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CN104203286B - 用于光动力疗法的新型光免疫偶联物 - Google Patents

用于光动力疗法的新型光免疫偶联物 Download PDF

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CN104203286B CN201280071458.5A CN201280071458A CN104203286B CN 104203286 B CN104203286 B CN 104203286B CN 201280071458 A CN201280071458 A CN 201280071458A CN 104203286 B CN104203286 B CN 104203286B
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Abstract

一种化合物，包括：·光敏剂，其共价结合于·选自下组的蛋白抗体或其衍生物或其片段、合成肽，如scFv、模拟表位·其结合于CD抗原、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体，尤其是ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体，其中·所述光敏剂与蛋白的结合通过O6‑烷基鸟嘌呤‑DNA烷基转移酶(hAGTm)，其为经修饰的人DNA修复蛋白。

Description

用于光动力疗法的新型光免疫偶联物
发明领域
光动力疗法(PDT)是一种非常有前景的微创癌症治疗手段。引入改良的光敏剂以及临床应用方案后，已有数个经FDA批准的PDT药物可用，而其他的(药物)则处于临床前和临床开发1的多个阶段中。无害光线直接激活后，光敏药物可变得具有细胞毒性而发挥其作用；或在非直接激活后，在原位启动产生毒性自由基或活性氧(ROS)从而发挥其作用。这些过程能造成细胞的破坏，并最终通过凋亡或坏死2诱导细胞的死亡。细胞破坏的部位取决于光敏剂的种类、温育周期以及递送方式。疏水性光敏剂常常破坏细胞膜，而阳离子光敏剂则在膜囊泡(如线粒体)中积聚并导致局部的破坏3。
PDT的一个最大挑战在于其缺乏靶向特异性。在由光照激活后，光敏剂在破坏肿瘤组织的同时也破坏健康组织，这会造成长期的皮肤光敏4。为了提高PDT的特异性，将光敏剂偶联于肿瘤特异性单克隆抗体或单链抗体片段(scFv)，从而产生了能够直接将光敏剂递送到肿瘤组织的所谓光免疫偶联物。这个方法称作光免疫疗法(PIT)5。标准的偶联反应并不适用于光敏剂和抗体的偶联，因为尚无一个可靠的方式来确定抗体-光敏剂的偶联能以最佳的化学计量比6产生。此外，光敏剂的化学性质(例如，疏水性，以及带电基团的数量和排列)能够改变抗体的药代动力学性质以及生物分布，并最终导致非特异性结合以及内化行为。随机的偶联也可引发光敏剂激发态的自淬灭，从而降低光动力活性5。因此，需要更可控的偶联反应来克服这些限制。
PDT的一个主要缺陷在于经激活的光敏剂的非选择性效应，其常常同时破坏健康细胞和肿瘤细胞。利用抗体的靶向疗法彻底改变了癌症治疗，数个结合于肿瘤细胞抗原的抗体已经造成了轰动的效应。将额外的效应分子(例如，放射性核素、药物或毒素)7共价连接于治疗性抗体能增强其效果，因为这能实现选择性递送，并降低通常与小分子药物8相关的全身性毒性反应。相同的理论也适用于光敏剂。效应分子通常利用半胱氨酸残基上的还原巯基或赖氨酸侧链的氨基基团与抗体相连。然而，这两种方法都会产出异质性的产物，包括在不同位点连接效应分子的偶链抗体混合物，以及连接各抗体的效应分子数量各异，从而导致摩尔比是一范围，以及极为不同的药代动力学、效力以及安全性特征。
通过纯化含有2、4、8个一甲基奥瑞他汀E(MMAE)偶联分子的三种抗体部分，Hamblett和其同事9研究了异质性抗体药偶联物的毒性、药代动力学性质以及治疗效率。含有8个MMAE基团的部分较其他部分而言耐受性较差，清除较快，并显示出最低的效率。这提示了抗体药偶联物的关键设计参数是连接于抗体的药物分子数量。然而，即使携带相同数量药物分子的纯化抗体依然会构成复杂的混合物，因为具有许多不同的结合位点。例如，通常一个抗体中约有40个赖氨酸残基，这可能导致大于一百万个不同的偶联抗体种类。相似地，半胱氨酸残基有1-8个，通常会生成约100个不同的偶联变体。每一个抗体药偶联物通常都会显现出独特的、不可预测的药代动力学特征9。
发明概述
光敏性药物暴露在无害光线下所引起的毒性效应能够杀灭癌细胞，但这也会对周围健康细胞造成巨大损伤。通过将光敏性药物偶联于特异性结合肿瘤相关细胞表面抗原的抗体和抗体片段，能使光动力疗法的特异性有所提高。然而，标准偶联反应所产生的异质性产物却削弱了其靶向特异性和(作用)谱特性。
在本发明中，利用结合于表皮生长因子(EGFR)的抗体片段(scFv-425)作为模型来研究采用SNAP-标签融合作为改良的偶联方法。scFv-425-SNAP-标签融合蛋白能够特异性结合光敏剂，例如经苄基鸟嘌呤(O6-benzylguanine)修饰的二氢卟吩e6(chlorin e6)，从而生成特异性递送至EGFR+癌细胞并引起显著的肿瘤细胞特异性细胞毒的异质性产物。(本文)讨论了我们的研究结果对光动力疗法发展的影响。
本发明提供了一种化合物，其包括：共价结合于结合结构的光敏剂，所述结合结构选自下组：抗体或其衍生物或其片段、合成肽(如scFv)、模拟表位(其结合结构结合于CD抗原)、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体、尤其是ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体，其中，所述光敏剂通过经修饰的人类DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(hAGTm)而结合于内化受体结合蛋白。
在本发明的一个实施例中，表皮生长因子受体结合蛋白是scFv抗体片段，尤其是如SEQ ID NO.:1所示的scFv抗体片段，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
在本发明的另一实施例中，本发明化合物包括或具有氨基酸序列SEQ ID NO.:3，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
在本发明的又一实施例中，本发明化合物中光敏剂偶联于O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的活性位点。
在本发明的化合物中，所示的光敏剂选自下组：卟啉、叶绿素以及具有光敏能力的染料。
本发明的主题还在于一不含光敏剂的化合物。所示化合物包括选自下组的结合蛋白：抗体或其衍生物、或其片段、合成多肽(如scFv)、模拟表位(其结合蛋白结合于CD抗原)、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体，尤其是ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体，其通过经修饰的人类DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(hAGTm)偶联于内化受体结合蛋白。
特别地，所述结合蛋白是scFv抗体片段，尤其是如SEQ ID NO.:1和/或SEQ IDNO.:3所述的scFv抗体片段。该化合物可由SEQ ID NO.:2和/或SEQ ID NO.:4所示的多核苷酸编码。具体的实施例即结合于ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体。
所述化合物的具体实施例即由核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示的多核苷酸编码。
本发明的另一主题在于制备本发明化合物的方法，包括步骤：将O6-鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(hAGTm)与选自下组的结合蛋白融合：抗体或其衍生物或其片段、合成肽如scFv、模拟表位，其结合蛋白结合于CD抗原、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体，尤其是ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体。具体地，将scFv-425 DNA序列插入真核细胞表达载体pMS-SNAP中经SiFI和NotI消化的位点，从而提供N末端结合配体(scFv-425)和C末端SNAP-标签序列。
具体地，还将His6标签与蛋白相融合。融合蛋白可在人体细胞中表达，尤其是胚肾细胞系中，例如HEK-293T细胞(ATCC:CRL-11268)，并利用该标签的亲和树脂(例如，Ni-NTA修饰树脂)进行纯化。
本发明的另一主题是下式所示的卟啉衍生物
其中，卟啉光敏剂，例如二氢卟吩e6的羧基至少部分与活化的酯反应，或通过偶联剂，继而与O6苄基鸟嘌呤、O2苄基胞嘧啶或辅酶A(CoA)反应。
在本发明方法中，O6-苄基鸟嘌呤、O2-苄基胞嘧啶或辅酶A(CoA)偶联于连接分子，例如PEG-24-NH2和/或通过琥珀酰亚胺(如NHS)或偶联剂形成活化的酯，所述偶联剂选自下组：碳二亚胺，如EDC、EDAC和DCC。
本发明的主题还在于一种药物，其含有本发明的化合物以及药学上可接受的佐剂，以便改进光免疫疗法相关的药学效应或赋予这种效应。
本发明还提供了本发明化合物的用途，用于通过光免疫疗法治疗癌症。
本领域技术人员理解，术语“含有”可替换为“组成”而不引入延伸到本文公开内容之外的新主题。
下面通过具体实施例，对本发明化合物的效果进行演示和更详细地描述。表皮生长因子受体(EGFR、erbB1、HER1)是酪氨酸激酶生长因子受体ErbB家族的四个成员之一，其在约30％的上皮来源的癌症中高表达，因此成为癌症免疫疗法10中最吸引人的靶标。重组的抗EGFR抗体片段scFv-425结合癌细胞表面的EGFR，并有效地引起受体的内化作用11。利用scFv-425作为模型来开发新的偶联方法以提高PIT特异性和效率。为了达到这些目的，采用SNAP-标签技术，其基于20-KD经修饰的人DNA修复蛋白(称为O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(hAGTm))，其最初开发用于利用光活性分子对抗体进行位点特异性的标记11。所述SNAP-标签能够有效地共价偶联于经受体基团O(6)-苄基鸟嘌呤(BG)修饰的任何底物。所述SNAP-标签通过亲核取代反应将取代的苄基基团转移至其活性位点并释放自由鸟嘌呤11，从而与对位取代的BG衍生物反应。
根据本发明设计并合成了scFv-425-SNAP-标签融合蛋白。将BG修饰的二氢卟吩e6(Ce6)光敏剂递送至EGFR+癌细胞。构建物中还包括一连接区以及24条聚乙二醇(PEG)链，从而增加光敏剂和蛋白之间的距离。经BG修饰的Ce6特异性地共价偶联于scFv-425-SNAP-标签融合蛋白，而对抗体的结合和内化活性无不利影响。Ce6被特异性递送至4种EGFR+癌症细胞系(A431、MDA-MB-231、MDA-MB-468和SiHa)，并引起显著的肿瘤细胞特异性细胞毒性。
发明详述
本发明还示范性地更详细描述了利用Ce6作为光敏剂以及ErbB家族酪氨酸激酶生长因子受体作为结合物。
附图说明
图1：SNAP-标签融合蛋白的构建、表达和结合。(a)重组SNAP-标签融合蛋白的双顺反真核表达盒示意图。pMS-scFV-425-SNAP载体编码结合配体(scFv-425)，其受CMV启动子的转录调控，并在框内加入SNAP-标签。免疫球蛋白κ前导序列(Ig-κ-L)促进蛋白分泌，TGA终止密码子紧接着C末端His6-标签之后。对照载体的表达盒与PMS-scFv-425-SNAP一致，但含有scFv-Ki4而非scFv-425作为结合配体。(b)通过SDS-PAGE分离scFv-425-SNAP蛋白的纯化部分，然后作考马斯亮蓝染色，(c)利用BG-Vista Green温育scFv-425-SNAP，并用UV灯显影蛋白。M：蛋白标记，1:3μl用250mM Imidazol洗脱的scFv-425-SNAP，2：1.5μl用250mMImidazol洗脱的scFv-425-SNAP，3:10μl用40mM Imidazol洗脱的scFv-425-SNAP,4：经10mMImidazol洗脱的蛋白，5：流出物，6:HEK-293T细胞上清液。利用EGFR+A431(d)和EGFR-L540细胞(e)作流式细胞术来评估scFv-425-SNAP和scFv-Ki4-SNAP的结合分析。灰色填充曲线代表了未处理的细胞。用0.5μg/ml纯化融合蛋白scFv-425-SNAP(浅灰色曲线)和Ki4-SNAP(黑色曲线)温育细胞。5-His Alexa荧光488偶联物(Penta-His Alexa Fluor 488Conjugate)(1/500稀释)(购自凯杰公司-Qiagen)作为二抗。为了排除抗-His Alexa荧光488检测抗体的非特异性染色，采用不含His-标签的融合蛋白作为对照(黑色虚线)。
图2：采用质谱分析法，在苄基鸟嘌呤(BG)修饰前后对Ce6光敏剂进行分析。(a)Ce6、BG-PEG24-NH2、和BG-PEG24-Ce6的ESI质谱图。上图代表Ce6(597.215Da)，中图代表BG-PEG24-NH2(1398.761 Da)，下图代表BG-PEG24-Ce6(1979.004Da)。(b)将BG-PEG24-Ce6偶联于scFv-425-SNAP。M，蛋白标记物；1，用1.5倍摩尔量的BG-VistaGreen温育scFv-425-SNAP；2，用3倍摩尔量的溴代噻吩喋啶(bromothenylpteridine，BTP)阻断scFv-425-SNAP，并用BE-Ce6温育2小时，最后与BG-VistaGreen混合；3，用1.5倍摩尔量的BG-Ce6温育scFv-425-SNAP 2小时，然后换1.5倍摩尔量的BG-VistaGreen。通过SDS-PAGE分离偶联蛋白，并采用CRi Maestro显像系统进行显像。不同的染料光谱经Maestro软件分离，相应的胶体用考马斯亮蓝(c)染色。
图3：特异性识别EGFR+细胞的scFv-425-SNAP-VistaGreen和scFv-425-SNAP-Ce6的结合活性。37℃，在PBS中将4×105个细胞与各融合蛋白温育20分钟后进行流式细胞分析。(a)scFv-425-SNAP-VistaGreen(浅灰色曲线)由A431、MDA-MB-468、MDA-MB-231、SiHa、L540和CHO-K1细胞(灰色填充曲线)进行测试。用BG-VistaGreen标记scFv-Ki4-SNAP作为对照(黑色曲线)，其结合活性由A431、L540和CHO-K1细胞(灰色填充曲线)进行测试。(b)scFv-425-SNAP-Ce6的结合活性(浅灰色曲线)由A431、MDA-MB-468、MDA-MB-231、SiHa、L540和CHO-K1细胞(灰色填充曲线)进行测试。作为对照，用BG-Ce6(黑色曲线)标记的scFv-Ki4-SNAP经A431、L540和CHO-K1细胞(灰色填充曲线)进行测试。
图4：共聚焦显微术分析融合蛋白的内化作用。获得EGFR+细胞系A431、MDA-MB-468、MDA-MB-231和SiHa,以及EGFR–细胞系L540和CHO-K1的共聚焦图像，这些细胞系在4℃下用0.5μg scFv-425-SNAP-Ce6温育30分钟(a)或在37℃下培养60分钟(b)。(1)Ce6荧光信号；(2)透射光；(3)荧光信号和透射光的叠加。
图5：光动力疗效评估。使用scFv-425-SNAP-Ce6进行细胞增殖和凋亡实验。采用XTT试验，利用细胞系A431(■)、MDA-MB-468(▲)、MDA-MB-231(◆)、SiHa(●)和CHO-K1(▼)对(a)受辐射的细胞和(b)未受辐射细胞检测scFv-425-BG-Ce6的细胞毒性。测定scFv-Ki4-SNAP-Ce6对A431细胞(x)的细胞毒性作为对照。用不同浓度的BG-Ce6处理相同细胞，并在(c)或不在(d)光照激活下分析细胞活性。(e)利用Apo-ONETM均质胱冬酶-3/7试验，在50nMBG-Ce6、200nM scFv-SNAP-Ce6和200nM scFv-Ki4-SNAP-Ce6下对凋亡进行了评估。(f)通过照射光敏的A431细胞产生活性氧，利用二氯荧光素衍生物羧基-H2DCFDA测定。
光动力疗法(PDT)是一种微创治疗方法，其联用无毒的光敏剂、无害可见光和氧来产生细胞毒性活性氧，从而通过凋亡和/或坏死来杀灭恶性细胞12。现已开发有多种不同的光敏剂，但选择Ce6作为模型是因为其已经在PDT研究中得以广泛地评估，也具有有利的物理和化学性质。Ce6的吸收最大值为664nm，在光子效应和细胞穿透之间有很好的平衡13，而羧基基团的存在也能作进一步的功能化5。
利用本发明的SNAP-标签技术能在抗体上提供独特的偶联位点，从而产生均一的偶联制剂。本发明构建物中特异性结合EGFR的scFv抗体的编码序列与hAGT表达盒遗传融合，使得所述抗体具有SNAP-标签，因而形成位点特异性偶联的BG修饰物质，尤其是Ce6。只要所述抗体携带SNAP-标签且所述的物质经BG基团修饰，则该偶联方法可应用于任何抗体-光敏剂组合。
该偶联反应是有效的，从而能够制备出均一的scFv-425-SNAP-Ce6和scFv-Ki4-SNAP-Ce6样品。测试了这些制剂特异性杀灭肿瘤细胞的能力。测试发现，在暴露于光线之后，scFv-425-SNAP-Ce6在四株人类肿瘤来源的细胞系中，即上皮、乳腺、宫颈癌(A431,MDA-MB-231,MDA-MB468和SiHa)，能够选择性地杀灭EGFR+细胞。scFv-425-SNAP-Ce6的光毒性取决于EGFR以及光线，且毒性作用在A431和MDA-MB468细胞中最为有效，这些细胞所表达的受体最高(1-1.3×106个受体/细胞)14,15。其他细胞表达的EGFR较少(MDA-MB-231为1.3×105个受体/细胞，SiHa为2×104–2×105个受体/细胞)15,16，且scFv-425-SNAP-Ce6的毒性作用也随之下降，但不是融合蛋白在治疗上无效。这意味着scFv-425-SNAP-Ce6可以靶向各种EGFR+细胞而不只是EGFR+表达水平最高的细胞。而当EGFR-细胞(CHO-K1)暴露于scFv-425-SNAP-Ce6中时，也未观察到毒性作用。
之前显示，scFv-425-SNAP在注射之后，能直接在小鼠肾脏中积聚，然后就能在膀胱中检测到，这提示了其经肾脏过滤而清除10。尽管清除得很快，但scFv-425-SNAP在肿瘤组织中的积聚和潴留也显然足以在注射后10小时产生非常高的肿瘤背景比。
scFv/SNAP-标签融合蛋白的表达、纯化和功能分析
将EGFR特异性scFv-425抗体片段10和结合于不同抗原(CD30)的对照片段(scFv-Ki4)17的编码序列转移至pMS-SNAP双顺反载体，从而产生完整的scFv-425-SNAP和scFv-Ki4-SNAP表达盒，如图1a所示。通过转染将构建物导入至HEK-293T细胞，采用博莱霉素(zeocin)的选择以及绿色荧光蛋白(GFP)的活性检测来鉴定稳定转化的细胞。通过亲和层析(利用C-末端His6标签)将融合蛋白从上清液中分离，最终纯度为～90％，上清液中蛋白的最终收率为18mg/L(图1b)。
通过将未处理的培养上清液、层析步骤中的流出部分以及洗出液与经BG-修饰的Vista Green混合，从而确认各融合蛋白中的SNAP-标签活性(图1c)。利用表达EGFR的靶细胞系(A431)以及无此抗原但表达CD30的对照细胞系，通过流式细胞术确认scFv-425-SNAP蛋白的结合活性。采用二抗-His5 Alexa 488抗体对结合进行检测。流式细胞数据确认，scFv-425-SNAP特异性地与EGFR+靶细胞快速、高效结合(图1d)，而scFv-Ki4/SNAP只与CD30+L540细胞结合(图1e)。
用苄基鸟嘌啉修饰光敏剂二氢卟吩e6
采用N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、羟基琥珀亚酰胺磺酸钠盐(磺基-NHS)以及BG-PEG24-NH2接头对光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)进行成功修饰。将Ce6的羧基修饰至BG基团，该反应的效率由HPLC测得(数据未示出)。质谱分析确定BG-PEG24-Ce6的纯度较高。Ce6、BG-PEG24-NH2和BG-PEG24-Ce6的精确质量由Micromass QTOFII质谱分析仪测得，确认纯化后的BG-PEG24-Ce6质量与偶联的Ce6和BG-PEG24-NH2理论计算质量一致(图2a)。
采用BG-修饰荧光素和Ce6标记的蛋白
将SNAP-标签与经BG-修饰的荧光染料偶联，并测试其功能，结果显示，室温下温育2小时后，标记的效率为85-90％(数据未示出)。利用经BG修饰的Ce6重复该反应。光敏剂仅与融合蛋白中的活性SNAP-标签反应，且该反应能够被溴代噻吩喋啶(BTP)不可逆阻断，如用10倍摩尔量的BG-Vista Green作后温育所示。CRi Maestro成像系统的分析显示没有已经阻断的融合蛋白的相关荧光(图2b、c)。
流式细胞术和共聚焦显微
利用经BG-Vista Green或BG-Ce6标记的蛋白进行流式细胞术分析来测定经标记的scFv-425-SNAP融合蛋白的活性。冰上温育30分钟后，所有经标记的蛋白在相应的靶细胞系中(A431、MDA-MB-23、MDA-MB-468和SiHa)均显示强烈的荧光信号，而在对照细胞(L540和CHO-K1)中则没有。正如预期的那样，经标记的scFv-Ki4-SNAP在L540中显示出强荧光信号，而A431和CHO-K1细胞中则没有(图3)。
共聚焦显微显示，与scFv-425-SNAP-Ce6温育的A431、MDA-MB-231、MDA-MB468和SiHa细胞均有强烈、特异性和均匀的膜染色(图4a)。在经37℃(而非4℃)下温育30分钟后，所标记的融合蛋白均被A431、MDA-MB-231、MDA-MB468和SiHa细胞特异而高效地摄取(图4b)。与之相反，EGFR-的细胞系L540和CHO-K1在相同条件下与scFv-425-SNAP-Ce6温育后，却未能检测出任何信号(图4a、b)。
scFv-425-SNAP-Ce6的光细胞毒性
采用基于XTT的比色细胞增殖实验，利用四株EGFR+细胞系和CHO-K1作为阴性对照来评估scFv-425-SNAP-Ce6和未偶联BG-Ce6的浓度依赖性细胞毒效应。光照激活后并作24小时温育后，用scFv-425-SNAP-Ce6处理的A431、MDA-MB-23、MDA-MB-468和SiHa细胞系的活力显著降低，并呈浓度依赖性。IC50值为48nM(A431)、200nM(MDA-MB-231)、38nM(MDA-MB-468)和218nM(SiHa)。即便暴露于800nM的偶联融合蛋白，CHO-K1细胞未受影响，对照构建物scFv-Ki4-SNAP-Ce6在A431和CHO-K1细胞中的影响可忽略。与之相反，未偶联的Ce6对所有细胞系均有毒性，其IC50值为16nM(A431)、22nM(MDA-MB-231)、22nM(MDA-MB-468)、26nM(SiHa)和18nM(CHO-K1)。这些数据如图5a、c所示。
通过无光照激活步骤的平行实验显示，Ce6偶联和未偶联的形式在光照激活后均具有毒性。任何一个细胞系均未显示出显著的活力下降(图5b、d)。
为了测定scFv-425-SNAP-Ce6在靶细胞中是否通过激活凋亡途径从而选择性诱导了细胞的程序性死亡，分析光照激活24小时后的A431、MDA-MB-231、MDA-MB468、SiHa和CHO-K1细胞内的胱冬酶-3和胱冬酶-7的活性。scFv-425-SNAP-Ce6(200nM)和未偶联的Ce6(50nM)均能提高胱冬酶-3和胱冬酶-7的水平，而经200nM scFv-Ki4-SNAP-Ce6处理的A431细胞则未观察到有显著的增加(图5e)。
通过检测DCF的485/535-nm荧光，研究光激活的A431细胞所产生的ROS，其中DCF通过6-羰基-20,70-二氯二氢荧光素二乙酸二-(乙酰氧基-甲基)酯(H2DCFDA)的氧化和脱乙酰化产生。发现有200nM的偶联Ce6和50nM的未偶联Ce6存在下，光照激活后，ROS合成有激增，而在未经照射的细胞中，ROS水平则仅有小幅上升，仅比未经光敏剂处理的细胞中所观察到的背景水平高一点(图5f)。
方法
细胞培养
所有细胞系是人源的，包括EGFR+A431、MDA-MB-231、MDA-MB468和SiHa细胞以及EGFR-的L540、CHO-K1和HEK-293T细胞。A431、L540、CHO-K1和HEK-293T细胞在加入了2mM左旋谷酰胺、10％(v/v)胎牛血清(FBS)以及100U/ml青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养。MDA-MB-231、MDA-MB468和SiHa细胞在含10％(v/v)胎牛血清(FBS)以及100U/ml青霉素-链霉素的DMEM中培养。所有细胞系均在37℃、5％CO2环境下培育。所有的培养基和添加剂均获自德国达姆施塔特的英杰公司(Invitrogen，Darmstadt)。
蛋白的表达和纯化
将每个scFv的序列插入表达盒中，从而提供N-末端结合配体(scFv-425或scFv-Ki4)以及C-末端O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-标签)序列。TGA终止密码子紧跟着His6标签序列后产生。采用Ni-NTA金属亲和层析将His6-标记的融合蛋白自无细胞上清液中纯化。用FLPC系统进行大容量的纯化，该系统带有5mL Ni-NTA Superflowcartridge(凯杰公司(Qiagen)，希尔登，德国，)，经4×缓冲液(200mM NaH2PO4，1.2M NaCl，40mM Imidazol，pH8)平衡。结合了His-标签的蛋白经50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMImidazol(pH 8)洗脱。洗脱后，将蛋白用含有1mM二硫赤藓糖醇(卡尔罗斯股份有限公司(Carl Roth GmBH)，卡尔斯鲁厄(Karlsruhe)，德国)的磷酸缓冲盐(PBS)在4℃下透析过夜。加入四氢嘧啶低温保存剂至终浓度为50mM，等分试样储存于-20℃。
苄基鸟嘌呤对Ce6的修饰
室温下将2mg Ce6在二甲基甲酰胺中与5倍摩尔量的EDC和磺基-NHS(西格马-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯(St Louis)，密苏里州)混合30分钟，从而用苄基鸟嘌呤修饰Ce6(卟啉产品(Porphyrin Products)，罗根(Logan)，犹他州)的羧基。然后在室温下将活化的混合物与4倍摩尔量的苄基鸟嘌呤连接头BG-PEG24-NH2(Covalys生命科学股份公司(Covalys Biosciences AG)，威特斯维尔(Witterswil)，瑞士)混合并避光过夜。经修饰的Ce6利用岛津Prominence HPLC系统以及2.5μm(4.6×50mm)沃特XBridgeTM OSTC18柱(沃特(Waters)，米尔福德(Milford)，马萨诸塞州)(流速1mL/分钟)进行HPLC纯化。采用100％0.1M TEAA到100％乙腈的20分钟梯度进行分离，并在280-410nm下进行监测。采用Micromass QTOFII质谱分析仪对Ce6、BG-PEG24-NH2和BG-PEG24-Ce6进行质量测定，其具有电喷雾离子源Advion Nanomate(Advion，伊萨卡(Ithaca)，纽约，美国)7μl样品体积，1.4kV。利用MaxEnt3TM算法(Micromass)在400-2000Da的范围内，自300-2500m/z的质谱中获得精确的质量。
蛋白标记
通过在室温下与1.5-3倍摩尔量的染料温育2小时，纯化的SNAP-标签融合蛋白与BG修饰的染料(Covalys生命科学股份公司(Covalys Biosciences AG)，维特斯维尔(Witterswil)，瑞士)偶联，或与BG修饰的Ce6偶联。利用zeba旋转脱盐柱(7k MWCO)(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，洛克福德(Rockford)，IL)，通过凝胶过滤层析去除残余染料。采用相应染料的消光系数以及融合蛋白的理论消光系数对偶联的效率进行光度检测。通过SDS-PAGE分离后，用有蓝色或黄色滤波器的UV透照器Gel Doc XR凝胶成像(Bio-Rad实验室(Bio-Rad Laboratories)，慕尼黑，德国)或CRi Maestro成像系统(CRi,沃本(Woburn)，马萨诸塞州，美国)目测观察标记的蛋白。
流式细胞仪
采用FACSCalibur(贝克顿&迪克森公司，海德堡，德国)(Becton&Dickinson,Heidelberg,Germany)和CellQuest软件，通过流式细胞仪检测标记的和未标记的融合蛋白的结合效率。采用EGFR+细胞系A431、MDA-MB-231、MDA-MB468和SiHa测试scFv-425-SNAP的结合效率，EGFR-细胞系L540和CHO-K1作为阴性对照。对照融合蛋白scFv-Ki4-SNAP识别CD30抗原且必定会因此结合于L540细胞，而不与其他细胞系结合。约4×105个细胞在含有0.5μg标记蛋白的200μL PBS中，在冰上温育20分钟。采用1.8mL PBS，在常规细胞清洗器内将细胞洗涤两次，并用流式细胞术进行分析。
共聚焦显微术
采用TCS SP5共聚焦显微镜(莱卡微系统(LEICA Microsystem)，韦茨拉尔(Wetzlar)，德国)目测观察图像。如以上流式细胞术所述准备细胞。通过将细胞和标记的融合蛋白在冰上温育30分钟来测定结合效率。通过将细胞和标记的融合蛋白在37℃下温育30分钟来监测内化情况。
scFv-425-SNAP-Ce6的光毒性
用PBS洗涤如上所述培养的A431、MDA-MB-231、MDA-MB468、SiHa和CHO-K1细胞的等份试样(2×104)两次，然后用浓度增加的Ce6、scFv-425-SNAP-Ce6或Ki4-scFv/SNAP-Ce6处理，随后在37℃下温育3小时。对照培养物用500μg/ml的博莱霉素而非光敏剂进行温育。然后采用Hydrosun型505、7mm水比色皿和光谱范围580-1400nm的橙色滤光镜OG590(Hydrosun医疗技术股份有限公司(Hydrosun Medizintechnik GmbH)，米尔海姆(Müllheim)，德国)，细胞用24J/cm2宽频可见/远红外光照射细胞，然后于37℃、5％CO2环境下继续温育24小时。
光照激活24小时后，采用XTT细胞增殖试剂盒II(罗氏(Roche)，曼海姆(Mannheim)，德国)测定细胞活性。细胞用2,3-二(2-甲氧基-4-硝基-5磺酰基)-5[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓氢氧化物(1mg/ml)试剂温育，在37℃下温育2小时。采用ELISA酶标仪Elisareader ELx808(Bio-TEK,Bad Friedrichsahll，德国)，在吸收波长450nm、参照波长630nm下对活肿瘤细胞将XTT还原为甲臜(formazan)进行比色监测。
光照激活后24小时，采用Apo-ONE胱冬酶-3/7试验(普洛麦格(Promega)，曼海姆(Mannheim)，德国)测定细胞裂解物中的胱冬酶-3/7活性。简而言之，向细胞中加入100μl的Apo-ONE试剂，再温育六小时，然后在485nm激发波长和535nm的发射波长下，采用ELISA酶标仪Elisareader ELx808(Bio-TEK,Bad Friedrichsahll，德国)获取荧光读数。通过测定H2DCFDA(英杰公司，达姆施塔特，德国)的485/535nm荧光比对ROS的浓度进行了检测。简而言之，在50nM Ce6或200nM的scFv-425-SNAP-Ce6，以及10μM H2DCFDA的存在下，将2×104个细胞在含有1％FCS的30ml PBS中温育30分钟。采用含有2.5％FCS的温PBS洗涤细胞两次，然后将细胞在RPMI-160培养基中温育2小时，然后作如上光照。光照后直接取其荧光读数。采用空白探头(细胞和培养基)读数作为背景，并将其从所有样本读数中扣除。
数据分析
采用GraphPad Prism软件(GraphPad公司，圣地亚哥(San Siego)，加利福尼亚州)进行统计学分析以及曲线拟合。数据以平均值±MES表示。采用t分布检验和双相卡方检验评估独立实验中的显著性。p＜0.05的标准用于显著性差异的判断。
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Claims (10)

1.一种制备方法，所述方法用于如下式所示的卟啉衍生物
与一种化合物偶联，所述化合物包括结合蛋白，所述结合蛋白为scFv，其结合ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体，并共价结合于称为O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(hAGTm)的经修饰的人DNA修复蛋白；
其中，作为光敏剂的所述卟啉衍生物二氢卟吩e6的羧基至少部分与活化的酯反应，或通过偶联剂，然后与O6-苄基鸟嘌呤、O2-苄基胞嘧啶或辅酶A(CoA)反应；
从而使得所述的光敏剂偶联于O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的活性位点。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，O6-苄基鸟嘌呤、O2-苄基胞嘧啶或辅酶A(CoA)偶联于连接分子，PEG-24-NH2和/或通过琥珀酰亚胺或偶联剂形成所述活化的酯，所述偶联剂为碳化二亚胺。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述偶联剂选自下组：EDC、EDAC和DCC
4.通过权利要求1或2所述的方法制备的化合物，其中，如下式所示的卟啉衍生物
偶联于结合蛋白，所述结合蛋白为scFv，其结合ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体，并共价结合于称为O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(hAGTm)的经修饰的人DNA修复蛋白；
其中，作为光敏剂的所述卟啉衍生物二氢卟吩e6的羧基至少部分与活化的酯反应，或通过偶联剂，然后与O6-苄基鸟嘌呤、O2-苄基胞嘧啶或辅酶A(CoA)反应；
从而使得所述的光敏剂偶联于O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的活性位点。
5.如权利要求4所述的化合物，特异性靶向于内化和疾病特异性细胞表面受体。
6.如权利要求4或5所述的化合物，其特征在于，所述结合蛋白如SEQ ID NO.:1所示，其由SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸序列编码。
7.如权利要求4-5中任一项所述的化合物，所述结合蛋白如SEQ ID NO.:3所示，其由SEQ ID NO.:4所示的多核苷酸序列编码。
8.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，所述的结合蛋白如SEQ ID NO.:1或SEQ IDNO.:3所示。
9.一种药物，其含有权利要求4-8中任一项所述的化合物，和药学上可接受的佐剂，以便改进光免疫疗法相关的药学效应或可能赋予这种效应。
10.权利要求4-8中任一项所述的化合物的用途，用于制备药物，所述药物用于通过光免疫疗法治疗癌症。
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