DE10021678A1 - Antikörperkonstrukte mit variablen Regionen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antikörperkonstrukten, die aus mindestens drei antigenbindenden Antikörperfragmenten (variable Regionen, Fv) aufgebaut sind und von denen mindestens zwei eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Antikörperkonstrukte für nachweisende, insbesondere diagnostische, therapeutische und Forschungszwecken und sie betrifft Reagenzien, die unter Verwendung wenigstens eines dieser Antikörperkonstrukte hergestellt sind.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antikörperkonstrukten die aus
mindestens drei antigenbindenden Antikörperfragmenten (variable Regionen, Fv) aufgebaut
sind und von denen mindestens zwei eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Antikörperkonstrukte für
nachweisende, insbesondere diagnostische, therapeutische und Forschungszwecken und sie
betrifft Reagenzien, die unter Verwendung wenigstens eines dieser Antikörperkonstrukte
hergestellt sind.
Bispezifische Antikörper sind am besten rekombinant herzustellen, da bei der herkömmlichen
Quadroma- bzw. Hybrid-Hybridoma-Technik ein Gemisch aus 10 verschiedenen Produkten
auftritt, aus denen das einzige korrekte nur unter erheblichem Aufwand abgetrennt werden
kann (Milstein und Cuello, 1983, Nature 305, 537-540). Bispezifische Antikörper sind aber
als Agenzien für neuartige Therapieverfahren notwendig, die ohne solche Moleküle nicht
durchgeführt werden könnten. Anwendung finden sie im besonderen bei der Stimulierung der
Immunantwort gegen Tumorzellen (Segal et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11, 558-562;
Hombach et al., 1993, Int. J. Cancer 55, 830-836; Manzke et al., 1999, Int. J. Cancer 80, 715-
722). Dabei werden T-Lymphozyten spezifisch an Tumorzellen herangeführt und oft noch
zusätzlich durch einen der Bindungsarme des bispezifischen Agens aktiviert. Verschiedene
molekulare Formate wurden zur Herstellung von therapeutischen Antikörpern im allgemeinen
und von bispezifischen Antikörpern im speziellen entwickelt (Breitling und Dübel, 1997,
Rekombinante Antikörper, Spektrum der Wissenschaft Verlag, Heidelberg; Carter und
Merchant, 1997, Curr. Opin. Biotech. 8, 449-454). Bei ausführlichen Untersuchungen zur
Tumorlokalisation von verschiedenen Antikörperformaten (scFv, Diabody, Minibody,
komplette IgG) mit identischer Antigenbindestelle (Tumormarker carcinoembryonic antigen,
CEA) aber mit unterschiedlichem Molekulargewicht (ca. 30 kDa, 60 kDa, 90 kDa und 150 kDa)
zeigte sich, daß die beiden kleineren Formate aufgrund ihrer raschen Filtrierung durch die
Niere zu einem weit geringeren Konzentrationsverhältnis Tumor/Gewebe führten als
Konstrukte, deren Molekulargewichte über der Filtrationsgrenze der Niere lagen (Wu et al.,
1996, Immunotechnology 2, 21-36; Hu et al., 1996, Cancer Res. 56(13), 3055-61). Beste
Tumorlokalisation erbrachte der sog. Minibody (ca. 90 kDa), der aus zwei identischen scFv-
Fragenten besteht, welche durch fusionierte CH3 Domänen dimerisieren (Hu et al., 1996,
Cancer Res. 56(13), 3055-61). Dieses Konstrukt ist zwar bivalent, aber monospezifisch. Die
Herstellung von bispezifischen Antikörpern nach diesem Muster ist schwierig, da es wiederum
zu homologen Paarungen und damit zu unerwünschten und schwer abtrennbaren
Nebenprodukten kommen kann. Die Verwendung von CH1 und CL(kappa)-Domänen zur
Dimerisierung (Müller et al.,. 1998, FEBS Lett. 422, 259-64) löste zwar das Problem der
Nebenprodukte bei der Herstellung bispezifischer Minibodies, jedoch ist die Affinität durch
die Monovalenz der jeweiligen Antigenbindestellen eingeschränkt. Die Stabilisierung von Fv-
Fragmenten durch Disulfidbrücken (dsFv, Brinkmann et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 90(16), 7538-42; Reiter et al., 1995, Protein Eng. 8, 1323-31) verbesserte deren Serum-
Halbwertzeit gegenüber scFvs und führte zu einer erhöhten Lokalisierung dieser Konstrukte im
Tumorgewebe (Reiter et al., 1994, Protein Eng. 7, 697-704; Reiter et al., 1994, J. Biol. Chem.
269, 18327-18331; Reiter et al., 1994, Int. J. Cancer 58, 142-149; Webber et al., 1995, Mol.
Immunol. 4, 249-258). Bispezifische Diabodies, wie sie vielfach für die Therapie hergestellt
wurden, sind kleiner als das pharmakokinetisch optimale Konstrukt für die Tumortherapie,
indem sie lediglich aus zwei antigen-bindenden Antikörperfragmenten zusammengesetzt sind
(Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448; Hollinger et al., 1996,
Protein Eng. 9, 299-305; Holliger et al., 1999, Cancer Res. 59, 2909-16; Arndt et al., 1999,
Blood 94, 2562-2568; Helfrich et al., 1998, Int. J. Cancer 76, 232-9). Die Verwendung von
dsFv-dsFv'-Antikörpern, d. h., Konstrukten aus zwei Disulfidbrücken-stablisierten Fv-
Fragmenten, die durch ein kurzes Linker-Peptid verbunden sind (Breitling und Dübel, 1997,
Rekombinante Antikörper, Spektrum der Wissenschaft Verlag, Heidelberg; Schmiedl et al.,
submitted) beseitigt zwar die Stabilitätsprobleme der Diabodies, das Konstrukt hat aber auch
ein zu geringes Molekulargewicht für eine optimale Tumorlokalisation.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb, ein neues Verfahren bereitzustellen, um
neuartige Antikörperkonstrukte für diagnostische, therapeutische und Forschungszwecken
bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik beseitigen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch das im Anspruch 1 näher gekennzeichnete
Verfahren gelöst. Dieses erfindungsgemässe Verfahren stellt Antikörperkonstrukte zur
Verfügung welche eine bivalente Bindung an den Tumor oder den Effektor und damit eine weit
höhere off-rate bei der Dissoziierung ermöglichen, dies hat eine längere Lokalisation im
Zielgewebe zur Folge, und kommt außerdem ohne jegliche Dimerisierungsdomänen aus (Fig. 1).
Dadurch wird bei optimalem Molekulargewicht (ca. 90 kDa) eine optimale Bindung erreicht,
die mit keinem der bisher beschriebenen Konstrukte in gleicher Weise erreicht werden kann.
Das hier beschriebene molekulare Design vereint deshalb erstmals die zuvor separat
gefundenen positiven Eigenschaften bisheriger Konstrukte:
- 1. Stabilisierung durch Disulfidbrücken,
- 2. Bivalenz zusätzlich zur Bispezifität und
- 3. Minibody-Größe.
Diese Ziele werden dadurch erreicht, daß die Antikörperkonstrukte rekombinant hergestellt
werden, z. B. in E. coli, Insektenzellkulturen, Pichia patoris, CHO-Zellkulturzellen oder
transgenen Pflanzen. Dazu werden Vektoren mittels DNA-Klonierung nach Stand der Technik
hergestellt, welche nach Transfektion in die entsprechenden Wirtszellen bzw -organismen die
rekombinante Proteinproduktion der Untereinheiten ermöglichen. Die DNA-Moleküle, welche
für die Untereinheiten der V-bodies codieren, werden dafür solcherart durch PCR-Mutagenese
oder andere Mittel nach Stand der Technik konstruiert, daß im rekombinant produzierten
Protein 1. mindestens eines der beteiligten Fv-Regionen durch Mutation von zwei an der
Kontaktstelle zwischen VH und VL gegenüberliegenden Aminosäurepositionen (jeweil eine in
VH und eine in VL) zu Cystein mit einer interface-Disulphidbrücke stabilisiert werden
(Brinkmann et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(16), 7538-4), und 2.
Proteinkomkplexe nach Abb. 2 oder 3 produziert werden. Letzteres wird dadurch erreicht, daß
über die Einführung von kompatiblen Restriktionsschnittstellen an den Enden der
Genfragmente für die verschiedenen variablen Domänen und darauffolgende Ligation oder
durch PCR-Assembly die verschiedenen variablen Domänen in den entsprechenden
Expressionsvektoren so angeordnet werden, daß sie für die in Fig. 1, 2 oder 3 angezeigten
Polypeptidketten codieren. Bi-/Trivalenz resp. Bi-/Trispezifität und Minibody-Größe
werden dadurch erreicht, daß die für die variablen Regionen codierenden DNA-Fragmente so
zusammengesetzt werden, daß das resultierende Produkt aus 3 Fv-Fragmenten besteht. Die
resultierende Molekularmasse entspricht dadurch der vorteilhaften Minibody-Größe. Die
optimale Anordnung (Reihenfolge) der verschiedenen VH und VL-Ketten-Gene zueinander im
Vektor kann dabei individuell für jedes Konstrukt optimal gewählt werden. Mögliche
entstehende Nebenprodukte der rekombinanten Produktion können mithilfe
chromatographischer Methoden nach Stand der Technik abgetrennt werden.
Die Antikörperkonstrukte werden ausschließlich aus antigenbindenden Domänen bestehen, da
konstante Domänen für die Dimerisierung nicht mehr notwendig sind, und die Konstrukte
durch den Einsatz von interchain-Disulfidbrücken optimal stabilisiert sind. Die beschriebenen
Antikörperkonstrukte werden deshalb im weiteren als "V-Bodies" bezeichnet, da sie bis auf
kurze Spacer-Peptide ausschließlich aus variablen Regionen zusammengesetzt sind. Eine
Herstellung von Molekülen mit den geschilderten Vorteilen war bisher nicht möglich.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht im Gegensatz zu anderen Methoden zur
Herstellung bispezifischer Antikörper, die Konstruktion der V-bodies aus humanen V-
Regionen dies ermöglicht die Herstellung des gesamten Konstruktes aus ausschließlich
humanen Protein-Fragmenten - damit wird eine Immunreaktion (z. B. HAMA) gegen das
therapeutische Agens vermieden, wie sie bei Konstrukten auftritt, die ihre Bivalenz oder
Bispezifität durch Fusion der antigen-bindenden Domänen an heterologe Fusionspartner
erreichen (wie Streptavidin, Zipper-Motive, Protein A-Fusionen etc.). Variationen der V
bodies bestehen aus 2, 3 oder 4 Polypeptidketten, wobei unterschiedliche Grade à
Disulfidstabilisierung zum Einsatz kommen (Fig. 1, 2, 3). Trispezifische Antikörper sind ohne
Mehraufwand gegenüber bispezifischen Antikörpern herzustellen, wenn die rekombinanten
Expressionsvektoren so konstruiert werden, daß zwei Polypeptidketten-Konstrukte aus je
einem scFv und einer variablen Domäne eines dsFv-Fragmentes eingesetzt werden.
Unter Beibehaltung der für das in vivo-targeting optimalen Molekülgröße lassen sich
trispezifische Antikörper herstellen, ohne daß besondere Trimerisierungsmotive zusätzlich zu
den antigenbindenden Regionen der Antikörper eingesetzt werden müssen. Dies wird
eingesetzt, um therapeutische Agentien herzustellen, die zum einen mehrere Tumormarker auf
einer Zelle binden können, oder mehrere verschiedene Epitope eines Tumormarkers. Ebenso
kann eine Kombination aus einem Tumormarker und einem gewebespezifischen Antikörper
eingesetzt werden. Dadurch erhöht sich die Tumorspezifität erheblich gegenüber monovalenter
oder multivalent-monospezifischer Bindung, und verringert stark die Belastung der Patienten
durch die bisher sehr häufig auftretende Lokalisierung der Antikörper in unspezifischen
Geweben (sowohl durch Kreuzreaktionen wie durch Expression des Tumormarkers auf
anderen Geweben). Zudem wird die apparente Affinität durch die erhöhte Avidität verbessert.
Die verbleibende Bindestelle der trispezifischen Antikörper dient zur Verstärkung der
Immunantwort gegen den Tumor, insbesondere durch Bindung an CD3 oder CD28 der T-
Lymphozyten. Auch eine Aktivierung der Natural Killer (NK)-Zellen gegen den Tumor über
Bindung an CD16 ist möglich. Alternativ kann dieses Antikörperfragment auch
Komplementkaskaden aktivieren.
Durch Produktion von zwei verschiedenen Antikörperketten in E. coli unter Benutzung von
kompatiblem Expressionsvektoren (z. B. pOPE und pDOPE), werden V-Bodies im Periplasma
von E. coli zusammengesetzt, welche eine Bindestelle für humanes CD3 enthalten, und zwei
Bindestellen für einen Tumormarker, z. B. MUC1, erbB2 o. ä., oder Differenzierungsmarker,
wie z. B. CD19. Die Proteine werden aus dem Periplasma gereinigt, und intravenös eingesetzt,
um T-Lymphozyten an den Tumor heranzuführen. Eine Produktion der Proteine in
eukaryontischen Zellinien (z. B. CHO oder Baculovirus) oder transgenen Pflanzen ist zur
Herstellung ebenfalls möglich.
Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung von Antikörperkonstrukten, dadurch gekennzeichnet, daß die
Antikörperkonstrukte aus mindestens drei antigenbindenden Antikörperfragmenten (variable
Regionen, Fv) aufgebaut sind, von denen mindestens zwei eine unterschiedliche Primärstruktur
aufweisen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusammenhalt der
Polypeptidketten durch Einführung einer neuen Disulfidbindung an der Kontaktfläche der
variablen Regionen gewährleistet wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Polypeptidketten jeweils aus einem scFv-Antikörperfragment und der Hälfte eines anderen
Fv-Antikörperfragmentes bestehen (Fig. 2).
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Antikörpermolekül aus mehr als zwei Polypeptidketten zusammengesetzt ist, die mindestens
zwei Antikörperfragmente bilden, welche durch Einführung einer neuen Disulfidbindung an der
Kontaktfläche der variablen Regionen verknüpft sind (Fig. 3).
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das trivalente
Molekül Teile anderer Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie enthält, insbesondere
variable Regionen von T-Zell-Rezeptoren.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß an ein nach
einem der Ansprüche 1 bis 5 hergestellten Molekül weitere Effektordomänen gekoppelt sind,
insbesondere IL2, Interferon alpha, Interferon Gamma, B7.1, B7.2, TNFalpha,
Komplementkaskadenkomponenten, Toxine (wie Ricin, PE, DT) oder RNasen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß an ein nach
einem der Ansprüche 1 bis 5 hergestellten Molekül radioaktive Substanzen gekoppelt sind,
insbesondere solche, die für die Tumortherapie oder die in vivo Diagnostik geeignet sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß an ein nach
einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellten Molekül Substanzen gekoppelt sind, welche eine
Zerstörung der Zellen in der Umgebung der V-bodies durch körpereigene Effektoren bewirken,
im besonderen durch andere Zellen, besonders des Immunsystems, wie T-Lymphozyten
oder Makrophagen, oder durch Moleküle des Immunsystems, wie Komplementproteine.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß an ein nach
einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellten Molekül Ankerdomänen angefügt werden, welche
eine Kopplung an einen Effektor erlauben, insbesondere Avidin, Streptavidin oder
Mutationen dieser Moleküle, oder Biotin, oder Streptavidin /Avidin-Bindepeptide, oder
bakterielle Immunglobulinbindemoleküle wie Protein A, Protein G, Protein H, Protein L, oder
Calmodulin, oder Calmodulin-Bindemoleküle, oder Fragmente von RNasen, oder nicht
natürliche Sequenzen, welche an Fragmente von RNasen binden, oder Leucin-Zipper.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß an ein nach
einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellten Molekül ein oder mehrere
Polyethylenglykolmoleküle gekoppelt wird.
11. Verwendung der Antikörperkonstrukte nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur
Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen/Arzneimitteln für die diagnostische
und/oder therapeutische Behandlung.
12. Verwendung der Antikörperkonstrukte nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur
Identifizierung von pharmakologisch und/oder gentherapeutisch und/oder immunologisch
einsetzbaren Substanzen.
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