ES2258329T3 - Celulas madre mesenquimaticas para la prevencion y tratamiento de respuestas inmunes en trasplantes. - Google Patents

Abstract

Un método ex vivo para reducir una respuesta inmune contra un aloantígeno, que comprende: poner en contacto células efectoras inmunes ex vivo con células madre mesenquimáticas en una cantidad eficaz para reducir la respuesta inmune.

Description

Células madre mesenquimáticas para la prevención y tratamiento de respuestas inmunes en trasplantes.

La presente invención se refiere a la inhibición de una respuesta de células T a un aloantígeno y además se refiere a la inhibición y/o o prevención de la reactivación de células T activadas previamente. Más particularmente, la presente invención se refiere al campo de la prevención, reducción o tratamiento de una respuesta inmune provocada por células efectoras inmunes contra tejidos y/o células y/u órganos extraños. La invención además se refiere a la prevención, reducción o tratamiento del rechazo de trasplantes y/o la reacción de injerto contra hospedador.

Antecedentes de la invención

La tolerancia es la ausencia adquirida de respuesta específica a un antígeno frente al que normalmente se produciría una respuesta inmune. Típicamente, para inducir tolerancia, debe haber una exposición a un antígeno de tolerancia, lo cual tiene como resultado la muerte o inactivación funcional de ciertos linfocitos. La tolerancia completa se caracteriza por la ausencia de una respuesta inmune detectable, mediada por anticuerpos o por células, a la segunda exposición antigénica. La tolerancia parcial se tipifica por la reducción cuantitativa de una respuesta inmune.

La función del sistema inmune es eliminar cuerpos extraños que pueden contener patógenos y mantener la ausencia de respuesta o la tolerancia frente a autoantígenos. La tolerancia de las células T se consigue 1) en el timo, cuando se eliminan por deleción clonal (tolerancia central) timocitos reactivos para autopéptidos, y 2) en la periferia por exposición a autoantígenos en condiciones tolerogénicas (tolerancia periférica). La deleción clonal también puede deberse a la expresión de moléculas de muerte celular en células presentadoras de antígenos. Son ejemplos clásicos de moléculas de muerte el ligando Fas (FasL) y el ligando TRAIL, que se unen a sus receptores, Fas y DR4, respectivamente, en células T activadas, induciendo la apoptosis de las células T. La interacción de CD27, un miembro de la superfamilia de TNFR, y el ligando CD27 (CD70) también induce la apoptosis de células T.

Desafortunadamente, el sistema inmune no distingue los intrusos beneficiosos, tales como el tejido trasplantado, de los que son perjudiciales, y de esta manera el sistema inmune rechaza tejidos u órganos trasplantados. El rechazo de órganos trasplantados está mediado de forma significativa por células T alorreactivas presentes en el hospedador que reconocen xenoantígenos o aloantígenos del donante.

En el momento actual, para prevenir o reducir una respuesta inmune contra un trasplante, se trata a los pacientes con potentes fármacos inmunosupresores. La infusión en estos individuos de fármacos que previenen o reprimen la respuesta inmune de células T inhibe el rechazo del trasplante, pero también puede ocasionar una supresión inmune general, toxicidad e incluso la muerte debido a infecciones oportunistas. Debido a la toxicidad y a la proporción de respuesta incompleta con el tratamiento convencional del rechazo de tejidos de donantes, se necesitan estrategias alternativas para tratar a los pacientes que no puedan resistir o no respondan a los modos actuales de terapia con fármacos.

Por consiguiente, existe la necesidad de prevenir y/o reducir una respuesta inmune indeseada por un hospedador frente a un trasplante por células efectoras inmunes, como método para evitar el rechazo de tejidos de donantes por parte del hospedador. También sería ventajoso un método para eliminar o reducir una respuesta inmune indeseada por un tejido de donante contra un tejido del receptor, conocida como enfermedad de injerto contra
hospedador.

El documento WO 97/41863 describe que puede promoverse inmunotolerancia a un injerto en un mamífero receptor por medio de la administración de células madre hematopoyéticas.

El documento US 5.486.359 describe el aislamiento, purificación y expansión cultural de células madre mesenquimáticas humanas, proporcionando de esta manera una población homogénea de células madre mesenquimáticas.

El documento WO 96/23058 describe que el injerto de médula ósea se mejora en un individuo por medio de la administración de células madre mesenquimáticas e injertos de médula ósea.

Sumario de la invención

Se ha descubierto que pueden usarse células madre mesenquimáticas humanas en trasplantes para mejorar una respuesta por el sistema inmune de tal forma que se reduzca o elimine la respuesta inmune frente al antígeno o antígenos.

La invención se refiere a un método ex vivo para reducir una respuesta inmune contra un aloantígeno de acuerdo con la reivindicación 1. La invención se refiere además al uso de células madre mesenquimáticas purificadas para la fabricación de una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4. La invención también se refiere al uso de células madre mesenquimáticas para la fabricación de una preparación de acuerdo con la reivindicación 29. Además, la invención se refiere a un método ex vivo para reducir una respuesta inmune producida por un trasplante de un donante de acuerdo con la reivindicación 31.

La invención proporciona un método ex vivo para reducir o suprimir una respuesta inmune producida por células T que responden a un aloantígeno, en particular un tejido, órgano o células alogénicas, en el que la respuesta inmune se reduce o suprime por medio del uso de células madre mesenquimáticas. Las células madre mesenquimáticas pueden ser autólogas con respecto a las células T (obtenidas a partir del mismo hospedador) o alogénicas con respecto a las células T. En el caso de células madre mesenquimáticas que son alogénicas con respecto a las células T, las células madre mesenquimáticas pueden ser autólogas con respecto a las células o tejidos a los que responden las células T (obtenidas a partir del mismo hospedador) o las células madre mesenquimáticas pueden obtenerse a partir de un hospedador que es alogénico tanto con respecto a la fuente de las células T como con respecto a la fuente de las células o tejidos a los que responden las células T.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso ex vivo para prevenir la reestimulación de células T activadas (activadas contra un aloantígeno, en particular un órgano, tejido o células alogénicas) poniendo en contacto células T activadas con células madre mesenquimáticas en una cantidad eficaz para prevenir y/o reducir la respuesta de células T posterior a un antígeno extraño. Las células madre mesenquimáticas que se usan pueden ser autólogas con respecto a las células T y/o alogénicas con respecto a las células T. Cuando se usan células madre mesenquimáticas alogénicas, las células madre mesenquimáticas pueden obtenerse a partir del mismo hospedador que el tejido o las células que activaron las células T o pueden obtenerse a partir de un hospedador que es alogénico tanto con respecto a las células T como con respecto al hospedador que proporcionó las células o tejidos que activaron las células T.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se usan células madre mesenquimáticas para la fabricación de una preparación para suprimir o mejorar una respuesta inmune a un trasplante (tejido, órgano, células, etc.) por medio de la administración de la preparación a las células madre mesenquimáticas del receptor del trasplante en una cantidad eficaz para suprimir o mejorar una respuesta inmune contra el trasplante. Las células madre mesenquimáticas pueden ser autólogas con respecto al receptor del trasplante o pueden ser alogénicas con respecto al receptor del trasplante.

Por consiguiente, un método ex vivo de la presente invención proporciona poner en contacto el receptor del tejido de donante con células madre mesenquimáticas. En una realización de este aspecto, el método implica el uso de células madre mesenquimáticas purificadas para la fabricación de una preparación farmacéutica para administración al receptor del tejido de donante. La preparación farmacéutica que comprende células madre mesenquimáticas purificadas puede administrarse al receptor antes o al mismo tiempo que el trasplante o después del trasplante. Las células madre mesenquimáticas pueden ser autólogas o pueden ser alogénicas al receptor y pueden obtenerse a partir del donante. En otro aspecto de la invención, las células madre mesenquimáticas alogénicas también se pueden obtener a partir de una fuente que no sea el donante y esta fuente no necesita corresponder ni al tipo del donante ni al tipo del receptor.

En otra realización de este método, como parte de un procedimiento de trasplante, las células madre mesenquimáticas se modifican para expresar una molécula que induce muerte celular. Las células madre mesenquimáticas pueden usarse para suministrar al sistema inmune una molécula que induce la apoptosis de células T activadas que llevan un receptor para la molécula. Esto tiene como resultado la deleción de linfocitos T activados y la supresión de una respuesta inmune indeseada a un trasplante. De acuerdo con este aspecto de la invención, se modifican células madre mesenquimáticas humanas alogénicas para expresar una molécula de muerte celular. La molécula puede ser exógena o endógena a las células madre mesenquimáticas. En realizaciones preferidas de los métodos descritos en este documento, las células madre mesenquimáticas expresan la molécula de muerte celular ligando Fas o ligando
TRAIL.

Las células madre mesenquimáticas también pueden usarse en una preparación farmacéutica para administración al receptor como parte del trasplante. Para este objetivo, la presente invención proporciona un método ex vivo para reducir o mejorar una respuesta inmune incluyendo o proporcionando por perfusión al tejido u órgano de donante en el receptor células madre mesenquimáticas obtenidas a partir del donante del órgano o tejido, células madre mesenquimáticas procedentes de una tercera parte o células madre mesenquimáticas autólogas a las células T. Las células madre mesenquimáticas mejoran la respuesta inmune por las células T del receptor contra el tejido extraño cuando se trasplanta en el receptor.

En otra realización de esta invención, las células madre mesenquimáticas perfundidas en el órgano o tejido también pueden incluir una molécula que induce muerte de células T activadas.

En otra realización, el método de la presente invención proporciona el uso de células madre mesenquimáticas purificadas para la fabricación de una preparación farmacéutica para tratar a un paciente que ha recibido un trasplante, con el fin de reducir la gravedad o eliminar un episodio de rechazo contra el trasplante, por medio de la administración al receptor del tejido de donante de una composición farmacéutica que comprende células madre mesenquimáticas purificadas después de que el tejido de donante se haya trasplantado al receptor. Las células madre mesenquimáticas pueden ser autólogas o alogénicas con respecto al receptor. Las células madre mesenquimáticas alogénicas pueden obtenerse a partir del donante o a partir de una tercera parte. La presentación de células madre mesenquimáticas a un receptor que experimenta una respuesta inmune adversa a un trasplante induce la ausencia de respuesta de las células T a una estimulación antigénica adicional, reduciéndose o eliminándose de esta manera una respuesta adversa por las células T activadas al tejido u órgano de donante.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método ex vivo para reducir una respuesta inmune por un tejido, órgano o células de donante contra un receptor, es decir, la respuesta de injerto contra hospedador, que comprende tratar el tejido, órgano o las células de donante con células madre mesenquimáticas alogénicas (alogénicas con respecto al de donante) ex vivo antes del trasplante del tejido, órgano o células en el receptor. Las células madre mesenquimáticas reducen en el trasplante la respuesta de las células T, que posteriormente pueden activarse contra células presentadoras de antígenos del receptor de tal forma que el trasplante pueda introducirse en el cuerpo del receptor (hospedador) sin la aparición o con una reducción en la respuesta adversa del trasplante al hospedador. De esta manera, se previene lo que se conoce como enfermedad de "injerto contra hospedador".

En una realización preferida, el trasplante de donante primero puede exponerse a tejidos o células del receptor o de una tercera parte ex vivo, para activar las células T en el trasplante de donante. El trasplante de donante después se pone en contacto con células madre mesenquimáticas autólogas o alogénicas con respecto al donante. Las células madre mesenquimáticas pueden ser células madre mesenquimáticas del receptor o de una tercera parte. Las células madre mesenquimáticas reducirán o inhibirán la respuesta inmune secundaria adversa por células T en el trasplante de donante contra la estimulación antigénica por parte del receptor cuando el trasplante de donante posteriormente se introduzca en el receptor.

Por consiguiente, las células madre mesenquimáticas pueden obtenerse a partir del receptor, por ejemplo, antes del trasplante. Las células madre mesenquimáticas pueden aislarse y almacenarse en estado congelado hasta que se necesiten. Las células madre mesenquimáticas también pueden expandirse en cultivo hasta las cantidades deseadas y almacenarse hasta que se necesiten. Las células madre mesenquimáticas purificadas se administran en una preparación farmacéutica al receptor en una cantidad eficaz para reducir o eliminar una respuesta inmune adversa en curso producida por el trasplante de donante contra el receptor (hospedador). La presentación de células madre mesenquimáticas al receptor que experimenta una respuesta inmune adversa producida por un trasplante inhibe la respuesta en curso y previene la reestimulación de las células T, reduciendo o eliminando de esta manera una respuesta adversa por células T activadas al tejido del receptor.

Otra realización incluye modificar las células madre mesenquimáticas del receptor por una molécula que induce muerte de células T activadas.

De esta manera, de acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención, se emplean células madre mesenquimáticas humanas para tratar el rechazo de trasplantes y/o la enfermedad de injerto contra hospedador como resultado de un trasplante y/o prevenir o reducir el rechazo de trasplantes y/o la enfermedad de injerto contra hospedador. También pueden emplearse células madre mesenquimáticas humanas para facilitar el uso de injertos o trasplantes xenogénicos.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. Las células madre mesenquimáticas alogénicas no inducen una respuesta inmune. Las células T procedentes de A proliferaron de una manera dependiente de la dosis cuando se mezclaron con diferentes cantidades de PBMC procedentes de B. Las células T procedentes de A no proliferaron en respuesta al contacto con células madre mesenquimáticas procedentes de B, aunque las células madre mesenquimáticas se manipularan para proporciona una activación completa de células T (las células madre mesenquimáticas se trataron con IFN-\gamma y se transdujeron con moléculas co-estimuladoras B7-1 o B7-2.

Fig. 2. Las células madre mesenquimáticas suprimieron de forma activa la reacción mixta de linfocitos (MLR) entre linfocitos de dos individuos diferentes. Las hMSC alogénicas con respecto al receptor (tercera parte o donante) no correspondían en tipo ni a las células estimuladoras ni a las células respondedoras en la MLR (barras blancas); o las hMSC correspondían en tipo (donante) a las células estimuladoras en la MLR (barras sombreadas). De esta manera, las células madre mesenquimáticas suprimieron la MLR sin especificidad en cuanto al tipo de MHC. Las células madre mesenquimáticas suprimieron la MLR de una manera dependiente de la dosis.

La Figura 3 muestra la respuesta secundaria de células T respondedoras inducidas por PBMC estimuladoras (alogénicas), no expuestas a MSC, y después expuestas a PBMC autólogas, PBMC alogénicas (estimulador o tercera parte) o sin células.

La Figura 4 muestra la respuesta secundaria de células T respondedoras activadas por PBMC estimuladoras (alogénicas), posteriormente cultivadas con MSC alogénicas (estimulador) y después expuestas a PBMC autólogas, PBMC alogénicas (estimulador o tercera parte) o sin células.

La Figura 5 (Figs 5A-5D) demuestra que se suprimió la respuesta secundaria de células T respondedoras previamente activadas por PBMC alogénicas estimuladoras y después de la activación cultivadas con MSC alogénicas (mismo donante (Fig. 5B), tercera parte (Fig. 5D) o autólogas (Fig. 5C)) y después expuestas a células estimuladoras autólogas o alogénicas (mismo donante o tercera parte).

La Figura 6 (Figs 6A-6D) muestra la supresión de una MLR primaria en el modelo canino por MSC. autol = autólogo; ident = compañeros de camada con idéntico DLA; unrel = no relacionados.

La Figura 7 muestra la supresión de una MLR primaria por MSC no adherentes.

La Figura 8 muestra un mapa esquemático del plásmido EGFP pOT24 usado en el Ejemplo 8.

Descripción detallada de la invención

Como se define en este documento, una célula madre mesenquimática alogénica se obtiene a partir de un individuo diferente de la misma especie que el receptor. Los antígenos de donante se refieren a antígenos expresados por el tejido de donante que se va a trasplantar en el receptor. Los aloantígenos son antígenos que difieren de los antígenos expresados por el receptor. El tejido, los órganos o las células de donante a trasplantar constituyen el trasplante. Como ejemplos de trasplantes pueden incluirse piel, médula ósea y órganos sólidos tales como corazón, páncreas, riñón, pulmón e hígado.

Los inventores han descubierto que cuando se ponen en contacto células madre mesenquimáticas humanas con linfocitos T alogénicos, in vitro, las células T alogénicas no proliferan. Normalmente, el co-cultivo de células de diferentes individuos tiene como resultado una respuesta de células T, manifestada por la activación y proliferación de las células T, conocida como reacción mixta de linfocitos (MLR).

Estos resultados inesperados demuestran que las células T no responden a células madre mesenquimáticas no correspondientes. La falta de una respuesta proliferativa a células madre mesenquimáticas humanas por las células T alogénicas era inesperada, porque las células madre mesenquimáticas humanas expresan moléculas en la superficie que hacen que sean inmunogénicas, es decir, expresan moléculas del MHC de clase I alogénicas. Este descubrimiento indica que las células madre mesenquimáticas no son inmunogénicas para el sistema inmune.

Los inventores también descubrieron que las células madre mesenquimáticas pueden suprimir una MLR entre células alogénicas. Las células madre mesenquimáticas redujeron de forma activa la respuesta de células T alogénicas en reacciones mixtas de linfocitos de una forma dependiente de la dosis. Además, las células madre mesenquimáticas procedentes de diferentes donantes no presentaban especificidad de respuesta reducida con respecto al tipo de MHC. De esta manera, las células madre mesenquimáticas no necesitaban tener una correspondencia de MHC con la población de células diana en la reacción mixta de linfocitos para reducir la respuesta proliferativa de células T alorreactivas a células madre mesenquimáticas.

Por consiguiente, la presente invención proporciona el uso de células madre mesenquimáticas purificadas para la fabricación de una preparación farmacéutica para reducir, inhibir o eliminar una repuesta inmune por medio de la administración de células madre mesenquimáticas alogénicas a un receptor de un tejido, órgano o células de donante. En una realización, las células madre mesenquimáticas se administran al receptor simultáneamente con el trasplante. Como alternativa, las células madre mesenquimáticas humanas pueden administrarse antes o junto con la administración del trasplante. Por ejemplo, las células madre mesenquimáticas humanas pueden administrarse al receptor de aproximadamente 3 a 7 días antes del trasplante del tejido de donante.

De esta manera, las células madre mesenquimáticas pueden usarse para la fabricación de una preparación farmacéutica para condicionar el sistema inmune de un receptor a un tejido de de donante o tejido extraño por medio de la administración al receptor, antes o al mismo tiempo que el trasplante del tejido de donante, de células madre mesenquimáticas en una cantidad eficaz para reducir o eliminar la repuesta inmune contra el trasplante por las células T del receptor. Las células madre mesenquimáticas afectan a las células T del receptor de tal forma que la respuesta de células T se reduce o elimina cuando se presentan al tejido de de donante o tejido extraño. De esta manera, se puede evitar el rechazo del trasplante por parte del hospedador o puede reducirse su gravedad.

Los inventores han descubierto además que cuando los linfocitos T que ya se han expuesto a una estimulación antigénica, es decir, están activados, posteriormente se exponen a células madre mesenquimáticas, las células T no producen o producen una respuesta inmune reducida a la estimulación antigénica posterior por células alogénicas. De esta manera, las células madre mesenquimáticas inducen un estado de hiporrespuesta de las células T.

Estos resultados inesperados demuestran que las células T activadas se volvieron no respondedoras a una estimulación alogénica adicional por exposición de las células T preactivadas a células madre mesenquimáticas humanas. Las células madre mesenquimáticas pueden ser autólogas o alogénicas con respecto a las células T.

Por consiguiente, la presente invención proporciona el uso de células madre mesenquimáticas purificadas para la fabricación de una preparación farmacéutica para tratar a un paciente que está experimentado una respuesta inmune adversa a un trasplante por medio de la administración de células madre mesenquimáticas a dicho paciente en una cantidad eficaz para reducir o suprimir la respuesta inmune. Las células madre mesenquimáticas se obtienen a partir del donante del tejido, el receptor del trasplante o una tercera parte.

Las células madre mesenquimáticas además pueden modificarse para expresar una molécula de muerte celular para mejorar la eliminación de las células T activadas. Por ejemplo, la molécula de muerte celular puede expresarse por las células madre mesenquimáticas que se han modificado por ingeniería genética para expresar la molécula de muerte celular exógena.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método ex vivo para reducir, inhibir o eliminar una respuesta inmune por un trasplante de donante contra su receptor (injerto contra hospedador). Por consiguiente, la invención proporciona poner en contacto un órgano o tejido de donante con células madre mesenquimáticas antes del trasplante. Las células madre mesenquimáticas mejoran, inhiben o reducen una respuesta adversa por el trasplante de donante contra el receptor.

En una realización preferida, antes del trasplante, el trasplante de donante se trata con tejido o células alogénicas (receptor) que activan las células T en el trasplante de donante. El trasplante de donante después se trata con células madre mesenquimáticas, autólogas o alogénicas, antes del trasplante. Las células madre mesenquimáticas previenen la reestimulación o inducen una hiporrespuesta de las células T a la estimulación antigénica pos-
terior.

Para el preacondicionamiento de un trasplante de donante, las células madre mesenquimáticas pueden modificarse adicionalmente para expresar una molécula de muerte celular de tal forma que se eliminen las células T activadas que han entrado en contacto con las células madre mesenquimáticas.

De esta manera, en el contexto del trasplante de médula ósea (células madre hematopoyéticas), puede reducirse o eliminarse el ataque del hospedador por el injerto. La médula ósea puede pretratarse con células madre mesenquimáticas del receptor antes del implante de la médula ósea o de células madre de sangre periférica en el receptor. En una realización preferida, la médula del donante primero se expone a tejido/células del receptor y después se trata con células madre mesenquimáticas. Aunque sin limitarse a ello, se cree que el contacto inicial con el tejido o las células del receptor funciona para activar las células T en la médula. El tratamiento posterior con las células madre mesenquimáticas inhibe o elimina la activación adicional de las células T en la médula, reduciendo o eliminando de esta manera un efecto adverso por el tejido de donante, es decir, la terapia reduce o elimina la respuesta de injerto contra hospedador.

En otra realización, puede tratarse un receptor de un trasplante que padece la enfermedad de injerto contra hospedador para reducir o eliminar la gravedad de esta enfermedad por medio de la administración a dicho receptor de una preparación farmacéutica que comprende células madre mesenquimáticas purificadas autólogas o alogénicas con respecto al donante, pudiendo ser dichas células alogénicas células madre mesenquimáticas autólogas con respecto al receptor o células madre mesenquimáticas de tercera parte, en una cantidad eficaz para reducir o eliminar un rechazo de injerto del hospedador. Las células madre mesenquimáticas inhiben o suprimen en las células T activadas del tejido de donante la creación de una respuesta inmune contra el receptor, reduciendo o eliminando de esta manera la respuesta de injerto contra hospedador.

Las células madre mesenquimáticas del receptor pueden obtenerse a partir del receptor antes del trasplante y pueden almacenarse y/o expandirse en cultivo para proporcionar una reserva de células madre mesenquimáticas en cantidades suficientes para tratar un ataque en curso de un injerto contra un hospedador.

En otro método de la presente invención, el tejido de donante se expone a células madre mesenquimáticas de tal forma que las células madre mesenquimáticas se integran en el propio injerto de órgano antes del trasplante. En esta situación, una respuesta inmune contra el injerto producida por cualquier célula del receptor alorreactiva que escape al tratamiento convencional para prevenir el rechazo del trasplante, por ejemplo, inmunosupresión mediada por fármacos, se suprimiría por las células madre mesenquimáticas presentes en el injerto. Las células madre mesenquimáticas preferiblemente son alogénicas con respecto al receptor y pueden ser células madre mesenquimáticas de donante o células madre mesenquimáticas obtenidas a partir de otro individuo distinto del donante o el receptor. En algunos casos, pueden usarse células madre mesenquimáticas autólogas con respecto al receptor para suprimir una respuesta inmune contra el injerto.

En otra realización de este método, las células madre mesenquimáticas se modifican por ingeniería genética para expresar moléculas de muerte celular de tal forma que cualquier célula T del hospedador alorreactiva se elimine tras el contacto con estas células madre mesenquimáticas.

Adicionalmente se cree que además de prevenir o mejorar una respuesta inmune inicial, las células madre mesenquimáticas que permanecen en el sitio local también suprimirían cualquier respuesta de células T posterior que pudiera producirse.

Como se usa en este documento, una "molécula de muerte celular" es una molécula que interacciona o se une con su receptor afín en una célula T estimulada que induce muerte de células T o apoptosis. Fas media la apoptosis de células T activadas recientemente que se exponen de nuevo a estimulación (van Parijs et al., Immunity 4: 321-328 (1996)). Fas es un receptor de membrana de tipo I que cuando presenta enlaces cruzados por su ligando afín induce apoptosis en una amplia diversidad de células. La interacción entre la molécula Fas (CD95) en células T diana y su ligando Fas L en células madre mesenquimáticas tiene como resultado la agregación de receptores, con lo que se transducen señales que conducen a la apoptosis de la célula diana. Se ha demostrado que el sistema Fas está implicado en varias funciones celulares in vivo, incluyendo la selección negativa de timocitos, el mantenimiento de sitios de privilegio inmune dentro del cuerpo y la citotoxicidad mediada por linfocitos T citotóxicos (CTL) (Green y Ware, Proc Natl Acad Sci, 94 (12): 5986-90 (1997)).

Otros miembros de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) tienen papeles en la muerte celular programada. El ligando TRAIL, que interacciona con su receptor DR4, puede inducir apoptosis en una diversidad de líneas celulares transformadas (G. Pan et al. Science, 277: 815-818 (1997)); y la expresión de CD27 y su ligando CD70 (Prasad et al., Proc Natl Acad Sci, 94: 6346-6351 (1997)) también induce la apoptosis. La expresión de Fas se restringe a células T estimuladas y sitios de privilegio inmune. TRAIL se detecta en muchos tejidos normales.

Tanto el ligando Trail como CD27, pero no el ligando Fas, se expresan en células madre mesenquimáticas humanas no manipuladas. Las células T activadas, pero no las células T en reposo, expresan el receptor Trail y CD70. La mayoría de las células T encontradas en el cuerpo están en estado en reposo; las células T se activan cuando encuentran células tanto en el contexto del MHC como la molécula co-estimuladora apropiada tal como B7-1 o B7-2.

De esta manera, el encaje de receptores de muerte celular en células T activadas con sus ligandos expresados en las células madre mesenquimáticas tiene como resultado la muerte de células T por medio de apoptosis. Ciertos ligandos distintos de los mencionados específicamente antes y sus receptores, presentes dentro de las células madre mesenquimáticas o introducidos en las células madre mesenquimáticas, pueden realizar esta función. Por lo tanto, las células madre mesenquimáticas administradas a un individuo delecionan las células T activadas, reduciendo la gravedad o incidencia de la enfermedad de rechazo de trasplantes.

De acuerdo con los métodos de la presente invención descritos en este documento, se contempla que las células madre mesenquimáticas de la presente invención pueden usarse junto con modos actuales de tratamiento del rechazo del tejido de donante o de la enfermedad de injerto contra hospedador. Una ventaja de este uso es que mejorando la gravedad de la respuesta inmune en el receptor de un trasplante, puede reducirse la cantidad de fármaco usada en el tratamiento y/o la frecuencia de la administración de terapia con fármacos, dando como resultado un alivio de la supresión inmune general y efectos secundarios indeseados.

Además se contempla que puede requerirse únicamente un solo tratamiento con las células madre mesenquimáticas de la presente invención, eliminando la necesidad de una terapia crónica con fármacos inmunosupresores. Como alternativa, pueden emplearse múltiples administraciones de células madre mesenquimáticas.

Por consiguiente, la invención descrita en este documento permite la prevención o tratamiento del rechazo de trasplantes por medio de la administración de las células madre mesenquimáticas en una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz para la prevención, tratamiento o mejora del rechazo de trasplantes de un órgano, tejido o células de la misma especie, o de un trasplante de xenoinjerto de órgano o tejido, y/o de la enfermedad de injerto contra hospedador.

La administración de una sola dosis de células madre mesenquimáticas puede ser eficaz para reducir o eliminar la respuesta de células T a un tejido alogénico con respecto a las células T o a un tejido "no propio", particularmente en el caso en el que los linfocitos T retienen su carácter de falta de respuesta (es decir, tolerancia o anergia) a células alogénicas después de separarse de las células madre mesenquimáticas.

La dosificación de las células madre mesenquimáticas varía dentro de amplios límites y, por supuesto, se ajustará a los requisitos individuales en cada caso particular. En general, en el caso de la administración parenteral, es habitual administrar de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 millones de células por kilogramo de peso corporal del receptor. El número de células usado dependerá del peso y del estado del receptor, el número o frecuencia de administraciones y otras variables conocidas por los especialistas en la técnica. Las células madre mesenquimáticas pueden administrarse por una vía que sea adecuada para el tejido, órgano o células a trasplantar. Pueden administrarse por vía sistémica, es decir, parenteral, por inyección intravenosa o pueden dirigirse a un tejido u órgano particular, tal como la médula ósea. Las células madre mesenquimáticas humanas pueden administrarse por implantación subcutánea de células o por inyección de células madre en tejido conectivo, por ejemplo, músculo.

Las células pueden suspenderse en un diluyente apropiado a una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 x 10^{6} células/ml. Son excipientes adecuados para soluciones de inyección los que son biológica y fisiológicamente compatibles con las células y con el receptor, tales como solución salina tamponada u otros excipientes adecuados. La composición para administración debe formularse, producirse y almacenarse de acuerdo con métodos convencionales que cumplen los criterios apropiados de esterilidad y estabilidad.

Las células madre mesenquimáticas pueden aislarse, preferiblemente a partir de médula ósea, purificarse y expandirse en cultivo, es decir, in vitro, para obtener suficientes números de células para uso en los métodos descritos en este documento. Las células madre mesenquimáticas, los blastocitos pluripotentes en formación encontrados en el hueso, normalmente están presentes a muy baja frecuencia en la médula ósea (1:100.000) y otros tejidos mesenquimáticos. Véase Caplan y Haynesworth, Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359. En Gerson et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.591.625 se describe la transducción génica de células madre mesenquimáticas.

A menos que se indique otra cosa, se realizan manipulaciones genéticas como se describe en Sambrook y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Ejemplo 1 Ausencia de Alorreactividad de Células Madre Mesenquimáticas

La reacción mixta de linfocitos mide la compatibilidad de los antígenos superficiales del donante y es una indicación de la probabilidad de rechazo del tejido de donante. Los antígenos de la superficie celular responsables de inducir el rechazo al trasplante son antígenos del MHC de clase I y de clase II. Las células T son alorreactivas a antígenos del MHC extraños. Las moléculas del MHC de clase I y II estimulan la reacción mixta de linfocitos.

Se sometieron voluntarios humanos normales a leucoféresis en un sistema de aféresis COBE SPECTRA^{TM} (COBE, Lakewood, CO). Se cultivaron 1 x 10^{5} células T del individuo A (T_{A}) en pocillos de microtitulación de fondo plano con PBMC alogénicas tratadas con mitomicina C (para prevenir la proliferación de PBMC a células T) del individuo B (mPBMC_{B}) durante 7 días. Las mPBMC_{B} se sembraron a 20 K y 100 K. Los cultivos se sometieron a pulsos de ^{3}H-timidina durante las últimas 18 horas del periodo de cultivo para medir la proliferación de células T. Los resultados mostrados en la Figura 1 indican que las células T_{A} reconocían los PBMC_{B} como extraños. (Véanse las barras debajo de "T_{A} + mPBMC_{B}".). Cuantas más PBMC_{B} estaban presentes, más células T proliferaban.

Se co-incubaron 2 x 10^{4} células madre mesenquimáticas humanas (hMSC) del mismo donante que las PBMC con 1x10^{5} células T del individuo A (T_{A}). Las células se cultivaron en pocillos de microtitulación de fondo plano durante un total de 7 días. Los cultivos se sometieron a pulsos de ^{3}H-timidina durante las últimas 18 horas del periodo de cultivo para medir la proliferación de las células T. Dos días antes del co-cultivo con las células T, las células madre mesenquimáticas humanas se sembraron en pocillos de microtitulación al número indicado anteriormente (confluencia) y se trataron con IFN-\gamma (50 unidades/ml) para estimular la expresión de antígenos superficiales en MSC. Se incubaron hMSC no transducidas o hMSC transducidas con moléculas de coestimulación B7-1 humana o B7-2 humana con las células T. Las células de control se transdujeron con Neo.

Los resultados mostrados en la Fig. 1 (Véase la Figura 1 "T_{A} + hMSC transducidas") demuestran que los linfocitos T no respondían (no proliferaban) a las células madre mesenquimáticas humanas, es decir, no se reconocían como extraños.

Los resultados también demuestran que la falta de respuesta a las células madre mesenquimáticas no se debía a la compatibilidad genética entre los individuos, ya que las células T reconocían células mononucleares de sangre periférica (PBMC_{B}) del donante de hMSC como extrañas.

Ejemplo 2 Supresión de Reacción mixta de linfocitos

Para determinar si las células madre mesenquimáticas suprimían de forma activa la respuesta alogénica, se establecieron reacciones mixtas de linfocitos (MLR) en placas de cultivo de tejidos, con o sin células madre mesenquimáticas adherentes obtenidas a partir de 2 donantes diferentes: un donante correspondía con las células estimuladoras en la MLR y el otro donante no estaba relacionado con las células estimuladoras o respondedoras.

Se mezclaron 10^{5} PBMC del individuo A (PBMC_{A}) con 10^{5} PBMC del individuo B diana (PBMC_{B}). Las PBMC_{B} se irradiaron con 3000 rads x irradiación para impedir su proliferación debido a la activación por PBMC_{A}. De esta manera, sólo proliferarían las PBMC_{A}. Cuando se mezclaron PBMC_{A} y PBMC_{B}, se produjo una reacción mixta de linfocitos en la que las células PBMC_{A} (células respondedoras) se activaban por los antígenos superficiales en las PBMC_{B} (células estimuladoras). Los cultivos se incubaron durante un intervalo de 7 días y se sometieron a pulsos de ^{3}H-timidina durante las 18 horas finales. En presencia de las PBMC_{B}, las PBMC_{A} proliferaban dando un recuento de 40.000. Véase la Figura 2, 1ª barra, ("NINGUNA" se refiere a la ausencia de células madre mesenquimáticas).

Sin embargo, cuando se mezclaron PBMC_{A} y PBMC_{B} en presencia de células madre mesenquimáticas, se suprimió la reacción mixta de linfocitos. Se mezclaron 10^{5} PBMC_{A} con 10^{5} PBMC_{B} en pocillos de placas de microtitulación recubiertos con una monocapa adherente de células madre mesenquimáticas humanas. Las células madre mesenquimáticas se cultivaron en los pocillos en cantidades que variaban de 7.500 a 22.500 células madre mesenquimáticas por pocillo. Se ensayaron dos poblaciones de células madre mesenquimáticas: se obtuvieron células madre mesenquimáticas humanas a partir de un individuo B y se obtuvieron células madre mesenquimáticas humanas a partir de un individuo que no correspondía al tipo de MHC del individuo A ni del individuo B (una tercera parte). Los cultivos se incubaron durante un intervalo de 7 días y se sometieron a pulsos de ^{3}H-timidina durante las 18 horas finales. En presencia de las células madre mesenquimáticas humanas, se suprimió la MLR. Véase la Figura 2. De esta manera, independientemente del origen del MHC de las células madre mesenquimáticas, las células madre mesenquimáticas suprimían la reacción mixta de linfocitos.

Los resultados mostrados en la Figura 2 también indican que las células madre mesenquimáticas humanas reducían la reacción mixta de linfocitos de una manera dependiente de la dosis. Las células madre mesenquimáticas de cualquier donante suprimían la proliferación igualmente, lo que indicaba que no había especificidad de supresión con respecto al tipo de MHC. Estos resultados demuestran que las células madre mesenquimáticas suprimían de forma activa la reacción mixta de linfocitos cuando las células se cultivaban conjuntamente.

Ejemplo 3 Falta de Respuesta en Reacción Mixta de Linfocitos Secundaria

Estos experimentos se realizaron para determinar si la supresión de células T preactivadas por MSC daba como resultado una falta de respuesta específica durante la estimulación secundaria.

A. Se indujeron células T procedentes del donante 248 (d248) por PBMC alogénicas procedentes del donante 273 (d273) durante 7 días, y después se cultivaron durante 3 días más solas o en presencia de MSC tratadas con IFN-\gamma del mismo donante (d273). Las células después se reestimularon por PBMC del mismo donante (d273), autólogas (d248) o de una "tercera parte" (d244).

Preparación de linfocitos

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll-Paque (Pharmacia). Se congelaron alícuotas de las células en FCS al 90% con un 10% de DMSO y se almacenaron en nitrógeno líquido. Después de la descongelación, las células se lavaron dos veces con medio MSC (DMEM con bajo contenido de glucosa y un 10% de FCS) y se resuspendieron en medio de ensayo (medio de ISCOVE con Hepes 25 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales 100 \muM, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 0,25 \mug/ml de anfotericina B, 2-mercaptoetanol 5,5x10^{-5} M (todos los reactivos de GibcoBLR) y suero AB humano al 5% (Sigma, ensayado por MLR)).

Para preparar la fracción enriquecida en células T, se separaron las PBMC de monocitos y células B por selección negativa inmunomagnética. Las PBMC se incubaron con mAb de ratón anti-CD 19 y CD 14 humano (formato sin azida/bajo nivel de endotoxina (NA/LE)) seguido de Ab de cabra anti-IgG de ratón conjugado con biotina (adsorción múltiple) (todos los reactivos de Pharmingen) y microperlas de estreptavidina (Miltenyi Biotec). Las células después se separaron usando un clasificador de células magnético (MACS, Miltenyi Biotec). La fracción enriquecida en células T contenía aproximadamente un 70-90% de células CD3+.

Cultivo de MSC

Se aislaron MSC humanas a partir de médula ósea como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359 y se mantuvieron en cultivo con medio MSC y se usaron en los pases de 3 a 6. Las células se elevaron usando solución de Tripsina al 0,05%/EDTA, se lavaron una vez con medio MSC y se cultivaron a una densidad de confluencia del 70-80% que era 1x10^{6}/placa en placas de cultivo de tejidos de 10 cm. El día después del cultivo, se añadió IFN-\gamma (Boehringer Mannheim) a 500 U/ml y las células se incubaron 3 días más. Antes de la transferencia de las células T, las placas de MSC se lavaron 4 veces con HBSS y una vez con ISCOVES, y se añadió medio de ensayo a 10 ml/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 10 cm.

MLR primaria (1ª)

Se activaron células T (d248) por PBMC irradiadas (d273). Las PBMC usadas para la estimulación se irradiaron con rayos X con 3.000 rad usando un sistema de rayos X Cabinet (Faxitron X ray, Buffalo Grove, IL). Para la estimulación primaria, se mezclaron 2 x 10^{7} respondedores con 2 x 10^{7} estimuladores en medio de ensayo de 20 ml en placas de cultivo de tejidos de 10 cm. Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2} durante 7 días.

Cultivos de células T activadas/MSC

Se recogieron células T activadas en la MLR 1ª, se lavaron una vez con medio MSC, se resuspendieron en medio de ensayo a 10^{6}/ml en 10 ml y se añadieron a placas de cultivo de tejidos de 10 cm que contenían MSC autólogas o alogénicas o medio solo, y se incubaron durante 3 días más.

Ensayo de reestimulación

Se recogieron células T cultivadas con MSC o medio, se lavaron una vez con medio MSC y se reestimularon con PBMC irradiadas procedentes del donante original, un donante no relacionado o PBMC autólogas. Para el ensayo, se incubaron 5 x 10^{4} respondedores inducidos y 5 x 10^{4} estimuladores irradiados en placas de 96 pocillos. Los ensayos se realizaron por triplicado. Los cultivos se sometieron a pulsos de 1 \muCi de [^{3}H] timidina (Amersham) durante 18 horas antes de la recolección. Los cultivos se recogieron usando Harvester 96 (Tomtec), los filtros se analizaron usando un contador de centelleo de líquidos Microbeta Trilux y un contador de luminiscencia (E.G.&G Wallac). Los datos se presentan como cpm medias \pm SD de tres réplicas.

Las células T cultivadas solas (control positivo) mostraron una respuesta acelerada a la reestimulación con el "mismo donante" con un pico en el día 2. La respuesta de la "tercera parte" también estaba acelerada, prácticamente con la misma cinética que "el mismo donante" pero con un máximo menor y un inicio ligeramente retrasado. (Fig. 3). Las células T cultivadas en MSC alogénicas posteriormente mostraron ausencia de respuesta a las PBMC del "mismo donante" o de "tercera parte" durante los 6 días de cultivo (Fig. 4).

Ejemplo 4 Falta de Respuesta en Reacción de Linfocitos Mixtos Secundaria

Se estimularon células T del donante 413 con PBMC irradiadas procedentes del donante 273 durante 7 días (1,5 x 10^{6} ml cada uno, cultivos volumétricos de 20 ml). Se cultivaron MSC de diferentes donantes 413, 418 y 273 en placas de cultivo de tejidos de 10 cm a 1x10^{6}/placa, se pretrataron con IFN-\gamma durante 3 días y se lavaron antes de la mezcla con las células T preactivadas.

Se incubaron células T preactivadas en la MLR durante 7 días solas o con MSC durante 3 días más (1,0 x 10^{6}/ml de células T, 10 ml/placa). Después de 3 días de incubación con MSC, se recogieron las células T y se reestimularon con PBMC irradiadas 273 (donante original), 413 (autólogas), PBMC10 (tercera parte) o PHA (5 \mug/ml) en presencia o ausencia de PBMC autólogas (d413). Las células se añadieron a 5 x 10^{4}/pocillo, los cultivos se sometieron a pulsos de [^{3}H] timidina en los puntos de tiempo indicados durante 18 horas más.

Los resultados indican que el tratamiento de las células T activadas con MSC autólogas (d413) (Fig. 5C), del mismo donante (d273) (Fig. 5B) y de tercera parte (d418) (Fig. 5D) inducían una falta de respuesta a la estimulación antigénica en las células T. El cultivo de control (Fig. 5A) sin tratamiento con MSC mostró la reestimulación de las células tras la exposición a PBMC alogénicas.

Ejemplo 5 Supresión de MLR Primaria por MSC Caninas

Se purificaron PBMC caninas a partir de sangre periférica por centrifugación en gradiente de Ficoll-Paque (1,077). Se irradiaron PBMC estimuladoras con 2200 rad de rayos X (7 minutos 70 kV). Se mezclaron 10^{5} estimuladores irradiados con 10^{5} PBMC respondedoras en placas de 96 pocillos en presencia o ausencia de MSC caninas precultivadas en placas (E647, 2 x 10^{4}/pocillo). Los cultivos se incubaron durante 6 días y se sometieron a pulsos de [^{3}H]TdR (5 Ci/mmol, 1 \muCi/pocillo) durante 16 horas más. Los resultados se muestran en las Figuras 6A-6D. E647 y E645 eran compañeros de camada (DLA idéntico). Los resultados demostraron que las MSC autólogas así como las alogénicas suprimían la MLR primaria.

Ejemplo 6 Supresión de MLR Primaria por MSC No Adherentes

Se mezclaron células T de d273 (2 x 10^{5}/pocillo) con PBMC irradiadas procedentes de d244 (2 x 10^{5}/pocillo) y diferentes números de MSC. Se pretrataron MSC de dD244 o d273 con IFN-\gamma (900 U/ml durante 3 días) o se dejaron sin tratar, se tripsinizaron el día del experimento y se añadieron al mismo tiempo que las células T y las PBMC. Los cultivos se incubaron durante 7 días, y se añadió [^{3}H]TdR (5 Ci/mmol, 1 \muCi/pocillo) durante 16-18 horas más. Los resultados se muestran en la Figura 7 y demuestran que las MSC no adherentes también suprimían una MLR primaria.

Ejemplo 7 Las MSC Alogénicas Soportan la Supervivencia de Aloinjertos de Piel Población de Estudio

Se estudiaron babuinos (papio anubis) jóvenes. Los individuos de estudio eran machos y hembras no preñadas que pesaban 7-20 kg y tenían una edad comprendida entre 3 y 16 años. Se realizaron análisis con respecto a la tuberculosis, virus del papiloma, se calcularon los títulos de citomegalovirus (CMV) y los babuinos se ensayaron por medio de análisis virales de primates que consistían en análisis con respecto a virus de simios, y que incluían flotación fecal y frotis. Se determinaron pares de donante y receptor por disparidad del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) a través de tipificación por PCR. Durante el periodo de estudio, los babuinos se encerraron en un área individual aparte del área de los animales de compañía.

Recolección de Médula Ósea del Donante para el Aislamiento de MSC y Expansión en Cultivo

Se obtuvieron aspirados de médula por medio de una aguja a partir de la cresta ilíaca para el aislamiento y expansión en cultivo de las MSC. El aspirado de médula se obtuvo alternando el lado una vez por semana durante cuatro semanas consecutivas. El volumen del aspirado se determinó por una estimación del 10% del volumen sanguíneo del animal. Se estima que el volumen sanguíneo (litros) es un 7% del peso corporal. Entonces, un babuino de 10 kg tendría un
volumen sanguíneo estimado de 0,7 litros. Por lo tanto, un aspirado del 10% del volumen sanguíneo sería 70 mililitros.

Antes del procedimiento, se administraron 500 mg de cefazolina por vía intramuscular (IM) para una profilaxis antibacteriana perioperatoria. Los babuinos se sedaron y se anestesiaron para el procedimiento con ketamina a 10 mg/kg IM y xilazina 1 mg/kg IM. Los sitios de inserción de la aguja se limpiaron con povidona-yodo y después se aclararon con alcohol. Los aspirados se obtuvieron a partir de la cresta ilíaca usando una aguja de médula ósea de 2 pulgadas de calibre 16. Se acopló una jeringa a la aguja y se aplicó succión para extraer la médula. Para el dolor postoperatorio, se administró el analgésico Buprenorfina a 0,03 mg/kg IM Q12 x 2 dosis.

Transporte de Aspirados de Médula Ósea del Donante

Los aspirados de médula ósea se transfirieron desde la jeringa a un Vacutainer® estéril que contenía heparina sódica. Los tubos se pusieron en un recipiente Styrofoam^{TM} y se transportaron a temperatura ambiente (RT) por reparto nocturno a la instalación de procesamiento de células.

Aislamiento y Establecimiento de Cultivo de MSC

Se diluyeron alícuotas de 5 a 10 ml de médula ósea en 50 ml de Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (DPBS) en un tubo de cultivo de polipropileno. Las suspensiones celulares se centrifugaron a 2200 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). Los recuentos de células nucleadas totales se determinaron en ácido acético al 4%. Las células después se diluyeron en DPBS para una concentración final de 20 x 10^{6} células/ml. Se introdujeron 10 ml o 200 x 10^{6} células en 20 ml de Percoll (sp.gr. 1,073 g/ml) en un tubo cónico de 50 ml y se sometieron a centrifugación a 1300 rpm durante 20 minutos. La interfaz celular que contenía células mononucleares se lavó en DPBS, se resuspendió en medio completo y se contó para obtener la recuperación. Las células mononucleares lavadas obtenidas en la interfaz de Percoll después se establecieron en matraces T-185 que contenían 30 ml de medio completo y 15-20 x 10^{6} células/matraz (8,1 x 10^{4} MSC/cm^{2}) y se pusieron en un incubador a 37ºC con un 5% de CO_{2}.

Recolección de MSC

Se decantó el medio de los matraces triples y los matraces se aclararon con 50 ml de DPBS. Después de decantar la DPBS, se añadieron 23 ml de tripsina al 0,05% a cada matraz triple. Los matraces se pusieron en una incubadora a 37ºC durante 3 minutos. Después de la separación de las células, se añadieron 23 ml de medio completo a cada matraz. Las suspensiones celulares se transfirieron a tubos cónicos de 50 ml y los matraces se lavaron con 30 ml de HBSS. Los tubos se centrifugaron a 2200 rpm durante 5 minutos a RT.

Formulación/Envasado

Las MSC recogidas se formularon a aproximadamente 10 x 10^{6} células por ml en solución crioprotectora que constaba de un 85% de Plasma-Lyte A (Baxter IV Therapy), un 10% de DMSO y un 5% de MSC-suero del donante, y se crioconservaron en bolsas que contenían 15-20 ml.

Etiquetado/Almacenamiento/Transporte

Las células se crioconservaron usando un congelador de velocidad controlada (Cryomed, Forma Scientific) a 1-2ºC por minuto hasta -90ºC. Las muestras después se transfirieron a un congelador de almacenamiento de nitrógeno líquido en la fase de vapor (-120 a -150ºC).

Dosis

Para conseguir una dosis de MSC de 20 x 10^{6} células/kg, el producto final se preparó a un 115% de la dosis requerida el día de infusión.

Recolección de piel

Antes de la operación quirúrgica, al babuino se le administró cefazolina a 500 mg IM como profilaxis antibacteriana perioperatoria. El babuino se sedó con ketamina a 10 mg/kg IM y se anestesió por inducción con Thiopental intravenoso, un anestésico de inhalación con un 1-2% de isofluorano. Se recogió piel de la pared abdominal anterior, se puso en una compresa de gasa humedecida con solución salina y teñida previamente. Después se cerró la herida. El babuino se devolvió a la colonia después de despertarse. Para el dolor postoperatorio, se administró el analgésico Buprenorfina a Q12 x 2 dosis y Ancef diariamente durante 2 días.

Trasplante de Piel e Infusión de MSC en el Receptor

Antes de la cirugía, al babuino se le administró cefazolina a 500 mg IM como profilaxis antibacteriana perioperatoriamente. El babuino se sedó y se anestesió con ketamina a 10 mg/kg IM e inducción con Thiopental intravenosa, un anestésico de inhalación con un 1-2% de isofluorano. Se recogió piel de la pared abdominal anterior y se puso en una compresa de gasa humedecida con solución salina teñida previamente. Esta piel se dividió en dos injertos; uno se usó como control de tercera parte para otro babuino receptor y el otro se usó como un control autólogo para este mismo animal. El animal después se puso en una posición postrada. Se retiraron tres secciones de 3 x 2 cm de piel del dorso, a lo largo de la columna vertebral, entre las escápulas. Los injertos de piel recogidos previamente del donante de MSC, de un donante de tercera parte y los propios se desgrasaron, se recortaron para ajustarse a los defectos de piel creados y se cosieron en su sitio.

Después del injerto, el babuino recibió una infusión intravenosa de MSC a una dosis de 20 x 10^{6} MSC del donante/kg. Se obtuvieron muestras de sangre periférica antes de MSC, 1 hora, y los días 1-3 después de MSC; y se obtuvieron aspirados de médula el día 0 después de MSC, y los días 3, 14 y 30.

Para el dolor postoperatorio, se administró el analgésico Buprenorfina a Q12 x 2 dosis y Ancef diariamente durante 2 días. Se observó al animal diariamente y los injertos se fotografiaron un día sí y otro no empezando el día 7 después del injerto.

Exámenes Físicos y Ensayos de Diagnóstico

Cada babuino se sedó con ketamina 10 ml/kg IM para el examen. Mientras estaba sedado, se obtuvieron dos-tres mililitros de médula a partir de la cresta ilíaca por aspiración con una aguja y se recogieron en heparina sódica los días 4, 13 y 30, el final del estudio. Se recogió una biopsia de piel el mismo día que se obtuvieron los aspirados de médula.

Resultados Efectos de la Infusión de MSC sobre la Supervivencia de Aloinjertos de Piel

Los animales de control no tratados (N=2) tuvieron un tiempo medio de supervivencia de aloinjertos de piel de 8,0\pm 0 días. La infusión de MSC no relacionadas-MSC del donante (N=2) dio como resultado una prolongación del tiempo de supervivencia del injerto de piel a un tiempo de supervivencia medio de 115\pm0,71 días (Ensayo U de Mann-Whitney, P<0,05). La infusión de MSC de una tercera parte no relacionadas o aloinjertos del donante (N=4) tuvo como resultado una prolongación significativa de los tiempos de supervivencia de los injertos de piel hasta un tiempo medio de supervivencia de 12,3\pm0,96 días (Ensayo U de Mann-Whitney, P<0,003).

Los receptores 6140 y 6200 recibieron aloinjertos del donante de MSC 6243, entre sí (un injerto de tercera parte) y a partir de sí mismos (un autoinjerto). Veinticuatro horas antes de recoger el injerto de piel del donante de MSC, 6243, se inyectaron MSC de 6243 bajo la piel abdominal anterior que se había delineado para el injerto. Después del injerto, a los receptores se les administró una infusión intravenosa de 20 x 10^{6} MSC/kg (6243). Los dos aloinjertos de tercera parte se rechazaron el día 13. Se descubrió que los aloinjertos de donante de MSC (6243) eran hemorrágicos el día 4, un hallazgo normalmente atribuido a un fallo técnico. Tras el examen patológico, se detectó queratina de una forma parecida a una pista, por debajo de la dermis: la naturaleza de estas pistas sugiere que se habían formado por la aguja en el momento de la inyección subcutánea de MSC. La presencia de estas células había inducido una respuesta inflamatoria tremenda. Esta respuesta inflamatoria impedía a los injertos de piel adherirse/"tomarse" de manera apropiada y estos injertos se necrosaron completamente el día 7. Los autoinjertos no se rechazaron.

Los receptores 6654 y 6659 recibieron aloinjertos del donante de MSC 6593, entre sí (un injerto de tercera parte) y de sí mismos (un autoinjerto). Después del injerto, a los receptores se les administraron infusiones intravenosas de 20 x 10^{6} MSC/kg. Los aloinjertos del donante de MSC se rechazaron los días 11 y 12 y los aloinjertos del donante de tercera parte se rechazaron los días 11 y 12. Los autoinjertos no se rechazaron.

De forma similar, los receptores 6663 y 6658 recibieron aloinjertos del donante de MSC 6656, entre sí (un injerto de tercera parte) y de sí mismos (un autoinjerto). Después del injerto, a los receptores se les administraron infusiones intravenosas de 20 x 10^{6} MSC/kg. Los aloinjertos del donante de MSC se rechazaron el día 11 y los aloinjertos del donante de tercera parte se rechazaron los días 10 y 12. Los autoinjertos no se rechazaron.

Los receptores 6532 y 6720 en la ramificación de control del estudio recibieron auto- y aloinjertos sin administración de MSC por infusión o inyección. Los aloinjertos se rechazaron el día 8. Los autoinjertos no se rechazaron.

No hubo toxicidades identificables asociadas con la infusión de MSC alogénicas y no se observó ninguna secuela clínica adversa en el intervalo de seguimiento posterior de 30 días. Se obtuvieron muestras de sangre antes de la administración de MSC, 1 y 2 horas después y los días 1, 2 y 3 después del injerto y de la infusión de MSC. Se obtuvieron aspirados de médula los días 4 y 13 después del injerto y de la infusión de MSC.

Estos resultados demuestran que una sola infusión de MSC alogénicas de babuino puede retrasar el rechazo de injertos alogénicos de piel. No se administró ninguna otra terapia inmunosupresora. Una dosis de MSC alogénica o de tercera parte aumentó el tiempo hasta el rechazo en un 50% (el tiempo de rechazo convencional en este modelo es de 8 días (Véase Goodman et al. Am Surg 62(6): 435-42 (1996)).

Ejemplo 8

El objetivo del estudio fue demostrar la posibilidad y seguridad en perros de la infusión de una dosis moderadamente elevada de células madre mesenquimáticas caninas de compañero de camada con idéntico antígeno leucocitario de perro (DLA) donante a 10 x 10^{6} células/kg en una situación de injerto alogénico de médula. El objetivo secundario fue examinar la distribución y función de MSC marcadas con GFP y nuevas del donante a 50 y 100 días después del trasplante.

Materiales y métodos Animales experimentales

Para el estudio se usaron perros Beagle. En el estudio se usaron dos machos y dos hembras compañeros de camada con DLA idéntico, con edades de 7 o 9 meses el día 0. El método para la tipificación usado implica el uso de marcadores microsatélite muy polimórficos para seguir la herencia de la región de DRB de Clase II en el Antígeno Leucocitario de Perro (DLA), el equivalente canino del complejo de histocompatibilidad principal. Los microsatélites son pequeñas repeticiones de 2, 3 ó 4 nucleótidos que muestran una variación de suficiente longitud en los alelos de tal forma que pueden usarse para seguir la herencia de segmentos cromosómicos por medio de cruces multigeneracionales. La segregación de alelos típicamente se controla usando una reacción en cadena de la polimerasa de una sola etapa con cebadores derivados de secuencias únicas de ADN que rodean cada repetición. Además, se realizaron reacciones mixtas de leucocitos en las parejas de compañeros de camada con DLA idéntico elegidos para el estudio para proporcionar confirmación de los resultados del ensayo con marcadores de microsatélite de PCR.

Diseño del Estudio

Los perros se sometieron al trasplante con cMSC y médula ósea del mismo donante compañero de camada de idéntico DLA. Los injertos de médula se recogieron a partir de cada uno de los compañeros de camada con DLA idéntico el día 0 antes de la irradiación corporal total (TBI) y se intercambiaron. Se indujo mieloablación por exposición de los perros el día 0 a una sola dosis de TBI de 920 centigray (cGy) (exposición al aire de la línea media de dos fuentes de ^{60}Co opuestas suministradas a una velocidad de 7 cGy (9,3 R)/min. Las cMSC expandidas en cultivo aisladas a partir de un aspirado de médula del donante a 4 o más semanas antes del trasplante se transdujeron con
Papp @ OT-24, que contenía los genes para la proteína fluorescente verde (GFP) y neomicina fosfotransferasa (neo). Las cMSC se crioconservaron después del pase 1 (P1) o el pase 2 (P2). Después de la TBI, las cMSC se descongelaron y se suministraron por vía intravenosa a través de una bomba de infusión portátil durante un periodo de tiempo de 15 minutos. En una a dos horas después de la infusión de cMSC, se infundió el injerto de médula ósea por vía intravenosa a una dosis de \geq 1 x 10^{8} células nucleadas totales (TNC)/kg.

Se administró ciclosporina a los cuatro perros para la profilaxis de la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) por vía intravenosa los días 0 a 5 a una dosis de 10 mg/kg BID (20 mg/kg/día) (Solución de Inyección Sandimmune®, Sandoz Pharmaceuticals Corporation). En los días 6 a 50 (final del estudio) para el grupo I.1.a, o 6 a 100 para el grupo I.1.b, la ciclosporina se administró a 10 mg/kg BID PO, (20 mg/kg/día) (Cápsulas de Gelatina Blanda Neoral®, Sandoz Pharmaceuticals Corporation). El cuidado de apoyo habitual con antibióticos orales para el receptor empezó el día -5 y los antibióticos sistémicos se iniciaron el día 0 y continuaron hasta que se consiguió la integración del injerto. Se administró líquido cuando fue necesario. No se requirieron transfusiones de plaquetas para ninguno de los cuatro perros durante la recuperación. Los procedimientos caninos convencionales requieren administrar una transfusión de sangre entera si el recuento de plaquetas se reduce de forma consistente por debajo de 10.000/mm^{3}, o si el personal del tratamiento observa signos de hemorragia. Las transfusiones de plaquetas, cuando fue necesario, se administraron como 50 ml de sangre entera irradiada (2000 cGy) de un donante aleatorio. La integración del injerto se estableció como el momento de la primera de tres mediciones consecutivas de >500 neutrófilos absolutos mm^{3}, >1.000/mm^{3}, y plaquetas >10.000/mm^{3}, 50.000/mm^{3} y >100.000.

Para seguir la recuperación hematopoyética, se obtuvieron recuentos completos de sangre (CBC) desde el día 0 al día 50, y posteriormente cada dos semanas para el grupo de estudio de 100 días. Se realizó un análisis químico del suero los días 0, 2 y posteriormente una vez por semana. Se tomaron muestras de sangre periférica el día 0, antes de la infusión de MSC, y en los puntos de tiempo de 5 y 15 minutos, 1 y 2 horas y 1, 2, 3 y 4 días para el aislamiento de ADN. El ADN se evaluó con respecto a la presencia de células marcadas con GFP por un Elisa de PCR de ADN anti-EGFP con digoxigenina incorporada en el producto y un ensayo colorimétrico anti-digoxigenina de segunda etapa. Se obtuvo un aspirado de médula cuando el recuento de plaquetas alcanzó de forma constante 50.000/mm^{3} y se examinó con respecto a la presencia de células marcadas con GFP usando el mismo método de PCR. Se establecieron cultivos de CMSC para examinar unidades formadoras de colonias (CFU) y para expandir las cMSC para el análisis de PCR anti-EGFP adicional. Después de la necropsia, se obtuvieron sangre periférica, aspirados de médula ósea y biopsias de médula ósea para el análisis de PCR anti-EGFP. Se realizaron ensayos de CFU en los aspirados de médula ósea, y el análisis de PCR anti-EGFP se realizó en cMSC expandidas en cultivo. Se realizó un análisis histológico con respecto a la presencia de GFP en diversos tejidos.

Aislamiento de cMSC, expansión en cultivo, transducción y crioconservación

Se obtuvieron aspirados de médula ósea bilaterales para el aislamiento de cMSC y el establecimiento en cultivo en la semana -4 para los perros CAN-07-01 y CAN-07-02 y en la semana -9 para los perros CAN-07-03 y CAN-07-04. Se obtuvieron quince ml de médula (7 ml de cada húmero) a partir de cada perro. Los perros se anestesiaron por la inyección de Butorfanol seguido de la inyección de una mezcla de Diazepam y clorhidrato de ketamina (Aveco Co., Inc., Fort Dodge, IA). Los sitios de la inserción de la aguja se limpiaron con povidona-yodo y después se aclararon con alcohol. Se obtuvieron aspirados de cada cóndilo humeral de cada perro usando una aguja de médula ósea de 2 pulgadas de calibre 16. Se acopló una jeringa a la aguja y se aplicó succión para extraer 8 ml de médula de cada húmero. Se transfirieron aspirados de médula ósea a tubos cónicos de polipropileno de 15 ml usando una técnica estéril. Después del procedimiento, el perro se puso en una cama caliente para recuperarse.

Se diluyeron alícuotas de 5 a 10 ml de médula ósea en 50 ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) en un tubo de cultivo de polipropileno. Las suspensiones celulares se sometieron a centrifugación a 2200 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). Los recuentos de células nucleadas totales se determinaron en ácido acético al 4%. Las células después se diluyeron en DPBS para una concentración final de 20 x 10^{6} células/ml. Después se introdujeron 10 ml o 200 x 10^{6} células en 20 ml de Percoll (sp.gr. 1,073 g/ml) en un tubo cónico de 50 ml y se sometieron a centrifugación a 1300 rpm durante 20 minutos. Las interfaz celular que contenía células mononucleares se lavó en DPBS, se resuspendió en medio completo y se contó para obtener un porcentaje de recuperación. Las células después se diluyeron en medio completo, los cultivos se establecieron como se describe más adelante y se pusieron en un incubador a 37ºC con un 5% de CO_{2}.

Construcción de vector retroviral bicistrónico MuL V

El retrovirus de la proteína fluorescente verde (EGFP) se construyó aislando el gen EGFP-1 de la medusa Aequorea victoria (Clontech, CA). El gen EGFP se clonó en el vector retroviral pJM573-neo (el plásmido resultante se denominó pOT-24). El plásmido pJM573-neo se obtuvo a partir de pN2 (Keller et. al., 1985, Nature 318:149) con las siguientes modificaciones: el sitio de iniciación gag del retrovirus murino se sustituyó por un codón stop en fase; se construyeron 5'LTR y 3'LTR en el mismo cassette; se insertaron el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) y un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) en pN2. En la Figura 8 se muestra un mapa esquemático del plásmido EGFP pOT24.

Preparación de Retrovirus Recombinante

Se transfectó pOT-24 en células productoras ecotrópicas GP&E86 usando DOTAP (Boehringer Mannheim) como sugiere el fabricante. Las células transfectadas se cultivaron en medio DMEM de alto contenido en glucosa (HG) suplementado con un 10% de FBS inactivado térmicamente, Penicilina-Estreptomicina (Life Technologies) y 0,5 mg/ml de sulfato de protamina-G418 (Sigma) como marcador selectivo. Los cultivos se mantuvieron hasta una confluencia del 70%, momento en el que el medio se reemplazó por medio retroviral nuevo (sin G418) y las células se mantuvieron a 32ºC durante 2 días. El medio de cultivo que contenía el retrovirus se recogió, se filtró a través de un filtro de 0,45 m y se almacenó a -70ºC. Se preparó retrovirus anfotrópico transduciendo células PA317 dos veces con virus ecotrópico usando un procedimiento de transducción centrífuga seguido de selección con G418 (0,5 mg/ml). Se recogió el sobrenadante retroviral. La titulación del retrovirus EGFP reunido en células 3T3 fue 1,2x10^{6} CFU/ml. Los sobrenadante retrovirales de GFP se crioconservaron a -70ºC.

CAN-07-01 y CAN-07-02

Las células mononucleares lavadas obtenidas en la interfaz de Percoll se establecieron en 10 matraces T-185 que contenían 30 ml de medio completo y 10 x 10^{6} células/matraz.

En los días 2, 6 y 9 de cultivo, los medios de los matraces se reemplazaron totalmente por medio completo nuevo. El día 12 del cultivo primario, se tomaron fotografías y se recogieron células desde el pase 0 (P0) al pase 1 (P1). El medio se aspiró y los matraces se lavaron dos veces con 8 ml de DPBS. Se añadieron 8 ml de tripsina y los matraces se pusieron en una incubadora a 37ºC durante 3 minutos. Cuando las células se habían elevado, la reacción se detuvo por la adición de 8 ml de medio completo. Las células se transfirieron y se reunieron en tubos cónicos de 50 ml. Los matraces se lavaron con DPBS y las células reunidas se centrifugaron a RT a 2000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se retiró y los sedimentos celulares se resuspendieron en medio completo. Las células se reunieron, se contaron y se examinó la viabilidad. Las células se cultivaron en 15 matraces T80 que contenían 18 ml de medio completo y 0,4 x 10^{6} células por matraz.

El día 15 del cultivo, se realizó la primera transducción en 15 de los 18 matraces. El medio se retiró. Se descongelaron alícuotas del sobrenadante retroviral y se añadió polibreno a una concentración final de 8 \mug/ml para obtener el cóctel de transducción. El medio celular se reemplazó por 10 ml del cóctel de transducción y los matraces se centrifugaron a 3000 rpm durante 1 hora a 32ºC. Después de la centrifugación, se añadieron a cada matraz 10 ml de medio completo preparado usando suero bovino fetal (FBS) inactivado térmicamente (con el cóctel de transducción) y los matraces se devolvieron a la incubadora. Tres matraces no se transdujeron y se reemplazó el medio nuevo. El día 16 de cultivo, el medio se reemplazó con medio completo nuevo. El día 17 de cultivo, se repitió el procedimiento de transducción.

El día 18 de cultivo, las células se recogieron como se ha descrito anteriormente y se tomaron de P1 a P2. Se añadieron 3 x 10^{6} células a 100 ml de medio completo y se vertieron en matraces triples (500 cm^{2}). Se prepararon quince matraces triples con células transducidas y se prepararon tres con células no transducidas. Todas las células restantes se crioconservaron. Se preparó una solución de congelación que contenía un 10% de DMSO y un 90% de FBS. Se resuspendieron 10 x 10^{6} células en 1 ml de solución de congelación. Los viales se etiquetaron y se crioconservaron en un recipiente Nalgene Cryo durante un mínimo de 4 horas a -70ºC y se almacenaron a 70ºC.

El día 22 del cultivo de P2, se tomaron fotografías para registrar la distribución y la morfología celular y las células P2 se recogieron y se crioconservaron como se describe más adelante.

CAN-07-03 y CAN-07-04

Las células mononucleares lavadas obtenidas en la interfaz de Percoll se establecieron en 15 matraces T-75 que contenían 20 ml de medio completo y 12 x 10^{6} células/matraz.

El día 2 de cultivo, los medios en los matraces y en las placas se reemplazaron totalmente con medio completo nuevo. El día 6 del cultivo primario para cMSC, se realizó la primera transducción como se ha descrito anteriormente. Tres matraces no se transdujeron, y el medio nuevo se reemplazó el día 6. El día 7 del cultivo, el medio se reemplazó por medio nuevo.

El día 8 de cultivo se repitió el procedimiento de transducción. El día 9 de cultivo se tomaron fotografías y las células se sometieron a pases de P0 a P1 como se ha descrito anteriormente. Se añadieron 3 x 10^{6} células a 100 ml de medio completo y se vertieron en matraces triples. Se prepararon quince matraces triples con células transducidas y se prepararon tres con células no transducidas.

Los aspirados de médula ósea de 15 ml produjeron 910, 1212, 856 y 1948 x 10^{6} células nucleadas para los donantes CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 y CAN-07-04, respectivamente. Los recuentos de células mononucleares obtenidos a partir de la interfaz de Percoll fueron 612, 666, 588 y 462 x 10^{6}, dando como resultado recuperaciones de 67,2, 55, 68,7 y 23,7%. Después de P1, la viabilidad celular fue una media de 97,1 (intervalo de 93,3 a 100)%. Después de P2, para los donantes CAN-07-01 y CAN-07-02, y células P1 para los donantes CAN-07-03 y CAN-07-04, la viabilidad celular de las células transducidas fue una media de 96,7 (intervalo de 96,3 a 97,9)%. Las células no transducidas tuvieron una viabilidad del 95,4 (intervalo de 93,3 a 96,9)%. Después de la recolección para la crioconservación de las cMSC, la viabilidad de las células transducidas fue una media de 99,4 (intervalo de 97,4 a 100)% y las células no transducidas tuvieron una viabilidad de 99,4 (intervalo 97,6 a 100)%
(Tabla 4).

El rendimiento de cMSC transducidas por matraz para los donantes CAN-07-01 y CAN-07-02, recogidas 4 días después del pase 2 y cultivadas en placas a 3 x 10^{6} por matraz fue 5,9 y 6,7 x 10^{6}, y el rendimiento de cMSC no transducidas por matraz fue de 8,4 y 7,5 x 10^{6}. El rendimiento de cMSC transducidas por matraz para los donantes CAN-07-03 y CAN-07-04, recogidas 4 días después del pase 1 (diferente diseño de transducción y de pase) y cultivadas en placas a 3 x 10^{6} por matraz fue de 20,2 y 14,0 x 10^{6}, y el rendimiento de cMSC no transducidas por matraz fue de 25,3 y 18,0 x 10^{6}.

Ensayos de CFU en cMSC procedentes de Cultivos P0

Se prepararon ensayos de colonia CFU en el momento del establecimiento del cultivo primario cultivando 0,5 x 10^{6} células por triplicado en placas de 100 mm que contenían 10 ml de medio completo. Las placas se incubaron a 37ºC con un 5% de CO_{2}. El medio se reemplazó por medio nuevo cada 2 a 4 días. El día 10 de cultivo, las placas de ensayo de CFU se aclararon con HBSS dos veces, se fijaron con glutaraldehído al 1% durante 15 minutos, se aclararon con HBSS dos veces y se secaron al aire. Las cMSC en las placas después se tiñeron con violeta de cristal al 0,1%, se aclararon con agua desionizada tres veces y se secaron al aire. Las colonias se contaron para calcular el número de unidades formadoras de colonias por 10^{6} células cultivadas.

Los ensayos de CFU cultivadas el día del aislamiento de células mononucleares y el establecimiento del cultivo y recogidas el día 10 produjeron 56, 46,7, 114 y 72 colonias por 10^{6} células para los perros CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 y CAN-07-04, respectivamente.

El día 13 del cultivo P1, se tomaron fotografías para registrar la distribución y la morfología celular y las células P1 se recogieron por tripsinización y se crioconservaron como se describe más adelante.

El medio de los matraces triples se decantó y los matraces se aclararon con 50 ml de DPBS. Después de decantar la DPBS, se añadieron 23 ml de tripsina al 0,25% a cada matraz triple. Los matraces se pusieron en una incubadora a 37ºC durante 3 minutos. Después de la separación de las células, se añadieron 23 ml de medio completo a cada matraz. Las suspensiones celulares se transfirieron a tubos cónicos de 50 ml y los matraces se lavaron con 30 ml de HBSS. Los tubos se centrifugaron a 2200 rpm durante 5 minutos a RT. Los sedimentos que contenían las células transducidas o no transducidas, respectivamente, se reunieron y contaron. Se apartó una alícuota de 1 x 10^{7} células para la determinación del porcentaje de transducción por un ensayo Elisa de PCR de ADN anti-EGFP.

Después de la recolección, las cMSC expandidas en cultivo y transducidas P1 o P2 recuperadas se centrifugaron a 1300 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en alícuotas de 1 ml con 1 x 10^{7} cMSC/ml en solución de crioprotector enfriada con hielo que contenía un 85% de Plasma-Lyte A (Baxter IV Therapy), un 10% DMSO y un 5% de suero canino autólogo. Se distribuyeron alícuotas de células en crioviales separados que contenían 1 ml cada uno. Los tubos se etiquetaron con el número de donante canino y el recuento total de células viables. Las cMSC se crioconservaron poniendo los viales de células en un recipiente de congelación Nalgene, se pusieron en un congelador a -70ºC durante 4 horas, y después se llevaron al almacenamiento a -70ºC.

Después de la recolección de células para la crioconservación del producto, se obtuvieron alícuotas de 1 x 10^{7} células para la determinación de la eficacia de la transducción. La eficacia de la transducción se analizó por un Elisa de PCR de ADN anti-EGFP con incorporación de digoxigenina en el producto y un ensayo colorimétrico anti-digoxigenina de segunda etapa.

Producto de Infusión de cMSC

De una a dos horas antes de la infusión, los viales de cMSC se descongelaron por medio de agitación en un baño de agua a 37ºC, se pulverizaron con etanol al 70% y se abrieron en una vitrina de bioseguridad. El producto de cMSC se suspendió en 50 ml de medio de infusión que contenía DMEM-LG más 30% de suero autólogo con respecto al donante de células. La viabilidad del producto de cMSC se determinó por exclusión de azul tripán para determinar la dosis viable real. Se presentó una alícuota de cada producto de cMSC para el aislado de levadura, crecimiento aerobio y crecimiento no aerobio. Las cMSC se evaluaron con respecto a la capacidad de unirse al plástico de cultivo de tejidos y de proliferar en cultivo P2 (P3 para CAN-07-01 y CAN-07-02). Se cultivaron alícuotas de 1 x 10^{6} y 0,16 x 10^{6} cMSC en medio de cultivo canino completo en matraces de cultivo de plástico T-25 por triplicado. Después de 24 horas, los matraces cultivados con 1 x 10^{6} cMSC, y el día tres, los matraces cultivados con 0,16 x 10^{6} cMSC, se recogieron por tripsinización y posteriormente se contaron.

Después de la TBI, la suspensión de cMSC se infundió a través de un catéter insertado en la vena cefálica usando un aparato de infusión manual Harvard Bard Mini Infuser para suministrar los 50 ml en un periodo de 15-20 minutos.

Se infundieron dosis moderadamente elevadas de 7,49, 7,35, 10,0 y 10,0 (media 8,7) x 10^{6} cMSC viables/kg el día 0 a los perros CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 y CAN-07-04, respectivamente. Estas dosis representan un aumento de 4 a 10 veces con respecto a la dosis típica que recibiría un paciente. Las cMSC viables totales infundidas variaban de 67,7 a 129 (media 93,9) x 10^{6} cMSC. La viabilidad de las células variaba de 92,1 a 97,6 (media 94,9) determinada por exclusión de azul tripán. Las infusiones de CMSC se administraron entre 71 y 146 (media 110) minutos después de la TBI.

Extracción de Muestras de Sangre Después de la Infusión

Se obtuvieron muestras de sangre (2 ml) antes (pre) y durante la infusión de cMSC cinco y quince minutos después del inicio de la infusión, así como en los puntos de tiempo de 1 y 2 horas y 1, 2, 3 y 4 días. Se prepararon lisados de células usando el kit de aislamiento de ADN Puregene^{TM} (Gentra Systems, Inc.) para uso en un Elisa de PCR de ADN Anti-EGFP con digoxigenina incorporada en el producto y un ensayo colorimétrico Anti-digoxigenina de segunda etapa para detectar el nivel de cMSC marcadas con GFP en la corriente sanguínea.

Recolección de médula ósea e infusión de injerto

La médula ósea a usar como injerto de trasplante se recogió a partir del compañero de camada con DLA idéntico antes de la TBI. Se obtuvieron aspirados de cada húmero usando una aguja de extracción de médula de acero inoxidable con un globo en la parte superior, de 4-6 pulgadas y de calibre 11, acoplada a un tubo de polivinilo que procedía de un matraz al vacío que contenía 100 ml de Medio de Cultivo de Tejidos 199 y 4 ml (4000 U) de heparina. La médula se hace pasar a través de un tamaño de poros de 300 y 200 mm y se almacena a 4ºC en un recipiente de transferencia, etiquetado con el donante y el receptor hasta la infusión después de ese día. El recuento total de células nucleadas de médula ósea (BM-TNC) de la médula se corrige para excluir cualquier célula no nucleada que pudiera estar presente en el volumen de sangre periférica obtenido durante la recolección de la médula.

El recuento total de células nucleadas (TNC) de la médula ósea se corrigió para excluir cualquier TNC que pudiera estar presente en el volumen de la sangre periférica obtenida durante la recolección de la médula. Las dosis corregidas de médula fueron 4,3, 3,5, 3,1 y 2,0 (media 3,2) x 10^{8} TNC/kg para los perros CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 y CAN-07-04, respectivamente. Las dosis de médula ósea no corregidas fueron 5,6, 4,2, 4,5 y 2,7 (media 4,3) x 10^{8} TNC/kg.

Veinte minutos antes de la infusión, la médula se puso a temperatura ambiente. Una hora después de la infusión de cMSC, la médula se sometió a una infusión intravenosa a través de una aguja de mariposa insertada en la vena cefálica, ejerciendo presión en la bolsa durante 1 a 2 minutos.

Cuidado de apoyo

El día -5, se administraron antibióticos orales (sulfato de neomicina y sulfato de polimixin) tres veces al día. Estos antibióticos orales se administraron hasta que los recuentos absolutos de neutrófilos alcanzaron 500/mm^{3}. El día 0, se administró por vía intravenosa el antibiótico sistémico Baytril dos veces al día y se continuó la administración hasta que los recuentos de neutrófilos absolutos alcanzaron 1.000/mm^{3} de forma consistente. Las pérdidas de líquidos y electrolitos como resultado de una toxicidad a la radiación transitoria se reemplazaron por administración subcutánea de 500 ml de solución de Ringer, dos veces al día hasta que se aceptaron los alimentos y el agua.

Recuento diferencial de células sanguíneas

Se recogieron muestras de sangre (2 ml) de la vena yugular o cefálica por la mañana del día del aspirado de médula para aislar las cMSC, los días 0 a 50 y cada dos semanas posteriormente hasta el final del estudio. La sangre se transfirió a un vacutainer que contenía EDTA. Los recuentos totales de glóbulos blancos (WBC) y de plaquetas por mm^{3} se miden usando un Sysmex E2500 y los recuentos diferenciales de células se determinaron manualmente después de la fijación y tinción con tinte de Wrights.

Necropsia

Se obtuvieron muestras de sangre para CBC, análisis químico 23 y evaluación por PCR. Los perros se sedaron con Butorfanol seguido de una mezcla de Diazepam y clorhidrato de ketamina. Después de la sedación, se obtuvieron biopsias y aspirados de médula ósea bilaterales a partir de los húmeros, fémures y crestas ilíacas. Después se completó la eutanasia con una sobredosis del sedante pentobarbital sódico. El grupo de perros del día 50 (CAN-07-01 y CAN-07-02) se sacrificaron el día 43 del estudio; el grupo de perros del día 100 (CAN-07-03 y CAN-07-04) se sacrificaron el día 100 del estudio. Tras la necropsia de los animales se recogieron series completas de los tejidos.

Inmediatamente se realizó la colección de tejidos para examen histológico. Para el análisis Elisa por PCR de ADN Anti-EGFP se usó una subserie de tejidos. Para el análisis Elisa por PCR de ADN Anti-EGFP, expansión de cultivos para el análisis de PCR adicional, y para los ensayos de CFU, se usaron aspirados de médula ósea y biopsias.

Los tejidos se recortaron hasta obtener piezas de aproximadamente 1 pulgada al cuadrado y se pusieron en tubos cónicos de 50 ml etiquetados separados, rellenos con Formalina Tamponada Neutra al 10% (pH 6,8-7,2). Los tejidos se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con Hematoxilina y Eosina. Las muestras de médula ósea se tiñeron con tinte de Ácido Peryódico de Schiff.

Los aspirados de médula ósea obtenidos antes de la necropsia se recogieron en tubos etiquetados de 15 ml a partir de los húmeros, fémures y crestas ilíacas izquierda y derecha de cada perro. Se obtuvo una subserie de muestras de tejido durante la necropsia y se recortaron hasta que se obtuvieron piezas de aproximadamente 1/4 de pulgada al cuadrado, se enrollaron en gasa humedecida con PBS y se pusieron por separado en una bolsa ziplock etiquetada. Los aspirados de médula ósea se mantuvieron en hielo.

Preparación de aspirados de médula ósea para ensayo de CFU

Se introdujeron alícuotas de aspirados de médula ósea procedentes de los húmeros, fémures y crestas ilíacas izquierda y derecha de cada perro obtenidas para análisis de PCR en tubos de 15 ml etiquetados. Las muestras de médula ósea se mantuvieron en hielo.

Ensayo de CFU en cMSC procedentes de médula ósea obtenida en la necropsia

Los ensayos de colonias CFU realizados en cMSC obtenidas a partir de médula ósea obtenida en la necropsia se prepararon cultivando 0,5 x 10^{6} células por triplicado en placas de 100 mm que contenían 10 ml de medio completo. Las placas se incubaron a 37ºC con un 5% de CO_{2}. El medio se reemplazó por medio nuevo cada 2-4 días. El día 10 del cultivo, las placas de ensayo de CFU se aclararon con HBSS dos veces, se fijaron con glutaraldehído al 1% durante 15 minutos, se aclararon con HBSS dos veces y se secaron al aire. Las cMSC en las placas después se tiñeron con violeta de cristal al 0,1%, se aclararon con agua desionizada tres veces y se secaron al aire. Las colonias se contaron para calcular el número de colonias por 10^{6} células cultivadas.

Aislamiento y purificación de ADN

Se aisló ADN a partir de una parte de cada tejido. La pieza restante de la muestra se crioconservó y se almacenó en un congelador a -70ºC. El ADN se aisló poniendo muestras en solución salina tamponada con fosfato (PBS), añadiendo solución de proteinasa K e incubando a 55ºC durante 3 horas o hasta que se disolvió el tejido. Las muestras posteriormente se trataron con RNasa a 37ºC durante 60 minutos. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y la proteína se precipitó. Las muestras se centrifugaron y la fase acuosa se recogió suavemente en isopropanol al 100%. Las muestras se mezclaron y se centrifugaron y el sedimento se lavó en etanol al 70%. Los tubos se centrifugaron, el sobrenadante se retiró por drenaje y los sedimentos se dejaron secar durante aproximadamente 1 a 6 horas. El ADN se dejó hidratar durante una noche a temperatura ambiente y posteriormente se almacenó a 4ºC.

Las muestras de sangre periférica y de médula ósea primero se lisaron con solución de lisis de RBC (Tampón de Cloruro Amónico). Después se aisló el ADN a partir de los lisados como se ha descrito anteriormente. El ADN se cuantificó por la adición de 998 \mul de H_{2}O desionizada y 2 \mul de ADN de la muestra en una cubeta y se sometió a agitación vorticial. Se usó un espectrofotómetro para determinar la densidad óptica (DO). La DO se leyó a 260 y 280, y la concentración de ADN se calculó en \mug/ml. La concentración de ADN se ajustó a 1 \mug/ml usando agua desionizada.

Elisa de PCR de ADN Anti-EGFP

El ensayo Elisa por PCR de ADN anti-EGFP usado en estos estudios detecta las cMSC infundidas utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos para GFP. Para el análisis de la expresión génica, se utilizó el kit (Boehringer Mannheim) PCR-ELISA (marcaje con DIG/detección). En resumen, la PCR se realizó en presencia de nucleótidos marcados con digoxigenina para marcar el producto amplificado. A continuación, se desnaturalizaron 25 \mul del producto de PCR y se dejaron hibridar en solución con sonda oligonucleotídica biotinilada en el extremo 5' a 37ºC en placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina. El producto de sonda-PCR unido se detectó por un conjugado de peroxidasa anti-digoxigenina y por medio del uso del sustrato colorimétrico 2,2' Azinobis (Ácido 3-etilbenzotiazolina sulfónico) (ABTS). Se generaron curvas patrón de titulación usando cMSC de control transfectadas para aproximar la concentración de ADN por cantidad de ADN usado en el ensayo. Por medio de una primera correlación con un patrón interno para PCR del ADN genómico de DLA de Clase, y después una correlación de la concentración de ADN con equivalentes celulares, y asumiendo un suceso de integración retroviral por célula transducida, puede obtenerse una estimación del número de células.

Se anotaron mediciones cuantitativas de ADN para GFP en todas las muestras/biopsias de médula ósea.

Recuperación de células sanguíneas después del trasplante

El número medio de días transcurridos para llegar a un umbral (hasta 3 valores consecutivos) de plaquetas de hasta 10.000/mm^{3} fue 12,8 (intervalo 11-17), de hasta 50.000/mm^{3} fue 19,8 (intervalo 16-25) y de hasta 100.000/mm^{3} fue 23,0 (intervalo 20-27). El número medio de días transcurridos para llegar a un valor umbral (hasta 3 días consecutivos) de neutrófilos absolutos de hasta 500/mm^{3} fue 9,3 (intervalo 8-11) y de hasta 1000/mm^{3} fue 10,5 (intervalo 9-13).

Aspirados de médula ósea provisionales

Cuando se recuperaron plaquetas consistentemente a valores mayores de 50.000 por mm^{3}, se recogió un aspirado de médula ósea provisional a partir de la cresta ilíaca. Este procedimiento se realizó el día 27 en un estudio para CAN-07-01 y CAN-07-02 y el día 29 para CAN-07-03 y CAN-07-04.

Resultados

Tras la evaluación histopatológica de todos los tejidos de CAN-07-01 y CAN-07-02, sacrificados el día 43, los descubrimientos fueron negativos para tejido conectivo ectópico y para la enfermedad de injerto contra hospedador subaguda.

Pudo encontrarse una señal de ADN detectable en la hora posterior a la infusión y de nuevo a los 2 días. Pudo medirse cuantitativamente una muestra 3 días después de la infusión para el ADN de GFP. Este punto de tiempo es coherente con las observaciones previas en el estudio de trasplante canino autólogo en el que se encontró señal a los 2 y a los 3 días.

Los datos de necropsia en el día 100 en CAN-07-03 y CAN-07-04 para células GFP+ mostró la señal de GFP (1 equivalente de célula GFP+ por 10 microgramos de ADN de entrada de PCR) en el fémur y húmero de CAN-07-03 y en el húmero de CAN-07-04.

En este modelo fue posible detectar la enfermedad de injerto de piel contra hospedador (GVHD) observando el enrojecimiento de los ojos y las orejas de los animales. Usando este indicador, se determinó que los animales que recibían células madre mesenquimáticas tenían una menor incidencia y/o menor gravedad de GVDH en comparación con los animales de control que no se trataban con células madre mesenquimáticas.

Estos resultados demuestran que las MSC alogénicas pueden soportar la rápida integración del injerto de células hematopoyéticas de médula ósea. No fue necesaria una transfusión de apoyo. No hubo ninguna prueba clínica de GVHD. La recuperación de las plaquetas fue más rápida que en los controles históricos. Hubo indicios de quimerismo en células estromáticas después del trasplante alogénico. La opción para injertar tejido alogénico usando MSC alogénicas amplía la variedad de material de trasplante útil en escenarios de trasplante clínico.

Claims (37)

1. Un método ex vivo para reducir una respuesta inmune contra un aloantígeno, que comprende:

poner en contacto células efectoras inmunes ex vivo con células madre mesenquimáticas en una cantidad eficaz para reducir la respuesta inmune.

2. El método de la reivindicación 1, donde las células efectoras son células T.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde las células efectoras son células T que se han activado previamente por un aloantígeno, que comprende:

poner en contacto dichas células T activadas con células madre mesenquimáticas en una cantidad eficaz para suprimir la reestimulación de dichas células T activadas.

4. Un uso de células madre mesenquimáticas purificadas para la fabricación de una preparación farmacéutica para reducir en un receptor de un trasplante una respuesta inmune de células efectoras contra un aloantígeno con respecto a las células efectoras.

5. El uso de la reivindicación 4, donde dichas células efectoras son células T.

6. El uso de la reivindicación 5, donde las células T proceden del donante y el aloantígeno procede del receptor.

7. El uso de la reivindicación 5, donde las células T proceden del receptor y el aloantígeno procede del donante.

8. El uso de la reivindicación 5, donde dichas células T están presentes en un trasplante.

9. El uso de la reivindicación 4, donde dicha preparación farmacéutica se va a administrar a un receptor de un trasplante que padece la enfermedad de injerto contra hospedador.

10. El uso de la reivindicación 4, donde dichas células madre mesenquimáticas (MSC) se han expandido en cultivo.

11. El uso de la reivindicación 4, donde dichas células efectoras son células T previamente activadas y dicha respuesta inmune es la activación de dichas células T.

12. El uso de la reivindicación 4, donde el trasplante es cutáneo.

13. El uso de la reivindicación 4, donde la preparación farmacéutica se va a administrar al receptor del trasplante para tratar el rechazo del trasplante por el receptor.

14. El uso de la reivindicación 4, donde las células madre mesenquimáticas son células madre mesenquimáticas humanas.

15. El uso de la reivindicación 4, donde la preparación farmacéutica comprende además agentes inmunosupresores.

16. El uso de la reivindicación 4, donde el trasplante es un órgano sólido.

17. El uso de la reivindicación 4, donde el órgano sólido se selecciona entre corazón, páncreas, riñón, pulmón o hígado.

18. El uso de la reivindicación 4, donde la preparación farmacéutica se va a administrar antes de dicho trasplante.

19. El uso de la reivindicación 4, donde la preparación farmacéutica se va a administrar simultáneamente con dicho trasplante.

20. El uso de la reivindicación 4, donde la preparación farmacéutica se va a administrar como parte del trasplante.

21. El uso de la reivindicación 4, donde la preparación farmacéutica se va a administrar después de dicho trasplante.

22. El uso de la reivindicación 4, donde la preparación farmacéutica se va a administrar por vía intravenosa al receptor.

23. El uso de la reivindicación 4, donde dichas células efectoras son células de un receptor de dicho trasplante de donante.

24. El uso de la reivindicación 4 para tratar en un receptor de un trasplante la enfermedad de injerto contra hospedador para reducir la respuesta inmune contra el receptor por el trasplante.

25. El uso de la reivindicación 24, donde las células madre mesenquimáticas son autólogas con respecto al receptor.

26. El uso de la reivindicación 24 ó 25, donde las células madre mesenquimáticas son autólogas con respecto al trasplante de donante.

27. El uso de la reivindicación 24, donde las células madre mesenquimáticas son alogénicas tanto con respecto al donante como con respecto al receptor.

28. El uso de la reivindicación 24, donde la preparación farmacéutica comprende además agentes inmunosupresores.

29. Un uso de células madre mesenquimáticas para la fabricación de una preparación para tratar un trasplante para reducir en el receptor del trasplante la respuesta inmune de células efectoras contra un aloantígeno con respecto a las células efectoras después del trasplante en el receptor del trasplante.

30. El uso de la reivindicación 29, donde dichas células efectoras son células T.

31. Un método ex vivo para reducir una respuesta inmune producida por un trasplante de donante, que comprende poner en contacto ex vivo el trasplante con tejido obtenido a partir del receptor del trasplante y después poner en contacto ex vivo el trasplante de donante con células madre mesenquimáticas en una cantidad eficaz para reducir la respuesta inmune contra el receptor por el trasplante de donante.

32. El método de la reivindicación 31, donde las células madre mesenquimáticas son alogénicas tanto con respecto al trasplante de donante como con respecto al receptor del trasplante.

33. El método de la reivindicación 31, donde las células madre mesenquimáticas son autólogas con respecto al receptor del trasplante.

34. El método de la reivindicación 31, donde las células madre mesenquimáticas son autólogas con respecto al trasplante de donante.

35. El método de la reivindicación 31, donde el trasplante de donante es médula ósea.

36. El método de la reivindicación 31, que comprende además el uso de agentes inmunosupresores.

37. El método de la reivindicación 31, donde las células madre mesenquimáticas se modifican para expresar una molécula que induce la muerte de células T activadas, donde dicha molécula se selecciona entre el grupo compuesto por FasL, CD70, CD27 y TRAIL-L.