JP6106640B2 - 二重特異性抗体の融合体 - Google Patents

Description

本発明は、新たな二重特異性抗体の融合タンパク質に関する。このような抗体は、対象抗原に対する第１の特異性と、第２の対象抗原、例えば、それらのｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期の延長に用いる血清担体タンパク質に対する第２の特異性とを含む。このような分子及びこれらを含む医薬組成物の作製法もまた提供される。

抗体は、その高い特異性及び親和性により、特に、タンパク質間相互作用を調節するのに理想的な診断剤及び治療剤となる。組換え抗体技術の分野における進歩の結果、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦ（ａｂ’）_２フラグメント、並びに他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントが作製されている。これらのより小型の分子は、抗体全体の抗原結合活性を保持し、また、免疫グロブリン分子全体と比較して改善された組織透過特性及び薬物動態特性も示しうる。実際、抗体フラグメントは、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）及びＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）などの製品の近年の成功によりみられる通り、汎用治療剤であることが判明しつつある。このようなフラグメントは、免疫グロブリン全体を上回る多数の利点を示すと考えられる一方、また、ｉｎ ｖｉｖｏにおける長い半減期を与えるＦｃドメインを欠くために、血清からのクリアランス速度の上昇も被っている（Ｍｅｄａｓａｎら、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１５８巻、２２１１〜２２１７頁）。

二重特異性を有する抗体、すなわち、異なる２種の抗原に結合する抗体は、既に説明されている（総説については、Ｓｅｇａｌら、１９９９年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１１巻、５５８〜５６２頁；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ及びＰａｃｋ、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３巻、８３〜１０５頁；Ｆｉｓｃｈｅｒ及びＬｅｇｅｒ、２００７年、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、第７４巻、３〜１４頁を参照されたい）。二重特異性もまた、ＷＯ０２／０２７７３、ＵＳ２００７０６５４４０、ＵＳ２００６２５７４０６、ＵＳ２００６１０６２０３、及びＵＳ２００６２８０７３４において説明されている。ヘテロ二重特異性抗体ベースの分子を作製するかつての手法では、一般に、化学架橋形成法又はタンパク質操作法が用いられてきた。化学架橋形成は、ヘテロ二量体形成及びホモ二量体形成の低収率及びその後におけるそれらのクロマトグラフィーによる分離の必要も被っている。タンパク質操作法は、高度に精巧である（例えば、ノブイントゥホール操作；Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、第９巻、第７号、６１７〜６２１頁）か、又は、不適切な安定性特性を有する分子（例えば、ダイアボディ、ｓｃＦｃ）を用いている。場合によって、二重特異性抗には、立体障害の問題もありえ、その結果、両方の抗原が各抗体アームに同時には結合できなくなる。

単一ドメイン抗体又はｄＡｂとしても知られる単一可変ドメイン抗体は、抗体の重（ＶＨ）鎖又は軽（ＶＬ）鎖の可変領域に対応する。マウス単一ドメイン抗体は、Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４１巻、５４４〜５４６頁により説明された。ヒト及び「ラクダ化」ヒト単一ドメイン抗体もまた説明されている（Ｈｏｌｔら、２００３年、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２１巻、４８４〜４９０頁）。単一ドメイン抗体はまた、ラクダ科動物（ラクダ及びラマ）及び軟骨魚（テンジクザメ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ及びｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋｓ））からも得られている。これらの生物は、それらの免疫系の不可欠で重要な成分としての、Ｆｃに相当する定常ドメインフレームワークに埋め込まれた、高親和性単一Ｖ様ドメイン（ラクダ科動物ではＶｈＨと呼ばれ、サメではＶ−ＮＡＲと呼ばれる）を進化させている（総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、第９号、１１２６〜１１３６頁）。

単一ドメイン抗体−酵素融合体は、ＥＰ０３６８６８４において説明されている。単一可変ドメインを含む単一ドメイン−エフェクター群融合体はまた、ＷＯ２００４／０５８８２０においても説明されている。二重可変ドメイン免疫グロブリンは、ＷＯ２００７／０２４７１５において説明されている。異なる特異性を有する２つの単一ドメイン抗体を含む二重特異性リガンドは、ＥＰ１５１７９２１において説明されている。

Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及び他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントの半減期を改善する手段が知られている。一手法は、該フラグメントをポリマー分子にコンジュゲートすることであった。したがって、動物におけるＦａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの短い循環半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）へのコンジュゲーションにより改善されている（例えば、ＷＯ９８／２５７９１、ＷＯ９９／６４４６０、及びＷＯ９８／３７２００を参照されたい）。別の手法は、ＦｃＲｎ受容体と相互作用する作用物質へのコンジュゲーションにより、抗体フラグメントを修飾することであった（例えば、ＷＯ９７／３４６３１を参照されたい）。半減期を延長させるためのまた別の手法は、血清アルブミンを結合するポリペプチドを用いることであった（例えば、Ｓｍｉｔｈら、２００１年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、第１２巻、７５０〜７５６頁；ＥＰ０４８６５２５；ＵＳ６２６７９６４；ＷＯ０４／００１０６４；ＷＯ０２／０７６４８９；及びＷＯ０１／４５７４６を参照されたい）。しかし、ＦｃＲｎ受容体と相互作用するために半減期が長いこれらの抗体に対する代替法として、ＰＥＧへのコンジュゲーションによる化学修飾もなく、ヒト血清アルブミンにコンジュゲートされることもない、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期が長い抗原結合免疫グロブリンタンパク質を作製する必要がなお依然として存在する。

血漿中には各種のタンパク質が存在し、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、及びアルブミン、又はこれらのいずれかのフラグメントを含む。血清担体タンパク質は、日数で測定される半減期、例えば、チロキシン結合タンパク質の５日間若しくはトランスサイレチンの２日間（Ｂａｒｔａｌｅｎａ及びＲｏｂｂｉｎｓ、１９９３年、Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、第１３巻、５８３〜５９８頁）、又はヨウ素化されたα１−酸糖タンパク質（Ｂｒｅｅら、１９８６年、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．、第１１巻、３３６〜３４２頁）の代謝回転の第２相における６５時間で体内を循環する。Ｇｉｔｌｉｎら（１９６４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第１０巻、１９３８〜１９５１頁）に由来するデータは、妊婦において、α１−酸糖タンパク質の半減期が３．８日間であり、トランスフェリンの場合が１２日間であり、フィブリノーゲンの場合が２．５日間であることを示唆している。血清アルブミンは、ヒトにおいて約１９日間の半減期を有する、血管内コンパートメント及び血管外コンパートメントの両方において豊富なタンパク質である（Ｐｅｔｅｒｓ、１９８５年、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．、第３７巻、１６１〜２４５頁）。これは、約２１日間であるＩｇＧ１の半減期に近似している（Ｗａｌｄｅｍａｎ及びＳｔｒｏｂｅｒ、１９６９年、Ｐｒｏｇｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ、第１３巻、１〜１１０頁）。

本発明は、組換えにより作製することができ、同時に２つの抗原に結合することが可能な、改善された二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。

したがって、本発明は、対象抗原に対する第１の特異性を有する免疫グロブリン部分を含み、第２の対象抗原に対する特異性を有する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含む、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。

本発明はまた、対象抗原に対する第１の特異性を有する免疫グロブリン部分を含み、第２の対象抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体をさらに含む、二重特異性抗体融合タンパク質も提供する。

本発明の二重特異性抗体融合体は、対象の２つの抗原に選択的に結合することが可能である。

一実施形態において、Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントが結合する対象抗原は、細胞結合タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、又は腫瘍細胞など、細胞上における細胞表面タンパク質の場合もあり、可溶性タンパク質の場合もある。対象抗原はまた、疾患又は感染時において上方調節されるタンパク質、例えば、受容体及び／又はそれらの対応するリガンドなど、任意の医療関連タンパク質でもありうる。細胞表面タンパク質の具体例は、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ドゥドゥリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ抗原及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦ、並びに適切な場合はこれらの受容体を含む。

可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来成長因子、並びに適切な場合はこれらの受容体を含む。他の抗原は、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、ＨｅｐＢ、及びＨｅｐＣなどのウイルス、生物テロリズム作用物質、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒及び毒素を含む。

一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質を用いて、対象抗原の活性を機能的に変化させることができる。例えば、抗体融合タンパク質は、前記抗原の活性を直接的又は間接的に中和するか、アンタゴナイズするか、又はアゴナイズしうる。

一実施形態において、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質中の単一ドメイン抗体（単数又は複数）が結合する第２の対象抗原は、細胞結合タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、又は腫瘍細胞など、細胞上における細胞表面タンパク質の場合もあり、可溶性タンパク質の場合もある。対象抗原はまた、疾患又は感染時において上方調節されるタンパク質、例えば、受容体及び／又はそれらの対応するリガンドなど、任意の医療関連タンパク質でもありうる。細胞表面タンパク質の具体例は、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ｄｕｄｌｉｎ２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ｎｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ抗原及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦ、並びに適切な場合はこれらの受容体を含む。

可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来成長因子、並びに適切な場合はこれらの受容体を含む。他の抗原は、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、ＨｅｐＢ、及びＨｅｐＣなどのウイルス、生物テロリズム作用物質、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒及び毒素を含む。

単一ドメイン抗体（単数又は複数）により結合されうる他の抗原は、細胞を介するエフェクター機能の動員を可能とする血清担体タンパク質、ポリペプチド、及び核種キレート剤タンパク質を含む。

したがって、一例において、本発明は、対象抗原に対する第１の特異性を有する免疫グロブリン部分を含み、第２のタンパク質に対する特異性を有する単一ドメイン抗体をさらに含み、後者により、補体経路の活性化及び／又はエフェクター細胞の動員などのエフェクター機能を動員する能力が提供される、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。さらに、核種キレート剤タンパク質に結合する単一ドメイン抗体により、本発明の融合タンパク質を用いて放射性核種をキレート化することができる。このような融合タンパク質は、治療のための造影法又は放射性核種による標的化法において用いられる。

したがって、一例では、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含む単離二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、動員ポリペプチドに対する特異性を有する少なくとも１つのｄＡｂに融合し、前記ｄＡｂが、前記動員ポリペプチドに対する結合により、直接的又は間接的に細胞を介するエフェクター機能（単数又は複数）を動員する能力を提供する融合タンパク質が提供される。

エフェクター機能の動員は、エフェクター機能が細胞と関連し、前記細胞がその表面上において動員分子を保有するという意味で、直接的でありうる。間接的な動員は、動員分子へのｄＡｂの結合が、例えば、これによりエフェクター機能が直接的又は間接的に動員される場合もあり、シグナル伝達経路の活性化を介する場合もある、因子の放出を引き起こす場合に生じうる。例は、ＴＮＦα、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１７、ＩＦＮγ、ヒスタミン、Ｃ１ｑ、オプソニン、並びにＣ２、Ｃ４、Ｃ３コンベルターゼ、及びＣ５〜Ｃ９など、古典及び副補体活性化カスケードの他のメンバーを含む。

本明細書で用いられる「動員ポリペプチド」は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγＲ、Ｃ１ｑ及びＣ３などであるがこれらに限定されない補体経路タンパク質、ＣＤ６８、ＣＤ１１５、ＣＤ１６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２を含むがこれらに限定されないＣＤマーカータンパク質（分化抗原群マーカー）を含む。ＣＤマーカータンパク質であるさらなる動員ポリペプチドは、ＣＤ１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、Ｄ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０６、ＣＤ１１４、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１２０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６９、ＣＤ１８４、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、ＣＤ２５７、ＣＤ２７８、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３及びＣＤ３０４、又は細胞を介するエフェクター機能を直接的若しくは間接的に動員する能力を保持するこれらのいずれかのフラグメントを含む。動員ポリペプチドはまた、エフェクター機能を保有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、及びＩｇＡなどの免疫グロブリン分子も含む。

一実施形態において、ｄＡｂがそれに対する特異性を有する第２のタンパク質は補体経路タンパク質であり、Ｃ１ｑが特に好ましい。

好ましい実施形態において、ｄＡｂがそれに対する特異性を有する第２のタンパク質はＣＤマーカータンパク質であり、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６、及びＣＤ３５が特に好ましい。

したがって、また、対象抗原に対する特異性を有する抗体フラグメントを含む単離二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６、及びＣＤ３５からなる群から選択されるＣＤ分子に対する特異性を有する少なくとも１つのｄＡｂに融合している融合タンパク質も提供される。

一実施形態において、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、第１の特異性を有する免疫グロブリン部分の半減期を延長させる。

したがって、一実施形態では、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含む二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体に融合し、前記単一ドメイン抗体が、前記血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する結合により、前記対象抗原に対する特異性を有する抗体フラグメントの半減期を延長させる融合タンパク質が提供される。

一実施形態では、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含む単離二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体に融合し、前記単一ドメイン抗体が、前記血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する結合により、前記対象抗原に対する特異性を有する抗体フラグメントの半減期を延長させる融合タンパク質が提供される。

本明細書で用いられる「血清担体タンパク質」は、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、及びアルブミン、又はこれらのいずれかのフラグメントを含む。

本明細書で用いられる「循環免疫グロブリン分子」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＤ、又はこれらのいずれかのフラグメントを含む。

ＣＤ３５／ＣＲ１は、３６日間の半減期を有する、赤血球上に存在するタンパク質である（通常２８〜４７日間の範囲；Ｌａｎａｒｏら、１９７１年、Ｃａｎｃｅｒ、第２８巻、第３号、６５８〜６６１頁）。

好ましい実施形態において、ｄＡｂがそれに対する特異性を有する第２のタンパク質は血清担体タンパク質であり、ヒト血清担体タンパク質が特に好ましい。最も好ましい実施形態において、血清担体タンパク質はヒト血清アルブミンである。

したがって、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含む二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体に融合している融合タンパク質が提供される。

一実施形態において、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含む単離二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体に融合している融合タンパク質を提供する。

一実施形態において、対象抗原に対する特異性を有する抗体フラグメントはＦａｂフラグメントである。別の実施形態において、対象抗原に対する特異性を有する抗体フラグメントはＦａｂ’フラグメントである。

したがって、最も好ましい一実施形態において、本発明の抗体融合タンパク質は翻訳融合タンパク質、すなわち、その各々の配列が発現ベクターによりコードされる遺伝子融合体である。代替的に、該抗体融合タンパク質成分は、化学的手段を用いて、すなわち、化学コンジュゲーション又は化学架橋形成により融合している。このような化学的手段は当技術分野において知られている。

一例において、抗体フラグメントは、天然又は改変のヒンジ領域を保有するＦａｂ’フラグメントである。本発明の二重特異性抗体融合タンパク質を調製するのに用いられる抗体フラグメントがＦａｂ’フラグメントである場合、前記フラグメントは、一般に、１つ又は複数のアミノ酸により、重鎖のＣ末端において延長される。したがって、本発明の抗体融合体は、直接に又はリンカーを介してｄＡｂへと翻訳融合（又は化学融合）するＦａｂ’フラグメントを含みうる。さらに、適切な抗体Ｆａｂ’フラグメントの例は、ＷＯ２００５００３１７０及びＷＯ２００５００３１７１において説明されるフラグメントを含む。

別の例において、抗体フラグメントはＦａｂフラグメントである。したがって、本発明の抗体融合体は、リンカー配列に翻訳融合（又は化学融合）し、これがｄＡｂへと翻訳融合（又は化学融合）する、Ｆａｂフラグメントを含みうる。ＷＯ２００５／００３１６９において説明される通り、Ｆａｂフラグメントは、鎖間システインで終結するＦａｂフラグメントであることが好ましい。

本発明で用いられる抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントは、任意の動物種に由来しうるが、モノクローナル抗体、ヒト抗体に由来するか、又はヒト化フラグメントであることが好ましい。本発明で用いられる抗体フラグメントは、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡ）又はサブクラスに由来することが可能であり、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、又はヒトを含む任意の動物種から得ることができる。

一実施形態において、抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントは、モノクローナル抗体フラグメント、完全ヒト抗体フラグメント、ヒト化抗体フラグメント、又はキメラ抗体フラグメントである。一実施形態において、抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントは、完全ヒト抗体フラグメント又はヒト化抗体フラグメントである。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、第２５６巻、４９５〜４９７頁）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１９８３年、第４巻、７２頁）、及びＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、７７〜９６頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社、１９８５年）など、当技術分野で知られる任意の方法により調製することができる。

本発明で用いられる抗体はまた、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、第９３巻、第１５号、７８４３〜７８４８頁、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８、及びＷＯ２００４／１０６３７７が説明する方法により、特異抗体の作製のために選択される単一種のリンパ球から生成される免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニング及び発現することによる、単一種リンパ球抗体法を用いても作製することができる。

ヒト化抗体は、非ヒト動物種に由来する１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを有する、非ヒト動物種に由来する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９を参照されたい）。

本発明で用いられる抗体はまた、当技術分野で知られる各種のファージディスプレイ法を用いても作製することができ、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５年、第１８２巻、４１〜５０頁；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５年、第１８４巻、１７７〜１８６頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４年、第２４巻、９５２〜９５８頁；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７年、第１８７巻、９〜１８頁；及びＢｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４年、第５７巻、１９１〜２８０頁；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；及びＷＯ９５／２０４０１；並びにＵＳ５，６９８，４２６；同５，２２３，４０９；同５，４０３，４８４；同５，５８０，７１７；同５，４２７，９０８；同５，７５０，７５３；同５，８２１，０４７；同５，５７１，６９８；同５，４２７，９０８；同５，５１６，６３７；同５，７８０，２２５；同５，６５８，７２７；同５，７３３，７４３；及び同５，９６９，１０８により開示される方法を含む。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳類を含む他の生物も、ヒト化抗体を作製するのに用いることができる。

完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）がすべて、必ずしも同じ抗体に由来するわけではないが、ヒト起源であるか、又はヒト起源の配列と実質的に同一の抗体である。完全ヒト抗体の例は、例えば、上記で説明したファージディスプレイ法により作製される抗体と、一般にＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６，ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１、及びＥＰ０４６３１５１Ｂ１で説明される通り、マウス免疫グロブリンの可変領域及び定常領域の遺伝子がそれらのヒト対応物により置換された、マウスにより作製される抗体とを含みうる。

本発明で用いられる抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの出発材料は、任意の抗体全体、とりわけ、任意の適切な酵素的切断法及び／又は酵素的消化法を用いる、例えば、ペプシン処理によるモノクローナル抗体全体から得ることができる。その代わりに、又はそれに加えて、抗体出発材料は、抗体の可変領域及び／又は定常領域をコードするＤＮＡの操作及び再発現を伴う組換えＤＮＡ法の使用により調製することもできる。標準的な分子生物学の技法を用いて、所望のアミノ酸又はドメインを修飾するか、付加するか、又は欠失させることができる。可変領域又は定常領域に対する任意の変更もなお、本明細書で用いられる「可変」領域及び「定常」領域という用語により包含される。

抗体フラグメントの出発材料は、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、又はヒトを含む任意の動物種から得ることができる。抗体フラグメントの部分は複数の動物種から得ることができ、例えば、抗体フラグメントはキメラでありうる。一例では、定常領域が１つの動物種に由来し、可変領域が別の動物種に由来する。抗体フラグメントの出発材料はまた、改変することもできる。別の例において、抗体フラグメントの可変領域は、組換えＤＮＡ操作法を用いて作製されている。このような操作されたバージョンは、天然抗体のアミノ酸配列におけるか又はこれに対する挿入、欠失、又は変化により、例えば、天然抗体可変領域から作製されるものを含む。この種の具体例は、少なくとも１つのＣＤＲと、場合によって、１つの抗体に由来する１つ又は複数のフレームワークアミノ酸と、第２の抗体に由来する残りの可変領域ドメインとを含有する、操作された可変領域ドメインを含む。これらの抗体フラグメントの作製法及び製造法は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｂｏｓｓら、ＵＳ４，８１６，３９７；Ｃａｂｉｌｌｙら、ＵＳ６，３３１，４１５；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４１巻、５４４頁；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６巻、３８３３頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２２巻、３２３頁；Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻、４２３頁；Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５，５８５，０８９；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、第１０巻、１〜１４２頁；Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２１６巻、１６５〜１８１頁を参照されたい）。

本発明において、Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントに融合した各単一ドメイン抗体は、直接に又はリンカーを介して連結されうる。

ｄＡｂをＦａｂ又はＦａｂ’に連結するのに適するリンカー領域の例は、可撓性リンカー配列及び剛性リンカー配列を含むがこれらに限定されない。可撓性リンカー配列は、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、ＰＮＡＳ、第８５巻、５８７９〜５８８３頁；Ｗｒｉｇｈｔ及びＤｅｏｎａｒａｉｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００７年、第４４巻、第１１号、２８６０〜２８６９頁；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１９９５年、第８巻、第７号、７２５〜７３１頁；Ｌｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、第１１８巻、第４号、８２５〜８３１頁；Ｔａｎｇら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７１巻、第２６号、１５６８２〜１５６８６頁；並びにＴｕｒｎｅｒら、１９９７年、ＪＩＭＭ、第２０５巻、４２〜５４頁において開示される配列を含む（代表例については、表１を参照されたい）。

剛性リンカーの例は、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号３４）、ＰＰＰＰ（配列番号３４）、及びＰＰＰを含む。

一実施形態において、抗体ヒンジ配列又はその一部は、リンカー、例えば、上部ヒンジ配列として用いられる。本発明で用いられる抗体Ｆａｂ’フラグメントは、天然又は改変のヒンジ領域を保有することが典型的である。このようなヒンジ領域は、ｄＡｂ部分に対する天然リンカーとして用いられる。天然ヒンジ領域は、抗体分子のＣ_Ｈ１ドメインと通常結合するヒンジ領域である。改変ヒンジ領域は、天然ヒンジ領域とは長さ及び／又は成分が異なる任意のヒンジである。このようなヒンジは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、又はヤギのヒンジ領域など、他の任意の動物種に由来するヒンジ領域を含みうる。他の改変ヒンジ領域は、Ｃ_Ｈ１ドメインのクラス又はサブクラスとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全ヒンジ領域を含みうる。したがって、例えば、クラスγ１のＣ_Ｈ１ドメインを、クラスγ４のヒンジ領域に結合させることができる。代替的に、改変ヒンジ領域は、天然ヒンジ又は反復内の各ユニットが天然ヒンジ領域に由来する反復ユニットの一部も含みうる。さらなる代替法において、天然ヒンジ領域は、１つ若しくは複数のシステイン又は他の残基をアラニンなどの中性残基に転換することによるか、又は適切に配置された残基をシステイン残基に転換することにより変更することもできる。このような手段により、ヒンジ領域内における多数のシステイン残基を増加又は減少させることができる。加えて、軽鎖の鎖間システインからのヒンジシステイン（単数又は複数）の距離、ヒンジシステイン間の距離、及び可撓性など、ヒンジの特性に影響を与えうるヒンジ内の他のアミノ酸の組成など、ヒンジの他の特性を制御することができ、例えば、ヒンジ内にグリシンを組込むことにより回転可撓性を上昇させることもでき、プロリンを組込むことにより可撓性を低下させることもできる。代替的に、ヒンジ内に荷電残基又は疎水性残基の組合せを組込むことにより、多量体化特性を賦与することもできる（リンカーとしての荷電テール又はイオンテール、例えば、酸性テールの使用については、例えば、Ｒｉｃｈｔｅｒら、２００１年、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、第１４巻、第１０号、７７５〜７８３頁を参照し、ロイシンジッパー配列については、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第５巻、第１号、１５４７〜１５５３頁を参照されたい）。他の改変ヒンジ領域は、完全に合成の場合もあり、長さ、組成、及び可撓性など所望の特性を有するように設計する場合もある。

例えば、ＵＳ５，６７７，４２５、ＵＳ６６４２３５６、ＷＯ９９１５５４９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ９８２５９７１、及びＷＯ２００５００３１７１において、多数の改変ヒンジ領域が既に説明されており、これらは、参照により本明細書に組込まれる。このようなヒンジは、一般に、ＣＨ１領域に後続するが、軽鎖のカッパフラグメント又はラムダフラグメントの定常領域末端に組込むこともできる（例えば、表２を参照されたい）。

本発明で用いられる、単一ドメイン抗体又はｄＡｂとしても知られる単一可変ドメインは、当技術分野で知られる方法を用いて作製することができ、ＷＯ２００５１１８６４２；Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４１巻、５４４〜５４６頁及びＨｏｌｔら、２００３年、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２１巻、４８４〜４９０頁において開示される単一可変ドメインを含む。一実施形態において、本発明で用いられる単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又は軽鎖ドメイン（ＶＬ）である。各軽鎖ドメインは、カッパサブグループでもラムダサブグループでもありうる。ＶＨドメイン及びＶＬドメインを単離する方法は当技術分野で説明されており、例えば、ＥＰ０３６８６４及びＷａｒｄら、前出を参照されたい。このようなドメインは、任意の適切な動物種又は抗体出発材料に由来しうる。一実施形態において、単一ドメイン抗体は、げっ歯類、ヒト、又は他の動物種に由来しうる。一実施形態において、単一ドメイン抗体はヒト化される。

一実施形態において、単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ２００５／１１８６４２；Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２２巻、１１６１〜１１６５頁及びＨｏｌｔら、２００３年、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２１巻、４８４〜４９０頁において説明される方法を用いるファージディスプレイライブラリーに由来する。好ましくは、このような単一ドメイン抗体は完全ヒト抗体であるが、また、他の動物種にも由来しうる。Ｈｏｌｔら、前出で説明される通り、単離された単一ドメイン抗体の配列を改変して、単一ドメイン抗体の特性、例えば、可溶性を改善することができることが理解される。

一実施形態において、ｄＡｂは、ｓｃＦｖファージディスプレイから得られるヒト配列であるか、或いはトランスジェニックのＨｕｍｏｕｓｅ（商標）若しくはＶｅｌｏｃｉｍｏｕｓｅ（商標）又はヒト化げっ歯類に由来する。

一実施形態において、ｄＡｂは、ヒト若しくはヒト化げっ歯類、ラクダ科動物、又はサメから得られる。このようなｄＡｂは、ヒト化されることが好ましい。一例において、単一ドメイン抗体は、ＥＰ０６５６９４６で説明されるラクダ科動物免疫グロブリンに基づくＶＨＨドメインである。一例では、対象抗原によりラクダ又はラマを免疫感作し、力価が適切であれば血液を採取する。ｄＡｂをコードする遺伝子を単一細胞ＰＣＲによりクローニングすることもでき、ｄＡｂをコードするＢ細胞（単数又は複数）をＥＢＶ形質転換によるか又は不死化細胞系への融合により不死化することもできる。

本明細書の上記で説明した通り、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含む二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、第２の対象抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体に直接に又はリンカーを介して融合している融合タンパク質を提供する。

したがって、一実施形態において、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のＮ末端において、直接に又はリンカーを介してｄＡｂに融合する。代替的に、抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のＣ末端において、直接に又はリンカーを介してｄＡｂに融合する。別の実施形態において、抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの重鎖及び軽鎖は各々、該Ｃ末端において、直接に又はリンカーを介してｄＡｂに融合する。連結は化学コンジュゲーションでありうるが、翻訳融合、すなわち、各々の配列が発現ベクターにより順次コードされる遺伝子融合であることが最も好ましい。

単一ドメイン抗体のＮ末端がＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの重鎖又は軽鎖のＣ末端に直接に又はリンカーを介して融合することが典型的であり、単一ドメイン抗体がＦａｂ又はＦａｂ’のＮ末端に融合する場合は、そのＣ末端により、場合によってリンカーを介して融合する。

一実施形態において、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含むか又はこれよりなる二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、重鎖又は軽鎖のＮ末端において第２の対象抗原に対する特異性を有する単一ドメイン抗体に融合している融合タンパク質を提供する。

一実施形態において、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含むか又はこれよりなる二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、重鎖又は軽鎖のＣ末端において第２の対象抗原に対する特異性を有する単一ドメイン抗体に融合している融合タンパク質を提供する。

一実施形態において、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含むか又はこれよりなる二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが、重鎖又は軽鎖のＣ末端において第２の対象抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体に融合している融合タンパク質を提供する。

一実施形態において、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含むか又はこれよりなる二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが２つの単一ドメイン抗体に融合し、各単一ドメイン抗体が、場合によって、リンカーを介して、互いに直鎖配列中で融合し、結果として得られる単一ドメイン抗体融合体が、Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの軽鎖又は重鎖のＣ末端に融合する融合タンパク質を提供する。

一実施形態において、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントを含むか又はこれよりなる二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記フラグメントが２つの単一ドメイン抗体に融合し、一方の単一ドメイン抗体がＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの軽鎖Ｃ末端に融合し、他方の単一ドメイン抗体がＦａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの重鎖Ｃ末端に融合し、前記単一ドメイン抗体が、第２の対象抗原に対する特異性を有する融合タンパク質を提供する。

Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの重鎖及び軽鎖が各々、Ｃ末端において単一ドメイン抗体を含む一実施形態において、該２つの単一ドメイン抗体は同一であり、すなわち、同じ抗原に対する同じ結合特異性を有する。一例において、それらは、同じ抗原上における同じエピトープに結合する。例えば、単一ドメイン抗体は共に、同じＶＨ ｄＡｂの場合もあり、同じＶＨＨ ｄＡｂの場合もあり、同じＶＬ ｄＡｂの場合もある。

好ましくは、Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの重鎖及び軽鎖が各々、Ｃ末端において単一ドメイン抗体を含む場合、該２つの単一ドメイン抗体は、抗原に共同的に結合する相補的なＶＨ／ＶＬ対であり、すなわち、それらは、同じ結合特異性を有する相補的なＶＨ／ＶＬ対である。それらは、同じ抗体に由来するＶＨ／ＶＬ対であることが典型的である。

本発明の二重特異性抗体融合タンパク質が、相補的なＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含む一実施形態において、ＶＨ単一ドメイン抗体は重鎖定常領域（ＣＨ１）のＣ末端に融合し、ＶＬ単一ドメイン抗体は軽鎖定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端に融合する。

本発明の二重特異性抗体融合タンパク質が、相補的なＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含む一実施形態において、ＶＬ単一ドメイン抗体は重鎖定常領域（ＣＨ１）のＣ末端に融合し、ＶＨ単一ドメイン抗体は軽鎖定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端に融合する。

本発明の二重特異性融合タンパク質において、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの成分が結合する抗原とは異なる第２の抗原に結合する。

一例において、本発明において用いられるｄＡｂは、補体経路タンパク質、ＣＤマーカータンパク質、又はＦｃγＲに対する特異性を示す。この場合、ｄＡｂは、ＣＤ分子に対して特異性であることが好ましい。ｄＡｂは、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６、及びＣＤ３５からなる群から選択されるＣＤ分子に対する特異性を示すことが最も好ましい。

好ましい例において、本発明で用いられるｄＡｂは、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を示し、血清担体タンパク質は、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、又は血清アルブミンなどのヒト血清担体タンパク質であることが好ましい。ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに対する特異性を示すことが最も好ましい。したがって、一例において、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１（例えば、ヒト血清アルブミン）によりウサギ、マウス、ラット、ラクダ、又はラマを免疫感作し、力価が適切であれば血液を採取する。ｄＡｂをコードする遺伝子を単一細胞ＰＣＲによりクローニングすることもでき、ｄＡｂをコードするＢ細胞（単数又は複数）をＥＢＶ形質転換によるか又は不死化細胞系への融合により不死化することもできる。代替的に、単一ドメイン抗体は、本明細書の上記において説明した通り、ファージディスプレイにより得ることもできる。

一実施形態において、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、ヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態において、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、及びラット血清アルブミンに結合する。

一実施形態において、血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、ＷＯ２００５／１１８６４２（例えば、図１ｃ及び１ｄを参照されたい）において提供されるｄＡｂ、若しくはＷＯ２００４／０４１８６２において提供されるＶＨＨ、又は例えば、ＷＯ２００６／１２２７８７の表ＩＩＩに記載のヒト化ナノボディである。

一実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１として図５（ｅ）の配列番号５６又は図５（ｋ）の配列番号６２で示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２として図５（ｆ）の配列番号５７又は図５（ｌ）の配列番号６３で示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３として図５（ｇ）の配列番号５８又は図５（ｍ）の配列番号６４で示される配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である。

別の実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３のうち少なくとも２つが、以下：ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５６又は配列番号６２で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号５７又は配列番号６３で示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号５８又は配列番号６４で示される配列から選択される、重鎖ＶＨ抗体である。例えば、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号５６で示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号５７で示される配列を有する、ＶＨドメインを含みうる。代替的に、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号５６で示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号５８で示される配列を有する、ＶＨドメインを含みうる。疑念を回避するため、すべての順列が含まれることが理解される。

別の実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５６で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号５７で示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号５８で示される配列を含む、重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である。

別の実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号６２で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号６３で示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号６４で示される配列を含む、重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である。

一実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、図５（ａ）（配列番号５２）で示される配列を有する、ヒト化重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体ｄＡｂＨ１である。Ｇ_４Ｓリンカーを含む適切なＣＨ１−ｄＡｂＨ１融合体の例は、図６（配列番号６８）で示される。

一実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、図５（ｃ）（配列番号５４）で示される配列を有する、ヒト化重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体ｄＡｂＨ２である。Ｇ_４Ｓリンカーを含む適切なＣＨ１−ｄＡｂＨ２融合体の例は、図６（配列番号６９）で示される。

抗体可変ドメイン内の残基は、Ｋａｂａｔらにより考案されたシステムに従い番号付けするのが慣例となっている。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７年、「免疫学的対象タンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、米国保健福祉省、ＮＩＨ（以後、「Ｋａｂａｔら（前出）」とする）に記載されている。別段に示す場合を除き、本明細書では、この番号付けシステムを用いる。

Ｋａｂａｔによる残基表示は、アミノ酸残基の直鎖番号付けと常に直接に対応するわけではない。実際の直鎖アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワーク領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれであれ、構造成分の短縮又はこれへの挿入に対応する、Ｋａｂａｔによる厳密な番号付けにおけるよりも少ないか又はこれに加えたアミノ酸を含有しうる。所与の抗体に対する、Ｋａｂａｔによる正確な残基の番号付けは、該抗体配列内における、Ｋａｂａｔにより番号付けされた「標準的な」配列と相同な残基のアライメントにより決定される。

重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによれば、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１９６巻、９０１〜９１７頁（１９８７年））によれば、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループは、残基２６〜残基３２に広がる。したがって、本明細書で用いられる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム及びＣｈｏｔｈｉａ位相ループ定義の組合せにより説明される残基２６〜３５を含む。

軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによれば、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。

一実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１として図５（ｈ）の配列番号５９又は図５（ｎ）の配列番号６５で示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２として図５（ｉ）の配列番号６０又は図５（ｏ）の配列番号６６で示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３として図５（ｊ）の配列番号６１又は図５（ｐ）の配列番号６７で示される配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体である。

別の実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３のうち少なくとも２つが、以下：ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号５９又は配列番号６５で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号６０又は配列番号６６で示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号６１又は配列番号６７で示される配列から選択される、軽鎖ＶＬ抗体である。例えば、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号５９で示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号６０で示される配列を有する、ＶＬドメインを含みうる。代替的に、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号５９で示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６１で示される配列を有する、ＶＬドメインを含みうる。疑念を回避するため、すべての順列が含まれることが理解される。

別の実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号５９で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号６０で示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号６１で示される配列を含む、軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体である。

別の実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号６５で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号６６で示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号６７で示される配列を含む、軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体である。

一実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、図５（ｂ）（配列番号５３）で示される配列を有する、ヒト化軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体ｄＡｂＬ１である。共にＧ_４Ｓリンカーを含む適切なＣＨ１−ｄＡｂＬ１融合体及びＣｋ１−ｄＡｂＬ１融合体の例は、図６（配列番号７０及び配列番号７２）で示される。

一実施形態において、本発明で用いられる、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体は、図５（ｄ）（配列番号５５）で示される配列を有する、ヒト化軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体ｄＡｂＬ２である。共にＧ_４Ｓリンカーを含む適切なＣＨ１−ｄＡｂＬ２融合体及びＣｋ１−ｄＡｂＬ２融合体の例は、図６（配列番号７１及び配列番号７３）で示される。

Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの重鎖及び軽鎖が各々、Ｃ末端において単一ドメイン抗体を含み、該２つの単一ドメイン抗体が、本明細書の上記で説明した通り、抗原に共同的に結合する相補的なＶＨ／ＶＬ対である一実施形態において、ＶＨ ｄＡｂはｄＡｂＨ１（配列番号５２）であり、ＶＬ ｄＡｂはｄＡｂＬ１（配列番号５３）である。

Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ’フラグメントの重鎖及び軽鎖が各々、Ｃ末端において単一ドメイン抗体を含み、該２つの単一ドメイン抗体が、本明細書の上記で説明した通り、抗原に共同的に結合する相補的なＶＨ／ＶＬ対である一実施形態において、ＶＨ ｄＡｂはｄＡｂＨ２（配列番号５４）であり、ＶＬ ｄＡｂはｄＡｂＬ２（配列番号５５）である。

別の態様において、本発明は、本明細書の上記及び図５（ｅ〜ｐ）に記載の１つ又は複数のＣＤＲを含有するアルブミン結合抗体又はこれらのフラグメントを提供する。前記ＣＤＲは、任意の適切な抗体フレームワーク及び任意の適切な抗体フォーマットに組込むことができる。このような抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、又はキメラ抗体でありうるがこれらに限定されない、抗体全体及びこれらの機能的に活性なフラグメント又は誘導体を含む。したがって、このようなアルブミン結合抗体は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全抗体分子又はそのフラグメントを含む場合があり、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体、又は四価抗体、ビスｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記いずれかのエピトープ結合フラグメントでありうるがこれらに限定されない（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、第２３巻、第９号、１１２６〜１１３６頁；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ、第２巻、第３号、２０９〜２１７頁を参照されたい）。これらの抗体フラグメントの作製法及び製造法は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２１６巻、１６５〜１８１頁を参照されたい）。多価抗体は、多重特異性を含む場合もあり、単一特異性の場合もある（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。本発明のこの態様はまた、これらのアルブミン結合抗体の変異体にも拡張されることが理解される。

このようなアルブミン結合抗体、特に、単一ドメイン抗体は、他の任意の適切な状況で所望されるか又は用いられる、他の任意の抗体若しくはタンパク質又は他の分子にコンジュゲートさせることができることが理解される。一例において、上記で説明し、図５（ａ〜ｄ）で示した、単一ドメイン抗体ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ２、ｄＡｂＬ２は、任意の適切な抗体フォーマットに組込むこともでき、融合体又はコンジュゲートなど、任意の適切な状況における単一ドメイン抗体として用いることもできる。

一実施形態において、本発明のこの態様の抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１として図５（ｅ）で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２として図５（ｆ）で示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として図５（ｇ）で示される配列を含む。

一実施形態において、本発明のこの態様の抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１として図５（ｋ）で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２として図５（ｌ）で示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として図５（ｍ）で示される配列を含む。

一実施形態において、本発明のこの態様の抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１として図５（ｈ）で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２として図５（ｉ）で示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として図５（ｊ）で示される配列を含む。

一実施形態において、本発明のこの態様の抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１として図５（ｎ）で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２として図５（ｏ）で示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として図５（ｐ）で示される配列を含む。

本発明の二重特異性融合タンパク質の単一ドメイン抗体（単数又は複数）がアルブミンに結合する場合、アルブミンに対する単一ドメイン抗体の結合親和性は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＦａｂ又はＦａｂ’の半減期を延長させるのに十分である。アルブミンに対する２．５μＭ以下の親和性で、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期が延長されることが報告されている（Ｎｇｕｙｅｎ，Ａ．ら（２００６年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、第１９巻、第７号、２９１〜２９７頁）。本発明の単一ドメイン抗体分子は、それらの目的及びそれらが結合する抗原に適する結合親和性を有することが好ましい。一例において、単一ドメイン抗体は、高結合親和性、例えば、ピコモル単位の結合親和性を有する。一例において、単一ドメイン抗体は、ナノモル又はマイクロモル単位の、抗原に対する結合親和性を有する。親和性は、天然又は組換えの抗原を用いる、本明細書の実施例で説明されるＢＩＡｃｏｒｅを含む、当技術分野で知られる任意の適切な方法を用いて測定することができる。

アルブミンに結合する本発明の単一ドメイン抗体分子は、約２μＭもしくはそれより良い結合親和性を有することが好ましい。一実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体分子は、約１μＭもしくはそれより良い結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体分子は、約５００ｎＭもしくはそれより良い結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体分子は、約２００ｎＭもしくはそれより良い結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体分子は、約１ｎＭもしくはそれより良い結合親和性を有する。本発明により提供され、当技術分野で知られる単一ドメイン抗体の親和性は、当技術分野で知られる任意の適切な方法を用いて変化させうることが理解される。したがって、本発明はまた、アルブミンに対して改善された親和性を有する、本発明のドメイン抗体分子の変異体にも関する。このような変異体は、ＣＤＲの突然変異誘発（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２５４巻、３９２〜４０３頁、１９９５年）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、７７９〜７８３頁、１９９２年）、大腸菌の変異株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２５０巻、３５９〜３６８頁、１９９６年）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第８巻、７２４〜７３３頁、１９９７年）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２５６巻、７７〜８８頁、１９９６年）、及びセクシュアルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、２８８〜２９１頁、１９９８年）を含む多数の親和性成熟プロトコールにより得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（前出）は、これらの親和性成熟法について論じている。

本発明はまた、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列も提供する。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的処理、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組合せにより作製される合成ＤＮＡを含みうる。

本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、当業者によく知られる方法により得ることができる。例えば、抗体フラグメント、リンカー、及び／又はｄＡｂの一部又は全部をコードするＤＮＡ配列は、決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて、所望の形で合成することができる。

分子生物学の標準的な技法を用いて、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成法を用いて完全に又は部分的に合成することができる。適切な場合、部位志向的突然変異誘発法及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いることができる。

本発明はさらに、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターが提供される。好ましい一実施形態において、クローニングベクター又は発現ベクターは、全二重特異性抗体融合タンパク質をコードする単一のＤＮＡ配列を含む。したがって、クローニングベクター又は発現ベクターは、翻訳融合タンパク質が生成されるように、ＤＮＡによりコードされる転写単位を順に含む。

実際、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端においてｄＡｂを有することが可能であり、したがって、ｄＡｂのＤＮＡによりコードされる転写単位は、翻訳融合体をコードするＤＮＡ配列内において、それぞれ、冒頭又は末尾となることが当業者に理解される。したがって、翻訳融合体は、Ｎ末端のｄＡｂ及びＣ末端のＦａｂ又はＦａｂ’を含みうる。さらに、翻訳融合体は、Ｎ末端のＦａｂ又はＦａｂ’及びＣ末端のｄＡｂも含みうる。

Ｆａｂ又はＦａｂ’の重鎖及び軽鎖を同じであるか又は異なるベクターに組込みうることが理解される。一実施形態では、１つのベクターがＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖及びＣ末端のｄＡｂを含む翻訳融合体を含み、別のベクターがＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖及びＣ末端のｄＡｂを含む翻訳融合体を含みうる。

例えば、抗体フラグメントのＮ末端においてｄＡｂ部分を有する二重特異性抗体融合タンパク質を作製することが所望される場合、ベクターは、ｄＡｂ部分をコードするＤＮＡ転写単位、場合によって、リンカー配列をコードするＤＮＡ転写単位、及び抗体フラグメントをコードするＤＮＡ転写単位の順に、ＤＮＡ転写単位を含む。抗体フラグメントのＣ末端においてｄＡｂ部分を有する二重特異性抗体融合タンパク質を作製することが所望される場合、ベクターは、抗体フラグメントをコードするＤＮＡ転写単位、場合によって、リンカー配列をコードするＤＮＡ転写単位、及び血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１、例えば、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有するｄＡｂ部分をコードするＤＮＡ転写単位の順に、ＤＮＡ転写単位を含む。したがって、本発明の翻訳融合体は、例えば、ｄＡｂ−リンカー−Ｆａｂ、Ｆａｂ−リンカー−ｄＡｂ、ｄＡｂ−Ｆａｂ、Ｆａｂ−ｄＡｂ、Ｆａｂ’−ｄＡｂ、ｄＡｂ−Ｆａｂ’、ｄＡｂ−リンカー−Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−リンカー−ｄＡｂを含むがこれらに限定されない、異なる構成でありうる。例えば、２つのベクターを用いる場合、第１のベクターはｄＡｂに融合したＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖を含むことが可能であり、第２のベクターはｄＡｂに融合したＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖を含むことが可能である。

本発明の翻訳融合体内に含まれる抗体フラグメントに対応するＤＮＡコードは、当業者に知られる構成内における転写単位としてベクターに組込むことができ、例えば、転写単位は、軽鎖に対応するコードの後に重鎖コードを含む場合もあり、この逆の場合もある（特に、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、２００２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第２６巻、３０９〜３２０頁を参照されたい）。

本発明によるベクターは、抗体リーダー配列など、適切なリーダー配列を含むことが好ましい。このようなリーダー配列は、当技術分野でよく知られている。

それによりベクターを構築しうる一般的な方法である、トランスフェクション法及び形質転換法並びに培養法は、当業者によく知られている。この点において、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、ニューヨーク、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社により刊行される、Ｍａｎｉａｔｉｓによるマニュアルが参照される。

また、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。二重特異性抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現に適する任意の宿主／ベクター系を用いることができる。細菌、例えば、大腸菌、及び他の微生物系を用いることもでき、真核生物、例えば、哺乳類の宿主細胞発現系を用いることもできる。適切な哺乳類宿主細胞は、ＮＳ０細胞、ＣＨＯ細胞、黒色腫細胞、又はハイブリドーマ細胞を含む。したがって、一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、大腸菌内で発現する。別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、哺乳類細胞内で発現する。

本発明はまた、二重特異性抗体融合タンパク質の作製のための工程であって、前記二重特異性抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列からのタンパク質の発現に適する条件下において、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む工程も提供する。本発明は、二重特異性抗体融合タンパク質を単離する方法をさらに提供する。

作製時において、必要な場合、当技術分野で知られる任意の適切な方法を用いて、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質を精製することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、又は疎水性相互作用クロマトグラフィーなどであるがこれらに限定されないクロマトグラフィー法を用いることができる。

二重特異性抗体融合タンパク質のサイズは、サイズ除外クロマトグラフィー及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥなど、当技術分野で知られる従来の方法により確認することができる。このような技法を用いて、該タンパク質が二量体化していないこと、及び／又は部分、例えば、ｄＡｂ部分の逸失が生じていないことを確認することができる。二量体が検出される場合、上記で説明した従来のクロマトグラフィー法を用いて、二量体分子種から単量体の二重特異性抗体融合タンパク質を精製することができる。

本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、炎症性疾患及び炎症性障害、免疫疾患及び免疫障害、線維化障害、並びに癌を含む疾患又は障害の治療において有用である。

「炎症性疾患」又は「炎症性障害」及び「免疫疾患又は免疫障害」という用語は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、マックルウェルズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型糖尿病、移植、及び移植片対宿主病を含む。

「線維化障害」という用語は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は強皮症）、腎線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧、末期腎疾患、腹膜線維症（持続的携帯型腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜症、反応性心筋線維症、瘢痕形成、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠動脈バイパス術、関節形成術、及び白内障術を含む。

「癌」という用語は、上皮から生じるか、又は皮内若しくはより一般に、体内臓器、例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱、又は腸の内壁で見出される、新規の悪性増殖を含む。癌は隣接組織内に浸潤し、遠隔の臓器、例えば、骨、肝臓、肺、又は脳に拡大（転移）する傾向がある。

したがって、本発明のさらなる態様により、１種又は複数種の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を伴う本発明の抗体融合体を含む医薬組成物が提供される。また、疾患又は障害の治療用薬剤の製造のための本発明の抗体融合タンパク質の使用も提供される。疾患又は障害は炎症性疾患又は炎症性障害であることが最も好ましい。

本発明による医薬組成物は、経口投与、口腔内投与、非経口投与、皮下投与、鼻腔内投与、局所投与、眼内投与、又は直腸内投与に適する形態をとる場合もあり、吸入又は吹送による投与に適する形態をとる場合もある。

適切な場合、例えば、抗体融合タンパク質の単一ドメイン抗体（単数又は複数）がアルブミンに結合する場合、当技術分野で知られる任意の適切な方法を用いて、二重特異性抗体融合タンパク質をヒト又は組換えの血清アルブミンとあらかじめ調合することが望ましいことがある。

経口投与の場合、医薬組成物は、結合剤（例えば、あらかじめゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロース、又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、又はシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプン又はグリコール酸ナトリウム）；又は保湿剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を伴う従来の手段により調製される錠剤、トローチ、又はカプセルの形態をとりうる。錠剤は、当技術分野でよく知られる方法により被覆することができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、又は懸濁液の形態をとる場合もあり、使用前の水又は他の適切な媒体による構成のための乾燥生成物として提示される場合もある。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性媒体、又は防腐剤などの薬学的に許容される添加剤を伴う従来の手段により調製することができる。調製物はまた、適切な場合、緩衝塩、芳香剤、着色剤、又は甘味剤も含有しうる。

経口投与用調製物は、活性化合物を制御放出するのに適する形で調合することができる。

口腔内投与の場合、組成物は、従来の方式で調合される錠剤又はトローチの形態をとりうる。

本発明の二重特異性抗体は、注射による、例えば、ボーラス注射又は注入による非経口投与用に調合することができる。注射用製剤は、単位用量形態、例えば、ガラス製アンプル、又は複数回投与用容器、例えば、ガラス製バイアル内において提示することができる。注射用組成物は、油性又は水性の媒体中における懸濁液、溶液、又は乳剤の形態をとる場合があり、懸濁剤、安定化剤、防腐剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含有しうる。代替的に、有効成分は、使用前の適切な媒体、例えば、無菌発熱物質非含有水による構成のための粉末形態でもありうる。

上記で説明した製剤に加え、本発明の二重特異性抗体はまた、デポ調製物としても調合することができる。このような長時間作用製剤は、移植（Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）によるか又は筋肉内注射により投与することができる。

鼻腔内投与又は吸入投与の場合、本発明による化合物は、適切な高圧気体、例えば、ジクロロジフルオロメタン、フルオロトリクロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切な気体若しくは気体の混合物の使用を伴う、高圧パック又は噴霧器のためのエアゾールスプレーの提示形態で簡便に送達することができる。

組成物は、所望の場合、有効成分を含有する１つ又は複数の単位用量形態を含有しうるパック又は分注器において提示することができる。パック又は分注器には、投与指示書を添付することができる。

外用投与の場合、本発明による化合物は、１種又は複数種の薬学的に許容される担体中に懸濁又は溶解させた活性成分を含有する適切な軟膏中に簡便に調合することができる。具体的な担体は、例えば、鉱物油、石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、乳化ワックス、及び水を含む。代替的に、本発明による化合物は、１種又は複数種の薬学的に許容される担体中に懸濁又は溶解させた活性成分を含有する適切なローション中にも調合することができる。具体的な担体は、例えば、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、ベンジルアルコール、２−オクチルドデカノール、及び水を含む。

眼内投与の場合、本発明による化合物は、殺菌剤又は殺真菌剤、例えば、硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウム、又は酢酸クロルヘキシジンなどの防腐剤を含むか又は含まない、等張性のｐＨ調整された無菌生理食塩液中におけるマイクロイオン化懸濁液として簡便に調合することができる。代替的に、眼内投与の場合、化合物は、ワセリンなどの軟膏に調合することもできる。

直腸内投与の場合、本発明による化合物は、坐剤として簡便に調合することができる。これらは、活性成分を、室温では固体であるが直腸内温度では液体であり、このため、直腸内では溶融して活性成分を放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することにより調合することができる。このような材料は、例えば、ココアバター、蜂蜜、及びポリエチレングリコールを含む。

特定の状態の予防又は治療に必要とされる本発明の化合物の量は、選択される化合物及び治療される患者の状態に応じて変化する。しかし、一般に、毎日の用量は、経口投与又は口腔内投与の場合、体重当たり約１０ｎｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、典型的には１００ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、非経口投与の場合、体重当たり約１０ｎｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、鼻腔内投与又は吸入若しくは吹送による投与の場合、約０．０５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば、０．５ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲である。

本発明の各実施形態の好ましい特徴は、他の実施形態の各々の場合と同様、変更すべき点は変更される。本明細書で引用される特許及び特許出願を含むがこれらに限定されないすべての刊行物は、各個別の刊行物が、全体として提示されたと仮定して、参照により本明細書に組込まれることが具体的かつ個別に示されたと仮定した場合と同様に、参照により本明細書に組込まれる。

ここで、以下の例を参照して本発明を説明するが、これらは単に例示的なものであり、いかなる形であれ、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

ｄＡｂがＣ末端にあるＦａｂ−ｄＡｂの略図である。 Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂの略図である。 ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ_４ＳＥ）（１）及びＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］_２）（２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。 ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ_４ＳＥ）（１）及びＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］_２）（２）のウェスタンブロット解析を示す図である。 ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。 レーンＭ＝ＳｅｅＢｌｕｅマーカー レーン１及び２＝ＩｇＧ対照 レーン３＝ＦａｂＢ レーン４＝ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ_４Ｓ×２）及びＦａｂＢ−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）であるＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ レーン５＝ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ_４Ｓ×２）及びｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）であるＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ ドメイン抗体ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＨ２、ｄＡｂＬ１、及びｄＡｂＬ２並びにこれらの抗体の各々に由来するＣＤＲの配列を示す図である。 ドメイン抗体に融合したＦａｂＢの重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含むＦａｂＢ−ｄＡｂ構築物を示す図である。 ドメイン抗体に融合したＦａｂＢの重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含むＦａｂＢ−ｄＡｂ構築物を示す図である。 Ｆａｂ’Ａの重鎖配列及び軽鎖配列並びにＦａｂＡの重鎖配列を示す図である。

実験：
（例１）
ヒト血清アルブミンに特異的なｄＡｂの作製
組換えＤＮＡ法を用いて、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有するｄＡｂをコードする、インフレームのＤＮＡによりコードされた転写単位を作製した。

所望の場合は、組換えＤＮＡ法を用いて、動員タンパク質に対する特異性を有するｄＡｂをコードする、インフレームのＤＮＡによりコードされた転写単位を作製することができる。

（例２）
抗体フラグメントの作製
軽鎖のＣ末端にｄＡｂを融合する場合、ヒトカッパ軽鎖定常領域（カッパ定常領域のＫｍ３アロタイプを有する）、ペプチドリンカー、及びｄＡｂをコードするＤＮＡを合成し、ＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩ制限フラグメントとして、ヒトガンマ−１ ＣＨ１定常領域をコードするＤＮＡを含有するＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈ社の自社製発現ベクターｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ）（Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００５年、第３０８巻、１７〜３０頁において説明されるｐＴＴＯ−１の誘導体）内にクローニングした。これにより、共にｔａｃプロモーターの制御下にある、リンカーを介してｄＡｂに融合したヒト化軽鎖に対する遺伝子と、これに後続するヒト化重鎖Ｆａｂフラグメントに対する遺伝子とからなる、ジシストロニックの遺伝子配置がもたらされる。また、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーの上流にある固有のＢｓｐＥ１部位、又はＡｌａ−Ｐｒｏに富むリンカーの上流にあるＡｓｃＩ部位もコードされる。

重鎖のＣ末端にｄＡｂを融合する場合、ヒトＣＨ１フラグメント（γ１アイソタイプの）をコードするＤＮＡと、これに後続するリンカー及びｄＡｂをコードする配列とを合成した。これを、ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントとして、ヒトガンマ−１ ＣＨ１定常領域をコードするＤＮＡを含有するＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈ社の自社製発現ベクターｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ）（Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌら、上記において説明されるｐＴＴＯ−１の誘導体）内にサブクローニングした。これにより、共にｔａｃプロモーターの制御下にある、非コード遺伝子間配列を伴うヒト化軽鎖に対する遺伝子と、これに後続する、リンカーを介してｄＡｂに融合した重鎖とからなる、ジシストロニックの遺伝子配置がもたらされる。その中における発現がＩＰＴＧの添加により誘導される大腸菌Ｗ３１１０株内に、組換え発現プラスミドを形質転換した。発現実験は、当初約０．５のＯＤ（６００ｎｍ）における２００ｕＭ ＩＰＴＧの添加を伴い小規模で（５ｍｌの培養容量）実施し、誘導の２時間後に細胞を回収し、トリス／ＥＤＴＡ中３０℃で一晩にわたり抽出した。透明な抽出物を、Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性解析に用いた。有望な発現収量及び活性をもたらす構築物を発酵のために選択した。

方法
以下の例では、ｄＡｂが融合する抗体鎖を、ｃカッパ軽鎖の場合はＣＫ又はＬＣ、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインの場合はＣＨ１又はＨＣと表記する。

大腸菌における発現のためのＦａｂＡ−ｄＡｂ融合プラスミドの構築
Ｆａｂ−ｄＡｂ融合タンパク質は、ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４を、ＦａｂＡの軽鎖又は重鎖の定常領域Ｃ末端に融合することにより構築した。ｄＡｂをｃカッパ領域（配列番号７５）に連結するには可撓性リンカー（ＳＧＧＧＧＳＥ（配列番号１））又は剛性リンカー（Ｇ（ＡＰＡＰＡ）_２（配列番号３４））を用い、ｄＡｂをＣＨ１領域（配列番号７６）に連結するにはリンカーＤＫＴＨＴＳ（配列番号２）を用いた。自社製のｐＴＴＯＤベクターのＦａｂＡ配列へのサブクローニングを可能とするフラグメントとして、定常領域−ｄＡｂ融合体をコードするＤＮＡ配列を合成により作製した。

軽鎖−ｄＡｂ融合体は、リンカー（ＳＧＧＧＧＳＥ（配列番号１））又は剛性リンカー（Ｇ（ＡＰＡＰＡ）_２（配列番号３４））を介してｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４に融合したＣ末端ｃカッパをコードする合成遺伝子のＳａｃＩ−ＡｐａＩフラグメントを、ＦａｂＡを発現することが可能なプラスミドの対応する部位にサブクローニングすることにより構築した。重鎖−ｄＡｂ融合体は、ＤＫＴＨＴＳリンカーを介してｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４に融合したＣ末端ＣＨ１をコードする合成遺伝子のＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＦａｂＡを発現することが可能なプラスミドの対応する部位にサブクローニングすることにより構築した。

Ｆａｂ’Ａは、ＩＬ−１ベータ結合抗体に由来し、その重鎖配列及び軽鎖配列は、図７に示す通り、それぞれ、配列番号７４及び７５に記載されている。軽鎖にｄＡｂが結合されるＦａｂ’Ａでは、重鎖（配列番号７６）にｄＡｂが結合されない場合でも、重鎖のヒンジをＤＫＴＨＴＳに変更した。

ＦａｂＡは、同じ軽鎖配列（配列番号７５）と、鎖間システインで終結する短縮重鎖配列（配列番号７７）とを含む。ｄＡｂＬ３及びｄＡｂＨ４は、それぞれ、ヒト血清アルブミンに結合する軽鎖ドメイン抗体及び重鎖ドメイン抗体である。

大腸菌における発現のためのＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂ融合プラスミドの構築
軽鎖及び重鎖の両方にｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４を有するＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂは、ＣＨ１−ｄＡｂ融合体をコードするＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｄＡｂが可撓性リンカーを介して軽鎖に融合する既存のＦａｂ−ｄＡｂプラスミドにサブクローニングすることにより構築した。

哺乳類細胞における発現のためのＦａｂＢ−ｄＡｂ融合プラスミドの構築
ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ２（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）であるＦａｂＢ−ｄＡｂはすべて、ＰＣＲにより構築され、次いで、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下において、哺乳類発現ベクターにクローニングされた。これらは、哺乳類細胞における発現のためのＦａｂＢ軽鎖を含有する類似のベクターと対合された（下記を参照されたい）。

ＦａｂＢは、細胞表面の共刺激分子に結合する抗体に由来する。例３で説明する通り、ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ２、及びｄＡｂＬ２が得られた。

哺乳類細胞における発現のためのＦａｂＢ−ｄＡｂ融合プラスミドの構築
ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ２（ＣＨ１−Ｇ_４Ｓ×２）であるＦａｂＢ−ｄＡｂはすべて、ＰＣＲにより構築され、次いで、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下において、哺乳類発現ベクターにクローニングされた。

哺乳類細胞におけるＦａｂＢ−ｄＡｂ及びｄｉｄＡｂの発現
製造元の指示に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の２９３フェクチントランスフェクション試薬を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に重鎖及び軽鎖のプラスミドをトランスフェクトした。略述すると、室温で２０分間にわたり、２μｇの重鎖プラスミド＋２μｇの軽鎖プラスミドを、１０μｌの２９３フェクチン＋３４０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地と共にインキュベートした。次いで、混合物を、懸濁液中における５×１０^６個のＨＥＫ２９３細胞に添加し、３７℃で振とうしながら、４日間にわたりインキュベートした。

Ｂｉａｃｏｒｅ
Ｆａｂ−ｄＡｂ構築物の相互作用に関する結合親和性パラメータ及び反応速度パラメータは、ＣＭ５センサーチップ及びＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）ランニングバッファーを用いるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００上で実施された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定された。Ｆａｂ−ｄＡｂ試料は、ヒトＦ（ａｂ’）_２特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、１０９−００６−０９７）又は自社製の抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体を用いて、センサーチップ表面に捕捉させた。共有結合による捕捉抗体の固定化は、標準的なアミン結合化学反応により達成された。

各アッセイサイクルは、１分間の注入を用いてまずＦａｂ−ｄＡｂを捕捉するステップと、これに続く３分間にわたる抗原の注入からなる結合とからなり、その後、５分間にわたり解離をモニタリングした。各サイクルの後、１分間ずつ２回にわたる４０ｍＭ ＨＣｌの注入により捕捉表面を再生した後、３０秒間にわたり５ｍＭ ＮａＯＨを注入した。用いられた流速は、捕捉の場合が１０μｌ／分であり、結合段階及び解離段階の場合が３０μｌ／分であり、再生の場合が１０μｌ／分であった。

反応速度アッセイの場合、抗原の滴定（ヒト血清アルブミンの場合、６２．５ｎＭ〜２μＭ、ＩＬ−１βの場合、１．２５〜４０ｎＭが典型的）を実施し、基準減算にはブランクのフローセルを用い、緩衝液のブランク注入を組入れて、測定器のノイズ及びドリフトを減算した。

反応速度パラメータは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを用いて、標準的な１：１の結合モデルに対する、結果として得られるセンサーグラムの同時的なグローバル近似により決定した。

同時的な結合について調べるため、捕捉されたＦａｂ−ｄＡｂ上に、個別の５μＭ ＨＳＡ若しくは１００ｎＭ ＩＬ−１β、又は５μＭ ＨＳＡ及び１００ｎＭ ＩＬ−１βの混合溶液を３分間にわたり注入した。

大腸菌からのＦａｂ−ｄＡｂの精製
ペリプラズム抽出
ペリプラズム内にＦａｂ−ｄＡｂを含有する大腸菌ペレットを、１００ｍＭトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４を用いて元の培養容量で再懸濁させた。次いで、これらの懸濁液を、４℃、２５０ｒｐｍで１６時間にわたりインキュベートした。再懸濁したペレットを、４℃、１００００×ｇで１時間にわたり遠心分離した。上清を取り出し、０．４５μｍにわたり濾過した。

プロテインＧによる捕捉
プロテインＧクロマトグラフィーにより、濾過された上清からＦａｂ−ｄＡｂを捕捉した。略述すると、上清を、２０分間の滞留時間により、２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．１中で平衡化されたＧａｍｍａｂｉｎｄ Ｐｌｕｓセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラムに適用した。２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．１によりカラムを洗浄し、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．８により結合した物質を溶出させた。溶出ピークを回収し、１Ｍ酢酸ナトリウムで約ｐＨ５にｐＨ調整した。ｐＨ調整された溶出物を濃縮し、１０ｋのＭＷＣＯ膜を用いて、５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５へとダイアフィルター処理した。

イオン交換
ＮａＣｌ溶出勾配を伴うｐＨ４．５における陽イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂ−ｄＡｂをさらに精製した。略述すると、ダイアフィルター処理されたプロテインＧ溶出物を、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中で平衡化されたＳｏｕｒｃｅ１５Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラムに適用した。５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５によりカラムを洗浄し、２０カラム容量にわたり５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中０〜１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配により、結合した物質を溶出させた。全勾配にわたり、カラム容量画分の１／３を回収した。該画分をＡ２８０及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、関連画分をプールした。

ゲル濾過
必要な場合、ゲル濾過により、Ｆａｂ−ｄＡｂをさらに精製した。略述すると、ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ_４ＳＥ）のプールされたイオン交換溶出物画分を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ５．０中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラムに適用し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ５．０のイソクラチック勾配により溶出させた。全勾配にわたり、カラム容量画分の１／１２０を回収した。該画分をＡ２８０及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、関連画分をプールした。ゲル濾過を受けなかったＦａｂ−ｄＡｂの場合、プールされたイオン交換溶出物画分を濃縮し、１０ｋのＭＷＣＯ膜を用いて、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１２５ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ５．０へとダイアフィルター処理した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
必要な場合は試料を水で希釈し、次いで、１０μｌに、１０μＬの２倍濃度試料ランニングバッファーを添加した。非還元試料の場合はこの時点で２μＬの１００ｍＭ ＮＥＭを添加し、還元試料の場合は２μＬの１０倍濃度還元剤を添加した。試料をボルテックスし、８５℃で５分間にわたりインキュベートし、冷却して、１２５００ｒｐｍで３０秒間にわたり遠心分離した。調製された試料を、４〜２０％のアクリルアミントリス／グリシンＳＤＳゲルに添加し、１２５Ｖで１００分間にわたり泳動した。ゲルは、ウェスタンブロット法用にＰＶＤＦ膜上に転写するか、又はクーマシーブルータンパク質色素により染色した。

ウェスタンブロット法
ゲルは、１２ｍＭトリス、９６ｍＭグリシンｐＨ８．３中のＰＶＤＦ膜に、１５０ｍＡで１６時間にわたり転写された。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ブロッキングバッファー）中に２％のＭａｒｖｅｌ（商標）により、１時間にわたりＰＶＤＦ膜をブロッキングした。
抗軽鎖抗体
ブロッキングバッファー中１／５０００の希釈率のＨＲＰ−ウサギ抗ヒトカッパ軽鎖抗体で１時間
抗重鎖抗体
ブロッキングバッファー中１／７０００の希釈率のマウス抗ヒト重鎖抗体で１時間。続いて、ブロッキングバッファー中１／２０００の希釈率のＨＲＰ−ヤギ抗マウス抗体で１時間。
抗Ｈｉｓタグ抗体
ブロッキングバッファー中１／１０００の希釈率のウサギ抗Ｈｉｓ６抗体で１時間。続いて、ブロッキングバッファー中１／１０００の希釈率のＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体で１時間。

洗浄１回につき１０分間ずつ６回にわたり、１００ｍｌ ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０によりすべてのブロットを洗浄した。ブロットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍへの曝露前にＥＣＬ試薬により１分間にわたり現像するか、又は金属増強ＤＡＢ試薬により２０〜３０分間にわたり現像した後で、水洗浄した。

高温逆相ＨＰＬＣ
８０℃、２ｍｌ／分の流速、及び勾配１８〜３８％（Ｂ）の２．１ｍｍ Ｃ８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌカラム上で、４分間にわたり試料（２μｇ）を解析した。
Ａ＝Ｈ_２Ｏ中に０．１％のＴＦＡ
Ｂ＝８０：２０のＩＰＡ：ＭｅＯＨ中に０．０６５％のＴＦＡ
検出は、２１４ｎｍにおける吸収による。

ＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、Ｆａｂ−ｄＡｂの収率を測定した。略述すると、抗ＣＨ１抗体によりＦａｂ−ｄＡｂを捕捉し、次いで、抗カッパ抗体−ＨＲＰにより明示した。

（例３）
抗アルブミン抗体の作製
組換えｃｈｒｏｍａｐｕｒｅヒト血清アルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎ社から購入）により、１／２垂れ耳ウサギを免疫感作した。ウサギは、１回目の免疫感作が完全フロイントアジュバント中に１００ｕｇのＨＳＡタンパク質であり、後続の免疫感作が不完全フロイント中に同量の同タンパク質である、３回の皮下免疫感作を受けた。ＷＯ０４／０５１２６８で説明される方法を用いて、ヒト、マウス、及びラットの血清アルブミンに結合する抗体１及び２を単離した。逆転写ＰＣＲによるクローニングの後、抗体１及び２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に対する遺伝子を単離し、配列決定した。

軽鎖を移植した配列を、ウサギＣカッパ定常領域をコードするＤＮＡを含有する、ウサギ軽鎖の発現ベクターｐＶＲｂｃＫ内にサブクローニングした。重鎖を移植した配列を、ウサギＦａｂ’重鎖定常領域をコードするＤＮＡを含有する、ウサギ重鎖の発現ベクターｐＶＲｂＨＦａｂ内にサブクローニングした。プラスミドをＣＨＯ細胞内に同時トランスフェクトし、アルブミンに対する結合及び親和性について、生成された抗体をスクリーニングした（表１）。製造元の指示書に従うＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製、型番１１６６８）による手順を用い、ＣＨＯ細胞のトランスフェクションを実施した。

ヒト化ドメイン抗体ｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＬ２、及びｄＡｂＨ２の作製
ヒトＶ領域アクセプターフレームワークと、フレームワーク領域内のドナー残基とを用いて、ヒト化ＶＬ領域及びＶＨ領域を設計した。抗体１及び２の各々について、１つの移植ＶＬ領域（Ｌ１（配列番号５３）及びＬ２（配列番号５５））と、１つの移植ＶＨ領域（Ｈ１（配列番号５２）及びＨ２（配列番号５４））とを設計し、オリゴヌクレオチド構築及びＰＣＲ突然変異誘発により遺伝子を構築した。移植ドメイン抗体及びそれらのＣＤＲを図５に示す。

（例４）
哺乳類細胞において発現したＦａｂＢ−ｄＡｂの解析
ＦａｂＢ−ｄＡｂ構築物は、本方法で説明された通りに作製され、ＦａｂＢ−ｄＡｂを含有する、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に由来する上清を、ＢＩＡｃｏｒｅで直接に調べた。

反応速度解析を実施して、ＦａｂＢ−ｄＡｂ構築物とのＨＳＡの相互反応を評価した。これらは、ＦａｂＢのＣＨ１のＣ末端に融合したｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ２、又はｄＡｂＬ３からなった（図６を参照されたい）。ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１はＫ_Ｄ＝１７０ｎＭで、Ｋ_Ｄ＝３９２ｎＭのＦａｂＢ−ｄＡｂＬ３よりも高度の親和性をＨＳＡに対して有する。ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ２は、Ｋ_Ｄ＝１０７４ｎＭで、ＨＳＡに対する親和性が最も低いことが示された（表２を参照されたい）。

ＦａｂＢ−ｄＡｂタンパク質に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法により、作製されたＦａｂＢ−ｄＡｂが予測されたサイズであることが確認された。

（例５）
哺乳類細胞において発現したＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂの解析
ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ構築物は、本方法で説明された通りに作製され、ｄｉｄＡｂを含有する、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に由来する上清を、ＢＩＡｃｏｒｅで直接に調べた。

単一のｄＡｂがＦａｂの重鎖Ｃ末端及び軽鎖Ｃ末端の両方に融合したｄｉｄＡｂ構築物を用いて、さらなる解析を実施した。ｄｉｄＡｂが天然の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの対合に由来する構築物は、単一のｄＡｂ単独と比較して、親和性の顕著な改善を示した（表２及び３）。２つの同一のｄＡｂＬ１からなるｄｉｄＡｂ融合体は、単一のｄＡｂＬ１についてみられる場合を上回る親和性の改善を示さなかった（データは示さない）。

ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂタンパク質に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂは発現が良好であり、予測されたサイズであることが確認された（図４ａを参照されたい）。このＳＤＳ ＰＡＧＥゲルは、細胞により発現した全タンパク質であることに注意されたい。

（例６）
精製ＦａｂＡ−ｄＡｂの解析
大腸菌におけるＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ_４ＳＥ）及びＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］_２）であるＦａｂ−ｄＡｂの発現用のプラスミドは、本方法で説明される通りに構築した。該Ｆａｂ−ｄＡｂは、本方法で説明される通り、大腸菌のペリプラズム内に発現させ、均一となるまで精製した。Ｆａｂ−ｄＡｂの純度は、高温逆相ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びウェスタンブロット法により評価した。Ｆａｂ−ｄＡｂはまた、Ｂｉａｃｏｒｅにより、抗原結合についても評価された。

高温逆相ＨＰＬＣ
本方法で説明される通りに実施された高温逆相ＨＰＬＣにより、ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ_４ＳＥ）及びＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］_２）中に含有されるすべての分子種の定量的解析がなされた。存在する各分子種の百分率を表４に示す。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本方法で説明される通り、非還元条件及び還元条件下においてＦａｂ−ｄＡｂ試料を調製し、ゲル上で泳動した。ゲルはクーマシー染色された。Ｆａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ_４ＳＥ）及びＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］_２）両方のＦａｂ−ｄＡｂ試料のバンド形成プロファイル共に、高温逆相ＨＰＬＣにより観察されたプロファイルによく対応する（図３）。

ウェスタンブロット
本方法で説明される通り、Ｆａｂ−ｄＡｂ試料を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、抗軽鎖抗体及び抗重鎖抗体によりウェスタンブロット解析を行った。これにより、ｄＡｂがＦａｂの軽鎖上にあること、及びいずれの試料においても重鎖が改変されていないことが確認された（図４）。またこれにより、クーマシー染色、非還元のＳＤＳ ＰＡＧＥにより検出されたすべてのバンドが、Ｆａｂ−ｄＡｂに関連する生成物であることも示された。

Ｂｉａｃｏｒｅ
本方法で説明されるＳＰＲによる反応速度解析を用いて、Ｆａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ_４ＳＥ）及びＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］_２）に対するヒト血清アルブミンの結合を評価した。表５の結果は、いずれの構築物共に、約１μＭの同様の親和性（Ｋ_Ｄ）によりヒト血清アルブミンに結合可能であることを示す。

さらなる反応速度解析により、すべての融合構築物が、ＩＬ−１βに対する元のＦａｂＡの相互反応特性を保持し（表６）、反応速度パラメータ及び親和性パラメータにはわずかな差が見られるにすぎないことが示された。

各構築物をセンサーチップ表面に捕捉した後、個別の５μＭヒト血清アルブミン若しくは１００ｎＭ ＩＬ−１β、又は５μＭヒト血清アルブミン及び１００ｎＭ ＩＬ−１βの混合溶液を３分間にわたり注入することにより、ヒト血清アルブミン及びＩＬ−１β抗原の両方に同時に結合する各構築物の潜在能力を評価した。各Ｆａｂ−ｄＡｂ構築物について、ＨＳＡ／ＩＬ−１βの混合溶液に対して見られる応答は、個別の注入に対する応答の総和とほぼ同一であった（表７を参照されたい）。これにより、Ｆａｂ−ｄＡｂには、ＩＬ−１β及びヒト血清アルブミンの両方に対して同時に結合することが可能であり、ＩＬ−１β又はヒト血清アルブミンに対する結合は、他方の相互作用を阻害しないことが示される。元のＦａｂＡは、ＩＬ−１βだけに結合し、ヒト血清アルブミンにはほとんど結合しなかった。

（例７）
ＦａｂＡ ｄｉｄＡｂ
大腸菌におけるＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂの発現
Ｃ末端のＨＩＳタグで終結するＦａｂＡ−ｄＡｂ融合体及びＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂ融合体を、大腸菌内において発現させた。ペリプラズム抽出の後、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグによりｄＡｂ融合タンパク質を精製した。抗ＣＨ１抗体及び抗ｃカッパ抗体を伴う非還元ゲルに対するウェスタンブロット法により、Ｆａｂ発現を解析した。ＦａｂＡ−ｄＡｂ及びＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂは全長タンパク質として発現し、いずれの抗体検出試薬にも反応することが示された。

大腸菌において発現したＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂの解析
さらなる解析を実施して、１つ又は複数のｄＡｂが融合したＦａｂＡ構築物に対するＨＳＡの結合を特徴づけた。ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４がＦａｂＡの軽鎖又は重鎖に融合する各種の構築物に対して、結合アッセイを実施した（構築物の詳細及び結合データの概要については、表８を参照されたい）。軽鎖又は重鎖上にｄＡｂＨ４だけを保有する構築物は、比較的低度の親和性（それぞれ、約９μＭ及び３μＭ）でＨＳＡに結合することがわかったが、単一の融合体（軽鎖上又は重鎖上における）としてか、又は対向鎖上における第２のｄＡｂ（ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４）とパートナーを形成してｄＡｂＬ３を保有する構築物については、より高い親和性の結合が観察された。

Claims (6)

1. ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５６の配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号５７の配列、並びにＣＤＲ−Ｈ３として配列番号５８の配列、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号５９の配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号６０の配列、並びにＣＤＲ−Ｌ３として配列番号６１の配列を含む、アルブミン結合抗体。
2. 配列番号５２の配列を有するＶＨドメインを含む、請求項１に記載のアルブミン結合抗体。
3. 配列番号５３の配列を有するＶＬドメインを含む、請求項１又は２に記載のアルブミン結合抗体。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体であって；該抗体が、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体、又は四価抗体、ビスｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、或いは上記いずれかのエピトープ結合フラグメントである；抗体。
5. 多重特異性を有する、請求項４に記載の抗体。
6. 他の任意の抗体若しくはタンパク質又は他の分子にコンジュゲートしている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。