성장시킨 H1 및 H9 인간 ES 세포를 리버라아제로 처리하고, 개질된 표면을 갖는 다양한 크기의 플라스크 상에 1:2 또는 1:3의 접종 밀도로 T25, T75, T150, 및 T175 플라스크에 도말하였다. 세포를 8 ng/㎖의 bFGF 및 20 마이크로몰의 Y-27632로 보충된 MEF 조절 배지 중에서 접종하였다. 이어서 플레이트가 대략 50% 융합성이 될 때까지 8 ng/㎖의 bFGF 및 20 마이크로몰의 Y-27632로 보충된 MEF 조절 배지를 매일 교환하면서 인간 ES 세포 콜로니를 성장시켰다. 이때 배지를 2% BSA, 100 ng/㎖ 액티빈 A, 20 ng/㎖ Wnt3a, 및 20 마이크로몰 Y-27632를 포함하는 DMEM/F12 배지로 교환하고, 배지를 매일 교환하면서 세포를 이 배지에서 2일 동안 유지하였다. 3일 및 4일째에 배지를 2% BSA, 100ng/㎖ 액티빈 A, 및 20 마이크로몰 Y-27632를 포함하는 DMEM/F12 배지로 교환하였다. 이어서 세포를 트립엘이를 이용하여 표면으로부터 유리시키고, 완성 내배엽(DE) 표면 마커, CXCR4의 발현에 대하여 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 이들 조건 하에서 인간 ES 세포가 거의 90% CXCR4+만큼 높은 고도 CXCR4 양성 집단으로 분화되었음을 관찰하였는데, 이는 상기 세포가 대부분 완성 내배엽으로 분화되었음을 나타낸다 (표 5). 더욱이, 성장 동안 또는 분화 동안 배양용 표면에 세포가 부착하는 것은 ROCK 저해의 유지에 의존적이었으며, 그 이유는 배양 배지로부터의 Y-27632의 제거가 플라스틱으로부터의 세포 탈리로 이어졌기 때문이다.

췌장 내배엽이 플라스크 포맷의 표면 개질 플레이트 상에서 유도된 완성 내배엽으로부터 형성될 수 있는지를 결정하기 위하여, 세포를 추가 4일 동안 Y-27632 (20 마이크로몰), FGF-7 (50 ng/㎖), KAAD 사이클로파민 (2.5 마이크로몰), 및 1% B27 (인비트로젠)을 이용하여 DMEM-F12 중에서 인큐베이션하고, 이어서 이 추가 4일 동안 레틴산 (1 마이크로몰; 시그마-알드리치)으로 보충된 이 배지에서 인큐베이션하여 세포를 췌장 내배엽 단계로 분화시켰다. 이어서 RNA 샘플을 취하고, 췌장 마커 Pdx1에 대하여 실시간 PCR로 분석하였다. 처리한 샘플을 1의 배수 변화로 설정한 미처리 대조군에 대하여 정상화하였다. 샘플이 미분화 인간 ES 세포에 비하여 증가된 수준의 PDX1을 가짐이 관찰되었으며, 이때 mRNA 수준은 미분화 인간 ES 세포에서 관찰되는 것보다 분화된 세포에서 적어도 256배 더 높았다.

실시예 16

표면 처리 및 표면 개질 플레이트

표면 개질 플레이트는 코로나 플라스마 처리 또는 마이크로파 플라스마 처리를 이용하여 사출 성형 물품을 처리함으로써 준비하였다 (표 6). 사출 성형에 사용한 중합체 물질은 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 폴리카르보네이트와 폴리스티렌의 블렌드, 및 환형 올레핀 공중합체였다. 표면 개질 플레이트를 개별적으로 플라스틱 백 내에 패킹하고, 이어서 감마선 조사 (25 kGy)에 의해 살균하고, 마지막으로 세포 배양 또는 표면 특성화 실험에 사용할 때까지 실온에서 보관하였다. 표면 개질 플레이트 18, 30 및 31-32를 상기 중합체 물질을 사용하여 각각 표면 개질 플레이트 19, 33 및 34로서 성형하였지만, 플라스마 처리를 하지는 않았다. 표면 14 및 31에는 감마선을 조사하지 않았다.

챔버 내부로부터 전기적으로 절연되고 챔버 내부에 위치한 단지 하나의 전극을 갖는 금속 진공 챔버 (씨-랩 플라스마(C-Lab Plasma); 덴마크 베타폰 에이/에스 소재)에서 코로나 플라스마 처리를 수행하였다. 금속 벽은 반대 전극 (기저 전극)으로서의 역할을 하였다. 자기 조절식 코로나 발생기(self-tuning corona generator)는 전체 챔버에 플라스마를 발생시키기에 충분한 에너지를 제공하는 전기장을 발생시켰다. 처리할 물품을 챔버의 바닥에 두었다. 챔버를 폐쇄하고 1 Pa (10^-2 mbar)의 압력이 되도록 배기시켰다. 이 압력에서 진공 펌프로의 밸브를 닫고 코로나 발생기를 결합시켰다. 발생기를 2000 W의 출력을 생성하도록 설정하였다. 플라스마에 5 내지 60초 동안 에너지를 가하였다. 이어서 가스 유입 밸브 (공기)를 열고, 챔버 내의 압력이 대기압 수준으로 되돌아가도록 하였다.

마이크로파 플라스마 처리를 쿼츠 진공 챔버(quarts vacuum chamber) (표면 개질 플레이트 5-12의 경우 모델 300-E, 및 표면 개질 플레이트 14 및 15의 경우 모델 440; 둘 모두 독일 소재의 테크닉스 플라스마 게엠베하(Technics Plasma GmbH))에서 수행하였다. 플라스마를 발생시키기 위한 에너지를 상기 챔버 외부의 2.43 GHz 마이크로파 발생기에 의해 공급하였다. 처리할 물품을 상기 챔버 내부의 유리 플레이트 상에 두었다. 챔버를 폐쇄하고 30 내지 50 Pa (0.3 내지 0.5 mbar)의 압력이 되도록 배기시켰다. 진공 펌프로의 밸브를 계속하여 열어두고, 가스 유입 밸브에 의해 가스 (공기 또는 산소) 유동을 조정함으로써 압력을 원하는 값으로 유지하였다. 이어서 마이크로파 발생기를 결합시켰다. 상기 발생기를 500 또는 600 W의 출력을 생성하도록 설정하였다. 이어서 펌프 밸브를 닫고, 공기 유입 밸브를 열어 챔버 내의 압력이 대기압 수준으로 되게 하였다.

표 6은 코로나 플라스마 또는 마이크로파 플라스마에 의해 표면 개질 플레이트를 준비하는 데 사용한 전력, 시간, 압력 및 가스를 예시한다.

실시예 17

본 발명의 표면 개질 플레이트의 표면 특성화

물 접촉각

표면 개질 플레이트 1-4 및 13을 개별적으로 플라스틱 백 내에 패킹하고, 살균하고, 시험 기간 전체에 걸쳐 실온에서 보관하였다. 접촉각을 먼저 표면 처리 및 살균한지 1주일 후에 측정하고, 이어서 도 29에 주어진 시점에서 다시 측정하였다. 모든 접촉각 측정은 정적 세실 드롭법 및 스웨덴 소재의 파이브로 시스템즈 아베(FIBRO Systems AB)로부터의 PG-X 측정 헤드 [비디오 카메라 및 컴퓨터 소프트웨어 (v. 3.1)로 이루어진 측각기]를 이용하여 행하였다. 탄젠트 경사법(tangent leaning method)을 접촉각 계산에 사용하였다. 4.0 ㎕의 밀리큐(MilliQ) 물의 드롭을 제조자의 사용 설명서에 따라 정적 모드로 자동 적하 적용을 이용하여 적용하였다. 각각의 드롭의 접촉각을 1회 측정하였다 (7개의 드롭을 시점 당 각각의 샘플에 적용함). 각각의 시점에 있어서, 보다 초기의 측정으로부터의 임의의 영향을 피하기 위하여 새로운 샘플을 사용하였다. 표면 처리 및 살균을 첫 번째 측정 12주 전보다 더 이전에 행한 것을 제외하고는 표면 1-4 및 13 상에서의 측정과 동일한 실험 조건 하에 넝클론 델타™ 및 셀바인드™ 표면 상에서의 측정을 실시하였다 (넝클론 델타™ *는 첫 번째 측정 1주 전에 살균함). 도 29는 표면 개질 플레이트 1-4 및 13이 유사한 친수성의 것이며 넝클론 델타™ 및 셀바인드™ 표면보다 더 큰 친수성 (보다 작은 물 접촉각)의 것이었음을 보여준다. 표면 개질 플레이트 1-4 및 13의 친수성은 표면 처리 및 살균 후 적어도 12주 동안 안정하였다.

셀바인드™는 이전에 접촉각이 13.4도 (4도의 표준 편차)인 것으로 설명되었다 [문헌[Corning Technical Report (2005), Corning® CellBIND® Surface: An Improved Surface for Enhanced Cell Attachment (CLS-AN-057 REV1), http://catalog2.corning.com/Lifesciences/media/pdf/t_CellBIND_Improved_Surface_CLS_AN_057.pdf]].

음전하 밀도

표면 개질 플레이트 1-4 및 13, 넝클론 델타™ 표면, 셀바인드™ 표면, 프리마리아™ 표면, 팔콘™ 표면, 및 비-처리된 (그러나 살균된) 폴리스티렌 표면 (모두 3-㎝ 디쉬 포맷) 상에서의 음전하의 밀도를 측정하였다. 3 ㎖의 크리스탈 바이올렛 수용액 (0.015% (w/v))을 각각의 디쉬에 분배하고, 디쉬를 부드러운 진탕 (50 rpm) 하에 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 표면에 결합되지 않은 크리스탈 바이올렛을 제거하기 위하여, 디쉬를 3 ㎖ 밀리큐 물로 3회 세척하고, 이어서 60℃에서 하룻밤 건조시켰다. EtOH 용액 (99%) 중 0.1 M HCl 1.5 ㎖을 첨가하고 디쉬를 부드러운 진탕 (50 rpm) 하에 실온에서 2분 동안 인큐베이션함으로써 표면에 결합된 크리스탈 바이올렛을 탈착시켰다. 탈착된 크리스탈 바이올렛을 포함하는 HCl:EtOH 용액의 흡광도를 인비전(EnVision) 2100 미세플레이트 판독기 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer; 미국 매사추세츠주 월삼 소재)를 사용하여 590 ㎚에서 측정하였다. 흡광도 값을 HCl:EtOH 용액의 배경 흡광도에 대하여 보정하였다. 음전하 밀도를 표면 당 3개의 디쉬에서 측정하였으며, 흡광도 측정을 각각의 디쉬에 대하여 삼중으로 실시하였다.

표면 개질 플레이트의 음전하 밀도가 도 30에 예시되어 있다. 표면 1-4 및 13의 음전하 밀도는 유사하였지만, 5-60초의 간격의 보다 긴 표면 처리 시간에 의해 표면 음전하 밀도가 더 낮아지는 경향이 있었다. 표면 1-4 및 13은 2007년에 처리된 셀바인드™ 표면 및 넝클론 델타™ 표면보다 유의하게 더 낮은 음전하 밀도를 가졌다. 표면 1-4 및 13은 2005년에 처리된 넝클론 델타™ 표면과 동일한 수준의 음전하 밀도, 그리고 프리마리아™ 표면, 팔콘™표면, 및 비-처리된 (그러나 살균된) 폴리스티렌 표면보다 유의하게 더 높은 음전하 밀도를 가졌다. 2007년에 처리된 넝클론 델타™ 표면보다 2005년에 처리된 넝클론 델타™ 표면의 음전하 밀도가 더 낮다는 것은 표면 처리된 폴리스티렌이 시간이 지남에 따라 음으로 하전되는 것이 약간 덜해지게 됨을 시사한다. 셀바인드™의 높은 수준의 음전하 밀도는 보다 높은 표면 조도 및 그에 따른 표면적 때문이 아니다 (이 실시예에서 AFM 분석 참조).

X-선 광전자 분광법 ( XPS )

표면 개질 플레이트 1-4 및 13-15와, 넝클론 델타™, 코스타™, 팔콘™, 셀바인드™ 및 프리마리아™ 표면을 갖는 플레이트를 XPS를 사용하여 분석하였다. 플레이트로부터 섹션들을 절단하고 이들을 스프링 클립을 이용하여 스테인리스 강 샘플 홀더 상에 장착함으로써 샘플이 x-선 공급원을 향하게 하였다. 샘플을 Al kα 방사선 (1486 eV)으로 조사하였다. 샘플과 분석기 사이의 각을 45°로 하여 분석을 실시하였다. 당해 기기의 판매사인 피지컬 일렉트로닉스(Physical Electronics)에 의해 제공되는 소프트웨어 패키지를 이용하여 스펙트럼을 커브 피팅시켰다. 상기 소프트웨어는 데이터 프로세싱을 위하여 상업용 맷랩(Matlab)™ 루틴을 이용하였다. 분석용으로 사용한 기기는 피지컬 일렉트로닉스 모델 5400 X-선 광전자 분광계였다. 플레이트의 표면 처리된 부분으로부터 직경 약 1 밀리미터의 영역 내에서 가장 외측의 깊이 2 내지 5 나노미터를 표면당 2개의 플레이트 각각에서 분석하였다.

원자%의 단위의 표면 원소 조성이 표 7에 예시되어 있다. 모든 표면 개질 플레이트는 탄소, 산소 및 질소를 표면에서 포함하였다 (수소는 XPS에서 검출되지 않음). 표면 1-4, 표면 13 및 셀바인드™ 표면은 분석한 다른 표면보다 더 많은 산소를 포함하였다. 표면 1-4 및 표면 13-15는 프리마리아™보다 적은 질소, 그러나 넝클론 델타™, 코스타™, 팔콘™, 및 셀바인드™ 플레이트의 표면보다 많은 질소를 포함하였다. 산소 및 질소 수준은 보다 긴 표면 처리 시간과 양성적으로 상관되었으며 (표면 1-4 및 13), 이들 원소 둘 모두의 최고 수준은 30 또는 60초의 코로나 플라스마 처리를 이용하여 얻어졌다 (각각 표면 3 및 표면 4). 표면 3 및 4는 원소 조성이 유사하였다. 표면 2 및 13은 원소 조성이 유사하였으며, 원소 조성 면에서 표면 1보다 표면 3 및 4와 더욱 유사하였다.

문헌에서 발견되는 화학종의 피크 폭 및 에너지 위치를 이용함으로써, 표면 중 탄소에 있어서의 결합 환경을 확인 및 정량화하기 위하여 C1s 스펙트럼 피크를 커브 피팅시켰다 (최상의 카이제곱 피트(chi-squared fit)) (표 8). 농도는 원자% 단위로 보고되어 있는데, 이는 면적 퍼센트에 원자 농도를 곱함으로써 얻었다. 표면 2-4 및 13은 탄소 결합 환경의 견지에서 유사하였다. C*-C-O-C-C* 결합 환경에서의 탄소의 비율은 분석한 다른 표면에서보다 표면 2-4 및 13에서 더 낮았다. O-[C=O]-O 결합 환경에서의 탄소의 비율은 분석한 다른 표면에서보다 표면 2-4 및 13에서 더 높았다. 표면 2-4 및 13과 표면 1, 셀바인드™표면, 및/또는 프리마리아™ 표면 사이의 유사성을 또한 확인하였다. C-O-C 또는 C-NH3⁺ 결합 환경 (스펙트럼 내에서 동일한 에너지 위치)에서의 탄소의 비율은 분석한 다른 표면에서보다 표면 1-4 및 13에서 더 높았다. C-O-C*=O 결합 환경에서의 탄소의 비율은 분석한 다른 표면에서보다 표면 2-4, 표면 13, 및 프리마리아™ 표면에서 더 높았다. CO₃ - 결합 환경에서의 탄소의 비율은 분석한 다른 표면에서보다 표면 2-4, 표면 13, 및 셀바인드™ 표면에서 더 높았다. C=O 결합 환경에서의 탄소의 비율은 분석한 다른 표면에서보다 표면 1-4, 표면 13, 및 셀바인드™ 표면에서 더 높았다. C-[O]-C 결합 환경에서의 탄소의 비율은 분석한 다른 표면에서보다 표면 1-4, 표면 13, 셀바인드™ 표면 및 프리마리아™ 표면에서 더 높았다. 에너지 손실 피크가 방향족 Π→Π^*전이에 의해 생겼으며, 이는 표면 방향성의 표시자이다.

O1s 스펙트럼 피크는 거의 가우스형(Gaussian)이었으며 커브 피팅할 수 없었다. 문헌에서 발견되는 화학종의 피크 폭 및 에너지 위치를 이용함으로써, 표면 중 질소에 있어서의 결합 환경을 확인 및 정량화하기 위하여 N1s 스펙트럼 피크를 커브 피팅시켰다 (최상의 카이제곱 피트) (표 9). 농도는 원자% 단위로 보고되어 있는데, 이는 면적 퍼센트에 원자 농도를 곱함으로써 얻었다. 넝클론 델타™, 셀바인드™, 코스타™, 및 팔콘™ 표면으로부터의 N1s 시그널은 약하였으며, 따라서 이들 표면에서 질소에 있어서의 결합 환경을 확인하는 것은 가능하지 않았다. N1s 스펙트럼은 표면 개질 플레이트 1-4 및 13에 있어서 구별할 수 없었으며, 2개의 대표적인 N1s 스펙트럼의 커브 피팅으로부터 생기는 데이터가 예시되어 있다. -NH₃ ⁺ 결합 환경에서의 질소의 비율은 표면 14 및 15와 프리마리아™ 표면에서보다 표면 1-4 및 13에서 더 높았다. -NH₂ 결합 환경에서의 질소는 단지 표면 14 및 15와 프리마리아™ 표면에서 검출되었다. -NO₂ 결합 환경에서의 질소는 단지 표면 1-4 및 13과, 표면 15의 단일 샘플에서 검출되었다. -NO₃ 결합 환경에서의 질소는 단지 표면 15 및 프리마리아™ 표면에서 검출되었다.

이전에 셀바인드™는 ESCA에 의해 분석할 때 70.4%의 탄소, 29.0%의 산소, 0.6%의 질소, 및 <0.01%의 기타 원소의 원소 조성과, 상대적으로 높은 농도의 C-[O]-C, C=O, 및 COOH/R 기를 갖는 것으로 설명되었다 [Corning Technical Report (2005), Corning® CellBIND® Surface: An Improved Surface for Enhanced Cell Attachment (CLS-AN-057 REV1), http://catalog2.corning.com/Lifesciences/media/pdf/t_CellBIND_Improved_Surface_CLS_AN_057.pdf].

이전에 프리마리아™는 ESCA에 의해 분석할 때 74.6%의 탄소, 14.1%의 산소, 11.1%의 질소, 및 0.2%의 기타 원소의 원소 조성을 가지며, 주로 니트릴 (C≡N) 및 우레아 [HN(C=O)NH] 탄소-질소 결합 환경을 갖는 것으로 설명되었다.

원자력 현미경법 ( AFM )

표면 개질 플레이트 1-4 및 13과, 넝클론 델타™ 및 셀바인드™ 표면을 갖는 플레이트를 AFM을 사용하여 분석하였다. 디지털 인스트루먼츠(Digital Instruments)의 다중모드 원자력 현미경(Multimode Atomic Force Microscope)을 탭핑 모드(tapping mode)로 사용하여 샘플을 분석하였다. 사용한 팁은 탭핑 모드 팁, 타입 TESP7이었다. 양면 점착 테이프를 이용하여 샘플을 샘플 디스크에 부착시켰다. 플레이트의 표면-처리된 부분의 10 ㎛ x 10 ㎛ 및 500 ㎚ x 500 ㎚의 영역을 분석하였다. 나노미터 단위의 최대 높이 (Rmax) 및 표면 평균 조도 (Ra)가 표 10에 예시되어 있다. 넝클론 델타™및 셀바인드™표면을 갖는 플레이트와 유사하게, 표면 개질 플레이트 1-4 및 13은 상대적으로 매끄러웠으며, Ra 및 Rmax는 두 스캔 중 어느 하나에서 표면 처리 시간과 상관되지 않았다. 세포 배양용으로 의도된 비-처리된 폴리스티렌 및 산화된 폴리스티렌 표면과, 프리마리아™ 표면의 분석이 문헌[Shen and Horbett, J. Biomed. Mater. Res. 57:336-345, 2001]에 의하면 표면 조도가 모든 3개의 표면에 있어서 대략 4 ㎚인 것으로 설명되었다.

실시예 18

인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성과 관련된 표면 원소 조성 및 접촉각

표면 원소 조성의 XPS 분석의 결과, 표면 접촉각 측정 결과, 및 인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성 실험의 결과에 대한 요약이 표 11에 주어져 있다.

로 또는 로 키나아제를 저해할 수 있는 화합물의 부재 하에 인간 ES 세포의 고형 기재 표면에의 부착 및 상기 표면 상에서의 콜로니 형성 (10 ㎠의 표면 당 적어도 15개의 콜로니)이 단지 표면 개질 플레이트 2-4 및 13, 셀바인드™ 플레이트 및 프리마리아™ 플레이트 상에서 관찰되었다 (세포를 세포 클러스터의 현탁물로서 표면에 제시함). 표면 개질 플레이트 2-4 및 13은 세포 부착, 콜로니 형성 및 계대를 지지하였다. 약 3회의 계대 후, 표면 개질 플레이트 2-4 및 13 상에서의 인간 ES 세포의 성장 속도는 (단지 로 저해 및 로 키나아제 저해의 부재 하에서) 자연적으로 하락하지만, 세포 형태에 의하면 세포가 분화되지 않고 있음을 나타냈다. 더욱이, 만능성 마커 발현은 표면 3 상에서 4회 계대한 세포에서 유지되었다. 셀바인드™ 플레이트는 인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성을 지지하였지만, 세포의 분화는 제1 계대 이전에 관찰되었다. 세포 형태 관찰을 기초로 하면, 프리마리아™ 플레이트는 분화 징후 없이 인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성을 지지하였다 (계대는 시험하지 않음). 표면의 산소 (예를 들어, 표면 14에 대하여 표면 2) 및 질소 (예를 들어, 코스타™에 대하여 프리마리아™; 및 셀바인드™에 대하여 표면 2 및 13) 둘 모두의 함량은 로 키나아제 저해의 부재 하에 인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성을 지지하는 상기 표면들의 능력에 영향을 주었다. 적어도 약 0.9%의 질소 함량, 적어도 약 22.3%의 질소 및 산소 함량의 합계, 및 적어도 약 13.9도의 물 접촉각을 갖는 표면은 로 저해 또는 로 키나아제 저해의 부재 하에 인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성을 지지하였다.

로 또는 로 키나아제를 저해할 수 있는 화합물의 존재 하에 인간 ES 세포의 고형 기재 표면 상의 부착 및 콜로니 형성 (10 ㎠의 표면 당 적어도 15개의 콜로니)이 표면 개질 플레이트 1-15, 표면 개질 플레이트 19, 표면 개질 플레이트 33, 표면 개질 플레이트 34, 셀바인드™ 및 프리마리아™ 상에서 관찰되었다 (세포를 세포 클러스터의 현탁물로서 표면에 제시함). 본 발명자는 인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성의 촉진에서 표면 2-4 및 13과 프리마리아™가 표면 1, 19, 33 및 34와 셀바인드™ - 이는 다시 표면 5-12, 14 및 15보다 더 우수함 - 보다 더 우수함을 알게 되었다. 표면 개질 플레이트 3 및 4 상에서, 그리고 로 키나아제 저해제의 존재 하에서, 인간 ES 세포는 부착하여 콜로니를 형성하였으며 이는 확장되고 적어도 10회 계대되어 정상적인 핵형을 갖는 만능 세포를 생성할 수 있었다. (핵형은 표면 4 상에서 성장한 세포에서만 시험함). 표면의 산소 (예를 들어, 넝클론 델타™에 대하여 셀바인드™) 및 질소 (예를 들어, 코스타™에 대하여 프리마리아™; 및 셀바인드™에 대하여 표면 2 및 13) 둘 모두의 함량은 로 저해 및 로 키나아제 저해의 존재 하에 인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성을 지지하는 상기 표면들의 능력에 영향을 주었다. 적어도 약 0.5%의 질소 함량, 적어도 약 17.2%의 질소 및 산소 함량의 합계, 및 적어도 약 13.9도의 물 접촉각을 갖는 표면은 로 키나아제 저해의 존재 하에 인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성을 지지하였다. 적어도 약 0.5%의 질소 함량, 적어도 약 17.3%, 그러나 19.9% 미만의 질소 및 산소 함량의 합계, 및 적어도 약 9.4도의 물 접촉각을 갖는 표면은 몇몇 경우 로 키나아제 저해의 존재 하에 인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성을 지지하였지만 (표면 14), 다른 것에서는 그렇지 않았다 (표면 22-24).

본 발명자는 표면 개질 플레이트 4 상에서 배양한 인간 ES 세포 배양물로부터 로 키나아제 저해제를 제거하면 인간 ES 세포가 고형 기재의 표면으로부터 탈리됨을 알게 되었다. 이어서 상기 세포는 로 키나아제 저해제로 재처리함에 의해 표면에 재부착시킬 수 있다. 인간 ES 세포의 효소적 계대가 잠재적인 스트레스 요인(stressor)이어서 핵형 불안정성을 야기할 수 있다면, 로 키나아제 저해제의 일시적 제거를 이용하여 인간 ES 세포를 계대하는 것이 효소적 계대의 스트레스를 제거할 수 있다.

인간 ES 세포 부착 및 콜로니 형성을 동물 성분이 없는 배지, 로 키나아제 저해 및 표면 개질된 플레이트 4를 이용하여 또한 입증하였다. 표면 개질 플레이트 4를 세포외 매트릭스 단백질로 사전 처리하는 것은 더 많은 콜로니로 이어졌지만, 이는 로 키나아제 저해의 존재 하에서만 그러하였다.

세포를 클러스터로서 계대함에 의해 콜로니 스타일 배양 조건을 유지하는 효소적 방법을 이용하여 인간 ES 세포를 계대하는 것 외에, 인간 ES 세포를 또한 트립엘이™ 또는 아쿠타아제(Accutase)™와 같은 효소를 사용하여 단일 세포로서 계대할 수 있다. 로 키나아제 저해제의 존재 또는 부재 하에서, 트립엘이™를 사용하여 단일 세포의 현탁물로 해리시킨 인간 ES 세포 콜로니는 표면 개질 플레이트 3 및 4에 부착되었으며, 적어도 5회 계대되어 만능성 마커를 갖는 세포를 생성할 수 있는 콜로니를 형성하였다.

단일 세포의 현탁물로서 세포를 계대함으로써 준비된 인간 ES 세포 배양물로부터 로 키나아제 저해제를 제거하는 것은 고형 기재의 표면으로부터의 인간 ES 세포의 탈리로 이어지지 않았지만, 로 키나아제 저해제가 제거되지 않았을 경우보다 더 빠르게 성장하는 콜로니로 이어졌다.

실시예 19

Y-27632를 이용한 처리는 표면 개질 플레이트에의 HEK293 세포 부착을 향상시킨다

인간 배아 신장 세포 293 (HEK293, ECACC 번호 85120602)을 10% 소 태아 혈청 (FBS; 론자(Lonza))을 포함하는 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM; 벨기에 베르비에르스 소재의 론자)에서 유지하였다. 3:1, 1:1, 1:3, 1:7, 및 마지막으로 0:1의 순차적 비의 혈청-보충된 EMEM 및 Pro293a-CDM 배지를 점차적으로 그리고 여러 계대에 걸쳐 사용함으로써 유착성 HEK293의 배양에 최적화된 무혈청 화학적 규명 배지인 Pro293a-CDM 배지 (론자)에 세포를 적응시켰다. 유지 및 적응을 위하여, HEK293 세포를 넝클론 델타™ 표면 (서모 피셔 사이언티픽, 덴마크 로스킬데 소재)을 갖는 75-㎠ 플라스크에서 2.0 x 10⁴개의 세포/㎠로 접종하고, 해리를 위하여 트립신/EDTA를 사용하여 70-80% 융합성에서 계대하였다.

1.0, 4.0 또는 10 μM의 농도의 Y-27632 (시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로 보충된 Pro293a-CDM 배지 (100 ㎕)를 표면 4, 넝클론 델타™ 표면 또는 셀바인드™ 표면을 갖는 평평한 바닥의 96-웰 플레이트에 분배하였다. HEK293을 포함하는 추가의 100 ㎕의 Pro293a-CDM 배지를 상기 웰에 첨가하였다 (4.0 x 10⁴개의 세포/㎠). 이어서 이 배양물을 공기 중 5% CO₂의 가습된 분위기에서 37℃에서 (i) 96시간; 또는 (ii) 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 배양물을 200 ㎕의 둘베코 인산염 완충 염수(Dulbecco s Phosphate Buffered Saline, DPBS; 론자)로 1회 세척하고, 이어서 Y-27632를 포함하지 않는 200 ㎕의 Pro293a-CDM 배지를 첨가하고, 마지막으로 배양물을 추가로 48시간 동안 인큐베이션하였다.

이어서 웰 내의 생육가능한 세포의 개수를 스위스 소재의 로슈(Roche)로부터의 락테이트 데하이드로게나아제 (LDH) 활성 키트를 사용하여 결정하였다. 간략하게는, 웰을 Pro293a-CDM 배지로 세척하고, 유착성 세포를 37℃에서 30분간 인큐베이션하는 동안 2% (v/v) 트리톤(Triton) X-100 (시그마 케미칼 컴퍼니)을 포함하는 100 ㎕ DPBS에서 용해시켰다. 용해물 및 100-㎕ 촉매 및 염료 시약 혼합물을 혼합하고, 암소에서 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 1.0 M HCl을 첨가함으로써 반응을 중단시키고, 490 ㎚에서의 흡광도를 미세플레이트 판독기 (제니오스 프로(Genios Pro); 오스트리아 테칸 소재)에서 측정하였다. 세포수를 이들 샘플로부터의 그리고 LDH를 포함하는 표준물로부터의 A490 값을 사용하여 공지된 세포수로부터 계산하였다.

Pro293a-CDM 배지 중에서의 HEK293 세포의 부착 및 성장에 대한 고형 기재 표면 및 Y-27632의 영향이 도 31a에 예시되어 있으며, 여기서 Y-27632에 96시간 연속 노출시키는 것은 "Y-27632 96h on"으로 표식되어 있고, Y-27632에의 48시간 연속 노출, 이어서 배지 교환 및 Y-27632의 부재 하에서의 48시간의 인큐베이션은 "Y-27632 48h on/48h off"로 표식되어 있다. Y-27632의 부재 하에서, HEK293 세포는 모든 3개의 표면에 부착되었다. 48시간의 인큐베이션 후 배지의 교환은 96시간의 인큐베이션 후 측정할 때보다 배양물 중 세포가 유의하게 더 적었다. Y-27632는 2.0 및 5.0 μM의 농도로 적용될 때 표면 4 및 셀바인드™ 표면 상에서의 HEK293 세포의 부착을 향상시켰다. 48시간의 인큐베이션 후 Y-27632를 제거하면 모든 3개의 표면으로부터 세포가 상당히 탈리되었다.

㎠ 당 2.0 x 10⁴개의 비-적응 HEK293 세포 및 10% FBS로 보충된 EMEM을 내내 사용한 것을 제외하고는 유사한 실험을 실시하였다. 10% FBS가 보충된 EMEM 중에서의 HEK293 세포의 부착 및 성장에 대한 고형 기재 표면 및 Y-27632의 영향이 도 31b에 예시되어 있으며, 여기서 Y-27632에 96시간 연속 노출시키는 것은 "Y-27632 96h on"으로 표식되어 있고, Y-27632에의 48시간 연속 노출, 이어서 배지 교환 및 Y-27632의 부재 하에서의 48시간의 인큐베이션은 "Y-27632 48h on/48h off"로 표식되어 있다. Y-27632의 부재 하에서, HEK293 세포는 모든 3개의 표면에 부착되었다. 48시간의 인큐베이션 후 배지의 교환은 96시간의 인큐베이션 후 측정할 때보다 배양물 중 세포가 유의하게 더 적었다. Y-27632는 2.0 및 5.0 μM의 농도로 적용될 때 표면 4 및 셀바인드™ 표면 상에서의 HEK293 세포의 부착을 향상시켰다. 48시간의 인큐베이션 후 Y-27632를 제거하면 표면 4 및 셀바인드™ 표면으로부터 세포가 상당히 탈리되었다.

실시예 20

Y-27632 및 H-1152를 이용한 처리는 표면 개질 플레이트 상에서의 HEK293 세포 성장을 향상시킨다

HEK293 세포를 10% FBS (론자)를 포함하는 EMEM (론자)에서 유지하였다. 세포를 해리를 위하여 트립신/EDTA를 사용하여 70-80% 융합도에서 계대하고, 넝클론 델타™ 표면 (서모 피셔 사이언티픽, 덴마크 로스킬데 소재)을 갖는 75-㎠ 플라스크에서 대략 2.0 x 10⁴개의 세포/㎠로 접종하였다.

1.0, 5.0, 10, 15 또는 20 μM의 Y-27632 (시그마 케미칼 컴퍼니) 또는 0.4, 1.2, 1.6, 2.4 또는 2.8 μM의 H-1152 (칼바이오켐, 이엠디 케미칼스 인크.(Calbiochem, EMD Chemicals Inc.), 독일 다름스타트 소재)를 포함하는, 10% FBS로 보충된 EMEM (500 ㎕)을 표면 4 또는 비-처리된 (그러나 감마선 조사됨; 25 kGy) 폴리스티렌 표면 중 어느 하나를 갖는 멀티디쉬 24-웰 플레이트에 분배하였다. 10% FBS로 보충되고 HEK293 세포를 포함하는 추가의 500 ㎕의 EMEM을 웰에 첨가하였다 (2.0 x 10⁴개의 세포/㎠). 배양물을 인큐사이트(IncuCyte)™ 플러스 (에센 인스트루먼츠 (Essen Instruments), 미국 미시건주 소재)에 넣고, 공기 중 5% CO₂의 가습된 분위기에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐사이트™ 플러스는 CO₂ 인큐베이터 내부에 맞도록 배치되고, 사용자-정의된 시점에서 그리고 배양물 내부의 위치에서 세포의 위상차 이미지를 획득함으로써 동적, 비침습성 생세포 이미징을 제공하도록 고안된 자동 이미징 플랫폼이다. 이 기기의 주요 계량 기준(metric)은 배양물 융합도(culture confluence), 즉 세포에 의해 덮여지는 표면의 분율이다. HEK293 세포를 조작 없이 72시간 동안 인큐베이션하고, 삼중 배양물에서 9개의 위치에서 매 2시간마다 이미지를 수집하였다. 배양물 융합도를 인큐사이트™ 플러스 소프트웨어 (v. 3.4.1.25966)를 사용하여 결정하였다.

Y-27632 및 H-1152의 농도의 증가는 표면 4 상에서의 HEK293 세포의 부착 및 성장을 향상시킨다 (도 32a). HEK293의 부착 및 성장에 대한 비-처리된 세포 배양용 표면 및 Y-27632 또는 H-1152의 영향이 도 32b에 예시되어 있다. HEK293 세포의 성장 및 부착은 10 μM의 Y-27632 및 0.6 - 1.2 μM의 H-1152의 존재 하에서 약간 향상되었다. 그러나, 비-처리된 세포 배양용 표면 상에서의 HEK293 세포의 성장 및 부착의 향상은 표면 4와의 비교에서 무의미하다.

실시예 21

H-1152를 이용한 처리는 표면 개질 플레이트에의 HEK293 세포의 성장 및 부착을 향상시킨다

0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4 또는 2.8 μM의 H-1152를 포함하는, 10% FBS로 보충된 EMEM (1.0 ㎖)을 표면 4를 갖는 멀티디쉬 12-웰 플레이트에 분배하였다. 10% FBS로 보충되고 HEK293 세포를 포함하는 추가의 1.0 ㎖의 EMEM을 웰에 첨가하였다 (4.0 x 10⁴개의 세포/㎠). 배양물을 인큐사이트™ 플러스에 넣고, 공기 중 5% CO₂의 가습된 분위기에서 37℃에서 42시간 동안 인큐베이션하였다 (이미지를 매 6시간마다 수집함). 이어서, 1 ㎖의 배양 배지를 피펫팅에 의해 제거하고, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 및 1.4 μM의 H-1152를 포함하는, 10% FBS로 보충된 1.0 ㎖의 EMEM을 첨가하였다. 배양물을 인큐사이트™ 플러스에 다시 넣고, 이미지를 이후의 25시간에 걸쳐 매 1시간마다 수집하였다. 이미지를 삼중 배양물에서 9개의 위치에서 수집하고, 배양물 융합도를 인큐사이트™ 플러스 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. H-1152 (0.6 μM)의 부재 또는 존재 하에 성장시킨 HEK293 세포 배양물의 특정 위치에서 수집한 인큐사이트™ 플러스로부터의 이미지를 검색하여 하기 시점에서의 HEK293 배양물 형태의 비교를 위한 위상차 현미경 사진으로서 제시하였다: 인큐베이션 시작 (0시간), 배지 교환 직전 (42시간), 배지 교환한지 1시간 후 (43시간), 및 마지막으로 인큐베이션한지 52시간 후.

H-1152의 부재 하에서 그리고 0.2 μM 또는 0.4 μM의 H-1152의 존재 하에서, 인큐베이션한지 42시간 후 배지의 50%를 교환하면 배양물 융합성이 유의하게 감소하였다 (도 33a). 0.6 μM, 0.8 μM 또는 1.4 μM의 H-1152의 존재 하에서, 배지 교환의 영향은 최소였다. H-1152의 존재 하에 표면 4 상에서 성장시킨 HEK293 세포는 H-1152의 부재 하에 표면 4 상에서 성장시킨 HEK293 세포보다 더 고르게 고형 기재 표면을 덮었다 (도 33b). H-1152의 부재 하에서, HEK293 세포는 큰 클러스터를 형성하였으며, 반면, H-1152의 존재 하에서 HEK293 세포는 보다 낮은 세포 밀도를 갖는 보다 작은 클러스터를 형성하였다.

실시예 22

Y-27632를 이용한 처리는 표면 개질 플레이트 상에서의 3회의 계대에 걸친 HEK293 세포 성장을 향상시킨다

5.0 μM의 Y-27632를 포함하는, 10% FBS로 보충된 EMEM (500 ㎕)을 표면 4 또는 넝클론 델타™ 표면을 갖는 멀티디쉬 24-웰 플레이트의 웰에 분배하였다. 10% FBS로 보충되고 HEK293 세포를 포함하는 추가의 500 ㎕의 EMEM을 웰에 첨가하고 (2.0 x 10⁴개의 세포/㎠), 배양물을 공기 중 5% CO₂의 가습된 분위기에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 37℃에서 2분 동안 트립신/EDTA (벨기에 베르비에르스 소재의 론자)로 처리함으로써 세포를 계대하고, 총 세포수를 뉴클레오카운트 셀 카운터 (NucleoCount Cell Counter) (덴마크 알레뢰드 소재의 케모메텍 에이/에스(Chemometec A/S))를 사용하여 결정하였다. 연속 계대에 있어서, HEK293 세포를 2.0 x 10⁴개의 세포/㎠로 접종하였다. 표면 4 및 넝클론 델타™ 표면 상에서의 HEK293 세포의 성장은 2.5 μM의 Y-27632의 존재에 의해 향상되었다 (도 34).

실시예 23

세포외 매트릭스 단백질/성분 및 영양 세포가 결여된 표면 개질 플레이트 4, 18, 및 19를 사용한 인간 배아 줄기 세포의 부착, 배양 및 유지

8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지에서 1:30의 매트리젤로 코팅된 플라스틱 제품 상에서 유지시킨 계대 42의 H1 hES 세포를 리버라아제™ 효소 처리에 의해 리프팅시키고, 8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지 중 1:2의 희석으로 표면 개질 96웰 포맷 플레이트에 도말하였다. 세포를 개질된 표면 4, 18, 또는 19, 또는 프리마리아™에 도말하였다. 개질된 표면에의 결합에 대한 로 키나아제 저해의 영향을 결정하기 위하여, 본 발명자는 세포를 10 μM의 로 키나아제 저해제 Y-27632, 또는 3 또는 10 μM의 로 키나아제 저해제 H-1152글리실 중 어느 하나로 처리하였다. 미처리된 세포는 대조군으로서의 역할을 하였다. 배양 24시간 후, 웰을 흡인시키고, 세포를 건조시키고, 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

본 출원인은 배양 24시간 후, 표면 개질 플레이트 4 및 19 및 프리마리아™ 플레이트 상에서 로 키나아제 저해제로 처리할 때 ES 세포 콜로니가 부착 및 확산되었음을 관찰하였지만, 동일한 효과가 표면 개질 플레이트 18 (도 35) 상에서는 관찰되지 않았다.

실시예 24

세포외 매트릭스 단백질/성분 및 영양 세포가 결여된 표면 개질 플레이트 30, 31, 32, 33, 및 34를 사용한 인간 배아 줄기 세포의 부착, 배양 및 유지

8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지에서 1:30의 매트리젤로 코팅된 플라스틱 제품 상에서 유지시킨 계대 47의 H1 hES 세포를 트립엘이™ 효소 처리에 의해 리프팅시키고, 8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지 중 1:3의 희석으로 표면 개질 96웰 포맷 플레이트에 도말하였다. 세포를 개질된 표면 30, 31, 32, 33, 또는 34에 도말하였다. 개질된 표면에의 결합에 대한 로 키나아제 저해의 영향을 결정하기 위하여, 본 발명자는 세포를 3 μM의 로 키나아제 저해제 H-1152글리실로 처리하였다. 미처리된 세포는 대조군으로서의 역할을 하였다. 부가적으로, 매트리젤™로 사전 처리한 표면 개질 플레이트의 웰에 세포를 접종하였다. 도말한지 24시간 후, 배지를 8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 신선한 MEF 조절 배지로 교환하고, 로 키나아제 저해제의 존재 하에 접종한 세포의 경우 배지를 3 μM H-1152글리실로 보충하였다. 배양 48시간 후, 웰을 흡인시키고, 세포를 건조시키고, 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

본 발명자는 배양 48시간 후, 표면 개질 플레이트 33 및 34 상에서 로 키나아제 저해제로 처리할 때 ES 세포 콜로니가 부착 및 확산되었음을 관찰하였지만 (각각 도 39 및 40), 동일한 효과가 표면 개질 플레이트 30, 31 또는 32 상에서는 관찰되지 않았다 (각각 도 36-40).

실시예 25

세포외 매트릭스 단백질/성분 및 영양 세포가 결여된 표면 개질 플레이트 22, 23, 24 또는 29를 사용한 인간 배아 줄기 세포의 부착, 배양 및 유지

8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지에서 1:30의 매트리젤로 코팅된 플라스틱 제품 상에서 유지시킨 계대 46의 H1 hES 세포를 리버라아제™ 효소 처리에 의해 리프팅시키고, 8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF 조절 배지 중 1:3의 희석으로 표면 개질 60 ㎜ 디쉬에 도말하였다. 세포를 표면 개질 플레이트 3, 4, 22, 23, 24 및 29에 도말하였다. 개질된 표면에의 결합에 대한 로 키나아제 저해의 영향을 결정하기 위하여, 본 발명자는 세포를 3 μM의 로 키나아제 저해제 H-1152글리실로 처리하여 세포를 도말하였다. 세포를 도말한지 24시간 후, 배지를 8 ng/㎖의 bFGF 및 1 μM의 로 키나아제 저해제 H-1152글리실로 보충된 신선한 MEF 조절 배지로 교환하였다. 개질된 표면 3, 4 또는 매트리젤™ 코팅된 플라스틱에 접종한 세포는 대조군으로서의 역할을 하였다. 도말한지 24시간 및 48시간 후에 플레이트를 위상차 현미경법으로 관찰하였다. 본 발명자는 배양 48시간 후, ES 세포 콜로니는 로 키나아제 저해제를 포함하거나 포함하지 않는 도말된 표면 개질 플레이트 22, 23, 24 또는 29에 부착된 반면, 로 키나아제 저해제의 존재 하에 표면 개질 플레이트 3 또는 4에 도말된 세포는 부착 및 확산되었음을 관찰하였다.

실시예 26

본 발명의 표면 개질 플레이트의 추가의 표면 특성화

물 접촉각

표면 개질 플레이트 1-4 및 13을 개별적으로 플라스틱 백 내에 패킹하고, 살균하고, 40주의 시험 기간 전체에 걸쳐 실온에서 보관하였다. 접촉각을 먼저 표면 처리 및 살균한지 1주일 후에 측정하고, 이어서 도 41에 주어진 시점에서 다시 측정하였다. 모든 접촉각 측정은 실시예 17에 설명한 바와 같이 행하였다. 표면 처리 및 살균을 첫 번째 측정 12주 전보다 더 이전에 행한 것을 제외하고는 표면 1-4 및 13 상에서의 측정과 동일한 실험 조건 하에 넝클론 델타™ 및 셀바인드™ 표면 상에서의 측정을 실시하였다 (누클론 델타™ *는 첫 번째 측정 1주 전에 살균함). 도 41은 표면 개질 플레이트 1-4 및 13이 유사한 친수성의 것이며 넝클론 델타™ 및 셀바인드™ 표면보다 더 큰 친수성 (보다 작은 물 접촉각)의 것이었음을 보여준다. 표면 개질 플레이트 1-4 및 13의 친수성은 표면 처리 및 살균 후 적어도 41주 동안 안정하였다.

플라스틱 백 내에 패킹되고, 실시예 16에 설명한 바와 같이 살균되고, 실온에서 9주 동안 보관된 표면 개질 플레이트 5-12, 22-24, 29, 30 및 33 상에서 접촉각을 또한 측정하였다 (28주 동안 보관된 표면 개질 플레이트 29는 제외). 표면 개질 플레이트 18, 19, 32 및 34는 단일-미세웰 포맷이었으며, 따라서 접촉각 측정에 사용할 수 없었다. 표면 개질 플레이트 30 및 33은 미세웰 플레이트 포맷이었으며, 접촉각 측정은 웰의 내부에서가 아니라 플레이트의 이면 상에서 실시하였다. 샘플 당 7 드롭을 적용하여 삼중 샘플을 분석한 것을 제외하고는, 실시예 17에 설명한 바와 같이 접촉각을 측정하였다 (고도로 친수성인 표면 개질 플레이트 29의 경우, 보다 작은 드롭의 2.5 ㎕ 밀리큐 물을 적용함). 표면 처리 및 살균을 첫 번째 측정 12주 전보다 더 이전에 행한 것을 제외하고는 동일한 실험 조건 하에서 코스타™, 팔콘™, 프리마리아™ 및 넝클론 델타™ 표면을 갖는 플레이트 상에서의 측정을 실시하였다. 도 42는 표면 개질 플레이트 5-12가 넝클론 델타™, 코스타™ 및 팔콘™ 표면보다 더 친수성 (보다 작은 물 접촉각)이었음을 보여준다. 표면 5-12의 친수성은 프리마리아™ 표면의 친수성에 비견되었으며, 표면 1-4 및 13의 친수성보다 더 높았다 (도 41에 예시되어 있음). 표면 개질 플레이트 22-24 및 33의 친수성은 표면 1-4 및 13의 친수성에 비견되었으며 (도 41에 예시되어 있음), 반면, 표면 30의 친수성은 넝클론 델타™, 코스타™ 및 팔콘™ 표면의 친수성에 비견되었다. 표면 개질 플레이트 29는 분석한 다른 표면보다 유의하게 더 친수성이었다.

음전하 밀도

표면 개질 플레이트 5-12 (모두 5-㎝ 디쉬 포맷), 18, 19, 30, 32, 33 및 34 (모두 미세웰 포맷), 표면 개질 플레이트 22-24 및 29 (모두 6-㎝ 디쉬 포맷), 및 셀바인드™표면 (3-㎝ 디쉬 포맷), 프리마리아™ 표면 (멀티디쉬-6 포맷) 및 넝클론 델타™ 표면 (3-㎝ 디쉬 포맷) 상의 음전하의 밀도를 결정하였다. 과량의 크리스탈바이올렛 수용액 (0.015% (w/v))을 각각의 포맷에 첨가하고 (디쉬 포맷의 경우 0.34 ㎖/㎠, 그리고 미세웰 포맷의 경우 0.13 ㎖/㎠), 부드러운 진탕 (50 rpm) 하에서 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 표면에 결합되지 않은 크리스탈 바이올렛을 제거하기 위하여, 디쉬를 디쉬 포맷의 경우 3 ㎖ 밀리큐 물로 3회, 그리고 미세웰 포맷의 경우 350 ㎕의 밀리큐 물로 3회 세척하고, 이어서 60℃에서 하룻밤 건조시켰다. EtOH 용액 (99%) 중 0.1 M HCl을 ㎠ 당 0.17 ㎖ 첨가하고 디쉬를 부드러운 진탕 (50 rpm) 하에 실온에서 2분 동안 인큐베이션함으로써 표면에 결합된 크리스탈 바이올렛을 탈착시켰다. 탈착된 크리스탈 바이올렛을 포함하는 HCl:EtOH 용액의 흡광도를 인비전 2100 미세플레이트 판독기 (퍼킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월삼 소재)를 사용하여 590 ㎚에서 측정하였다. 흡광도 값을 HCl:EtOH 용액의 배경 흡광도에 대하여 보정하였다. 음전하 밀도를 표면 개질 플레이트 5-12, 22-24, 29, 셀바인드™, 프리마리아™ 및 넝클론 델타™를 포함하는 3개의 디쉬 상에서 측정하고, 흡광도 측정을 각각의 디쉬에 대하여 삼중으로 실시하였다. 표면 개질 플레이트 18, 19, 30, 32, 33 및 34에 있어서, 하나의 샘플을 삼중 측정을 이용하여 시험하였다.

표면 개질 플레이트 5-12의 음전하 밀도는 유사하였으며, 이들 표면은 셀바인드™ 표면 및 넝클론 델타™ 표면보다 유의하게 더 낮은, 그러나 프리마리아™ 표면보다 유의하게 더 높은 음전하 밀도를 가졌다 (도 43). 표면 개질 플레이트 19, 33 및 34의 음전하 밀도는 표면 개질 플레이트 18, 30 및 32 - 후자는 중합체 물질이 동일한 각각의 비-처리된 표면임 - 의 음전하 밀도보다 유의하게 더 높았다. 표면 개질 플레이트 22-24 및 29의 음전하 밀도를 넝클론 델타™표면의 음전하 밀도에 대하여 정상화하였고, 도 44는 표면 개질 플레이트 22-24가 넝클론 델타™ 표면보다 더 높은 음전하 밀도를 가지며, 반면 표면 개질 플레이트 29의 음전하 밀도는 넝클론 델타™ 표면 (및 표면 4)의 음전하 밀도보다 유의하게 더 낮았음을 보여준다.

X-선 광전자 분광법 ( XPS )

표면 개질 플레이트 5-12, 18, 19, 22-24, 29, 30, 31-34를 실시예 17에 설명한 바와 같이 XPS를 사용하여 분석하였다. 원자% 단위의 표면 원소 조성이 표 12에 예시되어 있다. 질소를 포함하지 않는 표면 개질 플레이트 31 및 32 (플라스마 처리하지 않음)를 제외하고는, 모든 표면이 탄소, 산소 및 질소를 포함하였다 (수소는 XPS에서 검출되지 않음). 표면 개질 플레이트 5-12는 표면 개질 플레이트 1-4 및 13보다 더 적은 산소, 그러나 코스타™, 팔콘™ 및 넝클론 델타™ 표면보다 유의하게 더 많은 산소를 포함하였다 (표 7에 예시되어 있음). 표면 개질 플레이트 5-12는 마이크로파 플라스마 처리에 의해 준비한 반면, 표면 개질 플레이트 1-4 및 13은 코로나 플라스마 처리에 의해 생성하였다. 코로나 플라스마 처리에 의해 준비한, 그러나 폴리스티렌 (표면 개질 플레이트 1-4 및 13의 준비에서 사용함) 이외의 다른 중합체로부터 사출 성형된 표면 개질 플레이트 19, 33 및 34는 표면 개질 플레이트 1-4 및 13의 것과 비견되는 산소 수준을 포함하였다. 표면 개질 플레이트 22-24는 표면 개질 플레이트1-4 및 13보다 더 적은 산소를 포함하였다. 표면 개질 플레이트 29는 표면 개질 플레이트1-4 및 13과 비견되는 수준의 산소를 포함하였다. 표면 개질 플레이트 5-12, 19, 33 및 34는 표면 개질 플레이트 1-4 및 13보다 더 적은 질소, 그러나 코스타™, 팔콘™ 및 넝클론 델타™ 표면보다 더 많은 질소를 포함하였다 (표 7에 예시되어 있음). 표면 개질 플레이트 29는 프리마리아™ 표면을 포함한 분석한 다른 표면보다 유의하게 더 많은 질소를 포함하였다.

문헌에서 발견되는 화학종의 피크 폭 및 에너지 위치를 이용함으로써, 표면 개질 플레이트 중 탄소에 있어서의 결합 환경을 확인 및 정량화하기 위하여 C1s 스펙트럼 피크를 커브 피팅시켰다 (최상의 카이제곱 피트) (표 13). 농도는 원자% 단위로 보고되어 있는데, 이는 면적 퍼센트에 원자 농도를 곱함으로써 얻었다. 표면 10, 22-24 및 29를 제외한 모든 플라스마-처리된 표면은 탄소 결합 환경 견지에서 유사하였다. C-[O]-C에서의 탄소의 비율은 표면 5-12, 18, 30 및 32와 표면 1-4 및 13에서보다 표면 19, 33 및 34에서 유의하게 더 높았다 (표 8에 예시되어 있음). O-[C=O]-O 결합 환경에서의 탄소의 비율은 표면 1-4 및 13에서보다 표면 5-12, 19, 33 및 34에서 더 낮았다. C*-C-O-C-C*에서의 탄소의 비율은 표면 1-4 및 13에서보다 표면 5-9, 11, 12, 19, 33 및 34에서 유의하게 더 높았지만, 넝클론 델타™ 및 셀바인드™ 표면과 비견되었다. C-O-C 또는 C-NH₃ ⁺ 결합 환경 (스펙트럼에서 동일한 에너지 위치)에서의 탄소의 비율은 표면 1-4 및 13에서보다 표면 5-12, 19, 33 및 34에서 더 낮았지만, 코스타™, 팔콘™, 셀바인드™ 및 프리마리아™ 표면에서보다는 더 높았다. C-O-C*=O 결합 환경에서의 탄소의 비율은 표면 5-12에서보다 표면 19, 33 및 34에서 더 높았으며, 표면 1-4 및 13에서의 수준에 비견되었다. C=O 결합 환경에서의 탄소의 비율은 표면 19, 33 및 34에서보다 표면 5-12에서 더 높았지만, 표면 1-4 및 13에서보다는 더 낮았다. CO₃ ^- 결합 환경에서의 탄소의 비율은 표면 19, 33 및 34에서보다 표면 5-12에서 더 높았으며, 표면 1-4 및 13에서의 수준과 비견되었다. 표면 22-24는 탄소 결합 환경의 견지에서 유사하였다. 표면 22-24에 있어서 C-[O]-C, O-[C=O]-O, C-O-C 또는 C-NH₃ ⁺ , C-O-C*=O 및 C=O에서의 탄소의 비율은 표면 1-4 및 13의 경우보다 유의하게 더 낮았다. CO₃ ^- 및 C*-C-O-C-C* 결합 환경에서의 탄소의 비율은 표면 1-4 및 13의 경우보다 표면 22-24의 경우에 더 높았다. 표면 29의 탄소 결합 환경은 모든 플라스마-처리된 다른 표면의 탄소 결합 환경과 상이하였다. C-[O]-C에서의 탄소의 비율은 표면 1-4 및 13에 비견되었다. O-[C=O]-O, CO₃ ^- 및 C*-C-O-C-C* 결합 환경에서의 탄소의 비율은 표면 1-4 및 13의 경우보다 표면 29의 경우에 더 낮았다. C-O-C 또는 C-NH₃ ⁺, C-O-C*=O 및 C=O 결합 환경에서의 탄소의 비율은 표면 1-4 및 13의 경우보다 표면 29의 경우에 더 높았다. 에너지 손실 피크가 방향족 Π→Π^* 전이에서 생성되며, 이는 표면 방향성의 지시자이다.

O1s 스펙트럼 피크는 거의 가우스형이었으며 커브 피팅할 수 없었다. 문헌에서 발견되는 화학종의 피크 폭 및 에너지 위치를 이용함으로써, 표면 중 질소에 있어서의 결합 환경을 확인 및 정량화하기 위하여 N1s 스펙트럼 피크를 커브 피팅시켰다 (최상의 카이제곱 피트) (표 14). 농도는 원자% 단위로 보고되어 있는데, 이는 면적 퍼센트에 원자 농도를 곱함으로써 얻었다. 표면 9를 제외한 모든 표면에서 -NH₃ ⁺ 결합 환경에서의 질소의 비율은 표면 1-4 및 13에서 더 낮았다. 표면 5-12, 19, 33 및 34에서 -NH₂ 결합 환경에서의 질소 비율은 다양하였지만, 표면 1-4 및 13에서보다 더 높았다. 표면 5-12, 19, 33 및 34에서 -NO₂ 결합 환경에서의 질소 비율은 다양하였지만, 표면 1-4 및 13에서보다 더 낮았다. 표면 5-12, 19, 33 및 34에서 -NO₃ 결합 환경에서의 질소 비율은 다양하였지만, 표면 1-4 및 13에서보다 더 높았다. 표면 22-24 및 29의 질소 결합 환경은 다른 플라스마-처리된 표면과 상이하였다. 표면 22-24 및 29에서 -NH₂ 결합 환경에서의 질소의 비율은 다양하였지만, 표면 1-4 및 13에서보다 유의하게 더 높았다. -NO₂ 결합 환경에서의 질소의 비율은 표면 1-4 및 13에서보다 표면 22-24 및 29에서 더 낮았다. O=C-N-C=O 결합 환경에서의 질소의 비율은 표면 22-24 및 29와 표면 1-4 및 13에서 비견할만하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양이 실시예와 바람직한 실시 형태를 참고로 하여 상기에서 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해서가 아니라 특허법의 원리 하에서 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 규정됨이 이해될 것이다.

Claims

영양 세포층이 결여되고 흡착층이 결여된 표면에 인간 배아 줄기세포를 부착시키는 방법으로서,
a. 로 키나아제(Rho kinase) 활성을 저해할 수 있는 화합물 또는 로 활성을 저해할 수 있는 화합물의 존재 하에 인간 배아 줄기세포 현탁물을 상기 표면에 첨가하는 단계; 및
b. 세포가 부착되게 하는 단계를 포함하며, 상기 표면이 코로나 플라스마 처리된 폴리스티렌을 포함하고, 상기 표면은 하기 특징 중 하나를 가지는, 방법:
적어도 1.3%의 N, 적어도 24.9%의 O와 N의 합계 및 적어도 20.7도의 접촉각;
적어도 1.7%의 N, 적어도 29.6%의 O와 N의 합계 및 적어도 14.3도의 접촉각;
적어도 2.0%의 N, 적어도 30.7%의 O와 N의 합계 및 적어도 18.4도의 접촉각;
적어도 2.1%의 N, 적어도 30.2%의 O와 N의 합계 및 적어도 17.4도의 접촉각;
적어도 1.8%의 N, 적어도 28.2%의 O와 N의 합계 및 적어도 18.8도의 접촉각.
제1항에 있어서, 상기 세포 현탁물을 상기 표면에 첨가하기 전에 상기 표면에 흡착층을 추가하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 세포가 표면에 부착된 후 세포를 배양으로 유지하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 현탁물이 세포 클러스터의 현탁물인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 현탁물이 단일 세포의 현탁물인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표면이 용기 또는 매트릭스의 일부인 방법.
제1항에 있어서, 로 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물의 존재 하에 상기 세포 현탁물을 상기 표면에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 로 활성을 저해할 수 있는 화합물의 존재 하에 상기 세포 현탁물을 상기 표면에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, Y-27632의 존재 하에 상기 세포 현탁물을 상기 표면에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, H-1152, 파수딜 또는 하이드록시파수딜의 존재 하에 상기 세포 현탁물을 상기 표면에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
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제1항에 있어서, 로 키나아제(Rho kinase) 활성을 저해할 수 있는 화합물 또는 로 활성을 저해할 수 있는 화합물의 존재 하에 부착되지 않은 인간 배아 줄기세포와 비교하였을 때 향상된 기재 부착을 제공하는, 방법.
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