KR100376038B1 - 항-EGFR단일-사슬Fv및항-EGFR항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역된 포유동물의 세포, 바람직하게는 마우스의 세포로부터 제조된 파지-항체 라이브러리로부터 얻을 수 있는 신규한 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 및 단일-사슬 Fv(scFv) 에 관한 것이다. 파지-항체 라이브러리로부터 단리된 2 개의 단일-사슬 Fv를 유전공학적으로 처리하여 부분적으로 인간화된 완전한(whole) 항체 분자를 제조한다. 이와 같은 키메릭 항-EGFR 항체는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함하며, 단일-사슬 Fv 와 마찬가지로 인간 종양의 치료 및 진단을 위한 약제로서 사용할 수 있다.
Description
표피 성장 인자(EGF) 는 표피 세포 및 상피 세포를 유사분열촉진시키는 폴리펩티드 호르몬이다. EGF 는 감응 세포와 상호작용을 할 때 막 수용체(EGFR) 에 결합한다. EGFR 은 약 170 kD 의 막투과 당단백질이며 c-erb-B 원시발암유전자의 유전자 산물이다.
MAb 425 는 잘 알려진 인간 A431 암종 세포주(ATCC CRL 1555)에 대해 형성된 쥐의 단일클론 항체이며, 인간 EGFR 의 외부 도메인의 폴리펩티드 에피토프에 결합하고, EGF 의 결합을 억제한다. MAb 425(ATCC HB 9529) 는 시험관내 종양 세포독성을 매개하고 시험관내에서 유표피 및 결장직장 암종-유래 세포주의 종양 세포 성장을 억제하는 것으로 밝혀겼다(Rodeck 등, Cancer Res. 1987. 47: 3692) MAb 425 의 인간화 및 키메릭 형은 WO92/15683 에 개시되어 있다.
최근에는 작용성 항체 단편을 이 콜라이(E. coli)와 같은 원핵 숙주 세포에서 생산할 수 있는 방법이 제시되었다(Skerra & Pluckthun,Science1998. 240: 1038; Better 등,Science1988. 240: 1041). 이들 방범은 Fv 단편 및 Fab 단편을 포함하며, Fv 단편이 특히 중요하다. 단일-사슬 Fv(이때, VL및 VH사슬은 서로 결합되어 있다)도 제시되어 있다(Bird 등,Science1988. 242: 423: Huston 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA1988. 85: 5879).
파지-항체 라이브러리는 면역된 동물로부터 항체를 단리함에 있어 하이브리도마 기술의 대체 기술을 제공한다. 하이브리도마 기술은 항체를 생성하는 세포를 불멸화시킴으로써 이루어진다. 파지-항체 기술은 항체를 암호화하는 유전자를 불멸화시킴으로써 이루어진다(Winter, G. & Milstein, C.,Nature1991. 349: 293), 파지-항체 기술에서는 항체 H 사슬 가변 영역(VH) 및 L 사슬 가변 영역(VL) 유전자를 PCR 증폭하고, 가변 영역을 임의로 결합시켜 파지 입자의 표면상에서 항체 단편으로서 발현시키고, 해당 항원과 결합하는 항체에 대해 파지 항체의 라이브러리를 스크리닝한다.
하이브리도마 기술은 마우스 비장에서 강한 면역 반응이 일어날 수 있을 때 마우스 단일클론 항체를 단리하는데 매우 성공적이다. 예컨대, 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 에 대한 마우스 MAb 는 인간 A431 종양 세포의 복강내투여로 면역된 마우스의 비장으로부터 단리하였다(Murthy 등,Arch. Biochem. Biophys. 1987 252. 549). 하이브리도마 기술에 비해 파지-항체 기술의 강력한 장점은 사실상 어떠한 항체-발현 세포원도 출발 물질로서 사용할 수 있으며 많은 수의 상이한 항체들을 빠르게 스크리닝할 수 있다는 점이다. 파지-항체 기술의 다른 장점은 해당 항체의 가변 영역을 암호화하는 유전자가 이미 클로닝되어 있으며 다른 유전공학적 용도로 바로 사용할 수 있다는 점이다.
다른 한 보고서에서는 파지-항체 라이브러리로부터 단리된 항파상풍 유독소 Fab 단편이 완전한 항체 분자로 전환됨을 보고하고 있다(Bender 등,Hum. Antibod. Hybridomas1993. 4: 74).
지난 수십년동안, 인간 및 쥐의 전신계로부터의 매우 다양한 항원에 대한 단일클론 항체(mAb)를 생성시키기 위해 면역을 활성화시키기 위한 대체 기술로서 시험관내 면역이 이용되어 왔다(예컨대, Vaux, D.J.T., Helenius, A. & Mellman, I.,Nature, 1988. 336: 36; Gathuru,J. K.등, J. Immunol. Methods, 1991. 137: 95; Borrebaeck, C. A. K.,Immunol. Today, 1988. 9: 355). 이 기술의 장점은 단지 소량의 항원만이 필요하며 인간 하이브리도마를 생성하는데 이용할 수 있다는 점이다. 그러나, 시험관내 면역후 인간 임파구를 불멸화시키기가 어렵고 낮은 친화성의 IgM 항체가 생성된다는 점이 이 기술과 관련된 지속적인 문제점이 되고 있다.
항체를 얻는 새로운 방법은 H(VH) 및 L(VL) 사슬 가변 영역 유전자를 PCR 증폭한 다음 임의로 재조합시키고 파지 표출 라이브러리(7-9)로서 발현시키는 방법이다. 항체 가변 영역 유전자를 클로닝하고 단일-사슬 Fv (scFv)(10)로서 작은 피복 단백질(유전자 3)에 융합시킨다. 파지 입자는 항체 단편을 그의 표면상에 나타내며 항체 결합성을 이용한 팬닝(panning)에 의하여 선별할 수 있다. 이 기술은 V 유전자의 임의 재조합이 자연적 방법으로는 선별될 수 없는 새로운 특이성과 친화성을 갖는 신규의 쌍을 생성할 수 있다는 장점을 가진다. 더욱이, 이와 같은 방법은 쥐 또는 인간으로부터의 시험관내 면역된 임파구 또는 순수한 임파구를 이용할수 있다.
시험관내 면역 및 하이브리도마 기술에서 쥐의 B 세포에 의해 EGFR 에 대한 mAB를 얻으려는 이전의 방법은 낮은 친화성, 교차 반응성의 항체를 야기한다. 이와같은 단점을 극복하기 위하여 시험관내 면역 후, PCR 클로닝 기술의 조합을 실시하였다.
그러므로, 본 발명의 목적은 EGFR-수용체에 높은 친화성을 가지는, 상기 및 하기의 바람직한 공정에 의하여 얻어질 수 있는 항체 및 항체 단편을 개발하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 3 개의 다른 파지-항체 라이브러리로부터 단리된 마우스 항-EGFR 항체를 표준 하이브리도마 기술로 단리된 마우스 MAb(425) 와 비교한다(Murtliy 등,Arch. Biochem. Biophys. 1987. 252: 549; Kettleborough 등,Protein Eng. 1991. 4: 773) 라이브러리는 면역된 마우스의 비장뿐만 아니라 면역된 마우스에서 유출된 임파절 및 시험관내 먼역된 마우스 세포로부터 제조하였다. 라이브러리로부터 단리된 2 개의 단일-사슬 Fv(scFv)를 유전공학적으로 처리하여 인간 불별영역에 결합된 마우스 가변 영역을 갖는 키메릭 완전 항체 분자를 형성하였다.
구체적으로, 본 발명은 면역된 포유동물, 바람직하게는 마우스에서 유출된 임파절 세포 또는 비장 세포, 또는 시험관내 면역된 세포로부터 형성된 파지-항체 라이브러리로부터 얻을 수 있는 항-EGFR 단일-사슬 Fv 에 관한 것이다. 주로, 본 발명은 scFv 에 한정되는 것이 아니라 Fab 또는 F(ab')2와 같은 다른 항-EGFR 항체 단편에까지 적용된다.
본 발명에 따른 일부 scFv 는 정확하게 한정된 DNA 및 아미노산 서열을 가진다. 그러므로, 본 발명의 다른 목적은 H 및 L 사슬의 가변 영역이 하기 서열목록의 서열번호: 1 내지 32, 바람직하게는 제 5 도 내지 제 8 도에 주어진 H 및 L 사슬로부터 선택된 DNA 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 단일-사슬 Fv 단편을 제공하는 것이다.
대부분의 경우 완전한 기능을 가지는 완전한 항체만이 진단 및 치료용으로 사용될 수 있기 때문에 인간 면역글로불린의 불변 영역과 단일-사슬 Fv 로부터의 가변 영역을 연결하여 완전하게 또는 부분적으로 인간화된 항-EGFR 항체를 형성하는 것이 본 발명의 관심사이다.
그러므로, 본 발명의 목적은 상기, 하기 또는 특허 청구 범위에서 정의되는 바와 같이 항체 단편으로부터 유래된 DNA 서열 및 인간 면역글로불린의 불변 영역으로부터 유래된 DNA 서열로부터 형성된 완전한 항-EGFR 항체(바람직한 구체예로서, H 사슬은 감마-1 사슬의 아미노산 서열을 포함하고, L 사슬은 카파 사슬의 아미노산 서열을 포함한다)를 제공하는 것이다.
본 발명에 따라서, 항-EGFR scFv 는 파지-항체 라이브러리 기술을 이용하여 단리한다. 그러므로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항-EGFR 단일-사슬 Fv의 제조 방법에 관한 것이다:
(i) 면역된 포유동물 세포, 바람직하게는 마우스 세포로부터 RNA를 단리하는 단계;
(ii) 제 1 가닥 cDNA를 합성하는 단계;
(iii) 면역된 세포로부터의 cDNA에서 VH및 VR유전자를 증폭하는 단계;
(iv) 적당한 제한 부위와 함께 상기 유전자를 파지미드 벡터에 클로닝하는 단계;
(v) 연결 혼합물로 원핵 세포를 형질전화시키는 단계;
(vi) 정제된 EGFR을 이용하이 EGFR을 지향하는 파지 항체에 대해 파지 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및
(vii) 원핵 숙주 세포, 바람직하게는 이 콜라이에서 원하는 단일-사슬 Fv를 생산하는 단계.
다른 한편으로, 본 발명의 목적은 특허 청구 범위에 정의된 바와 같거나 또는 상기한 바와 같이 생산된 항-EGFR 항체 단편의 가변 영역을 암호화하는 DNA를, 인간 면역글로불린의 불변 영역을 암호화하는 게놈 DNA를 함유하는 1개 이상의 진핵 세포 발현 벡터에 클로닝하고, 진력 세포를 상기 벡터로 형질전환시키고, 항체를 발현시키고 단리함으로써 완전한 항-EGFR 항체를 제조하는 방법을 개시하는 것이다.
항-EGFR scFv 및 무엇보다도 완전한 항-EGFR 항체는 인간 종양의 진단 및 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기한 바와 같거나 또는 특허 청구범위에 정의한 바와 같은 완전한 항-EGFR 항체 또는 항-EGFR 단일 사슬 Fv를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 장점 및 목적은 하기와 같이 요약할 수 있다.
신규한 마우스 항-EGFR 항체를 파지-항체 라이브러리로부터 단리하였다. 신규한 항체는 최소한 4 개의 상이한 VH하위군 및 4 개의 상이한 VK하위군을 나타냈다(Kabat 등 Sequences of proteins of immunological interest. 5th Eds., U. S. Dept. of Health & Human Services, Bethesda 1991). 이들은 하이브리도마 기술을 이용하여 단리한 마우스 MAb 에 의해 사용된 서열 및 쌍과는 다른 서열 및 쌍을 나타냈다. 마우스 425 MAb 는 파지 항체에서는 관찰되지 않는 VH2b 및 VK4 쌍을 갖는다. scFv L13 11D 의 VH는 425 VH에 가장 높은 동질성 백분율을 가졌다(84.9%). 중요 차이는 CDR 에 있었다. scFv S4 2D 의 VK는 425 VK에 가장 높은 동질성 백분율을 가졌다(83.2%). 역시 주요 차이는 CDR, 특히 CDR3 에 있었다. 본 발명에서, 파지-항체 라이브러리로부터 다양한 신규 항-EGFR 항체를 단리하였으며, 이들 항체 모두는 425 MAb 에 의해 인식되는 에피토프와는 상이한 EGFR 상의 에피토프를 인식하는 2 이상의 scFv를 갖는다는 점에서 425 MAb 와는 다르다. 이는 조합적인 라이브러리로부터 단리된 항체가 하이브리도마 기술에 의해 단리된 항체와 매우 유사하다는 보고와는 상반된다(Caton & Koprowski,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. 87: 6450).
3 개의 파지-항체 라이브러리중에서, 높은 친화성 항체를 얻기 위하여 필요한 선별 단계의 수 및 단리된 높은 친화성 항체의 다양성의 관점에서 가장 좋은 라이브러리는 유출되는 임파절로부터 생성된 라이브러리이다. 임파절은 2 가지 이유에서 파지-항체 라이브러리의 구성을 위한 RNA 원으로서 선택하였다. 첫 번째, 이전의 연구에서 복강을 통한 면역후 비장으로부터 얻어지는 것보다 다리를 통한 면역후 슬와부 임파절로부터 높은 친화성 IgG 항체를 생성하는 B 세포가 높은 비율로 얻어짐이 밝혀졌다(Venn & Dresser,J. Immunol. Methods1987. 102: 95) 두 번째, 유출되는 임파절은 인간 항-종양 항체를 단리할 수 있는 좋은 출처원으로 여겨진다. 따라서, 다리-면역된 마우스의 슬와부 임파절로부터 인간 항-EGFR 항체를 단리하느 것이 유방암 환자의 보조 임파절로부터 인간 항-EGFR 항체를 단리하는 것의 모델이 되고 있다. 소량의 임파절 물질로부터 좋은 크기의 라이브러리를 제조할 수 있으며, 이 라이브러리로부터 높은 친화성 항체를 단리할 수 있음이 입증되었다.
마우스 항-EGFR 항체가 3 개의 모든 파지-항체 라이브러리로부터 단리되었지만, 이렇게 새로이 단리된 항체가 하이브리도마 기술을 이용하여 단리된 마우스 425 MAb 보다 모두 더 높은 친화성을 가짐은 분명하지 않다. 첫 번째 분석에서, 파지-항체 유래 scFv 는 425 MAb로부터 제조된 scFv 보다 EGFR 에 더 잘 결합하는 것으로 보인다(제 2 도). 키메릭 완전 항체 분자로 실시한 다른 실험에서, 키메릭 항체중의 하나(S4 2D) 는 키메릭 425 항체의 친화성에 버금가는 EGFR 에 대한 친화성을 나타냈다. 제 2 키메릭 항체(L3 11D) 는 키메릭 425 항체의 친화성보다 4 배 낮은 친화성을 가졌다(제 4 도). scFv를 이온하여 얻어진 결합 자료는 scFv 의 제조물이 단량체 및 이량체의 혼합물을 함유할 수 있기 때문에 잘못되어질 수 있다(Griffiths 등,EMBO J. 1993. 12: 725). 이와 대조적으로 키메릭 IgG 항체는 이량체를 형성하지 않는 것으로 예상되며, 키메릭 L3 11D 및 S4 2D 항체는 2가의 단량체 키메릭 IgG 항체에 대해 예상되는 크기인 것으로 밝혀졌다. 그러나, scFv425, L3 11D, 및 S4 2D 의 친화성-정제 제조물의 분석 결과는 이들 scFv 제조물이 단량체, 이량체 및 기타 다량체 형태를 함유하는 것으로 밝히고 있다. 또한 단량체 및 다량체 형태의 상대적 비율은 각 scFv 에 대해 다양하였다. 425 scFv 는 이량체 형태를 가장 낮은 백분율로 가졌다. 에상한 바와 같이, 이량체 및 특히 더 큰 다량체 형태는 단량체 형태보다 정제된 EGER 에 더 강한 결합성을 나타낸다. 425 scFv 는 일부 새로이 단리된 scFv 보다 이량화하는 경향이 더 약한 것으로 보인다.
파지 입자의 표면상에 항체 단편을 발현시키는 것이 원하는 특이성을 가지는 항체를 신속하게 선별하는 강력한 방법의 기초를 형성할 지라도 파지 항체 또는 항체 단편 자체(scFv 또는 Fab) 는 둘다 원하는 최종 산물인 것 같지는 않다. 또한 파지 라이브러리로부터 단리된 마우스 scFv 가 완전 항체 분자로 용이하게 전환되는 방식이 밝혀졌다. 이 경우, 마우스 가변 영역은 인간 불변 영역에 결합하여 부분적으로 인간화된 키메릭 항체를 형성하였다.
이러한 결과들은 면역된 마우스로부터 다양한 항-EGFR 항체 단편을 단리하는데 파지-항체 기술을 이용할 수 있음을 나타낸다. 그다음 원하는 불변 영역을 가지는 완전 항체 분자를 항체 단편으로부터 제조할 수 있다. 일부 경우, 하이브리도마 기술은 여전히 마우스로부터 단일클론 항체를 단리하기 위해 선택할 수 있는 방법일 수 있다. 면역원성이 강한 항원을 이용할 수 있고 하나 또는 적은 수의 상이한 항-항원 항체를 생산하는 적은 수의 하이브리도마 세포주가 바람직할 경우에는 파지-항체 기술을 고려할 이유는 거의 없을 것이다. 그러나, 다리 주사와 같은 특별한 면역 절차가 높은 친화성 항체를 생성하는데 바람직하거나, 또는 항원상의 다양한 에피토프에 대한 많은 수의 항체가 필요하거나, 또는 매우 분별적이고 가능한 낮은 면역원성 에피토프에 대한 항체가 필요할 경우에는 파지-항체 기술 방법을 선택할 수 있다. 또한 항체의 유전공학적 처리가 에상될 경우 파지-항체 기술은 항체 유전자가 이미 클로닝되어 있다는 점에서 바람직하다.
미립자 항원에 의한 시험관내 면역과 PCR-클로닝 기술을 결합시킨 본 발명의 방법은 EGFR 과만 반응하고 다른 항원과는 교차 반응하지 않는 scFv 단편을 생성하였다. 본 명세서에 언급된 면역 절차는 수용성이 아닌 막 소포 제조물인 항원 전달, 및 FCS 가 없는 배지 자체에 좌우된다. 두 방법 모두는 항원을 항원-전달 세포에 이용가능하게 함으로써 시험관내 면역 효율을 증가시키는 수단으로서 보고되어 있다(예컨대, Brams, P. 등,J. Immunol. Methods, 1987, 98: 11).
MTC 로 얻어진 결과는 시험관내 면역 방법을 개선시키기 위해 림포카인 원으로서 MTC 상징액 사용을 제안하는 이전의 보고서와 일치한다(예컨대, Borrebaeck, C.A.K. & Moller, S.A.,J. Immuno., 1986. 136: 3710; Moller, S. A. & Borebaeck, C.A.K., Borreback, C.A.K. (Eds), In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Elsevjer Science Publishers B. V., Amsterdam 1988, p. 3). 막 소포 제조물은 많은 다른 항원 결정기가 이와 같은 소포에 존재하기 때문에 다중항원으로서 여겨져야 한다. 이러한 이유에서 이들은 특정 수준의 다중클론성 활성화를 유도하는 것으로 보인다. 본 발명자들은 항-EGFR 특이적 반응이 표준 다중클론성 활성자이후 얻어진 반응과는 명백히 다르기 때문에 이 사실은 배제하였다.
시험관내 면역후 B-세포를 불멸화시키는 대신에 된 발명자들은 항체 VH및 VL유전자를 불멸화시키는 분자 수준의 방법을 사용하였다. 이들 단일클론 항체단편은 박테리아에서 발현시키고 생산하였다. 파지 표출 시스템은 특이적 항원에 대한 항체 단편을 단리하는 강력한 방법이다. 항체 단편과 g3p 피복 단백질사이의 종결 코돈의 존재는 억제자 또는 비-억제자 균주를 이용하여 표면 표출과 가용성 scFv 단편으로서의 분비사이의 전화를 허용한다(Hoogenboom 등,Nucl. Acids Res1991. 19: 4133).
시험관내 항원 자극된 B-세포에서 mRNA 수준 및 특이적 반응의 증가에 기인하여, 시험관내 면역에 의해 항원에 높은 특이성을 가지는 항체 단편을 단리할 수 있다. 2회에 걸친 선별후 100%의 클론이 EGFR 결합에 양성이었다. 이와는 대조적으로 생체내 면역 방법으로부터 유래된 클론은 4회에 걸친 선별후에야 100% 양성이었다(Kettleborough, 등, EP 94104160 및Eur. J. Immunol. 1994. 24: 952).
순수한 항체 유전자로부터의 파지 표출 라이브러리를 이용함으로써 특이적 인간 항체 단편을 시험관내 면역후 또는 면역없이 제조할 수 있다. 항체 단편은 박테리아에서 직접적으로, 따라서 단순하고 신속하며 경제적인 방식으로 생산될 수 있다.
생물학적 물질 및 일반적 방법
본 명세서에서 언급되는 미생물, 세포주, 플라스미드, 파지미드, 프로모터, 내성 표지, 복제 개시점, 또는 기타 벡터의 단편은 상업적으로 구입할 수 있거나일반적으로 입수할 수 있다. 명세서에 다른 별도의 사항이 주어지지 않을 경우 이들은 예로서만 이용되고, 본 발명에 필수적이지는 않으며, 각각 다른 적당한 수단 및 생물학적 물질로 대체될 수 있다.
박테리아 숙주는 scFv 를 클로닝하고 scFv 단백질을 생산하는데 바람직하게 이용될 수 있다. 이들 숙주의 예로는 이 콜라이 또는 바실러스(Basillus) 등을 들 수 있다.
예컨대 COS, CHO 또는 효모와 같은 진핵 숙주도 본 발명에 따른 완전한 항-EGFR 항체를 생산하는데 바람직하다.
본 발명에 필수적인 기술은 하기 명세서에 상세하게 기술되어 있다. 상세하게 기술되지 않은 기타 기술은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 표준 공지 방법에 따르거나 언급한 참고 문헌 및 특허 출원 문헌 및 기타 표준 문헌에 상세하게 기술되어 있다.
본 발명은 면역된 포유동물, 바람직하게는 마우스의 세포로부터 제조된 파지-항체 라이브러리로부터 얻을 수 있는 신규한 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR)항체 및 항체 단편, 바람직하게는 단일-사슬 Fv(scFv) 에 관한 것이다. 파지-항체 라이브러리로부터 단리된 항체 단편을 유전공학적으로 처리하여 부분적으로 인간화된 완전한(whole) 항체 분자를 제조할 수 있다. 이들 키메릭 항-EGFR 항체는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함하며, 이들의 항체 단편과 마찬가지로 인간 종양의 진단 및 치료제로서 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 파지-항체 라이브러리가 표준 하이브리도마 기술에 비하여 면역된 포유동물로부터 항체를 단리하는 더욱 유용한 다른 한 방법임을 밝히고 있다.
더욱이, 본 발명은 흑색종, 신경교종 또는 암종 등의 종양을 치료하기 위한 상기 항체 또는 그의 단편을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한 상기 항체 또는 단편은 시험관내 또는 생체내에서 상기 종양의 위치를 파악하고 평가하는 진단용으로 사용될 수 있다.
본 명세서는 하기에서 정의하는 바와 같은 기술적 용어를 사용한다.
"FR"(골격 영역) 은 3개의 CDR(상보성 결정 영역)을 지지하는 L 사슬(lightchain) 또는 H 사슬(heavy chain) 가변 영역의 4 개의 소영역(subregion)을 의미한다.
"CDR"(상보성 결정 영역) 은 항원과의 직접적인 접촉에 주로 관여하는 루프 구조를 형성하고 고가변 서열을 갖는 L 또는 H 사슬 가변 영역의 3 개 소영역을 의미한다.
"키메릭" 또는 부분적으로 인간화된 항체는 비-인간, 예컨대 마우스로부터 유래한 가변 영역(CDR 포함) 과 인간으로부터 유래한 불변 영역을 포함하는 항체를 의미한다.
"인간화" 또는 완전하게 인간화된 항체는 CDR 이 비-인간으로부터 유래한것을 제외하고는 인간으로부터 유래한 FR 및 불변 영역을 포함하는 항체를 의미한다.
"EGF" 및 "EGFR" 은 표피 성장 인자 및 그의 수용체를 의미한다.
"PCR"은 중합효소 연쇄 반응을 의미한다.
"scFv" 는 항체 단편인 단일-사슬 Fv 를 의미한다.
"VL" 은 L 사슬 가변 영역을 의미한다.
"VK" 는 카파 L 사슬 가변 영역을 의미한다.
"VH" 는 H 사슬 가변 영역을 의미한다.
PBS 는 포스페이트 완충된 식염수를 의미한다.
FCS 는 소 태아 혈청을 의미한다.
HBSS 는 한스(Hanks) 평형 염 용액을 의미한다.
FITC 는 플루오레세인이소티오시아네이트를 의미한다.
MTC 는 혼합된 흉선 세포 배양물을 의미한다.
제 1 도, 파지-항체 라이브러리로부터 단리된 scFv의 아미노산 서열. (A) 임파절 라이브러리로부터의 scFv (B) 비장 라이브러리로부터의 scFv 상보성 결정영역(CDR) 및 골격 영역(FR)이 표시되어 있음.
제 2 도. EGFR 에의 scFv 의 결합. 박테리아 상징액중의 scFv 의 농도를 평가하고 scFv를 정제된 EGFR 에의 결합에 대해 ELISA 로 시험하였다 (A) 임파절 라이브러리로부터의 scFv. (B) 비장 라이브러리로부터의 scFv. P1(양성 대조군)은 MAB 425 로부터 유래된 scFv 이다. L1 및 S1(음성 대조군)은 예비-선별된 임파절 및 비장 라이브러리로부터의 비결합성 scFv이다.
제 3 도. 포유동물 세포에서 발현시키기 위해 가변 영역을 재구성하는데 사용된 중간 벡터. (A) VH벡터. (B) VK벡터
제 4 도. 키메릭 완전 항체의 EGFR 에의 결합. COS 세포 상징액중의 항체의 농도는 ELISA 로 측정하였고 항체는 정제된 EGFR 에의 결합에 대해 ELISA로 시험하였다.
제 5 도. scFv No. L2 11C 의 DNA 및 아미노산 서열. (A): L 사슬; (B)H 사슬.
아미노산 위치:
제 6 도. scFv No. L2 12B 의 DNA 및 아미노산 서열. (A): L 사슬; (B)H 사슬
아미노산 위치:
제 7 도. scFv No. L3 11D 의 DNA 및 아미노산 서열 (A): L 사슬; (B) H 사슬
FR 및 CDR 의 아미노산 위치는 제 6 도에 주어진 서열에 상응한다.
제 8 도. scFv No. S4 2D 의 DNA 및 아미노산 서열. (A): L 사슬; (B) H 사슬.
아미노산 위치:
제 5 도 내지 제 8 도의 서열은 또한 본 발명의 일부인 하기 첨부된 서열목록으로도 제공된다.
(1) 파지-항체 라이브러리의 제조 및 스크리닝
3 개의 파지-항체 라이브러리를 제조하였다: 하나는 인간 암종 세포주 A431로 면역된 마우스의 비장으로(8.8 × 105), 다른 하나는 정제된 EGFR 로 다리에 면역된 마우스의 슬와브 임파절로부터(6.5 k 106), 그리고 또 다른 하나는 A43l 소포로 시험관내 면역된 마우스 임파구로부터(1.1 × 105)(시험관내 면역 및 A431 소포의 제조에 대한 상세한 사항은 하기 실시예 1 및 2에 개시되어 있다). 선별하기전에, 각 라이브러리로부터 46 개 이상의 클론을 BstN1 핑거프린팅(fingerprinting; Clackson 등,Nature1991 352: 624)으로 분석하여 다양한 정보를 결정하였다. 광범위한 범위의 분해 패턴을 관찰하였다. 또한 선별하기 진에 각 라이브러리의 96개의 클론으로확터의 scFv 를 EGFR 에의 결합에 대해 ELISA 로 시험하였다. 비장 및 임파적 라이브러리로부터의 scFv 는 EGFR 에 결합하지 않았다. 시험관내 면역화 라이브러리로부터의 scFv 중의 하나가 EGER 에 결합하였다 EGFR-피복된 면역시험관을 이용한 제 1 회 선별후 EGFR-결합 scFv의 맑은 밀집군이 임파절 라이브러리 및 시험관내 면역화 라이브러리로부터 관찰되었다. 제 2 회 선별은 EGFR-결합 scFv 가 비장 라이브러리로부터 검출되기 전에 실시하였다. 제 3 회 선별에 의하여 임파절 및 시험관내 면역화 라이브러리로부터의 대부분의 scFv 는 EGFR 에의 결합에 양성이었다. 비장 라이브러리로 제 4 회 선별후, 대부분의 scFv는 EGFR 에의 결합에 양성이었다(하기 표 1).
표 1. 각 회의 선별후 EGFR-결합 클론의 백분율
(2) EGFR-결합 클론의 서열 분석
매 회의 선별후, EGFR-결합 클론으로부터의 scFv 삽입체를 BstNI핑거프린팅(Clackson 등,Nature1991. 352: 624) 으로 분석하였다. 특정 분해 패턴에 대한 밀집군이 존재함이 명백하였다. VH및 VK의 DNA 서열을 결정하기 위해 다른 BstNI 핑거프린트를 갖는 클론을 임파절 라이브러리의 제 2 및 제 3 회 선별 및 비장 라이브러리의 제 3 및 제 4 회 선별로부터 선택하였다. 높은 친화성 항체는 나중의 선별에 존재하는 것으로 예상되기 때문에 나중의 선별로부터 수득된 클론을 분석하였다(Clackson 등,Nature1991. 352: 624).
임파절 라이브러리로부터 16 개 클론의 서열을 분석하고 6 개의 다른 scFv 를 얻었다(제 1 도). 이들중 5 개가 독특한 VH및 VK의 쌍이었다. 나머지 6 번째는 6 개의 아미노산이 변화된, 이전에 발생한 VH의 변형체이었으며, 6 개의 아미노산중 5 개의 아미노산은 골격 영역(FR) 1 에 존재하였다. 이들 변화중의 2 개는 퇴화 VH1BACKSFI 프라이머의 이용에 기여할 수 있다(Hoogenboom 등,Nncl. Actds Res. 1991 19: 4133). 나머지는 PCR 실수의 결과일 수 있다. VH는 2 개의 하위군인 VH2b 및 VH3d 로 분류되었으며, VK는 4 개의 하위군인 VK3, VK4, VK5 및 VK6 으로 분류되었다(Kabat 등, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Eds., U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda 1991). 비장 라이브러리로부터의 10 개의 개별 클론의 서열을 분석하고 4 개의 상이한 scFv를 발견하였다. 이들중의 3 개가 독특한 VH및 VK의 쌍이었으며, 4 번째는 단지 VH에서 2 개의 아미노산이 다르고(이들 2 개의 아미노산중의 1 개는 상보성 결정영역(CDR) 2 에 존재하였다), VK에서 2 개의 아미노산이 다른, 이전의 쌍중의 1 개와 유사하였다. 하위군의 분류 결과, VH는 하위군 VH2a, VH2C 및 VH3d로, 그리고 VK는 하위군 VK3 및 VK4 로 밝혀겼다. 임파절 및 비장 라이브러리로부터 얻어진 scFv 의 비교 결과는 두 라이브러리에 오직 1 개의 공통적인 scFv, 즉 scFv L3 10A/scFv S4 10H 가 존재함을 밝히고 있다(제 1 도). 이 클론은 ELISA 로 시험할 경우 EGFR 에 강하게 결합하는 것으로 보였다. 라이브러리 사이의 교차 오염을 제거하기 위하여 신중을 기하였지만 강한 결합성 EGFR 클론에 의한 약간의 오염을 배제하기는 어렵다. 그러나 Balb/c 마우스의 고유한 성징을 고려하여 동일한 scFv 가 2 개의 다른 라이브러리로부터 독립적으로 존재할 수 있다.
(3) EGFR 에의 결합의 특이성 및 친화성 분석
DNA 서열의 다양성 및 항원에의 우수한 결합성에 기초하여, 임파절 및 비장라이브러리로부터 유래된 몇가지 scFv를 선택하여 더욱 분석하였다. 이들 scFv를 정제된 EGFR 에의 결합, 부적절한 항원에의 결합 및 EGFR를 발현하거나 발현하지 않는 종양 세포주에의 결합에 대해 ELISA 로 분석하였다. 양성 대조군으로서, scFv를 마우스 425 MAb(P1) 으로부터 제조하였다. 음성 대조군으로서, 선별전에 임파절 및 비장 라이브러리로부터 단리된 파지 항체로부터 scFv를 제조하였다(각각 L1 및 S1). scFv 의 농도는 시험될 scFv 의 희석액을 웨스턴 블롯중의 공지 농도의 정제된 scFv 희석액과 비교함으로써 결정하였다.
scFv를 정제된 EGFR 에의 결합에 대해 ELISA 로 시험하고 그 결과를 그래프로 나타냈다(제 2 도). scFv를 EGFR 에의 결합에 관하여 순위를 정할 수 있었다. 실험사이에 3 개의 순위가 재현성있게 형성되었다. EGFR 에 가장 강하게 결합한 scFv 는 임파절 라이브러리로부터의 L2 1C 및 L3 10A 및 비장 라이브러리로부터의 S4 10H 이었다. 상기한 바와 같이, scFv L3 10A 및 S4 10H 는 동일한 DNA 서열을 가진다. VH에 2 개의 아미노산 변화 및 VK에 2 개의 아미노산 변화가 있는, scFV S4 10H 에 매우 유사한 scFv (S4 5A) 는 SA 10H 보다 낮은 순위를 꾸준하게 나타내있다. 이와 대조적으로, L2 12B와 L3 11D 사이에 관찰된 서열의 차이는 결합에 깊은 영향을 미치는 것 같지는 않았다. 단리된 scFv 중에 단지 2개, L2 8C 및 L2 11C 만이 scFv 425 보다 약하게 결합하는 것으로 보였다.
scFv를 플라스틱에의 결합 및 무관한 단백질(난알부민(OVA), 달걀 라이소자임, 치토크롬 c, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제, CBA 알부민 및 BSA)의 판넬에의 결합에 대해 ELISA 로 시험하였다. scFv 의 어느 것도 바탕 값보다 큰 신호를 나타내지 않았다.
scFv를 3 개의 종양 세포주에의 결합에 대해 ELISA 로 시험하였다. 세포주 A431 및 MDA MB 468 은 각각 외음부 및 유방으로부터 단리한 EGFR-함유 종양세포이다. 세포주 SK-MEL-23 은 강글리오사이드-함유 흑색종 세포주이고 음성 대조군으로서 포함하였다. 시험된 10 개의 scFv 중 단지 4 개만이 정제된 EGFR 및 EGFR-함유 종양 세포(L2 12B, L3 11D, L2 11C 및 S4 2D, 제 5 도 내지 제 8 도) 둘다에 결합하였다. SK-MEL-23 세포에의 결합은 관찰되지 않았다. 이러한 놀라운 사실을 뒷받침하기 위하여 일부 설명이 가능하다. 면역, 선별 및 ELISA 에 사용된 EGFR 은 분비된 EGFR-관련 단백질이었다고 설명할 수 있다(Weber 등,Science1984, 224: 294). 이 단백질은 C-말단에 부가적인 17 개의 아미노산을 가진다(Gunther 등,J. Biof. Chem. 1990. 265: 22082). scFv를 이들 17 개 아미노산 펩티드에의 결합에 대해 ELISA 로 시험하였으나, 결합은 관찰되지 않았다. 분비된 EGFR-관련 단백질과 종양 세포 표면상의 EGFR 은 구조 또는 글리코실화에서 차이를 가길 수 있다.
종양 세포에의 결합을 좀 더 조사하기 위하여, 3 개의 scFv(L2 11A, L3 11D 및 S4 2D)를 정제하고 유동 세포측정계로 A431 종양 세포에의 결합에 대해 분석하였다. 425 scFv 는 양성 대조군으로 사용하였다. 사용된 3 개의 scFv 중에 단지 L3 11D 및 S4 2D 만이 A431 세포에 결합하였다. 이들 두 scFv 는 scFv 425 와 유사한 결합 프로필을 가졌다.
EGFR 및 EGFR-함유 종양 세포 둘다에 결합하는 두 단리물로부터 제조된 정제된 scFv(L3 11D 및 S4 2D)를 마우스 425 MAb와의 경쟁적 결합 분석에서 시험하였다. 정제된 scFv 425 는 일정한 농도 범위에 걸쳐서 마우스 425 MAb 가 EGFR 에 결합하는 것을 억제할 수 있는 반면, scFv L3 11D 및 S4 2D 는 이들 농도에서 마우스 425 MAb 가 EGFR 에 결합하는 것을 억제하지 않았다. 이들 두 scFv 는 마우스 425 MAb 에 의해 인식되는 것과는 다른 EGFR 상의 에피토프를 인식하는 것으로 보인다.
(4) scFv 로부터 유래된 키메릭 완전 항체
완전 항체 분자로의 전환을 위하여 2 개의 scFv (L3 11D 및 S4 2D)를 선택하였다. 면역글로불린 선두 서열 및 스플라이스(splice) 공여 신호를 암호화하는 DNA서열을 포함하는 중간 벡터에 마우스 VH및 VK를 암호화하는 DNA를 클로닝하였다(제 3 도). VH중간 벡터에서 클로닝 부위의 존재는 VH의 제 1 잔기가 아스파트산에서 글루탐산으로 변하였음을 의미한다. 중간 벡터로부터, 선두 및 스플라이스 공여 서역에 결합된, VH및 VK를 포함하는 DNA 단편을 인간 감마-1 불변 영역 또는 인간 카파 불변 영역을 암호화하는 DNA를 함유하는 포유동물 세포 발현 벡터에 클로닝하였다(Maeda 등,Hum. Antibod. Hybriodomas1991. 2: 124). 각 키메릭 항체에 대하여, H 사슬 및 L 사슬 발현 벡터를 COS 세포에 동시형질감염시켰다. 양성 대조군으로서, 상기 세포를 또한 키메릭 425 항체를 암호화하는 H 사슬 및 L 사슬 발현 벡터로 동시형질감염시켰다(Kettleborough 등,Protein Eng. 1991. 4: 773). 세포로부터 배지를 모으고 ELISA 로 분석하여 존재하는 항체의 농도 및 항체가 EGFR 에 결합하는 능력을 측정하였다(제 4 도). 항원에의 최대 결합의 반 정도 결합하는데 필요한 항체 농도를 비교할 경우, 키메릭 S4 2D 항체는 키메릭 425 항체와 마찬가지로 EGFR 에 동일하게 결합하였다. 그러나 키메릭 L3 11D 항체는 키메릭 425 항체보다 거의 4 배정도 낮게 EGFR 에 결합하였다. 키메릭 425 항체의 친화성(Kettleborough 등Protein Eng. 1991 4: 773)은 경쟁 결합분석으로 측정하여 1.9 x 108M-1 이었다. scFv를 분석하는 이전의 자료는 scFv S4 2D 및 L3 11D 모두가 scFlr 425 보다 EGFR 에 더 잘 결합하는 것으로 나타났기 때문에 이러한 결과는 놀라운 사실이다(제 2 도). 키메릭 L3 11D 및 S4 2D 항체의 단백질 A-정제된 시료를 환원 및 비-환원 조건하에서 SDS-PAGE 로 분석하였다. 키메릭 L3 11D 및 S42D 항체를 또한 A431 및 SK-MEL-23 세포에의 결합에 대해 유동 세포계측기로 시험하였다. 두 키메릭 항체는 모두 EGFR-발현 A431 세포에 잘 결합하였으나 EGFR-음성 SK-MEL-23 세포에는 결합하지 않았다.
(5) 치료 및 진단 용도
본 발명에 따른 항체 단편 및 완전한 항체는 치료를 위하여 환자에 투여할 수 있다. 그러므로 본 발명의 목적은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 하기 특허 청구 범위 및 상기에서 정의되는 바와 같은 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 활성 성분으로서 포함하는 약제를 제공하는 것이다.
전형적으로 본 발명의 항체는 정맥내 주사되거나 또는 비경구 투여될 수 있다. 일반적으로, 항체 단편의 투여량 범위는 원하는 종양 억제 및 종양 용해 효과를 나타내기에 충분히 크다. 투여량은 환자의 질환의 정도, 연령, 상태 및 성별에 좌우되며 1 일 또는 수일동안 매일 1 회 또는 그 이상으로 0.1 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 투여량 범위로 다양하게 투여될 수 있다.
비경구 투여 제제는 멸균 수용액 또는 멸균 비-수용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르 및 이와 같은 목적에 적합한 공지의 기타 용매 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체는 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 사용될 수 있다. 이와 같은 적당한 담체의 예로는 식염수, PBS, 링거액, 또는 락테이트화 링거액 등을 들 수 있다. 항생제,산화 방지제 및 킬레이팅제와 같은 기타 첨가제 및 보존제도 약제에 함유될 수 있다.
항체(단편) 는 또한 이들의 세포독성을 뒷받침하기 위하여 공지 방법에 따라 IL-2 와 같은 사이토킨에 정합시킬 수 있다. 본 발명의 약제는 순환계 종양 및 충실성 종양뿐만 아니라 흑색종, 신경교종 및 암종을 포함한 모든 종류의 종양의 치료에 적합하다.
진단용으로 항체는, 예컨대 방사성 불투명 염료에 접합되거나 또는 방사표지될 수 있다. 바람직한 표지화 방법은 요오드겐 방법이다. 바람직하게는 항체는 진단용으로 F(ab')2또는 scFv 단편으로 투여될 것이다. 이는 우수한 결과를 제공하여 바탕값 공제를 불필요하게 한다.
실시예 1: A431 소포
일부 수정을 가하여 문헌(Cohen 등,J. Biol. Chem. 1982. 257: 1523; Yeaton 등,J. Biol. Chem. 1983. 258: 9254)에서 기술된 바와 같이 쉐드(shed) 막 소포 제제를 얻었다. A431 세포를 함유하는 밀집 배양된 플라스크를 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 PBS 로 세척하였다. 저삼투압성 PBS를 첨가하고 플라스크를 15 분동안 진탕시켰다. 그다음 세포를 소포화 완출액(100 mM NaCl, 50 mM Na2HPO4, 5 mMKCl, 0.5 mM MgSO2, pH 8.5)으로 세척하였다. 소포화 완충액을 첨가하고 플라스크를 실온, 37℃에서 교반하에 유지하였다. 그다음 완충액을 금속 스크린을 통하여 얼음중의 50 ㎖ 시험관으로 경사제거하고 4℃, 150 x g에서 5 분동안 원심분리하였다. 펠렛(pellet)을 버리고 상징액을 39,000 rpm에서 90 분동안 초원심분리하였다. 최종 펠렛을 10 mM Hepes 완충액(pH 7.4)에서 재현탁시켰다. 소포로부터 EGFR을 분석하기 위하여 시료를 에탄올 9 체적으로 침전시키고 0.08 M Tris, pH 6.8 로 재힌탁시킨 다음 SDS-PAGE를 MAb 425를 표준물질로 하여 실시하였다.
제제중의 단백질의 함량은 BSA를 표준물질로 이용하는 변형된 코마씨 플러스(Coomassie Plus) 방법으로 정량하고 595 nm에서 측정하였다. 소포로부터의 EGFR을 분석하기 위하여, 시료를 에탄올 9 체적으로 침전시켰다(4 ℃에서 하룻밤동안). 펠렛을 트리스(0.08 M, pM 6.8)로 재현탁시킨 다음 SDS-PAGE를 실시하였다(5% 정지 겔; 1 시간, 35 mA; 10% 진행 겔; 2.5 시간, 40 mA). 시료 및 표준물질은 이중으로 준비하였다. 이들중의 하나는 코마씨 블루로 염색하고 다른 하나는 니트로셀룰로스 시이트(12 V; 4℃에서 16 시간) 상에 블롯팅하고 알칼리 포스포파타제에 결합된 항-마우스 IgG 항체, 및 마우스 mAb 425(항-EGFR) 로 처리하였다.
3 개의 배지를 시험관내 면역에 사용하였다. 배지-1(M1), 배지-2(M2) 및 혼합된 흉선 세포 배양 배지(MTC). M1 은 50 mM 2-메르캅토에탄올 및 2 mM L-글루타민(Gibco)이 보충된 HL1(Ventrex Laboratories, USA) 로 이루어진다. M2는 50 mM 2-메르캅토에탄올, 40 U/㎖ IL-2(Genzyme), 20 mg/㎖ 보조 펩티드(AdjuvantPeptide; Sigma), 2 mM L-글루타민, 100 U/mg 페니실린(Gibco), 100 mg/㎖ 스트렙토마이신(Gibco) 이 보충된 HL1 으로 이루어진다. 4% 또는 20% FCS(Biological Industries)를 M2 에 첨가하였다. MTC 는 Vaux 등의 문헌에서(1)에 기술한 바와 같이 제조하였다. 멸균 50-메쉬 스크린을 통하여 흉선을 눌러 3주된 Balb/c 및 C57/BL-1 마우스의 흉선 단일 세포 현탁액을 간단히 제조하였다. 세포 현탁액을 모으고, HBSS에서 2 회 세척하여 생존 세포의 수를 트립판 블루 배제법으로 측정하였다. 그다음 4% FCS, 2 mL L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 HL1 배피에서 1 ㎖ 당 각 균주의 2.5 × 106흉선 세포 밀도로 흉선 세포를 배양하었다. 48 시간 후, 상징액을 회수하고, 0.22 mm 필터로 여과하고 -70℃에서 저장하였다.
비-면역된 8주된 Balb/c 마우스로부터의 비장세포 현탁액을 흉선 세포에서와 같이 얻었다. 생존성은 트립판 블루 배제법으로 측정하였다.
실시예 2: 시험관내 면역 및 스크리닝
3 개의 배지를 시험관내 면역에 사용하였다: 배지-1(M1), 배지-2(M2) 및 혼합된 흉선 세포 배양 배지(MTC). M1 은 50 mM 2-메르캅토에탄올 및 2 mM L-글루타민(Gibco) 이 보충된 HL1(Ventrex Laboratories, USA) 로 이루어진다. M2는 50 mM 2-메르캅토에탄올, 40 U/㎖ IL-2(Genzyme), 20 mg/㎖ 보조 펩티드(Sigma), 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린(Gibco), 100 mg/㎖ 스트렙토마이신(Gibco) 이 보충된 HL1 으로 이루어진다. 4% 또는 20% FCS(Biological Industries)를 M2 에 첨가하였다. MTC 는 Vmux 등의 문헌에서 (1) 에 기술한 바와 같이 제조하였다. 멸균 50-메쉬 스크린을 통하여 흉선을 눌러 3주된 Balb/c 및 C57/BL-1 마우스의 흉선 단일 세포 현탁액을 간단히 제조하였다. 세포 현탁액을 모으고, HBSS에서 2 회 세척하여 생존 세포의 수를 트립판 블루 배제법으로 측정하였다. 그다음 4% FCS, 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 HL1 배지에서 1 ㎖ 당 각 균주의 2.5 x 106흉선 세포 밀도로 흉선 세포를 배양하였다. 48 시간 후, 상징액을 회수하고, 0.22 mm 필터로 여과하고 -70℃에서 저장하였다.
비-면역된 8주된 Balb/c 마우스로부터의 비장세포 현탁액을 흉선 세포에서와같이 얻었다. 생존성을 트립판 블루 배제법으로 측정하였다.
멸균 50-메쉬 스크린을 통하여 흉선을 눌러 3주된 Balb/c 및 C57/BL-1 마우스의 흉선 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 세포 현탁액을 모으고, HBSS 로 세척하여 생존 세포의 수를 트립판 블루 배제법으로 측정하였다. 그다음 4% FCS, 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 HL1 배지에서 1 ㎖ 당 각 균주의 2.5 x 106흉선 세포 밀도로 흉선 세포를 배양하였다. 48시간 후, 상징액을 회수하고, 여과하고 저장하였다. 비-면역된 8주된 Balb/c 마우스로부터의 비장세포 현탁액을 흉선 세포에서와 같이 얻었다. 생존성은 트립판 블루 배제법으로 측정하였다.
6-웰 플레이트(Costar)에서 시험관내 면역을 실시하였다. M1-배지(50μM 2-메르캅토에탄올 및 2 mM 4 L-글루타민(Gibco)이 보충된 HL1(Ventrex Laboratories,USA) 로 이루어짐) 3.5 ㎖ 에 107비장세포를 함유하는 웰을 원하는 농도의 EGFR 함유 소포와 함께 항온처리하였다(37℃, 5% CO2). EGFR을 발현하지 않는 세포 또는 PBS 를 대조 웰에 첨가하였다. 몇시간 후, 4% 또는 10% FCS(Biological Industries)를 함유하는 M2-배지(50μM 2-메르캅토에탄올, 40 U/㎖ IL-2(Genzyme), 20μg/㎖ 보조 펩티드(Sigma), 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린(Gibco), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(Gibco) 이 보충된 HL1 으로 이루어짐) 3.5 ㎖를 각 웰에 첨가하였다. 일부 실험에서 M2 는 보조 펩티드(20 ㎍/㎖) 및 IL-2(40 U/㎖) 가 보충된 MTC-배지(혼합된 흉선 세포 배양 때지; Vaux 등,Nature1988, 336: 36)로 대체하였다(배양액중의 FCS, IL2 보조 펩티드의 최종 농도가 50% 감소함을 주의한다). 세포를 72, 96, 120 또는 144 시간동안 동일한 조건하에서 배양하고 최종적으로 세포를 특정 면역글로불린의 존재에 대해 시험하거나 또는 RNA 단리를 위해 처리하였다.
스크리닝은 정제된 항원 또는 A431 고정된 세포로 실시하였다. 절차는 문헌(Carroll 등,Hybridoma1990. 9: 81)에 기술된 바와 근본적으로 동일하나 일부 변경되었다. 멸균 96-웰 플레이트(Nunc, Maxisorb)를 PBS 중에서 정제된 EGFR(2.5 ㎍/㎖), GD3강글리오사이드(2 ㎍/㎖) 또는 RNase(10 ㎍/㎖) 로 하룻밤동안 피복시켰다. A431 세포를 항원으로 사용할 경우, 세포가 밀집될 때까지 96-웰 플레이트에서 배양하고, 0.1% 글루타르알데하이드로 고정시켰다. 시험관내 면역된 임파구를 세척하고 2% FCS 및 2 mM L-글루타민이 보충된 HL-1 배지에 5 × 105세포수/㎖ 로 재현탁시키고, 1 × 105세포를 각 웰에 첨가하고 48 시간동안 배양하였다(37℃, 5% CO2) 각 군에 대해 16 개의 동일물을 제조하여 시험하였다. 그다음 임파구를 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS 로 5 회 세척하여 제거하였다. 퍼옥시다제 표지된 토끼 항-마우스 면역글로불린(Dako)(1 시간, 37℃)을 이용하여 특정 면역글로불린을 검출하였다. 시트레이트-포스페이트 완충액(0.55 mg/㎖) 중의 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈-티아졸릴-6-설폰산)-디암모늄 염(ABTS)(Sigma)을 기질로 사용하였다.
실시예 3: 라이브러리 제조
A431 세포(Murthy 등, ArchBiochem, Biophys. 1987. 252: 549) 로 복강내 투여 면역된 마우스의 비장으로부터, 정제된 EGFR 로 다리에 면역된 마우스의 슬와부 임파절로부터 그리고 A431 소포로 시험관내 면역된 마우스 세포로부터 각각 제조된 RNA 로부터 3 개의 라이브러리를 제조하였다. 제 1 가닥 cDNA를 합성하였다. VH및 VK유전자를 PCR 증폭하고 조립하였다(Clackson 등,Nature1991. 352: 624), PCR을 이용하여, NotI 및 SfiI 제한 부위를 붙이고 scFv를 파지미드 벡터 pHEN1(Hoogenboom 등,Nucl. Acids Res. 1991, 19: 4133) 에 클로닝하였다. 연결 혼합물을 이 콜라이 세포에 일렉트로포레이션(electroporation)하고 생성된 콜로니를 배지에 분산시켜 라이브러리 스톡을 형성하였다(Marks 등,J. Mol. .Biol. 1991. 222: 581).
실시예 4: 라이브러리 스크리닝
M13K07 헬퍼 파지(Promega, Madison, WI)를 이용하여 라이브러리로부터 파지 항체를 구조하였다(Marks 등,J. Mol. Biol. 1991. 222: 581). 면역시험관(Nunc, Life Science, Paisley, UK)을 PBS에서 하룻밤동안 4 ㎖ 의 2.5 ㎍/㎖ EGFR로 피복시켰다. PBS 로 3 시간 세척한 후, 시험관을 2% 분말 우유를 함유하는 PBS(PBSM)에서 1 시간 이상 37℃에서 항온처리하였다. 파지 (102내지 103)를 4 ㎖ PBSM 에 재현탁시키고 실온에서 1 시간동안 EGFR-피복된 시험관에서 배양하였다. 시험관을 PBS 로 20 회, 0.1% 트윈 및 PBS 로 20 회 세척하였다. 결합된 파지를 말단 대 말단(end-over-end) 혼합으로 0.1 M 트리에틸아민 1 ㎖에서 10 분간 배양후 용출시켰다. 용출된 파지를 1 M 트리스-HCl, pH 7.5 0.5 ㎖를 첨가하여 중성화하고 이를 사용하여 대수기 이 콜라이 TG1 세포를 형질감감염시켰다. 형질감염된 세포를 도말하고 낮은 수준으로 scFv를 유도하는 개별 콜로니를 채취하였다. 나머지 콜로니를 배지에 분산시키고 분취량을 사용하여 다음 스크리닝을 위한 파지를 제조하였다.
실시예 5: scFv 생산 및 분석
가용성 scFv를 문헌(예컨대 Kettleborough 등, I. c.) 에 기술한 바와 같이 이콜라이 HB2151에서 생산하였다. 박테리아 상징액중의 scFv 농도를 공지된 농도의 정제된 scFv 제조물을 표준물질로 이용하여 평가하였다. 상징액을 여과하고 나트륨 아지드를 0.1% 로 첨가하였다. 상징액 및 표준물질의 일련의 희석액을 96-웰 복제 물을 이용하여 이보델론-PVDF 필터(Millipore, Watford, Uk) 상에 스폿팅(spotting하였다. 필터를 웨스턴 블롯에서와 같이 처리하였다(Towbin 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA1979. 76: 4350) scFv를 C-말단 택(tag)(Munro & Pelham,Cell1986, 46: 291) 에 대한 항체(9E10) 및 이어서 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG 및 IgM 항체(Jackson ImmunoResearch Lab Inc., West Grove, PA) 를 이용하여 검출하였다. 반응은 ECL 시스템(Amersham, Aylesbury, UK)을 이용하여 전개시켰다. 초기-플래쉬화(pre-flaslied) 방사선사진을 밀도측정계를 이용하여 스캐닝하였다. 표준 곡선을 그리고 이를 사용하여 상징백중의 scFv 의 농도를 평가하였다. 항원-결합 ELISA 는 EGFR-피복된 플레이트(2.5 ㎍/㎖) 로 실시하였다. scFv를 함유하는 상징액을 PBSM 에 희석하고 플레이트에 첨가하였다. 결합된 scFv를 상기한 바와같은 9E10 항체를 이용하여 검출하였다. 또한 상징액을 무관한 단백질 및 플라스틱의 판넬에의 결합에 대해 시험하였다. ELISA 플레이트를 난알부민, 달걀 라이소자임, 치토크롬 c, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제, 쥐 알부민(CBA 균주) 및 BSA 의 100 ㎍/㎖에서 하룻밤동안 피복시켰다. 2% 분말 우유를 함유하는 비희석된 상징액을 피복된 플레이트에 이중으로 첨가하고 결합된 scFv를 상기와 같이 검출하였다.
종양 세포주, A431(ATCC CRL 1555), MDA MB 468(ATCC HTB 132) 및 SK-MEL-23(음성 대조군) 을 이용하여 세포-결합 ELISA를 실시하였다. 세포를 폴리-D-라이신-처리된 96 웰 조직 배양 트레이(tray)(Nunc)에서 밀집화될 때까지 생육시켰다. 세포를 DMEM 으로 세척하고 2.5% BSA를 함유하는 PBS 로 37℃에서 2 시간동안 블로킹(blocking)시켰다. 공기를 통과시킨 후, 4% 분말 우유를 함유하는 2×YT 배지 동부피와 함께 각 웰에 상징액을 첨가하고 4℃에서 1 시간동안 항온처리하였다. 결합된 scFv를 상기한 바와 같이 검출하였다.
전제된 scFv (100 ㎍/㎖) 50㎕로 EGFR-피복된 ELISA 플레이트를 10 분동안 예비-항온처리함으로써 경쟁적 ELISA를 실시하였다. 그다음 3.13 내지 200 ng/㎖ 농도로 마우스 MAb 425(50 ㎕)를 첨가하였다. 항온처리 및 세척후, 결합된 마우스 MAb 425를 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG 및 IgM 항체를 이용하여 검출하였다.
실시예 6: DNA 분석
BstNI 핑거프린팅을 위하여, 개개 클론으로부터의 scFv 삽임체를 PCR 로 증폭하고 생성물을 BstNI 로 절단하였다(Clackson 등,Nature1991. 352: 624). DNA를 시쿼나게 킷트(Sequenase Kit, United States Biochemical, Cleveland, OH) 를 이용하여 서열을 분석하였다.
실시예 7: scFv 의 정제
박테리아 상징액을 원심분리하고 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후 시아노겐 브로마이드-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 에 커플링(coupling)된 정제된 EGFR (5 mg) 1 ㎖ 컬럼에 충진시켜 정제하였다. 컬럼을 PBS 30 ㎖ 로 세척한 다음 0.2 M 글리신, pH 5.0 5 ㎖ 로 세척하였다. scFv를 0.2 M 글리신/HCI, pH 2.8 로 용출시켰다. 용출액을 10 × PBS 로 중화시켰다. 단백질-함유 분획을 모으고 1% BSA 및 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS 로 한외여과(Amicon, Stonehouse, UK)에 의하여 완충액을 바꾸었다.
실시예 8: 정제된 scFv 의 FACS 분석
A431 세포를 트립신 처리하고 10% FCS를 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 세포를 냉각된 DMEM 으로 2 회 세척하고 45 ㎛ 스크린을 통하여 여과하였다. 세포(106)를 50 ㎕ PBS, 1% BSA 중에서 정제된 scFv 와 함께 얼음상에서 30 분동안 배양하였다. 냉각된 PBS 로 2 회 세척한 후, 결합된 scFv를 50 ㎕ FITC-접합된 9E10 항체(100 ㎕/㎖)를 이용하여 검출하였다. 얼음상에서 30 분간 놓아둔 후, 세포를 PBS 로 1 회 세척하고, 1% 포름알데하이드를 함유하는 PBS에서 고정시키고, FACSCAN(Becton-Dickinson, Cowley, UK)을 이용하여 분석하였다.
실시예 9: 완전한 키메릭 항체의 제조, 분석 및 발현
PstI 및 BstEII 부위를 이용하여, 선별된 scFv 의 VH를 암호화하는 DNA를 인간 항체 HG3 CL(Rechavi 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA1983, 80: 855) 로부터 유래된 진핵 세포성 선두 서열 및 스플라이스 공여 부위를 함유하는 중간 VH벡터에 서브클로닝하였다(제 3 도). 5' 및 3'-말단에 XhoI 및 SstI 부위를 혼입시키기위한 PCR 프라이머를 이용하여 VK를 암호화하는 DNA를 중간 VK벡터에 삽입하기에 적합하게 변형시켰다:
(VK전방: 5'-CCG TTT CAC CTC GAG CTT GGT CCC-3';
VK후방: 5'-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3').
변형된 인간 CAMPATH-1 L-사슬(Riechmann 등,Nature1988. 332: 21)로부터의 진핵 세포성 선두 서열 및 스플라이스 공여 부위를 함유하는 중간 VK벡터에SstI-XhoI 단편을 클로닝하였다(제 3 도). 가변 영역 + 진핵세포성 측위 영역을 암호화하는 DNA를 HindIII-BamHI 단편으로서, 인간 감마-1 불변 영역 또는 인간 카파 불변 영역(Maeda 등,Hum. Artibod, Hybridomas1991. 2: 124)을 암호화하는 게놈 DNA를 포함하는 포유동물 세포 발현 벡터에 클로닝하였다. H 및 L 사슬 발현 벡터를 COS 세포에 일렉트로포레이션시켰다. 72 시간후 배지를 모으고 키메릭 항-EGFR 항체를 ELISA 로 분석하였다(Kettleborough 등,Protein Eng. 1991. 4: 773).
실시예 10: 시험관내 면역된 세포로부터 유도된 scFv 의 생산
하기 방법은 상기 방법을 약간 변형시킨 방법이다. 면역, 라이브러리 제조, 및 스크리닝은 실시예 1 내지 4 에 주어진 바와 같다. 하기 단계를 좀 더 상세하게 기술한다.
1 차 라이브러리 및 3 회의 팬닝으로부터 유래된 클론을 스크리닝한 후, 일부 단일 암피실린-내성 콜로니를 선별하였다. 파지미드 DNA를 알칼리 분해로 제조하고 이를 사용하여 열 쇼크 방식으로 이 콜라이 HB2151, 비-억제자 균주를 형질감염시켰다. 콜로니를 2×TY-Amp-Glu 에 접종하고 30℃에서 하룻밤동안 생육시켰다. 5㎖ 분취량을 사용하여 100 mg 암피실린/㎖ 및 0.1% 글루코스를 함유하는 2 ×TY 액체배지 50㎖에 접종하고 30℃에서 1 시간동안(대수기까지) 진탕시키면서 배양하였다. 세포를 수확하고 최종 곱도 1 mM로 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG) 를 첨가하여 가용성 scFv 의 발현을 유도하였다(De Bellis, D. & Schwartz, I.Nucleic Acids Res., 1990. 18: 1311). 배양물을 30℃에서 하룻밤동안 진탕시키면서 생육시컸다. scFv를 함유하는 상징액을 취하고, 원심분리 및 0.22 mm 필터로 여과하여 정제하고 시험하였다. 박테리아 상징액을 상기한 바와 같이 ELISA 로 EGFR 에의 결합에 대해 시험하였다(Kettleborough, 등, EP 94104160 &Eur J. Immunol. 1994 24: 952). 선별된 scFv 단편의 특이성을 다른 항원 및 플라스틱뿐만 아니라 EGFR 에 관련된 단백질 및 EGFR 에 관련되지 않는 다양한 단백질로 피복된 플레이트를 이용한 ELISA 로 검사하였다. 사용된 항원은 다음과 같다: RNasc, BSA, OVA, GD3강글리오사이드, 비트로넥틴 수용체(VNR), 혈소판 당단백질 IIbIIIa(GPIIbIIIa), 및 디시알릴-락토-N-테트라오스(DSLNT). 피복은 각 항원에 대해 최적 농도에서 하룻밤동안 실시하였다. 피복된 ELISA 플레이트는 PBS중의 1.5%(w/v) 탈지유로 37℃에서 1 시간동안 블로킹시켰다. 세척후, scFv 상징액 100 ㎖를 마이크로타이터(microtiter) 웰에 첨가하고 37℃에서 2 시간동안 항온처리하였다. 결합된 scFv 는 항-c-myc항체 9E10(Myc 1-9E10.2 하이브리드로부터 제조된 배지) 및 알칼리 포스파타제-접합된 토끼 항-마우스 항체(Dako)를 이용하여 검출하였다.
3 개의 EGFR-함유 종양 세포주, A431, MDA MB 231 인간 유방 아데노암종(ATCC, HTB 26) 및 HT29 인간 결장 아데노암종(ATCC, HTB 38) 및 하나의 EGFR 비-발현 세포주 WM164를 이용하여 FACS 분석 및 비고정된 세포와의 평균 면역형광성 분석으로 세포상에서 scFv 가 EGFR 에 결합하는 능력을 시험하였다. 간접 면역형광성 분석을 위해, 세포를 테라사키(Terasaki) 플레이트( 2 × 104세포/웰) 에 도말하고 24 시간동안 배양하였다. scFv 단편을 함유하는 박테리아 조상징액 20㎖ 로 실온에서 90 분동안 세포를 배양하였다. 1 차 항체(항-c-myc) 및 2차 항체와의 항온처리는 실온에서 60 분동안 실시하였다. 2 차 항체, FICT-접합된 토끼 항-마우스 항체(Dako) 는 1:20 으로 희석하였다.
FACS 분석을 위하여, 5 × 105세포를 1% BSA 및 0.1% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS(PBS-BSA) 로 세척하고 50 ㎖ 박테리아 조상징액과 함께 4 ℃에서 20 분동안 배양하었다. 냉각된 PBS-BSA 로 2 회 세척한 후, PBS-BSA 에 1:25로 희석된 항-c-myc항체 및 FITC-접합된 염소 항-마우스 항체(Becton-Dickinson)를 이용하여 결합된 scFv를 검출하였다. 프로피듐 요오다이드(PI) 를 최종 농도 5 mg/㎖ 로 첨가하였다. 공기-냉각된 아르곤 레이저가 장착된 EPICS 프로필 II에서 유동 세포계측 분석을 실시하였다. 488 nm 선(15 mV)을 사용하여 여기시켰다. 530 nm 띠 통과 필터를 사용하여 FITC 방출선을 모으고 625 nm 띠 통과 필터를 이용하여 PI 방출선을 모았다. 전방 및 측면 스캐터(scatter)상에 비트맵을 설치하고 PI-염색 세포를 배제하여 살아있는 세포를 선택하였다.
1 차 라이브러리 및 선별 라이브러리의 다양성은 클로닝된 단편의 PCR 증폭(Gussow, D. Clackson, T,Nucleic Acids Res. 1989. 17: 4000) 및 BstNI 절단 패턴의 분석으로 결정하였다(8). 일부 클론은 디데옥시 사슬 종결법(Sanger, F 등,Nat. Acad. Sci., U.S.A. 1977 74, 5463) 에 의한 시쿼나제 킷트(USB)를 이용하여 서열을 분석하였다.
박테리아 조상징액(10㎖)을 12.5 % 겔을 이용하는 SDS-PACE 에 적용시켰다.문헌(Towbin 등,J. Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 1979. 76: 4350) 에 기술된 바에 따라 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 단백질은 이모빌론-P(Millipore) 또는 니트로셀룰로스(Bio-Rad) 에 전기블롯팅시켜 전이시켰다. 블롯은 2% 탈지유(w/v)를 함유하는 PBS 로 블로킹시켰다. 항-c-myc항체(9E10), 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 항체(Jackson), 및 높은 화학형광 시스템(ECL, Amersham)을 이용하여 scFv 단편을 검출하였다.
쉐드 막 소포의 정량 분석 결과 총 단백질 농도는 2.5 mg/㎖ 이었으며 그중 10 내지 14% 만이 EGFR 에 해당하었다(Sato 등,J. Natl. Cancer Inst. 1989. 21:1601; Yeaton, R 등,J. Biol. Chem., 1983, 258: 9254), 250 내지 350 ng/㎖ SDS-PAGE 및 이어서 코마씨-블루 염색을 이용한 전기영동 분석 결과 소포들은 비교적 복잡한 단백질 혼합물을 함유하였다. 단백질의 분해는 검출되지 않았다. 웨스턴 블롯팅 분석 결과 본 발명자의 실험 조건하에서 EGF 수용체의 완전한 분자가 막 소포 제조물에 존재하였다.
FCS 및 임포카인에 대한 요구도를 결정하기 위하여, MTC와, 20% 또는 4% FCS를 함유하는 M2를 비교하였다. EGFR 및 PBS를 함유하는 소포를 각각 항원 및 대조군으로 사용하였다. M1 (혈청 무함유)에서 3 시간동안 항원의 존재 또는 부재하에 6 개의 웰 플레이트에서 비장세포를 배양하였다. 그다음 MTC 또는 M2를 첨가하고 72, 96, 120 또는 144 시간후 A431 고정 세포를 이온하여 스크리닝을 실시하였다. 모든 실험에서, 회수된 생세포의 수는 공개된 결과와 일치하게 20 내지 40% 사이이었다(Gavilondo-Cowley, J. 등, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology,Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam 1988, p. 131) 최대 특이적 반응은 MTC 로 4 일째에 얻어진 반면 4% 또는 20% FCS(2% 또는 10% 최종 농도)를 함유하는 M2 는 6 일째까지 최대 반응을 지연시켰다(표 2). 그러나, MTC및 10% FCS는 결과가 특이적/비-특이적 반응의 비로서 표현될 때 알 수 있는 바와 같이, 아마도 다중클론 활성화에 의하여 비-특이적 반응을 유발하였다. 다른 분석을 위하여 본 발명자들은 4% FCS 및 6 일 배양물이 보충된 M2를 사용하기로 결정하였다.
소포의 표면에 EGFR 이 존재하면 이 항원에 대한 반응이 강력하게 높아진다. 상기한 바와 같은 유사한 절차에서, EGFR 발현 및 EGFR 비-발현 세포주로부터의 소포를 비교하였다. M1에서 3 시간동안 소포와 함께 임파구를 배양하였다. 그 후 4% FCS를 함유하는 M2를 첨가하였다. 6 일후, 각 군으로부터의 임파구를 EGFR, A431-고정된 세포, RNase 또는 GD3 로 피복된 96 웰 플레이트에서 48 시간동안 배양하였다. 예상한 바와 같이, 이들 분석의 결과는 다중 특이적 반응 패턴을 나타냈다(표 3). EGFR 에 대한 반응성은 EGFR-발현 소포를 항원으로 사용할 경우 광학 밀도의 관점에서 분명하게 증가하였다.
이들 결과를 종합하면, 완전하지는 않지만, EGFn 에 대해 면역된 임파구의 몇몇 풀(pool)을 생성하는 시험관내 면역후 가변 영역의 PCR 클로닝에 적합한 측정 가능한 항원-의존성 반응이 존재함을 알 수 있다.
시험관내 면역으로부터 유래된 scFv 단편을 pHEN1 파지미드에 클로닝한 후 1.1 × 105클론의 라이브러리가 얻어겼다. 이 라이브러리는 생체내 면역일 경우 2개 이상의 라이브리리와 동시에 제조되었다. 이들 파지 라이브러리의 제조는 이미 기술하였다(Kettleborough, 등, EP 94104160 및Eur. J. Immunol1994.24: 952).
EGFR 에 결합하는 scFv 단편을 선별하기 위해, ECFn-피복된 면역시험관을 이용하여 파지를 팬닝하였다. 용출된 파지를 사용하여 이 콜라이의SupE균주를 재감염시켰다. 총 3회의 선별 과정을 실시하였다. 각 선별에서, 항원이 없는 시험관을 동시에 시험하여 바탕값을 계산하였다. 제 1 팬닝에서, 1.5 × 1010파지 입자를 면역시험관에 적용하였으며, 6.6 × 104개의 파지가 피복된 면역시험관으로부터 용출된 반면, 바탕군으로부터는 단지 200 개의 콜로니만이 얻어졌다. 제 3 팬닝후, 1 × 1011개의 파지를 적용하고 5.6 × 1010개가 용출되었다.
scFv 단편을 더욱 특성확인하기 위하여, 본 발명자들은 각 선별 과정의 전후에 파지 군으로부터 22 개 클론을 선별하였다. 라이브러리의 다양성을 클로닝된 단편의 BstNI 절단 패턴으로 분석하였다. 선별전 라이브러리는 극히 다양한 것으로 여겨졌다. 제 1 선별후 유래된 결합 클론의 핑거프린팅 결과는 동일한 제한 패턴을 가지는 몇몇 그룹이 존재함을 나타내었다.
이들의 절단 패턴에 기초하여 다른 선별 과정으로부터 클론을 선별하였다. DNA 서열 분석 결과, 대부분의 선별 클론에 다른 서열이 존재하는 것으로 나타났다. 클론 10D2, 5D3, 10E2, 1B3, 4B3 및 5E2 의 상보성 결정 영역(CDR) 의 조성 및 길이는 상이하였다. VH및 VL서열의 CDR3에서 가장 큰 차이가 관찰되었다. 클론5D3 및 1E3 는 제 3 선별 과정으로부터 유래되었다. 이들은 ELISA 및 유동세포계측기로 분석한 바와 같이 EGFR 에 강력하게 결합하며 동일한 서열을 가졌다.
가용성 scFv 단편은 IPTG 의 존재하에 비-억제자 이 콜라이 균주 HB 2151을 생육시켜 얻어졌다.
scFv 생산을 증명하기 위하여, 개개 클론으로부터 박테리아 배지를 겔 전기 영동으로 분석하였다. 웨스턴 블롯팅 분석 결과 약 35,000 kD 에 분명한 띠가 나타났다.
EGFR 에의 결합 활성을 가지는 클론을 ELISA 로 식별하였다. 선별된 클론의 교차-반응성을 검사하기 위하여, 상기한 항원을 이용한 ELISA 분석을 실시하였다. 항원(EGFR, RNase, BSA, KLH, OVA, GD3강글리오사이드, 비트로넥틴 수용체, 혈소판 당단백질 IIbIIIa 및 디시알릴-락토-N-테트라오스)을 최적 농도에서 ELISA 플레이트에 피복시켰다(표 4). 비-EGFR 항원에의 결합은 검출되지 않았다. 또한 scFv를 3 개의 EGFR-함유 종양 세포주(인간 유표피 암종 A431, 인간 유방 아데노암종 MDA MB 231 및 인간 결장 아데노암종 HT 29) 에의 결합에 대해 시험하였다. EGFR 비-발현 WM 164 인간 흑색종을 음성 대조군으로서 사용하였다. 종양 세포주에 결합하는 것들을 비고정된 세포를 이용한 간접적 면역형광성 분석으로 시험하고 FACS 분석으로 정량하였다. 비고정 세포의 이용은 막 수용체의 본래구조를 확실히 한다. 양성 클론은 A431 세포를 이용한 뚜렷한 형광성을 나타냈다. 다른 EGFR-함유 종양 세포주의 형광성은 약하였다. 음성 세포주에의 결합은 검출되지 않았다. 결과는 유동 세포계측기로 확인하였다. 17개의 양성 클론 및 3개의 음성 클론을 유동 세포계측기로 A431, MDA MB 231 및 HT 29 세포에의 결합에 대해 분석하였다. WM 164를 음성 세포주로서 사용하였다. 425 scFv(P1 클론)를 양성 대조군으로 사용하고 클로닝 벡터(HEN)를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과를 하기 표 5 에 요약하였다. 두 클론 4B2 및 5E2 는 ELISA 로 분석하였을때 EGFR 에의 결합에 대해 양성이지만, EGFR-발현 종양 세포주에의 결합에 대해서는 음성이었다.
표 2. 시험관내 면역에 미치는 상이한 배지의 효과a)
표 3. 시험관내 면역후 반응의 다중 특이성a)
표 4. 몇몇 항원에 대해 선별된 scFv 단편의 교차 반응성a)
표 5. EGFR 에 대한 scFv 클론의 반응성. 정제된 가용성 항원을 사용하는ELISA 분석과 세포주의 세포계측 분석사이의 비교 결과.
Claims (8)
- 면역된 포유동물의 세포로부터 제조된 파지-항체 라이브러리로부터 얻을 수 있는, 서열목록의 서열번호: 4, 서열번호: 8, 서열번호: 12, 서열번호: 16, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26 및 서열번호: 28로 구성된 군에서 선택된 H 사슬(heavy chain) 아미노산 서열, 및 서열번호: 2, 서열번호: 6, 서열번호: 10, 서열번호: 14, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열변호; 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26 및 서열번호: 28로 구성된 군에서 선택된 L 사슬(light chain) 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 단일-사슬 Fv 항체 단편.
- 제 1 항에 있어서,면역된 마우스의 세포로부터 얻을 수 있는항체 단편.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,(i) 임파절 세포,(ii) 비장세포, 또는(iii) 시험관내 면역된 세포로부터 얻을 수 있는항체 단편.
- 인간 면역글로불린의 불변 영역으로부터 유래된 DNA 서열 및 제 1 항에 따른항체 단편으로부터 유래된 DNA 서열로 제조된 항-EGFR 항체.
- 제 4 항에 있어서,H 사슬 불변 영역이 인간 감마-1 사슬의 아미노산 서열을 포함하고, L 사슬 불변 영역이 인간 카파 사슬의 아미노산 서열을 포함하는항체.
- (i) 면역된 포유동물 세포, 바람직하게는 마우스 세포로부터 RNA를 단리 하는 단계;(il) 제 1 가닥 cDNA를 합성하는 단계;(iii) 면역된 세포로부터의 cDNA에서 VH및 VK유전자를 증폭하는 단계;(iv) 적당한 제한 부위와 함께 상기 유전자를 파지미드 벡터에 클로닝하는 단계;(v) 연결 혼합물로 원핵 세포를 형질전환시키는 단계;(vi) 정제된 EGFR을 이용하여 EGFR을 지향하는 파지 항체에 대해 파지 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및(vii) 원핵 숙주 세포, 바람직하게는 이 콜라이(E. coli)에서 원하는 단일-사슬 Fv를 생산하는 단계를 포함하는, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항-EGFR 단일-사슬 Fv의 제조 방법.
- 인간 면역글로불린의 불변 영역을 암호화하는 게놈 DNA를 포함하는 1 개 이상의 진핵 발현 벡터에, 제 6 항에 따라 생산된 항-EGFR 항체 단편의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 클로닝하는 단계;이 벡터(들)로 진핵 세포를 형질전환시키는 단계; 및항체를 발현시키고 단리하는 단계를 포함하는, 완전한(whole) 항-EGFR 항체의 제조 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항-EGFR 항체 단편 또는 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 완전한 항-EGFR 항체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 종양을 치료하거나 종양의 성장을 평가 및 확인 진단하기 위한 약학 조성물.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EPEP94104160.0 | 1994-03-17 | ||
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