DE69529649T2 - Anti-egfr einkettige fvs und anti-egfr antikoerper - Google Patents

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
• Diese Erfindung betrifft neue Anti-EGFR-Antikörper und Einketten-Fvs (scFvs), die aus Phagen-Antikörperbibliotheken, aufgebaut aus Zellen eines immunisierten Säugetiers, bevorzugt einer Maus, erhalten werden können. Die aus den Phagen-Antikörperbibliotheken isolierten Antikörperfragmente können zum Aufbau teilweise humanisierter ganzer Antikörpermoleküle technisch manipuliert werden. Diese chimären Anti-EGFR-Antikörper enthalten konstante Regionen menschlicher Immunglobuline und können wie auch ihre scFv-Agenzien zur Diagnose und Therapie menschlicher Tumore verwendet werden.
• Die Erfindung zeigt weiterhin, dass Phagen-Antikörperbibliotheken im Vergleich zu der Standard-Hybridomtechnologie ein alternatives und vielseitigeres Verfahren zur Isolation von Antikörpern aus immunisierten Säugetieren darstellen.
• Die Erfindung betrifft darüber hinaus pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Antikörper oder scFvs zu Zwecken der Behandlung von Tumoren wie Melanomen, Gliomen oder Karzinomen enthalten. Diese Antikörper oder Fragmente können auch für diagnostische Anwendungen in Bezug auf die Lokalisierung und Beurteilung dieser Tumore in vitro oder in vivo verwendet werden.
• Die Beschreibung betrifft mehrere technische Begriffe, die hiermit wie folgt definiert sind:
• "FRs" (Framework-Regionen) bedeuten die vier Subregionen der variablen Leicht- oder Schwerkettenregionen, welche die drei CDRs unterstützen.
• "CDRs" (Komplementaritäts-bestimmende Regionen) bedeuten die drei Subregionen der variablen Leicht- oder Schwerkettenregionen, die hypervariable Sequenzen besitzen und Schleifenstrukturen bilden, die für die Herstellung des direkten Kontakts mit dem Antigen primär verantwortlich sind.
• "Chimäre" oder teilweise humanisierte Antikörper bedeuten Antikörper, die aus menschlichen Quellen abgeleitete konstante Regionen und nicht aus menschlichen Quellen abgeleitete variable Regionen (einschließlich der CRDs), wie z. B. von der Maus, enthalten.
• "Humanisierte" oder vollständig humanisierte Antikörper bedeuten Antikörper, die aus menschlichen Quellen abgeleitete konstante Regionen und FRs enthalten, während sich die CDRs von nicht menschlichen Quellen ableiten.
• "EGF" und EGFR" bedeuten epidermaler Wachstumsfaktor und sein Rezeptor.
• "PCR" bedeutet die Polymerase-Kettenreaktion.
• "scFv" bedeutet ein Einketten-Fv, das ein Antikörperfragment ist.
• "VL" bedeutet variable Leichtkettenregion.
• "Vk" bedeutet variable Kappa-Leichtkettenregion.
• "V"" bedeutet variable Schwerkettenregion.
• PBS bedeutet Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.
• FCS bedeutet fetales Kälberserum.
• HBSS bedeutet Hanks gepufferte Salzlösung
• FITC bedeutet Fluoresceinisothiocyanat
• MTC bedeutet Mischzellkultur.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) ist ein Polypeptidhormon, das für Epidermal- und Epithelzellen mitogen ist. Wenn der EGF mit empfindlichen Zellen interagiert, bindet er an Membranrezeptoren (EGFRs). Der EGFR ist ein transmembranes Glycoprotein von ca. 170 kD und stellt ein Genprodukt des c- erb-B-Proto-Onkogens dar.
• Antikörper gegen den EGF-Rezeptor oder Fragmente davon und ihre Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Induktion terminaler Differenzierung in Tumorzellen sind in WO95/20045 beschrieben.
• MAb 425 ist ein muriner monoklonaler Antikörper, der gegen die weithin bekannte menschliche Karzinomzelllinie A431 (ATCC CRL 1555) gebildet wird, an ein Polypeptid-Epitop der externen Domäne des menschlichen EGFRs bindet und die Bindung von EGF inhibiert. Es wurde gefunden, dass MAb 425 (ATCC HB 9629) die Tumorzytotoxizität in vitro vermittelt und das Tumorzellwachstum von aus Epidermoid- und Kolorektalkarzinomen abgeleiteten Zelllinien in vitro unterdrückt (Rodeck et al., Cancer Res. 1987. 47: 3692). Humanisierte und chimäre Versionen von MAb 425 sind aus WO 92/15683 bekannt.
• Im Verlauf der letzten Jahre wurden Verfahren beschrieben (Skerra und Plückthun, Science 1988. 240: 1038; Better et al., Science 1988. 240: 1041), mit denen funktionelle Antikörperfragmente in eukaryontischen Wirtszellen, wie zum Beispiel E. coli, gebildet werden können. Diese schließen das Fv-Fragment und das Fab-Fragment ein, wobei das Fv-Fragment von speziellem Interesse ist. Einketten-Fvs (worin die VL- und die VH-Kette miteinander verknüpft sind) wurden auch beschrieben (Bird et al., Science 1988. 242: 423; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. 85: 5879).
• Phagen-Antikörperbibliotheken bieten bei der Isolation von Antikörpern aus immunisierten Tieren eine alternative Technologie zur Hybridom-Technologie. Die Hybridom-Technologie wirkt durch Immortalisierung der die Antikörper bildenden Zellen. Die Phagenantikörper-Technologie wirkt durch Immortalisierung der Gene, die für die Antikörper codieren (Winter, G. und Milstein, C., Nature 1991. 349: 293). In der Phagenantikörper-Technologie werden die Antikörpergene der variablen Schwerketten-Region (VH) und variablen Leichtketten-Region (VL) PCR-amplifiziert, die variablen Regionen werden zufällig kombiniert und als Antikörperfragmente auf der Oberfläche von Phagenpartikeln exprimiert, und die Phagen-Antikörperbibliotheken werden auf Antikörper, die an Antigene von Interesse binden, gescreent.
• Die Hybridom-Technologie ist bei der Isolation monoklonaler Maus-Antikörper sehr erfolgreich gewesen, wobei es möglich gewesen ist, eine starke Immunantwort in der Milz der Tiere auszulösen. So wurden zum Beispiel Maus-MAbs gegen den menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGRF) aus der Milz von Mäusen isoliert, die intraperitoneal mit den menschlichen Tumorzellen A431 immunisiert worden waren (Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys. 1987. 252: 549). Der potenzielle Vorteil der Phagenantikörper-Technologie im Vergleich zur Hybridom-Technologie besteht darin, dass nahezu jede Quelle Antikörper-exprimierender Zellen als Ausgangsmaterial verwendet werden kann und dass große Zahlen verschiedener Antikörper rasch gescreent werden können. Ein weiterer Vorteil der Phagenantikörper-Technologie besteht darin, dass die Gene, die für die variablen Regionen der Antikörper von Interesse codieren, bereits kloniert wurden und zur weiteren Genmanipulation unmittelbar zur Verfügung stehen.
• In einem Bericht wurde ein aus einer Phagen-Antikörperbibliothek isoliertes Anti- Tetanustoxoid-Fab-Fragment in ein ganzes Antikörpermolekül umgewandelt (Bender et al., Hum. Antibod. Hybridomas 1993. 4: 74):
• Während der letzten zehn Jahre wurde die In-vitro-Immunisation als ein alternatives Verfahren zur aktiven Immunisation zwecks Erzeugung monoklonaler Antikörper (MAbs) gegen ein breites Spektrum verschiedener Antigene aus sowohl menschlichen als auch murinen Systemen verwendet (z. B. Vaux, D. J. T.; Helenius, A. und Mellman, I.; Nature, 1988. 336: 36; Gathuru, J. K. et al.: J. Immunol. Methods, 1991. 137: 95; Borrebaeck, C. A. K.; Immunol. Today, 1988.9: 355). Zu den Vorteilen dieses Ansatzes gehört, dass nur kleine Antigenmengen erforderlich sind und dass das Verfahren zur Generierung menschlicher Hybridome anwendbar ist. Die Generierung von IgM-Antikörpern mit schlechter Affinität und die Schwierigkeit, menschliche Lymphozyten nach der In-vitro- Immunisation zu immortalisieren, sind zu mit dieser Technologie einhergehenden anhaltenden Problemen geworden.
• Einen neuen Weg, um Antikörper zu erhalten stellt die PCR-Amplifikation von Repertoires von Genen der variablen Schwer(VH)- und Leichtketten(VL-)Region dar, die dann zufällig rekombiniert und als Phagen-Display-Bibliotheken exprimiert werden (7-9). Antikörpergene der variablen Region wurden geklont und als ein Einketten-Fv-Fragment (scFv) an das kleine Hüllprotein (Gen 3) fusioniert (10). Der Phagenpartikel weist auf seiner Oberfläche das Antikörperfragment auf und kann durch Panning mittels der Bindungseigenschaften des Antikörpers ausgewählt werden. Diese Technologie besitzt den Vorteil, dass die zufällige Rekombination von V-Genen neue Paarungen mit neuen Spezifitäten und Affinitäten erzeugen kann, die durch natürliche Verfahren nicht ausgewählt werden könnten. Ein derartiger Ansatz macht weiter die Verwendung naiver oder in vitro immunisierter Lymphozyten aus murinen oder menschlichen Quellen möglich.
• Vorherige Versuche, mAbs gegen EGFR durch In-vitro-Immunisation muriner B- Zellen und Hybridom-Technologie zu erhalten, führten zu kreuzreagierenden Antikörpern mit geringer Affinität. Um diesen Hindernissen zu begegnen, wurde die Kombination von In-vitro-Immunisation gefolgt von der PCR-Klonierungstechnologie durchgeführt.
• Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, Antikörper und Antikörper-scFvs zu entwickeln, die eine hohe Affinität zu dem EGF-Rezeptor besitzen und die durch das vor- und nachstehend beschriebene vorteilhafte Verfahren erhalten werden können.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
• Diese Erfindung vergleicht Maus-Anti-EGFR-Antikörper, die aus drei verschiedenen Phagen-Antikörperbibliotheken mit einem mittels der Standard-Hybridomtechnologie isolierten Maus-MAb (425) isoliert wurden (Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys. 1987. 252: 549; Kettleborough et al., Protein Eng. 1991. 4: 773). Die Bibliotheken wurden nicht nur aus der Milz einer immunisierten Maus, sondern auch aus der Lymphknotendrainage einer immunisierten Maus und aus in vitro immunisierten Mauszellen hergestellt. Zwei der aus den Bibliotheken isolierten Einketten-Fvs (scFvs) wurden manipuliert, um chimäre ganze Antikörpermoleküle mit den murinen variablen Regionen an menschliche konstante Regionen gekoppelt aufzubauen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft speziell ein Anti-EGRF-Einketten-Fv, erhältlich aus Phagen-Antikörperbibliotheken, die aus Zellen, bevorzugt aus der Milz oder der Lymphknotendrainage eines immunisierten Säugetieres, bevorzugt einer Maus oder aus in vitro immunisierten Zellen hergestellt ist.
• Einige der erfindungsgemäßen scFvs verfügen über gut definierte DNA- und Aminosäuresequenzen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Einketten-Fv-Fragment bereitzustellen, worin die variablen Regionen der Schwer- und Leichtkette eine DNA- und/oder eine Aminosäuresequenz, die aus einer der in Sequenzkennzahlen 1-32, bevorzugt in Fig. 5-8 angegebenen Schwer- und Leichtkettensequenzen ausgewählt ist, enthalten.
• Da in vielen Fällen nur vollkommen funktionierende ganze Antikörper für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden können, ist es im Sinne der Erfindung, die variablen Regionen aus Einketten-Fvs mit den konstanten Regionen menschlicher Immunglobuline, die ganze, teilweise oder humanisierte Anti-EGFR-Antikörper bilden, zu verknüpfen.
• Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es daher, einen ganzen Anti-EGFR- Antikörpers bereitzustellen, der aus DNA-Sequenzen aufgebaut ist, die sich wie vor- oder nachstehend oder in den Ansprüchen definiert von Antikörperfragmenten ableiten und aus DNA-Sequenzen, die sich von konstanten Regionen menschlicher Immunglobuline ableiten, worin als eine bevorzugte Ausführungsform die Schwerkette die Aminosäuresequenz einer Gamma-1- Kette und die Leichtkette die Aminosäuresequenz einer Kappa-Kette enthält.
• Erfindungsgemäß werden die Anti-EGFR-scFvs mittels der Phagen-Antikörperbibliothek-Technologie isoliert. Deshalb betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines einkettigen Anti-EGFR-Fv mit den folgenden Schritten:
• (i) Isolation von RNA aus immunisierten Säugetierzellen, vorzugsweise Mauszellen,
• (ii) cDNA-Erststrangsynthese,
• (iii) Amplifikation der VH- und Vk-Gene in cDNAs aus den immunisierten Zellen,
• (iv) Klonieren dieser Gene mit geeigneten Restriktionsstellen in einen Phagemidvektor,
• (v) Transformation von Prokaryontenzellen mit den Ligationsmischungen,
• (vi) Screenen der Phagenbibliotheken auf gegen EGFR gerichtete Phagenantikörper mittels gereinigtem EGFR, sowie
• (vii) Produktion dieses einkettigen Fv in prokaryontischen Wirtszellen, vorzugsweise E. coli.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines ganzen Anti-EGRF-Antikörpers anzugeben, durch Klonieren der DNA, die für die variablen Regionen der Anti-EGFR-Antikörperfragmente codiert, die wie vorstehend angedeutet oder in den Ansprüchen definiert gebildet werden, in mindestens einen eukaryontischen Expressionsvektor, der genomische DNA enthält, die für die konstanten Regionen von menschlichen Immunglobulinen codiert, Transformieren von Eukaryontenzellen mit diesem Vektor bzw. diesen Vektoren und Expression und Isolation des Antikörpers.
• Die Anti-EG-scFvs und vor allem die ganzen Anti-EGFR-Antikörper können zur Diagnose und Therapie menschlicher Tumore verwendet werden. Die Erfindung betrifft folglich eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Anti-EGFR- Einketten-Fv oder einen ganzen Anti-EGFR-Antikörper wie vorstehend oder in den Ansprüchen definiert.
• Die Ergebnisse und Vorteile der vorliegenden Erfindung können wie folgt zusammengefasst werden:
• Neue Maus-Anti-EGFR-Antikörper wurden aus Phagen-Antikörperbibliotheken isoliert. Die neuen Antikörper stellten mindestens vier verschiedene VH-Untergruppen und vier verschiedene VK-Untergruppen dar (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5. Auflage, U.S.-Dept. of Health and Human Services, Bethesda 1991). Sie wiesen verglichen mit denen, die von einem mittels der Hybridom-Technologie isolierten Maus-MAb verwendet wurden unterschiedliche Paarungen und Sequenzen, auf. Der Maus-MAb 425 besitzt eine VH2b- und Vk4-Paarung, die in den Phagenantikörpern nicht beobachtet wurde. Die VH von scFv L3 11 D besaß die höchste prozentuale Identität zu VH 425 (84,9%). Die meisten Unterschiede fanden sich in den CDRs. Die Vk von scFv S4 2D besaß die höchste prozentuale Identität zu Vk 425 (83,2%). Wiederum fanden sich die meisten Unterschiede in den CDRs, insbesondere in CDR3. In dieser Erfindung wurde eine Reihe verschiedener neuer Anti-EGFR- Antikörper aus den Phagen-Antikörperbibliotheken isoliert, und diese Antikörper unterscheiden sich alle von MAb 425, wobei mindestens zwei der scFvs ein anderes Epitop auf dem EGFR als das von MAb 425 erkannte erkennen. Dies steht im Gegensatz zu einem früheren Bericht, in dem mitgeteilt wurde, dass die aus kombinatorischen Bibliotheken isolierten Antikörper den mittels der Hybridom-Technologie isolierten sehr ähnlich sind (Caton und Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. 87: 6450).
• Von den drei Phagen-Antikörperbibliotheken war die hinsichtlich der Anzahl erforderlicher Auswahlschritte zum Erhalten hochaffiner Antikörper und hinsichtlich der Diversität der isolierten hochaffinen Antikörper beste Bibliothek die aus der Lymphknotendrainage generierte Bibliothek. Lymphknoten wurden aus zweierlei Gründen als RNA-Quelle zum Aufbau der Phagen-Antikörperbibliotheken ausgewählt. Erstens wiesen frühere Arbeiten nach, dass nach Immunisation über den Fußballen ein höherer Anteil an hochaffine IgG-Antikörper bildenden B-Zellen aus den poplitealen Lymphknoten erhalten wurde als aus der Milz nach Immunisation über das Peritoneum (Venn und Dresser, J. Immunol. Methods 187. 102: 95). Zweitens wird die Lymphknotendrainage als eine gute Quelle zur Isolation menschlicher Anti-Tumor-Antikörper angesehen. Folglich galt die Isolation von Maus-Anti-EGFR-Antikörpern aus dem poplitealen Lymphknoten einer über den Fußballen immunisierten Maus als ein Modell für die Isolation menschlicher Anti-EGFR-Antikörper aus den Achsellymphknoten eines Patienten mit Mammakarzinom. Die Möglichkeit zur Herstellung von Bibliotheken einer guten Größe aus kleinen Lymphknotenmaterialmengen und dann Isolation hochaffiner Antikörper aus den Bibliotheken, wurde nachgewiesen.
• Obwohl Maus-Anti-EGFR-Antikörper aus allen drei Phagen-Antikörperbibliotheken isoliert wurden, ist es nicht deutlich, ob irgendwelche der neu isolierten Antikörper höhere Affinitäten als der mittels der Hybridom-Technologie isolierte Maus-MAb 425 besitzen. In den ersten Analysen schienen die von dem Phagenantikörper abgeleitete scFvs besser an EGFR zu binden als das aus MAb 425 aufgebaute scFv (Fig. 2). In anderen Experimenten mit chimären ganzen Antikörpermolekülen ließ einer der chimären Antikörper (S4 2D) eine Affinität zu EGFR erkennen, die der des chimären Antikörpers 425 entsprach. Der zweite chimäre Antikörper (L3 11D) besaß eine Affinität, die um das vierfache niedriger als die des chimären Antikörpers 425 war (Fig. 4). Die mittels der scFvs erhaltenen Bindungsdaten waren wahrscheinlich irreführend, weil scFv-Päparationen Gemische aus Monomeren und Dimeren enthalten können (Griffiths et al., EMBO J. 1993. 12: 725). Im Gegensatz dazu wird nicht erwartet, dass chimäre IgG-Antikörper Dimere bilden, und es wurde nachgewiesen, dass die chimären L3 11D- und S4 2D-Antikörper von der Größe sind, wie sie für bivalente, monomere chimäre IgG-Antikörper erwartet wird. Eine Analyse affinitätsgereinigter Präparationen von scfvs 425, L3 11D und S4 2D ließ jedoch erkennen, dass diese scFv-Präparationen monomere, dimere und andere multimere Formen enthielten. Außerdem variierten die relativen Anteile der monomeren und multimeren Formen für jedes scFv. Das scFv 425 besaß den niedrigsten Prozentsatz dimerer Formen. Die dimeren und insbesondere die größeren multimeren Formen wiesen, wie vorhergesagt, eine stärkere Bindung an den gereinigten EGFR als die monomere Form auf. Es hat den Anschein, dass scFv 425 eine schwächere Tendenz zur Dimerisierung als einige der neu isolierten scFvs besitzt.
• Obwohl die Expression von Antikörperfragmenten auf der Oberfläche von Phagenpartikeln die Grundlage eines leistungsfähigen Verfahrens zur schnellen Auswahl für Antikörper mit den gewünschten Spezifitäten bildet, handelt es sich wahrscheinlich weder bei Phagenantikörpern noch den Antikörper-Fragmenten selbst (scFvs oder Fabs) um das gewünschte Endprodukt. Weiterhin wird nachgewiesen, wie die aus Phagenbibliotheken isolierten Maus-scFvs ohne weiteres in ganze Antikörpermoleküle umgewandelt werden können. In diesem Fall wurden die murinen variablen Regionen mit den menschlichen konstanten Regionen zum Aufbau teilweise humanisierter chimärer Antikörper gekoppelt.
• Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die Phagenantikörper-Technologie zur Isolation einer Reihe verschiedener Anti-EGRF-Antikörperfragmente aus immunisierten Mäusen zu verwenden. Aus den Antikörper-Fragmenten können dann ganze Antikörpermoleküle mit den gewünschten konstanten Regionen aufgebaut werden. In einigen Fällen kann die Hybridom-Technologie noch das Verfahren der Wahl zur Isolation monoklonaler Antikörper aus Mäusen darstellen. Wenn ein hoch immunogenes Antigen zur Verfügung steht und wenn einige wenige Hybridomzelllinien, die einen bzw. einige verschiedene gegen das Antigen gerichtete(n) Antikörper bilden, ausreichend sind, dann liegt wahrscheinlich wenig Grund vor, die Phagenantikörper-Technologie in Erwägung zu ziehen. Wenn jedoch spezielle Immunisationsprotokolle, wie zum Beispiel Injektionen in die Fußballen, bei der Generierung hochaffiner Antikörper vorteilhaft wären oder wenn eine große Antikörperzahl gegen eine Reihe verschiedener Epitope an dem Antigen erforderlich ist, oder wenn Antikörper gegen ein sehr diskretes und möglicherweise weniger immunogenes Epitop erforderlich sind, dann könnte die Phagenantikörper-Technologie das Verfahren der Wahl darstellen. Auch wenn eine weitere Genmanipulation an den Antikörpern erwartet wird, ist die Phagenantikörper-Technologle insofern vorteilhaft, als dass die Antikörpergene bereits kloniert wurden.
• Der vorliegende Ansatz zur Kombination der In-vitro-Immunisation mit einem partikulären Antigen und der PCR-Klonierungstechnologie hat scFv-Fragmente generiert, die mit EGFR reagierten und nicht mit anderen Antigenen kreuzreagierten. Das hier berichtete Immunisationsprotokoll hängt von der Präsentation des Antigens ab, das nicht löslich ist, sondern eine Membranvesikel- Präparation darstellt, und von dem Kulturmedium selbst, das kein FCS enthält. Beide Verfahren wurden als ein Mittel zur Steigerung der Effizienz der In-vitro- Immunisation berichtet, indem das Antigen den Antigen-präsentierenden Zellen zur Verfügung gestellt wird (z. B. Brams, P. et al.: J. Immunol. Methods, 1987. 98: 11).
• Die mit der MTC erhaltenen Ergebnisse stimmen mit früheren Arbeiten überein (z. B. Borrebaeck, C. A. K. und Möller, S. A.: J. Immunol., 1986. 136: 3710; Möller, S. A. und Borrebaeck, C. A. K., in Borrebaeck, C. A. K. (Hrsg.), In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam 1988, S. 3), welche die Verwendung von MTC-Überständen als eine Quelle für Lymphokine zur Verbesserung des In-vitro-Immunisationsverfahrens vorschlagen. Man sollte sich die Membranvesikel-Präparation als ein Polyantigen vorstellen, da in diesen Vesikeln viele verschiedene antigene Determinanten vorhanden sind. Aus diesem Grund würde es den Anschein haben, dass sie ein bestimmtes polyklonales Aktivierungsniveau induzieren. Wir haben dies ausgeschlossen, weil sich die spezifische Anti-EGFR-Antwort eindeutig von der nach einem polyklonalen Standardaktivator erhaltenen Antwort unterschied.
• Anstelle der Immortalisierung der B-Zellen nach In-vitro-Immunisationen haben wir die molekulare Strategie der Immortalisierung der Antikörpergene von VH und VL verwendet. Diese monoklonalen Antikörperfragmente wurden in Bakterien exprimiert und gebildet. Das Phagen-Display-System ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Isolation von Antikörper-Fragmenten gegen spezifische Antigene.
• Das Vorliegen eines Stop-Codons zwischen dem Antikörperfragment und dem g3p-Hüllprotein erlaubt das Umschalten zwischen Oberflächen-Display und Sekretion als ein lösliches scFv-Fragment mittels Suppressor- oder Nicht- Suppressor-Stämmen (Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 1991. 19: 4133).
• Aufgrund der Zunahme der spezifischen Antwort und mRNA-Spiegel in mit Antigen stimulierten B-Zellen in vitro trägt die In-vitro-Immunisation zur Isolation von Antikörperfragmenten mit hohen Spezifitäten zu dem Antigen bei. Nach zwei Auswahlrunden waren 100% der Klone positiv für die EGFR-Bindung. Im Gegensatz dazu waren von In-vivo-Immunisationsverfahren abgeleitete Klone erst nach vier Auswahlrunden 100% positiv (Kettleborough, et al., EP 94104160 und Eur. J. Immunol. 1994. 24: 952).
• Die Verwendung von Phagen-Display-Bibliotheken aus naiven Antikörpergenen könnte die Herstellung spezifischer menschlicher Antikörperfragmente ohne Immunisation oder nach der In-vitro-Immunisation zulassen. Antikörperfragmente können direkt in Bakterien und folglich auf eine einfache, schnelle und rentable Weise gebildet werden.
BIOLOGISCHE MATERIALIEN UND ALLGEMEINE VERFAHREN
• Mikroorganismen, Zelllinien, Plasmide, Phagemide, Promotoren, Resistenzmarker, Replikationsstartpunkte oder andere Fragmente von Vektoren, auf die in dieser Anmeldung hingewiesen wird, sind im Handel oder anderweitig allgemein erhältlich. Vorausgesetzt, dass keine andere Information in der Anmeldung gegeben wird, werden sie lediglich beispielhaft verwendet und sind erfindungsgemäß nicht ausschlaggebend und können durch andere geeignete Werkzeuge bzw. biologische Materialien ersetzt werden.
• Bakterienwirte werden vorzugsweise zum Klonieren der scFvs und zum Herstellen der scFv-Proteine verwendet. Beispiele für diese Wirte sind: E. coli oder Bacillus.
• Eukaryontische Wirte wie zum Beispiel COS, CHO oder Hefen werden zum Herstellen der erfindungsgemäßen ganzen Anti-EGFR-Antikörper bevorzugt.
• Die Verfahren, die erfindungsgemäß notwendig sind, werden in der Beschreibung ausführlich beschrieben. Andere, nicht ausführlich beschriebene Verfahren entsprechen bekannten Standardverfahren, die dem Durchschnittsfachmann weitgehend bekannt sind oder ausführlicher in den angegebenen Referenzen und Patentanmeldungen sowie in der Standardliteratur beschrieben sind.
Kurze Beschreibung der Figuren:
• Fig. 1. Aminosäuresequenzen von aus Phagen-Antikörperbibliotheken isolierten scFvs. (A) scFvs aus der Lymphknoten-Bibliothek. (B) scFvs aus der Milz- Bibliothek. Die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) und Framework-Regionen (FR5) sind angegeben.
• Fig. 2. Bindung von scFv an EGFR. Die scFv-Konzentrationen in Bakterienüberständen wurden bestimmt und die scFv mittels ELISA auf Bindung an den gereinigten EGFR getestet. (A) scFvs aus der Lymphknoten-Bibliothek. (B) scFvs aus der Milz-Bibliothek. P1 (positive Kontrolle) ist das von MAb 425 abgeleitete scFv. L1 und S1 (negative Kontrollen) sind nicht bindende scFvs aus den vorausgewählten Lymphknoten- und Milz-Bibliotheken.
• Fig. 3. Zur Rekonstruktion der variablen Regionen zur Expression in Säugetierzellen verwendete intermediäre Vektoren. (A) VH-Vektor. (B) Vκ-Vektor. Fig. 4. Bindung chimärer ganzer Antikörper an EGFR. Die Antikörper-Konzentrationen in COS-Zellüberständen wurden mittels ELISA bestimmt und die Antikörper mittels ELISA auf Bindung an den gereinigten EGFR getestet.
• Fig. 5. DNA- und Aminosäuresequenz von scFv Nr. L2 C11. (A): Leichtkette; (B) Schwerkette.
• Aminosäurepositionen:
• (A) FR-1: 1-23, CDR-1: 24-34,
• FR-2: 35-49, CDR-2: 50-56,
• FR-3: 57-88; CDR-3: 89-97,
• FR-4: 98-109
• (B) FR-1: 1-30, CDR-1: 31-35,
• FR-2: 36-49, CDR-2: 50-66,
• FR-3: 67-98, CDR-3: 99-108,
• FR-4: 109-119.
• Fig. 6. DNA- und Aminosäuresequenz von scFv Nr. L2 12B. (A): Leichtkette, (B): Schwerkette.
• Aminosäurepositionen:
• (A) FR-1: 1-23, CDR-1: 24-38,
• FR-2: 39-49, CDR-2: 50-56.
• FR-3: 57-88, CDR-3: 89-97,
• FR-4: 98-109.
• (B) FR-1: 1-30, CDR-1: 31-35,
• FR-2: 36-49, CDR-2: 50-66,
• FR-3: 67-98, CDR-3: 99-108,
• FR-4: 109-119.
• Fig. 7. DNA- und Aminosäuresequenz von scFv Nr. L3 11 D. (A: Leichtkette; (B): Schwerkette.
• Die Aminosäurepositionen der FRs und CDRs entsprechen den in Fig. 6 angegebenen.
• Fig. 8. DNA- und Aminosäuresequenz von scFv Nr. S4 2D. (A): Leichtkette; (B): Schwerkette.
• Aminosäurepositionen:
• (A) FR-1: 1-23, CDR-1: 24-35,
• FR-2: 36-50, CDR-2: 51-57,
• FR-3: 59-89, CDR-3: 9ß - 98,
• FR-4: 99-110
• (B) FR-1: 1-30, CDR-1: 31-35,
• FR-2: 36-49, CDR-2: 50-66,
• FR-3: 67-98, CDR-3: 99-107,
• FR-4: 108-118.
• Die Sequenzen der Fig. 5-8 sind auch im anhängenden Sequenzprotokoll, das Teil dieser erfindungsgemäßen Offenbarung darstellt, angegeben.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG (1) Aufbau und Screening von Phagen-Antikörperbibliotheken
• Es wurden drei Phagen-Antikörperbibliotheken aufgebaut, eine aus der Milz einer mit der menschlichen Karzinomzelllinie A431 immunisierten Maus (8,8 · 10&sup5; Glieder), eine aus dem poplitealen Lymphknoten einer mit gereinigtem EGFR in den Fußballen immunisierten Maus (6,5 · 10&sup6; Glieder) und eine aus in vitro mit A431-Vesikeln immunisierten Maus-Lymphozyten (1,1 · 10&sup5; Glieder), (Einzelheiten zum Aufbau von A431-Vesikeln und zur In-vitro-Immunisation gehen aus Beispielen 1,2 hervor). Vor der Auswahl wurden mindestens 46 Klone aus jeder Bibliothek zur Bestimmung der Diversität des Repertoires mittels BstNI-Fingerprinting (Clackson et al. Nature 1991. 352: 624) analysiert. Es wurde ein breites Spektrum verschiedener Verdauungsmuster beobachtet. Vor der Auswahl wurden auch scFvs von 96 Klonen aus jeder Bibliothek mittels ELISA auf Bindung an EGFR getestet. Keine der scFvs aus der Milz- und Lymphknoten-Bibliothek banden an EGFR. Eines der scFvs aus der in vitro immunisierten Bibliothek band an EGFR. Nach einer Auswahlrunde mittels EGFR-beschichteter Immunoröhrchen wurde mit der Lymphknoten-Bibliothek und mit der in vitro immunisierten Bibliothek eine deutliche Anreicherung für EGFR-bindende scFvs beobachtet. Vor dem Nachweis jeglicher EGFR- bindender scFvs aus der Milz-Bibliothek wurde eine zweite Auswahlrunde benötigt. Zum Zeitpunkt der dritten Auswahlrunde waren die meisten der scFvs aus den Lymphknoten- und in vitro immunisierten Bibliotheken positiv für eine Bindung an EGFR. Nach einer vierten Auswahlrunde mit der Milz-Bibliothek waren die meisten der scFvs positiv für eine Bindung an EGFR (Tabelle 1). Tabelle 1. Prozentualer Anteil der EGFR-bindenden Klone nach jeder Auswahlrunde.
(2) Sequenzanalyse von EGFR-bindenden Klonen
• Nach jeder Auswahlrunde wurden scPv-Inserts von EGFR-bindenden Klonen mittels BstNI-Fingerprinting analysiert (Clackson et al. Nature 1991. 352: 624). Daraus ging deutlich hervor, dass für bestimmte Verdauungsmuster eine Anreicherung vorlag. Aus den zweiten und dritten Runden der Auswahl aus der Lymphknoten-Bibliothek und aus den dritten und vierten Runden aus der Milz- Bibliothek wurden Klone mit verschiedenen BstNI-Fingerprints zur DNA-Sequenzierung der VHs und Vκs gewählt. Klone aus späteren Auswahlrunden wurden analysiert, weil höher affine Antikörper in den späteren Runden erwartet wurden (Clackson et al. Nature 1991. 352: 624).
• Sechzehn Klone aus der Lymphknoten-Bibliothek wurden sequenziert, und es wurden sechs verschiedene scFvs erhalten (Fig. 1). Bei fünf von diesen handelte es sich um Paarungen von einzigartigen VHs und Vκs. Bei dem sechsten handelte es sich um eine Variation eines zuvor aufgetretenen VH mit sechs Aminosäureänderungen, von denen sich fünf in der Framework-Region (FR) 1 befanden. Zwei dieser Änderungen lassen sich der Verwendung des degenerierten VH1 BACKSFI-Primers zuschreiben (Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 1991. 19: 4133). Die anderen könnten auf PCR-Fehler zurückzuführen sein. Die VHS wurden in zwei Untergruppen, VH2b und VH3d, klassifiziert, während die Vκs in vier Untergruppen, Vκ3, Vκ4, Vκ5 und Vκ6 fielen (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5. Auflage, U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda 1991). Zehn individuelle Klone aus der Milz-Bibliothek wurden sequenziert, und vier verschiedene scFvs wurden gefunden. Davon handelt es sich bei drei um Paarungen von einzigartigen VHs und Vκs, während die vierte einer der früheren Paarungen mit nur zwei Aminosäureunterschieden in VH ähnlich war, von denen eine in der Komplementaritäts-bestimmenden Region (CDR) 2 und zwei Aminosäureunterschiede in Vκ auftraten. Die Klassifikation in Untergruppen wies VHs aus Untergruppen VH2a, VH2c und VH3d und Vκs aus Untergruppen Vκ3 und Vκ4 aus. Der Vergleich der aus den Lymphknoten- und Milz-Bibliotheken erhaltenen scFvs wies nur ein scFv aus, das beiden Bibliotheken gemein war, nämlich scFv L3 10A/scFv S4 10H (Fig. 1). Wenn dieser Klon mittels ELISA getestet wurde, schien er stark an EGFR zu binden. Während zur Elimination jeglicher Kreuzkontamination zwischen Bibliotheken mit großer Sorgfalt vorgegangen wurde, ist es schwierig, eine geringgradige Kontamination mit einem stark bindenden EGFR-Klon auszuschließen. Bei Berücksichtigung der Inzuchtnatur von Balb/c-Mäusen ist es jedoch möglich, dass die gleichen scFvs unabhängig aus zwei verschiedenen Bibiliotheken entstanden.
(3) Analyse der Affinität zu und Bindungsspezifität an EGRF
• Basierend auf der guten Bindung an Antigen und der Diversität der DNA- Sequenzen wurden mehrere sich von den Lymphknoten- und Milz-Bibliotheken abgeleitete scFvs zur weiteren Analyse gewählt. Die Analyse dieser scFvs erfolgte mittels ELISA auf Bindung an gereinigten EGFR, Bindung an irrelevante Antigene und Bindung an EGFR exprimierende bzw. nicht exprimierende Tumorzelllinien. Als eine positive Kontrolle wurden scFvs aus Maus-MAb 425 (P1) hergestellt. Als negative Kontrollen wurden scFvs aus Phagenantikörpern, die aus den Lymphknoten- und Milz-Bibliotheken vor der Auswahl (L1 bzw. S1) isoliert wurden, hergestellt. Die scFvs-Konzentration wurde durch Vergleich von Verdünnungen der zu testenden scFvs mit Verdünnungen eines gereinigten scFvs von bekannter Konzentration in einem Western-Blot bestimmt.
• Die scFvs wurden mittels ELISA auf Bindung an gereinigtes EGFR getestet und die Ergebnisse aufgetragen (Fig. 2). Es war möglich, die scFvs in Bezug auf ihre Bindung an EGFR einzustufen. Diese Einstufungen waren zwischen den Experimenten reproduzierbar. Bei den am stärksten an EGFR bindenden scFvs handelte es sich um L2 1C und L3 10A aus der Lymphknoten-Bibliothek und S4 10H aus der Milz-Bibliothek. Die scFvs L3 10A und S4 10H besitzen, wie zuvor beschrieben, die gleichen DNA-Sequenzen. Ein scFv (S4 5A), das dem scFv S4 10H mit zwei Aminosäureänderungen in VH und zwei in Vk sehr ähnlich war, führte konsistent zu einer niedrigeren Einstufung als S4 10H. Im Gegensatz dazu schienen die zwischen L2 12B und L3 11D beobachteten Sequenzunterschiede keinen ausgeprägten Effekt auf die Bindung zu haben. Von den isolierten scFvs schienen nur zwei, L2 8C und L2 11C, weniger gut als scFv 425 zu binden.
• Die scFvs wurden mittels ELISA auf Bindung an Kunststoff und an ein Panel nicht verwandter Proteine (Ovalbumin, Hühnereier-Lysozym, Cytochrom C, Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, CBA-Albumin und BSA) getestet. Keine der scFvs gaben ein über den Hintergrund hinausgehendes Signal ab.
• Die scFvs wurden mittels ELISA auf Bindung an drei Tumorzelllinien getestet. Zelllinien A431 und MDA MB 468 sind EGFR-tragenden Tumorzelle, die aus der Vulva bzw. Brust isoliert wurden. Zelllinie SK-MEL-23 ist eine Gangliosidtragende Melanomzelllinie und wurde als eine negative Kontrolle augenommen. Von den zehn getesteten scFvs banden nur vier sowohl an gereinigten EGFR als auch an EGFR-tragende Tumorzellen (L2 12B, L3 11D, L2 11C und S4 2D, Fig. 5-8). Keine Bindung wurde an SK-MEL-23-Zellen nachgewiesen. Es gibt mehrere mögliche Erklärungen für dieses überraschende Ergebnis. Eine könnte sein, dass der EGFR, der für Immunisation, Auswahl und ELISA verwendet wurde, ein sezerniertes EGFR-verwandtes Protein war (Weber et al., Science 1984. 224: 294). Dieses Protein weist 17 zusätzliche Aminosäuren an dem C-Terminus auf (Günther et al., J. Biol. Chem. 1990. 265: 22082). Die scFvs wurden mittels ELISA auf Bindung an dieses 17-Aminosäuren-Peptid getestet, und es wurde keine Bindung beobachtet. Es ist möglich, dass das sezernierte EGFR-verwandte Protein und der EGFR auf der Tumorzelloberfläche Unterschiede bezüglich der Konformation oder Glycosylierung aufweisen.
• Zur weiteren Untersuchung der Bindung an Tumorzellen wurden drei scFvs (L2 11A, L3 11D und S4 2D) gereinigt und mittels Flowzytometrie auf Bindung an A431-Tumorzellen analysiert. Das scFv 425 wurde als eine positive Kontrolle verwendet. Von den drei getesteten scFvs banden nur L3 11D und S4 2D an A431-Zellen. Diese beiden scFvs besaßen scFv 425 ähnliche Bindungsprofile.
• Die aus zwei der Isolate hergestellten gereinigten seFvs, die sowohl an EGFR als auch EGFR-tragende Tumorzellen (L3 11D und S4 2D) banden, wurden in kompetitiven Bindungsassays mit dem Maus-MAb 425 getestet. Während gereinigtes scFv 425 in der Lage war, die Bindung von Maus-MAb 425 an EGFR über einen gegebenen Konzentrationsbereich zu inhibieren, inhibierten scFvs L3 11D und S4 2D bei diesen Konzentrationen die Bindung von Maus-MAb 425 an EGFR nicht. Diese beiden scFvs scheinen ein Epitop auf dem EG FR zu erkennen, das sich von dem durch den Maus-MAb 425 erkannten unterscheidet.
(4) Von scFvs abgeleitete chimäre ganze Antikörper
• Zwei scFvs (L3 11D und S4 2D) wurden zur Umwandlung in ganze Antikörpermoleküle ausgewählt. DNAs, die für die murinen VHs und Vκs codieren, wurden in intermediäre Vektoren kloniert, die DNA-Sequenzen enthalten, die für Immunglobulin-Leader-Sequenzen und Splice-Donor-Signale codieren (Fig. 3). Die Positionierung der Klonierungsstellen in dem intermediären VH-Vektor bedeutete, dass der erste Rest der VH von Asparaginsäure in Glutaminsäure verändert wurde. Aus den intermediären Vektoren wurden DNA-Fragmente, enthaltend die VHs und Vκs, die nun an Leader- und Splice-Donor-Sequenzen gekoppelt waren, in Expressionsvektoren von Säugetierzellen kloniert, die DNAs enthielten, die entweder für die menschliche konstante Gamma-1-Region oder die menschliche konstante Kappa-Region codierten (Maeda et al. Hum. Antibod. Hybridomas 1991. 2: 124). Für jeden chimären Antikörper wurden die Schwer- und Leichtketten-Expressionsvektoren in COS-Zellen kotransfiziert. Als eine positive Kontrolle wurden die Zellen auch mit Schwer- und Leichtketten-Expressionsvektoren, die für den chimären Antikörper 425 codieren, kotransfiziert (Kettleborough et al., Protein Eng. 1991, 4: 773). Das Medium wurde aus den Zellen gesammelt und mittels ELISA zur Bestimmung der vorliegenden Antikörperkonzentration und der Fähigkeit des Antikörpers, an EFGR zu binden, analysiert (Fig. 4). Als die zum Erreichen einer halbmaximalen Bindung an Antigen erforderliche Antikörperkonzentration verglichen wurden, band der chimäre Antikörper S4 2D genauso gut an EGFR wie der chimäre Antikörper 425. Der chimäre Antikörper L3 11D band jedoch um das ca. vierfache weniger gut an EGFR als der chimäre Antikörper 425. Durch kompetitive Bindungsanalyse wurde ermittelt, dass die Affinität des chimären Antikörpers 425 (Kettleborough et al. Protein Eng. 1991. 4: 773) 1,9 · 10&sup8; M&supmin;¹ betrug. Diese Ergebnisse waren überraschend, weil frühere Daten zur Analyse der scFvs erkennen ließen, dass sowohl scFv S4 2D als auch L3 11D besser an EGFR banden als scFv 425 (Fig. 2). Mit Protein-A gereinigte Proben der chimären Antikörper L3 11D und S4 2D wurden mittels SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen analysiert. Die chimären Antikörper L3 11D und S4 2D wurden auch mittels Flowzytometrie auf Bindung an A431- und SK-MEL-23-Zellen getestet. Beide chimären Antikörper banden gut an die EGFR-exprimierenden A431-Zellen und banden nicht an die EGFR-negativen SK-MEL-23-Zellen.
(5) Therapeutische und diagnostische Verwendung
• Die erfindungsgemäßen Antikörperfragmente und ganzen Antikörper können als Therapie an menschliche Patienten verabreicht werden. Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine pharmazeutischen Formulierung bereitzustellen, die als Wirkstoff mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, wie oben und in den Ansprüchen definiert, in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmittel enthält.
• Der erfindungsgemäße Antikörper wird typischerweise intravenös oder parenteral injiziert. Die Dosierungsbereiche zur Verabreichung der Antikörperfragmente sind im Allgemeinen groß genug, um die gewünschte Tumorunterdrückende und Tumor-lysierende Wirkung hervor zu rufen. Die Dosierung hängt vom Alter, Zustand, Geschlecht und Ausmaß der Krankheit des Patienten ab und kann von 0,1 mg/kg bis 200 mg/kg, vorzugsweise von 0,1 mg/kg bis 100 mg/kg/Dosis in einer oder mehreren täglich verabreichten Dosen über einen oder mehrere Tage variieren.
• Präparate zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele nicht wässriger Lösungsmittel stellen Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle, wie z. B. Olivenöle, und injizierbare organische Ester, wie z. B. Ethyloleat und andere im Fach bekannte Lösungsmittel, die für diese Zwecke geeignet sind, dar. Die erfindungsgemäßen Antikörper können in einer Zusammensetzung verwendet werden, die einen physiologisch unbedenklichen Träger enthält. Beispiele dieser geeigneten Träger sind Kochsalzlösung, PBS, Ringer-Lösung oder laktierte Ringerlösung. Konservierungsmittel und andere Zusatzstoffe, wie z. B. Antibiotika, Antioxidanzien und Chelatbildner können auch in den pharmazeutischen Formulierungen enthalten sein.
• Der Antikörper bzw. das Antikörperfragment kann auch gemäß bekannten Verfahren an Zytokine, wie z. B. IL-2, konjugiert werden, um ihre Zytotoxizität zu unterstützen.
• Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen sind zur Behandlung aller Tumorarten, einschließlich Melanomen, Gliomen und Karzinomen sowie Tumoren des Kreislaufsystems und solider Tumore geeignet.
• Für diagnostische Zwecke kann der Antikörper z. B. an einen strahlenundurchlässigen Farbstoff konjugiert werden, oder er kann radioaktiv markiert werden. Das Iodogen-Verfahren stellt ein bevorzugtes Markierungsverfahren dar. Der Antikörper wird bevorzugt als F(ab')&sub2;- oder scFv-Fragmente für diagnostische Zwecke verabreicht. Dadurch werden überlegene Ergebnisse geliefert, bei denen keine Hintergrundsubtraktion erforderlich ist.
BEISPIEL 1: A431-Vesikel
• Präparationen abgestoßener Membranvesikel wurden mit einigen Modifikationen wie zuvor von (Cohen et al., JJ Biol. Chem. 1982. 257: 1523; Yeaton et al., J. Biol. Chem. 1983. 258: 9254) beschrieben erhalten. Konfluente Kolben mit A431-Zellen wurden mit Calcium und Magnesium enthaltender PBS gewaschen. Es wurde hypotone PBS zugefügt, und die Kolben wurden 15 Minuten geschüttelt. Dann wurden die Zellen mit Vesikulierungspuffer (100 mM NaCl, 50 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 5 mM KCl, 0,5 mM MgSO&sub2;, pH 8,5) gewaschen. Der Vesikulierungspuffer wurde zugefügt, und die Kolben wurden bei Raumtemperatur und bei 37ºC gerührt. Danach wurde der Puffer durch ein Metallsieb in 50-ml-Röhrchen auf Eis dekantiert und 5 Minuten bei 4ºC bei 150 · g zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand wurde 90 Minuten bei 39000 U/min ultrazentrifugiert. Die endgültigen Pellets wurden in 10 mM Hepes-Puffer (pH 7,4) resuspendiert. Zur Analyse des EGFR aus Vesikeln wurden Proben mit 9 Volumen Ethanol präzipitiert, mit 0,08 M Tris, pH 6,8, resuspendiert, und danach wurde SDS-PAGE mit MAb 425 als Standard durchgeführt.
• Der Proteingehalt der Präparationen wurde anhand eines modifizierten Coomassie-Plus-Verfahrens mit BSA als Standard quantifiziert und bei 595 nm abgelesen. Zur Analyse des EGFR aus Vesikeln wurden Proben mit 9 Volumen Ethanol (über Nacht bei 4ºC) präzipitiert. Das Pellet wurde mit Tris (0,08 M, pH 6,8) resuspendiert, und dann wurde eine SDS-PAGE ausgeführt (5% Sammelgel; 1 h, 35 mA; 10% Laufgel; 2,5 h; 40 mA). Die Proben und der Standard waren doppelt vorhanden. Ein Exemplar wurde mit Coomassie-Blau gefärbt, und das andere wurde auf Nitrozellulosefolien geblottet (12 V; 16 h bei 4ºC) und mit dem Maus-MAb 425 (Anti-EGFR) und an alkalische Phosphatase konjugiertem Anti-Maus-IgG-Antikörper behandelt.
• Bei den In-vitro-Immunisationen wurden drei Medien verwendet. Medium-1 (M1), Medium-2 (M2) und gemischtes Thymozyten-Kulturmedium (MTC). M1 bestand aus HL1 (Ventrex Laboratories, USA) mit dem Zusatz von 50 mM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin (Gibco). M2 bestand aus HL1 mit dem Zusatz von 50 mM 2-Mercaptoethanol; 40 U/ml IL-2 (Genzyme); 20 mg/ml adjuvantem Peptid (Sigma); 2 mM L-Glutamin; 100 U/ml Penicillin (Gibco); 100 mg/ml Streptomycin (Gibco). M2 wurden 4% oder 20% FCS (Biological Industries) zugefügt. MTC wurde wie von Vaux (1) beschrieben hergestellt. Kurz gefasst wurden Einzelzellsuspensionen aus Thymusdrüsen von drei Wochen alten Balb/c- und C57/BL-1-Mäusen durch Durchdrücken der Thymusdrüsen durch ein steriles 50-Mesh-Sieb hergestellt. Die Zellsuspension wurde gesammelt, zweimal in HBSS gewaschen und die Zahl lebensfähiger Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Die Thymozyten wurden dann bei einer Dichte von 2,5 · 10&sup6; Thymozyten je Stamm pro ml in HL1-Medium enthaltend 4% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin kultiviert. Nach 48 Stunden wurde der Überstand zurückgewonnen, durch ein Filter (0,22 mm) filtriert und dann bei -70ºC gelagert.
• Eine Suspension aus Splenozyten von nicht immunisierten acht Wochen alten BALB/c-Mäusen wurde, wie für die Thymozyten beschrieben erhalten. Die Bestimmung der Lebensfähigkeit erfolgte mittels Trypanblau-Ausschluss.
BEISPIEL 2: In-vitro-Immunisation und Screening
• Bei den /n-vitro-Immunisationen wurden drei Medien verwendet. Medium-1 (M1), Medium-2 (M2) und gemischtes Thymozyten-Kulturmedium (MTC). M1 bestand aus HL1 (Ventrex Laboratories, USA) mit dem Zusatz von 50 mM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin (Gibco). M2 bestand aus HL1 mit dem Zusatz von 50 mM 2-Mercaptoethanol; 40 U/ml IL-2 (Genzyme); 20 mg/ml adjuvantem Peptid (Sigma); 2 mM L-Glutamin; 100 U/ml Penicillin (Gibco); 100 mg/ml Streptomycin (Gibco). M2 wurden 4% oder 20% FCS (Biological Industries) zugefügt. MTC wurde wie von Vaux (1) beschrieben hergestellt. Kurz gefasst wurden Einzelzellsuspensionen aus Thymusdrüsen von drei Wochen alten Balb/c- und C57/BL-1-Mäusen durch Durchdrücken der Thymusdrüsen durch ein steriles 50-Mesh-Sieb hergestellt. Die Zellsuspension wurde gesammelt, zweimal in HBSS gewaschen und die Zahl lebensfähiger Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Die Thymozyten wurden dann bei einer Dichte von 2,5 · 10&sup5; Thymozyten je Stamm pro ml in HL-1-Medium enthaltend 4% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin kultiviert. Nach 48 Stunden wurde der Überstand zurückgewonnen, durch ein Filter (0,22 mm) filtriert und bei -70ºC gelagert.
• Eine Suspension aus Splenozyten von nicht immunisierten acht Wochen alten BALB/c-Mäusen wurde wie für die Thymozyten beschrieben erhalten. Die Bestimmung der Lebensfähigkeit erfolgte mittels Trypanblau-Ausschluss.
• Einzelzellsuspensionen aus Thymusdrüsen von drei Wochen alten Balb/c- und C57/BL-1-Mäusen wurden durch Durchdrücken der Thymusdrüsen durch ein steriles 50-Mesh-Sieb erhalten. Die Zellsuspension wurde gesammelt, mit HBSS gewaschen, und die Anzahl lebensfähiger Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Die Thymozyten wurden dann bei einer Dichte von 2,5 · 10&sup6; Thymozyten je Stamm pro ml in HL-1-Medium enthaltend 4% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin kultiviert. Nach 48 Stunden wurde der Überstand zurückgewonnen, filtriert und gelagert. Eine Suspension aus Splenozyten von nicht immunisierten acht Wochen alten BALB/c-Mäusen wurde wie für die Thymozyten beschrieben erhalten. Die Bestimmung der Lebensfähigkeit erfolgte mittels Trypanblau-Ausschluss.
• In-vitro-Immunisationen wurden in 6-Well-Platten (Costar) durchgeführt. Wells, die 10&sup7; Splenozyten in 3,5 ml M1-Medium (bestehend aus HL-1-Medium, Ventrex Laboratories, USA, mit dem Zusatz von 50 uM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin (Gibco) enthielten, wurden mit EGFR-tragenden Vesikel bei der gewünschten Konzentration inkubiert (37ºC, 5% CO&sub2;). Den Kontroll-Wells wurden Vesikel aus Zellen, die keinen EGFR exprimieren, oder PBS zugefügt. Nach einigen Stunden wurde jedem Well 3,5 ml M2-Medium (bestehend aus HL1, mit dem Zusatz von 50 uM 2-Mercaptoethanol, 40 U/ml IL-2 (Genzyme), 20 ug/ml adjuvantem Peptid (SIGMA), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin (Gibco), 100 ug/ml Streptomycin (Gibco)), enthaltend 4% oder 10% FCS (Biological Industries), zugefügt. In einigen Experimenten wurde M2 durch MTC- Medium (gemischtes Thymozyten-Kulturmedium (Vaux et al., Nature 1988. 336: 36), mit dem Zusatz von adjuvantem Peptid (20 ug/ml) und IL-2 (40 U/ml) ersetzt. (Hierbei ist zu beachten, dass die Endkonzentration von FCS, IL2 und adjuvantem Peptid in Kultur 50% reduziert ist.) Die Zellen wurden 72, 96, 120 oder 144 h bei den gleichen Bedingungen inkubiert, und die Zellen wurden abschließend auf das Vorliegen von spezifischem Immunglobulin getestet oder zur RNA-Isolation aufgearbeitet.
• Das Screenen wurde mit gereinigten Antigenen oder fixierten A431-Zellen durchgeführt. Das Verfahren wurde mit einigen Modifikationen im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt (Carroll et al., Hybridoma 1990. 9: 81). Kurz gefasst wurden sterile 96-Well-Platten (Nung, Maxisorb) über Nacht mit gereinigtem EGFR (2,5 ug/ml), GD3-Gangliosid (2 ug/ml) oder RNase (10 ug/ml) in PBS beschichtet. Wenn A431-Zellen als Antigen verwendet wurden, wurden die Zellen in 96-Well-Platten bis zum Konfluieren kultiviert und mit 0,1% Glutaraldehyd fixiert. In vitro immunisierte Lymphozyten wurden gewaschen und in HL1-Medium, mit dem Zusatz von 2% FCS und 2 mM L-Glutamin, bei 5 · 10&sup5; Zellen/ml resuspendiert, und jedem Well wurden 1 · 10&sup5; Zellen zugefügt und 48 h (37ºC, 5% CO&sub2;) inkubiert. Von jeder Gruppe wurden sechzehn Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Lymphozyten wurden dann durch 5-maliges Waschen in PBS, enthaltend 0,1% Tween-20, entfernt. Spezifische Immunglobuline wurden mittels Peroxidase-markiertem Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin (Dako) nachgewiesen (1 Stunde, 37ºC). 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)-Diammoniumsalz (ABTS) (Sigma) in Citrat-Phosphat- Puffer (0,55 mg/ml) wurde als Substrat verwendet.
BEISPIEL 3: Bibliotheksaufbau
• Es wurden drei Bibliotheken aus RNA aufgebaut, die aus der Milz einer Maus, die intraperitoneal mit A431-Zellen immunisiert worden war (Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys. 1987. 252: 549) aus dem poplitealen Lymphknoten einer Maus, die mit gereinigtem EGFR in den Fußballen immunisiert worden war, und aus Mauszellen, die in vitro mit A431-Vesikeln immunisiert worden waren, hergestellt wurde. Ein cDNA-Erststrang wurde synthetisiert. Die VH- und VK Gene wurden PCR-amplifiziert und assembliert (Clackson et al., Nature 1991. 352 624). Noti- und Sfil-Restriktionsstellen wurden mittels PCR angehängt und die scFvs in den Phagemidvektor pHEN1 kloniert (Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 1991. 19: 4133). Die Ligationsmischungen wurden in E. coli-Zellen elektroporiert und die sich ergebenden Kolonien in ein Medium zur Generierung der Bibliothek-Stammlösungen gestrichen (Marks et al., J. Mol. Biol. 1991. 222: 581).
BEISPIEL 4: Bibliothek-Screening
• Phagenantikörper wurden mittels des M13K07-Helferphagen (Promega, Madison, WI) aus den Bibliotheken gewonnen (Marks et al., J. Mol. Biol. 1991. 222: 581). Immunoröhrchen (Nung, Life Sciences, Paisley, GB) wurden mit 4 ml 2,5 ug/ml EGFR in PBS über Nacht beschichtet. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Röhrchen mindestens 1 h bei 37ºC in PBS enthaltend 2% Milchpulver (PBSM) inkubiert. Die Phagen (10¹² bis 10¹³) wurden in 4 ml PBSM resuspendiert und in dem EGFR-beschichteten Röhrchen 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das Röhrchen wurde 20-mal mit PBS, 0,1% Tween und 20-mal mit PBS gewaschen. Gebundene Phagen wurden nach einer 10-minütigen Inkubation in 1 ml 0,1 M Triethylamin durch Mischen durch Invertieren eluiert. Die eluierten Phagen wurden durch den Zusatz von 0,5 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5, neutralisiert und zum Infizieren von E. coli-TG1-Zellen in der exponentiellen Phase verwendet. Die infizierten Zellen wurden ausplattiert und einzelne Kolonien für die scFv-Induktion in kleinem Maßstab ausgesucht. Die restlichen Kolonien wurden in Medium gestrichen und ein Aliquot zur Herstellung der Phagen für die nächste Screening-Runde verwendet.
BEISPIEL 5: Herstellung und Analyse von scFvs
• Lösliche scFvs wurden in E. coli-HB2151 wie zuvor beschrieben hergestellt (z. B. Kettleborough et al., I. c.). Die scFv-Konzentrationen in den Bakterienüberständen wurden mittels einer gereinigten scFv-Präparation von bekannter Konzentration als Standard bestimmt. Die Überstände wurden filtriert und 0,1% Natriumazid zugefügt. Reihenverdünnungen von den Überständen und von dem Standard wurden auf Immobilon-PVDF-Filter (Millipore, Watford, GB) mittels eines 96-Well-Manifolds punktförmig aufgetropft. Die Filter wurden wie für einen Western-Blot behandelt (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1979. 76: 4350). Die scFvs wurden mittels eines gegen das C-terminale Tag gerichteten Antikörpers (9E10) (Munro und Pelham, Cell 1986. 46: 291), gefolgt von einem Peroxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-IgG- und -IgM-Antikörper (Jackson ImmunoResearch Lab Inc., West Grove, PA) nachgewiesen. Die Reaktionen wurden mittels des ECL-Systems (Amersham, Aylesbury, GB) entwickelt. Pre- Flashed-Autoradiographien wurden mittels eines Densitometers gescannt. Es wurde eine Standardkurve hergestellt und zur Bestimmung der scFv-Konzentrationen in den Überständen verwendet.
• Antigen-bindende ELISAs wurden mit EGFR-beschichteten Platten (2,5 ug/ml) durchgeführt. ScFvs enthaltende Überstände wurden in PBSM verdünnt und den Platten zugefügt. Gebundene scEvs wurden mittels des 9E10-Antikörpers wie vorstehend beschrieben nachgewiesen. Die Überstände wurden auch auf Bindung an ein Panel nicht verwandter Proteine und Kunststoff getestet. Die ELISA-Platten wurden mit 100 ug/ml Ovalbumin, Hühnereier-Lysozym, Cytochrom C, Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, murinem Albumin (CBA- Stamm) und BSA über Nacht beschichtet. Unverdünnte Überstände enthaltend 2% Milchpulver wurden den beschichteten Platten für eine Doppelbestimmung zugefügt und gebundene scFvs wie vorstehend beschrieben nachgewiesen.
• Zellbindende ELISAs wurden mit der Tumorzelllinien, A431 (ATCC CRL 1555), MDA MB 468 (ATCC HTB 132) und SK-MEL-23 (negative Kontrolle) durchgeführt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz in mit Poly-D-Lysin behandelten 96- Well-Gewebekulturschalen (Nunc) behandelt. Die Zellen wurden mit DMEM gewaschen und 2 h bei 37ºC mit PBS enthaltend 2,5% BSA blockiert. Nach der Aspiration wurden die Überstände jedem Well zusammen mit einem gleichen Volumen des 2xYT-Mediums enthaltend 4% Milchpulver zugefügt und 1 h bei 4ºC inkubiert. Gebundene scFvs wurden wie vorstehend beschrieben nachgewiesen.
• Ein kompetitiver ELISA wurde durch Vorinkubation von EGFR-beschichteten ELISA-Platten für 10 min mit 50 ul gereinigtem scFv (100 ug/ml) durchgeführt. Dann wurde Maus-MAb 425 (50 u1) zugefügt, um Konzentrationen von 3,13 bis 200 ng/ml zu erhalten. Nach der Inkubation und dem Waschen wurde gebundener Maus-MAb 425 mittels Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG- und -IgM-Antikörper nachgewiesen.
BEISPIEL 6: DNA-Analyse
• Zum BstNI-Fingerprinting wurden die scFv-Inserts von einzelnen Klonen mittels PCR amplifiziert und die Produkte mit BstNI verdaut (Clackson et al., Nature 1991, 352: 624). Die DNA wurde mittels eines Sequenase-Kits (United States Biochemical, Cleveland, OH) sequenziert.
BEISPIEL 7: Reinigung von scFvs
• Bakterienüberstände wurden vor dem Laden auf eine 1-ml-Säule aus gereinigtem EGFR (5 mg) gekoppelt an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mittels Zentrifugation und Filtration durch Filter (0,2 um) geklärt. Die Säule wurde mit 30 ml PBS, gefolgt von 5 ml 0,2 M Glycin, pH 5,0, gewaschen. Die scFvs wurden mit 0,2 M Glycin/HCl, pH 2,8 eluiert. Das Eluat wurde mit 10· PBS neutralisiert. Protein enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und der Puffer durch Ultrafiltration (Amicon, Stonehouse, GB) in PBS enthaltend 1% BSA und 0,05% Natriumazid gewechselt.
BEISPIEL 8: FACS-Analyse gereinigter scFvs
• A431-Zellen wurden trypsiniert und in DMEM enthaltend 10% FCS inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem DMEM gewaschen und durch ein Sieb (45 um) filtriert. Die Zellen (10&sup6;) wurden 30 min auf Eis in 50 ul PBS, 1% BSA, mit gereinigten scFvs inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit kalter PBS wurden die gebundenen scFvs mittels 50 ul FITC-konjugiertem 9E10-Antikörper (100 ug/ml) nachgewiesen. Nach 30 min auf Eis wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, in 1% Formaldehyd enthaltender PBS fixiert und mittels eines FACSCAN (Becton-Dickinson, Cowley, GB) analysiert.
BEISPIEL 9: Aufbau, Analyse und Expression ganzer chimärer Antikörper
• Mit den PstI- und BstEII-Stellen wurden für die VHs der ausgewählten scFvs codierende DNAs in einen intermediären VH-Vektor, enthaltend eine aus menschlichem Antikörper HG3 CL abgeleitete eukaryontische Leader-Sequenz (Rechavi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983. 80: 855) und eine Splice- Donor-Stelle subkloniert (Fig. 3). Die für die Vks codierenden DNAs wurden zur Insertion in einen intermediären Vk-Vektor mittels der PCR-Primer zum Einbau von XhoI- und SstI-Stellen an den 5'- und 3'-Enden
• angepasst. Die SstI-XhoI-Fragmente wurden in den intermediären Vk-Vektor, enthaltend eine von einer umgeformten menschlichen CAMPATH-1-Leichtkette abgeleitete eukaryontische Leader-Sequenz (Riechmann et al., Nature 1988. 352: 21) und eine Splice-Donor-Stelle kloniert (Fig. 3). Die für die variablen Regionen einschließlich der eukaryontischen flankierenden Regionen codierenden DNAs, wurden als HindIII-BamHI-Fragmente in Expressionsvektoren von Säugetierzellen, enthaltend genomische DNAs, die für eine menschliche konstante Gamma-1-Region oder menschliche konstante Kappa-Region codieren, kloniert (Maeda et al., Hum. Anitibod. Hybridomas 1991. 2: 124). Die Schwer- und Leichtketten-Expressionsvektoren wurden in COS-Zellen elektroporiert. Nach 72 h wurde das Medium gesammelt und die chimären Anti-EGFR-Antikörper wurden mittels ELISA analysiert (Kettleborough et al., Protein Eng. 1991. 4: 773).
BEISPIEL 10: Herstellung von aus in vitro immunisierten Zellen abgeleiteten scFvs
• Die nachstehend offenbarten Verfahren stellen geringfügige Modifikationen der vorstehend beschriebenen Verfahren dar. Immunisation, Bibliotheksaufbau und Screening gehen aus den Beispielen 1-4 hervor. Die folgenden Schritte werden nachstehend ausführlich beschrieben:
• Nach dem Screening der primären Bibliothek und der aus den drei Panning- Runden abgeleiteten Klone wurden einige Ampicillin-resistente Einzelkolonien ausgewählt. Die Phagemid-DNA wurde durch alkalische Lyse hergestellt und zur Transfektion von E. coli-HB2151, einem Nicht-Suppressor-Stamm, mittels Hitzeschock verwendet. Die Kolonien wurden in 2xTY-Amp-Glu inokuliert und über Nacht bei 30ºC wachsen gelassen. Ein 5-ml-Aliquot wurde zur Inokulation von 50 ml 2xTY-Bouillon, enthaltend 100 mg Ampicillin/ml und 0,1% Glucose, verwendet und 1 h unter Schütteln bei 30ºC (bis zur exponentiellen Phase) wachsen lassen. Die Zellen wurden geerntet und die Expression von löslichem scFv wurde durch den Zusatz von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert (De Bellis, D. und Schwartz, I.; Nucleic Acids Res.: 1990. 18: 1311). Die Kulturen wurden über Nacht bei 30ºC unter Schütteln wachsen gelassen. ScFv enthaltende Überstände wurden entnommen, mittels Zentrifugation und Filtration durch Filter (0,22 mm) geklärt und getestet. Die Bakterienüberstände wurden mittels ELISA, wie beschrieben, auf Bindung an EGFR getestet (Kettleborough, et al., EP 94104160 und Eur. J. Immunol. 1994. 24: 952). Die Spezifität ausgewählter scFv-Fragmente wurde mittels ELISA mittels unter Verwendung von mit verschiedenen mit EGFR verwandten und nicht verwandten Proteinen wie auch anderen Antigenen und Kunststoff beschichteten Platten geprüft. Bei den verwendeten Antigenen handelte es sich um: RNase, BSA, OVA, GD&sub3;-Gangliosid, Vitronectin-Rezeptor (VNR), Thrombozyten-Glycoprotein IIbIIIa (GPIIbIIIa) und Disialyl-lacto-N- tetraose (DSLNT). Die Beschichtung erfolgte über Nacht bei der für jedes Antigen optimalen Konzentration. Beschichtete ELISA-Platten wurden 1 h bei 37ºC mit 1,5% Magermilch in PBS (G/V) blockiert. Nach dem Waschen wurden den Mikrotiter-Wells 100 ml scFv-Überstände zugefügt und 2 h bei 37ºC inkubiert. Gebundenes scFv wurde mittels des Anti-c-myc-Antikörpers 9E10 (erschöpftes Kulturmedium von der Myc 1-9E10.2-Hybride) und eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten Kaninchen-Anti-Maus-Antikörpers (Dako) nachgewiesen.
• Drei EGFR-tragende Tumorzelllinien, A431, menschliches Mammaadenokarzinom MDA MB 231 (ATCC, HTB 26) und menschliches Kolonadenokarzinom HT29 (ATCC, HTB 38) und eine nicht exprimierende EGFR-Zelllinie, WM164, wurden zum Testen der Fähigkeit des scFv, an EGFR an Zellen zu binden, mittels FACS-Analyse und Immunofluoreszenz mit nicht fixierten Zellen verwendet. Für die indirekte Immunofluoreszenz-Analyse wurden die Zellen auf Terasaki-Platten (2 · 10&sup4; Zellen/Well) ausplattiert und 24 h kultiviert. Die Zellen wurden dann mit 20 ml rohem Bakterienüberstand, enthaltend die scFv-Fragmente, 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Inkubationen mit primärem Antikörper (Anti-c-myc) und sekundärem Antikörper wurden 60 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Der sekundäre Antikörper, FICT-konjugierter Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper (Dako), wurde 1 : 20 verdünnt.
• Zur FACS-Analyse wurden 5 · 10&sup5; Zellen mit PBS mit 1% BSA und 0,1% Natriumazid (PBS-BSA) gewaschen und 20 min bei 4ºC mit 50 ml rohem Bakterienüberstand inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit kaltem PBS-BSA wurde das gebundene scFv mittels des Anti-c-myc-Antikörpers und FITC- konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpers (Beoton-Dickinson) 1 : 25 verdünnt in PBS-BSA nachgewiesen. Propidiumiodid (PI) wurde bei einer Endkonzentration von 5 mg/ml zugefügt. Die Flowzytometrie-Analyse wurde in einem mit einem luftgekühlten Argon-Laser ausgerüsteten EPICS Profil II durchgeführt. Zur Exzitation wurde die 488-nm-Linie (15 mV) verwendet. Ein Bandpassfilter von 530 nm wurde zum Sammeln der FITC-Emission und ein Bandpassfilter von 625 nm zum Sammeln der PI-Emission verwendet. Lebende Zellen wurden durch Einstellen einer Bitmap auf Vorwärts- und Seitenstreuung und durch Ausschluss von mit PI gefärbten Zellen ausgewählt.
• Die Diversität der primären und ausgewählten Bibliotheken wurde mittels PCR- Amplifikation klonierter Fragmente (Güssow, D, Clackson, T.; Nucleic Acids Res. 1989. 17: 4000) und Analyse des BstNI-Verdauungsmusters (8) bestimmt. Einige Klone wurden mittels eines Sequenase-Kits (USB) nach dem Didesoxy- Kettenterminationsverfahren (Sanger, F et al.; Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1977. 74: 5463) sequenziert.
• Rohe Bakterienüberstände (10 ml) wurden mit einem Gel (12,5%) der SDS- PAGE unterzogen. Die Durchführung des Western-Blot erfolgte im Wesentlichen wie von Towbin beschrieben (Towbin et al. J. Proc. Nat. Acad. Sci., USA. 179. 76: 4350). Proteine wurden mittels Elektroblotting an Immobilon-P (Millipore) oder Nitrocellulose (Bio-Rad) transferiert. Der Blot wurde mit PBS enthaltend 2% Magermilch (GN) blockiert. Die scFv-Fragmente wurden mittels des Anti-c-myc-Antikörpers (9E10), Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus-Antikörper (Jackson) und eines Enhanced Chemilumineszenz-Systems (ECL, Amersham) nachgewiesen.
• Die quantitative Analyse der abgestoßenen Membranvesikel wies eine Gesamtproteinkonzentration von 2,5 mg/ml aus, wovon nur 10-14% dem EGFR (Sato et al.: J. Natl. Cancer Inst. 1989. 21: 1601; Yeaton, R et al., J. Biol. Chem., 1983, 258: 9254), 250 bis 350 ng/ml, entsprachen. Die elektrophoretische Analyse mittels PAGE-SDS, gefolgt von der Färbung mit Coomassie-Blau zeigte, dass die Vesikel ein ziemlich komplexes Proteingemisch enthielten. Es wurde kein Proteinabbau nachgewiesen. Die Western-Biot-Analyse ließ erkennen, dass unter unseren experimentellen Bedingungen in der Membranvesikel-Präparation komplette Moleküle des EGF-Rezeptors vorhanden waren.
• Zur Ermittlung der Anforderungen an FCS und Lymphokine wurden MTC und M2 enthaltend 20% oder 4% FCS verglichen. EGFR- und PBS-tragende Vesikel wurden als Antigen bzw. Kontrolle verwendet. Splenozyten wurden in Sechs-Well-Platten mit oder ohne Antigen 3 h in M1 (serumfrei) inkubiert. MTC oder M2 wurde dann zugefügt, und nach 72, 96, 120 oder 144 h wurde das Screening mittels fixierter A431-Zellen durchgeführt. In allen Experimenten lag die Anzahl der zurückgewonnenen lebensfähigen Zellen im Einklang mit den veröffentlichten Ergebnissen zwischen 20 und 40% (Gavilondo-Cowley, J. et al.; In Vitro Immunization in Hybridoma Technology. Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam 1988, S. 131). Die maximale spezifische Antwort wurde am vierten Tag mit MTC erhalten, wohingegen M2 bei 4% oder 20% FCS (2% oder 10% Endkonzentration) die maximale Antwort bis zum sechsten Tag verzögerte (Tabelle 2). MTC und 10% FCS triggerten jedoch eine nicht spezifische Antwort, wahrscheinlich durch polyklonale Aktivierung, wie gesehen werden konnte, als die Ergebnisse als das Verhältnis von spezifischer zu nicht spezifischer Antwort ausgedrückt wurden. Wir entschlossen uns, für weitere Assays M2 mit dem Zusatz von 4% FCS und 6-tägiges Kultivieren zu verwenden.
• Das Vorliegen von EGFR in der Vesikeloberfläche verbesserte die Antwort auf dieses Antigen erheblich. In ähnlichen wie den vorstehend beschriebenen Protokollen wurden Vesikel aus exprimierenden und nicht exprimierenden EGFR- Zelllinien verglichen. Lymphozyten wurden 3 h mit Vesikeln in M1 kultiviert. Danach wurde 4% FCS enthaltendes M2 zugefügt. Nach 6 Tagen wurden die Lymphozyten aus jeder Gruppe 48 h in 96-Well-Platten, beschichtet mit EGFR, fixierten A431-Zellen, RNase oder GD3, kultiviert. Erwartungsgemäß zeigten die Ergebnisse dieser Assays ein multispezifisches Antwortmuster (Tabelle 3). Wenn EGFR exprimierende Vesikel als Antigen verwendet wurden, war die Reaktivität gegen EGFR in Bezug auf die optische Dichte eindeutig erhöht.
• Obwohl unausgereift, ist aus diesen Ergebnissen insgesamt ersichtlich, dass eine messbare Antigen-abhängige Antwort nach In-vitro-Immunisation vorhanden war, die mehrere Pools immunisierter Lymphozyten gegen EGFR, die zum PCR-Klonieren variabler Regionen geeignet waren, generierte.
• Nach dem Klonieren von der In-vitro-Immunisation ableiteten scFv-Fragmenten in das pHEN1-Phagemid, wurde eine Bibliothek aus 1,1 · 10&sup6; Klonen erhalten. Diese Bibliothek wurde parallel zu zwei weiteren In-vitro-Immunisation bereitstellenden Bibliotheken generiert. Der Aufbau dieser Phagenbibliotheken wurde bereits beschrieben (Kettleborough, et al., EP 94104160 und Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952).
• Zur Auswahl der an EGFR bindenden scFv-Fragmente wurden Phagen mittels EGFR-beschichteter Immunoröhrchen gepannt. Zum Reinfizieren eines SupE- Stammes von E. coli wurden eluierte Phagen verwendet. Insgesamt wurden drei Auswahlrunden durchgeführt In jeder Runde wurde ein Röhrchen ohne Antigen zur Berechnung des Hintergrundes parallel getestet. Beim ersten Panning wurden auf das Immunoröhrchen 1,5 · 10¹&sup0; Phagenpartikel aufgebracht und 6,6 · 10&sup4; wurden aus dem beschichteten Immunoröhrchen eluiert, wohingegen nur 200 Kolonien aus der Hintergrundpopulation erhalten wurden. Nach dem dritten Panning wurden 1 · 10¹¹ Pagen aufgebracht und 5,6 · 10¹&sup0; wurden eluiert.
• Vor der Auswahl und nach jeder Auswahlrunde wählten wir 22 Klone aus den Phagenpopulationen zur weiteren Charakterisierung der scFv-Fragmente aus.
• Die Diversität der Bibliothek wurde anhand der BstNI-Verdauungsmuster der klonierten Fragmente analysiert. Vor der Auswahl schien die Bibliothek äußerst divers zu sein. Fingerprinting von aus der ersten Auswahlrunde abgeleiteten bindenden Klonen ließ das Vorliegen mehrerer Gruppen mit dem gleichen Restriktionsmuster erkennen.
• Klone wurden basierend auf ihren Verdauungsmustern aus verschiedenen Auswahlrunden ausgewählt. Die DNA-Sequenzierung wies das Vorliegen verschiedener Sequenzen in den meisten der ausgewählten Klone aus. Die Länge und Zusammensetzung der Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) von Klonen 10D2, 5D3, 10E2, 1B3, 4B3 und 5E2 waren unterschiedlich. Die größte Variation wurde bei den CDR3s von VH- und VL-Sequenzen beobachtet. Die Klone 5D3 und 1E3 stammten aus der dritten Auswahlrunde. Sie banden stark an EGFR, wie mittels ELISA und der Flowzytometrie analysiert wurde, und besaßen die gleiche Sequenz.
• Lösliche scFv-Fragmente wurden durch Wachstum des Nicht-Suppressor-E. coli-Stammes HB 2151 im Gegenwart von IPTG erhalten.
• Zur Verifikation der scFv-Herstellung wurde das Bakterienmedium von einzelnen Klonen mittels Gelelektrophorese analysiert. Die Western-Blot-Analyse wies eine eindeutige Bande um 35000 kD aus.
• Klone mit Bindungsaktivitäten an EGFR wurden mittels ELISA identifiziert. Zur Untersuchung der Kreuzreaktvität ausgewählter Klone wurden die ELISA- Assays mit verschiedenen Antigene durchgeführt. Die Antigene (EGFR, RNase, BSA, KLH, OVA, GD&sub3;-Gangliosid, Vitronectin-Rezeptor, Thrombozyten-Glycoprotein IIbIIIa und Disialyl-lacto-N-tetraose) wurden bei optimaler Konzentration ELISA-Platten aufgetragen (Tabelle 4). An den Nicht-EGFR-Antigenen wurde keine Bindung nachgewiesen. Die scFvs wurden auch auf Bindung an drei EGFR-tragende Tumorzelllinien (menschliches Epidermoidkarzinom A431, menschliches Mammaadenokarzinom MDA MB 231 und menschliches Kolonadenokarzinom HT 29) getestet. WM 164, der nicht exprimierende EGFR von einem menschlichen Melanom, wurde als negative Kontrolle verwendet. Diejenigen, die an Tumorzelllinien banden, wurden anhand indirekter Immunofluoreszenz mittels nicht fixierter Zellen getestet und mittels der FACS-Analyse quantifiziert. Die Verwendung nicht fixierter Zellen gewährleistet die natürliche Konformation der Membran-Rezeptoren. Positive Klone zeigten eine deutliche Fluoreszenz mit A431-Zellen. Die Fluoreszenz mit den anderen EGFR- tragenden Tumorzelllinien war schwach. An der negativen Zelllinie wurde keine Bindung nachgewiesen. Die Bestätigung der Ergebnisse erfolgte mittels der Flowzytometrie. Siebzehn positive Klone und drei negative Klone wurden mittels Flowzytometrie auf Bindung an A431-, MDA MB 231- und HT 29-Zellen analysiert. WM 164 wurde als die negative Zelllinie verwendet. Das scFv 425 (P1- Klon) wurde als positive Kontrolle und der Klonierungsvektor (HEN) als negative Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Zwei Klone, 4B2 und 5E2, waren, wie mittels ELISA analysiert, positiv auf Bindung an EGFR, aber negativ auf Bindung an EGFR exprimierende Tumorzelllinien. Tabelle 2. Effekt verschiedener Medien auf die In-vitro-Immunisation. a)
• Assay 1: M1 plus M2, 4% FCS (Endkonz. des FCS: 2%)
• Assay 2: M1 plus M2, 20% FCS (Endkonz. des FCS: 10%)
• Assay 3: A-Medium plus MTC, 4% FCS (Endkonz. des FCS: 2%)
• a) Milzzellen (10&sup7;) von der BALB/c-Maus wurden in 3,5 ml M1 mit Vesikeln aus A431-Zellen oder PBS 3 h in Wells von 6-Well-Platten inkubiert. Danach wurden 3,5 ml MTC oder M2, enthaltend 4% oder 20% FCS, zugefügt und die Platten inkubiert. Nach 3, 4, 5 oder 6 Tagen wurden die in vitro immunizierten Lymphozyten aus dem Kulturmedium entfernt, zur Entfernung der Vesikel in HBSS gewaschen und in mit fixierten A431-Zellen beschichtete 96-Well-Platten geimpft und 48 h inkubiert (siehe Verfahren):
• b) Endkonzentration des FCS im Kulturmedium.
• c) O. D. ist die bei 405 nm abgelesene optische Dichte. Sie stellt den Mittelwert von sechzehn Wells dar.
• d) Verhältnis der spezifischen Antwort (Vesikel als Antigen) zur nicht spezifischen Antwort (PBS als Antigen). Tabelle 3. Multispezifität der Antwort nach In-vitro-Immunisation (a)
• a) Lymphozyten wurden entweder mittels EGFR-exprimierender Vesikel (EGFR+) oder nicht EGFR-exprimierender Vesikel (EGFR-) in vitro immunisiert. Nach sechstägiger Inkubation wurden die Zellen aus der Kultur entfernt und gegen die vorstehend erwähnten Antigene gescreent.
• b) Die Antwort wird als optische Dichte (405 nm) ausgedrückt. Tabelle 4. Kreuzreaktivität ausgewählter scFv-Fragmente gegen mehrere Antigene (a)
• a) Die ELISA-Assays wurden wie beschrieben durchgeführt.
• b) Vitronectin-Rezeptor (VNR); Thrombozyten-Glycoprotein IIbIIIa (GPIIbIIIa); Disialyl-lacto-N-tetraose (DSLNT). Tabelle 5. Reaktivität der scFv-Klone gegen EGFR. Vergleichsergebnisse zwischen einem ELISA-Verfahren mit gereinigtem löslichem Antigen und der zytometrischen Analyse der Zelllinien.
• a) Drei EGFR-tragende Zelllinien (A431, MDAAMB231 und HT29) und eine nicht exprimierende Zelllinie (WM164) wurden zur Bestimmung der Fähigkeit von scFv zum Binden an Tumorzelllinien mittels zytometrischer Analyse wie beschrieben verwendet.
• b) Vektor ohne Fragment (HEN) und das scFv-Fragment von mAb 425 (Pl) wurden als negative bzw. positive Kontrolle verwendet.
SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
• (i) ANMELDER:
• (A) NAME: Merck Patent GmbH
• (B) STRASSE: Frankfurter Str. 255
• (C) STADT: Darmstadt
• (E) LAND: Deutschland
• (F) POSTLEITZAHL: 64271
• (G) TELEFON: 49-6151-727022
• (H) TELEFAX: 49-6151-737191
• (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Anti-EGFR-Einketten-Fvs und Anti-EGFR-Antikörper
• (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 32
• (iv) MASCHINENLESBARE FORM:
• (A) DATENTRÄGER: Diskette
• (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
• (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
• (D) SOFTWARE: PatentIn Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.30 (EPO)
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• (B) KLON: S4 2D (Schwerkette)
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE: 1..364 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ. ID NR: 16:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 118 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 17:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 717 Basenpaare
• (B) ART: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: Einsträngig
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: cDNA
• (iii) HYPOTHETISCH: Nein
• (iv) ANTI-SENSE: Nein
• (v) FRAGMENTART: N-terminal
• (vi) ORIGINALQUELLE:
• (A) ORGANISMUS: Maus
• (B) STAMM: Balb/c
• (D) ENTWICKLUNGSSTUFE: Erwachsen
• (F) GEWEBEART: Splenozyten
• (vii) UNMITTELBARE QUELLE:
• (B) KLON: 4 B 2
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE: 1..717 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:. 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 18:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 239 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 19:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 732 Basenpaare
• (B) ART: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: Einsträngig
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: cDNA
• (iii) HYPOTHETISCH: Nein
• (iv) ANTI-SENSE: Nein
• (vi) ORIGINALQUELLE
• (A) ORGANISMUS: Maus
• (B) STAMM: Balb/c
• (F) GEWEBEART: Splenozyten
• (vii) UNMITTELBARE QUELLE:
• (B) KLON: 10 D 2 (Einketten-Fv, Schwer- und Leichtkette plus Linker)
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE: 1..732 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 19:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 20:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 244 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 20:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 21:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 732 Basenpaare
• (B) ART: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: Einsträngig
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: cDNA
• (iii) HYPOTHETISCH: Nein
• (iv) ANTI-SENSE: Nein
• (v) FRAGMENTART: N-terminal
• (vi) ORIGINALQUELLE:
• (A) ORGANISMUS: Maus
• (B) STAMM: Balb/c
• (F) GEWEBEART: Splenozyten
• (vii) UNMITTELBARE QUELLE:
• (B) KLON: 3 D 3 (Einketten-Fv, Schwer- und Leichtkette plus Linker)
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE: 1..732 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 21:
(3) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 22:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 244 Aminosäuren ·
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 22:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 23:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 738 Basenpaare
• (B) ART: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: Einsträngig
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: cDNA
• (iii) HYPOTHETISCH: Nein
• (iv) ANTI-SENSE: Nein
• (v) FRAGMENTART: N-terminal
• (vi) ORIGINALQUELLE:
• (A) ORGANISMUS: Maus
• (B) STAMM: Balb/C
• (F) GEWEBEART: Splenozyten
• (vii) UNMITTELBARE QUELLE:
• (B) KLON: 1 E 3 (Einketten-Fv, Leicht- und Schwerkette plus Linker)
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (9) LAGE: 1..738 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 23:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 24:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 246 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 24:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 25:
• (i) SEQUENZMERKMALE
• (A) LÄNGE: 726 Basenpaare
• (B) ART: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: Einsträngig
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: cDNA
• (iii) HYPOTHETISCH: Nein
• (iv) ANTI-SENSE: Nein
• (v) FRAGMENTART: N-terminal
• (vi) ORIGINALQUELLE:
• (A) ORGANISMUS: Maus
• (B) STAMM: Balb/c
• (F) GEWEBEART: Splenozyten
• (vii) UNMITTELBARE QUELLE:
• (B) KLON: 5 F 1 (Einketten-Fv, Schwer-, Leichtkette, Linker)
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE: 1..726 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 25:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 26:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 242 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 26:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 27:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 726 Basenpaare
• (B) ART: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: Einsträngig
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: cDNA
• (iii) HYPOTHETISCH: Nein
• (iv) ANTI-SENSE: Nein
• (v) FRAGMENTART: N-terminal
• (vi) ORIGINALQUELLE:
• (A) ORGANISMUS: Maus
• (B) STAMM: Balb/C
• (F) GEWEBEART: Splenozyten
• (vii) UNMITTELBARE QUELLE:
• (A) BIBLIOTHEK: 7 G 1 (Einketten-Fv, Schwer-, Leichtkette, Linker)
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE: 1..726 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 27:
(2) ANGABEN SEQ ID NR: 28:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 242 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 28:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 29:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 726 Basenpaare
• (B) ART: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: Einsträngig
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: cDNA
• (iii) HYPOTHETISCH: Nein
• (iv) ANTI-SENSE: Nein
• (v) FRAGMENTART: N-terminal
• (vi) ORIGINALQUELLE:
• (A) ORGANISMUS: Maus
• (B) STAMM: Balb/C
• (D) ENTWICKLUNGSSTUFE: Erwachsen
• (F) GEWEBEART: Splenozyten
• (vii) UNMITTELBARE QUELLE:
• (B) KLON: 11 H 1 (Einketten-Fv, Leicht- und Schwerkette einschließlich Linker
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE: 1..726 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 29:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 30:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 242 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 30:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 31:
• (1) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 732 Basenpaare
• (B) ART: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: Einsträngig
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: cDNA
• (iii) HYPOTHETISCH: Nein
• (iv) ANTI-SENSE: Nein
• (v) FRAGMENTART: N-terminal
• (vi) ORIGINALQUELLE:
• (A) ORGANISMUS: Maus
• (B) STAMM: Balb/c
• (F) GEWEBEART: Splenozyten
• (vii) UNMITTELBARE QUELLE:
• (B) KLON: 1 A 1 (Einketten-Fv, Schwer- und Leichtkette einschließlich Linker)
• (ix) MERKMALE:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE: 1..732 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 31:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 32:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 244 Aminosäuren
• (B) ART: Aminosäure
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 32:

Claims (10)

1. Einkettiges Anti-EGFR-Fv, erhältlich aus einer aus Zellen eines immunisierten Säugetiers hergestellten Phagen-Antikörperbibliothek, wobei die variable Region des einkettigen Fv eine Schwerketten- Aminosäuresequenz aus der Gruppe SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18, SEQ ID NR: 20, SEQ ID NR: 22; SEQ ID NR:24, SEQ ID NR: 26 und SEQ ID NR: 28 und eine Leichtketten- Aminosäuresequenz aus der Gruppe SEQ ID NR: 2, SEC ID NR: 6, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 18, SEQ ID NR: 20, SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26 und SEQ ID NR: 28 enthält.

2. Einkettiges Anti-EGFR-Fv nach Anspruch 1, wobei die Zellen von einer immunisierten Maus stammen.

3. Einkettiges Anti-EGFR-Fv nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellen

(i) aus dem Lymphknoten,

(ii) aus der Milz oder

(iii) aus in vitro immunisierten Zellen stammen.

4. DNA-Molekül codierend für eine Schwerketten-Aminosäuresequenz oder eine Leichtketten-Aminosäuresequenz von einkettigen Anti-EGFR-Fvs nach Ansprüchen 1 bis 3, ausgewählt aus einer der in SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 angegebenen DNA-Sequenzen, bzw. DNA-Molekül codierend für eine Schwer- und Leichtketten-Aminosäuresequenz von einkettigen Anti-EGFR-Fvs nach den Ansprüchen 1 bis 3, ausgewählt aus einer der in SEQ ID Nr. 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 und 31 angegebenen DNA-Sequenzen.

5. Anti-EGFR-Antikörper codiert durch ein DNA-Molekül mit. Sequenzen nach Anspruch 4 sowie DNA-Sequenzen, die sich von konstanten Regionen menschlicher Immunglobuline ableiten.

6. Antikörper nach Anspruch 5, wobei die konstante Region der schweren Kette die Aminosäuresequenz der menschlichen Gamma-1-Kette und die konstante Region der leichten Kette die Aminosäuresequenz einer menschlichen Kappa-Kette enthält.

7. Verfahren zur Herstellung eines einkettigen Anti-EGFR-Fv nach Ansprüchen 1 bis 3 mit den folgenden Schritten:

(i) Isolation von RNA aus immunisierten Säugetierzellen, vorzugsweise Mauszellen,

(ii) cDNA-Erststrangsynthese,

(iii) Amplifikation der VH- und Vk-Gene in cDNAs aus den immunisierten Zellen,

(iv) Klonieren dieser Gene mit geeigneten Restriktionsstellen in einen Phagemidvektor,

(v) Transformation von Prokaryontenzellen mit den Ligationsmischungen,

(vi) Screenen der Phagenbibliotheken auf gegen EGFR gerichtete Phagenantikörper mittels gereinigtem EGFR, sowie (vii) Produktion dieses einkettigen Fv in prokaryontischen Wirtszellen, vorzugsweise E. coli.

8. Verfahren zur Herstellung eines ganzen Anti-EGFR-Antikörpers durch Klonieren der DNA nach Anspruch 4, die für die variablen Regionen von nach den Verfahren von Anspruch 7 erhältlichen Anti-EGFR-Antikörperfragmenten codiert, in mindestens einen eukaryontischen Expressionsvektor, der genomische DNA enthält, die für die konstanten Regionen von menschlichen Immunoglobulinen codiert, Transformieren von Eukaryontenzellen mit diesem Vektor bzw. diesen Vektoren, so wie Expression und Isolation des Antikörpers.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem einkettigen Anti-EGFR- Fv nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem ganzen Anti-EGFR- Antikörper nach Anspruch 5 oder 6.

10. Verwendung eines einkettigen Anti-EGFR-Fv nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines ganzen Anti-EGFR-Antikörpers nach einem der Ansprüche 5 oder 6 zur Herstellung eines Arzneistoffs gegen Tumore oder für ein diagnostisches Kit für die diagnostische Lokalisierung und Beurteilung des Tumorwachstums.