JP5152474B2 - オリゴ糖、その製造方法、及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、新規オリゴ糖、その製造方法、及びその用途に関し、さらに詳細にはα−グルコシダーゼ阻害活性を有する新規なオリゴ糖、その製造方法、それを含有するα−グルコシダーゼ阻害剤に関する。

α−グルコシダーゼ阻害剤は、食後の急激な血糖上昇を抑制する作用があることから、高血糖に起因する糖尿病、肥満症等の生活習慣病の予防、治療に有用であるとして注目されている。その作用機序は、経口摂取された飲食品中のシュクロース、マルトース、イソマルトース等の二糖類を単糖に分解するα−グルコシダーゼ活性を阻害し、二糖類の単糖への分解を抑制して単糖の腸管からの吸収を遅延させることにある。
α−グルコシダーゼ阻害剤として、これまでにボグリボース（Ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）、アカルボース（Ａｃａｒｂｏｓｅ）等が知られている。これらの化合物は動物試験や臨床試験において食後の血糖値上昇抑制効果が確認されており、抗糖尿病作用、抗肥満作用も確認され（非特許文献１）、糖尿病治療薬として使用されている。
しかしながら、これらの化合物は、α−グルコシダーゼ阻害活性は非常に強いものの、本来生体に対して異物であり、その安全性については懸念が残されており、使用上の厳密な制限がある。

医薬品として投与されるα−グルコシダーゼ阻害剤に対して、阻害作用は緩慢であるが、副作用がほとんど無く、主として食品用に使用される天然物由来の糖質関連物質として、例えばＬ−アラビノースやＤ−キシロース等の糖類や、糖アルコール類、ヌクレオチド及びその構成成分等が知られている（特許文献１〜３）。また、糖誘導体としてのα−メチル−Ｄ−キシロシドを有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤も開示されている(特許文献４)。
Ｌ−アラビノースやＤ−キシロース等の糖類は還元性の単糖であるが、甘味料として使用する場合は着色しやすいという問題がある。糖アルコールは阻害活性が弱く、多量に使用すると下痢などの症状を伴うことがある。ヌクレオチド類も活性が弱く、味質の面でも問題がある。また、α−メチルキシロシドは、安全性についての検証が必要である。
一方、澱粉由来で、適度のα−グルコシダーゼ阻害活性を有するオリゴ糖については知られていない。

特開平６−６５０８０号公報 特開平８−２３９７３号公報 特開平８−２８９７８３号公報 特開平１１−２８６４４９号公報 日本農芸化学会誌、第６３巻、第２１７ページ、１９８９年

本発明の目的は、新規なオリゴ糖を提供することである。
本発明の他の目的は、安全性が高く、医薬品、飲食品、飼料等への使用が可能な、安定性に優れたα−グルコシダーゼ阻害活性を有する新規オリゴ糖を提供することである。
本発明のさらに他の目的は新規オリゴ糖を含有するα−グルコシダーゼ阻害剤を提供することである。

本発明者らは、澱粉を焙焼して得られる焙焼デキストリンを、酸加水分解し、次いでα−アミラーゼ及びグルコアミラーゼ消化して得られる低分子オリゴ糖画分がα−グルコシダーゼ阻害活性を有することを見出し、その中から比較的高含量で適度のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する新規なオリゴ糖を単離してその構造を決定した。本発明はこのような知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、以下に示すオリゴ糖及びその製造方法を提供するものである。
１．下記式（Ｉ）で表されるオリゴ糖。

（式中、Ｒ₁及びＲ₂は、独立して水素原子又はグルコース残基を表すが、同時に水素原子であることはない。）
２．下記式（ＩＩ）で表される、上記１に記載のオリゴ糖。

３．上記１又は２に記載のオリゴ糖を含む、α−グルコシダーゼ阻害剤。
４．焙焼デキストリンを酸で加水分解し、次いでα−アミラーゼ及びグルコアミラーゼで消化して得られる分解物から、上記１又は２に記載のオリゴ糖を採取することを特徴とする、上記１又は２に記載のオリゴ糖の製造方法。

本発明のオリゴ糖は、澱粉由来の安全性の高い、低分子で非消化性の化合物であり、α−グルコシダーゼ阻害活性を有する。本発明のオリゴ糖を含有するα−グルコシダーゼ阻害剤は、食後血糖値の急激な上昇を抑制し、過血糖を主体とする糖尿病の予防や治療、肥満の予防や抑制を意図した、医薬品、飲食品、飼料、ペットフード等への広範な利用が可能となる。

本発明の式（ＩＩ）で表されるオリゴ糖は、マルトトリオースの中央のグルコース残基にグルコースがβ−１，６結合で結合した４糖骨格を有する新規オリゴ糖である。
本発明のオリゴ糖は、各種糖質分解酵素に対して耐性で、α−グルコシダーゼ阻害活性を有することを特徴とする。

本発明において、α−グルコシダーゼとは、シュクロースをグルコースと果糖に分解するシュクラーゼ（インベルターゼともいう）及びマルトースをグルコースに分解するマルターゼのことをいう。
シュクラーゼ阻害活性及びマルターゼ阻害活性は、例えば次のようにして測定することができる。市販のラット小腸粘膜酵素のアセトンパウダーをマレイン酸バッファー中で均質化し、その遠心上清を酵素液とする。基質（シュクロース又はマルトース）及び試料とともにそれぞれ３７℃で反応を行い、生成するグルコースを経時的に測定してその生成速度を求め、下記式により、各酵素に対する阻害活性を算出する。
阻害活性（％）＝１００ｘ{Ａ−（Ｂ−Ｃ）}／Ａ
ただし、
Ａ：試料を含まない反応系におけるグルコース生成速度
Ｂ：試料を含む反応系におけるグルコース生成速度
Ｃ：基質を含まない反応系におけるグルコース生成速度

本発明のオリゴ糖の製造方法に限定はなく、化学合成、酵素的合成又はそれらを組合わせた合成、あるいは焙焼デキストリンの加水分解物からの抽出等の方法から適宜選択することができるが、例えば次のようにして製造することができる。
まず、澱粉を鉱酸（例えば、塩酸、硫酸、硝酸）の存在下で常法により焙焼して焙焼デキストリンを得る。これを例えば、０．３５％シュウ酸存在下、１２０〜１４０℃で１５〜３０分間加水分解して、平均糖鎖長が４〜８のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する分解物を得る。
次いで、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼ消化を行って大部分の消化性糖残基を単糖に分解する。得られた酵素消化物を脱色、脱塩、濃縮を行った後、ポリスチレン製強酸性イオン交換樹脂のカラムに通して生成した単糖の大部分を除去し、平均糖鎖長が３〜５のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する分解物を得る。これをルーズ逆浸透膜により分子量分画を行い、α−グルコシダーゼ阻害活性の高い低分子画分を得る。さらに分取逆相クロマトグラフィーを行って本発明のオリゴ糖を単離する。
このようにして単離されたオリゴ糖は、メチル化分析およびＮＭＲ測定によりその構造を決定する。

本発明のオリゴ糖は、水溶性の無味無臭白色粉末であり、各種消化酵素に耐性の、安定性及び安全性に優れた澱粉由来のα−グルコシダーゼ阻害剤として、過血糖症の予防及び治療を目的とした医薬品（例えば抗糖尿病薬及び抗肥満薬）、食後の血糖上昇抑制を目的とした各種飲食品、飼料、あるいはペットフード等への用途が可能である。

本発明のオリゴ糖を医薬品として使用する場合、投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与、又は注射剤等の非経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、溶解補助剤、コーティング剤等の既知の医薬製剤技術分野で通常使用可能な補助剤を用いて製剤化することができる。その使用量は、症状、年齢、体重、投与方法及び剤形等によって異なるが、通常は成人に対して一日０．１ｇ〜５ｇを一回又は数回に分けて投与することが好ましい。
本発明のオリゴ糖を飲食品、飼料として使用する場合は、飲食品、飼料中に本発明のオリゴ糖を０．１質量％以上含有していれば、その形態にとくに制限されることは無く、飲料、固形食品、半流動食品、ゲル状食品等、あらゆる食品、飼料形態に加工することが可能である。飲食品、飼料の風味等を妨げない限り上限は特に限定されないが、通常は、飲食品、飼料中、１０質量％以下が好ましい。

以下に実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、実施例によって本発明が限定されるものではない。
実施例１（オリゴ糖の単離）
焙焼デキストリン２０質量部を酸（シュウ酸を焙焼デキストリン１００質量部に対して０．３５質量部）により１２５℃で３０分間加水分解し、次いでα−アミラーゼ（ターマミル１２０Ｌ、ノボザイム社）を焙焼デキストリン１００質量部に対して０．２質量部加え、ｐＨ６．０で６０℃、６０分間作用させ、次いでｐＨを４．５に調整し、グルコアミラーゼ（グルクザイムＮＬ−４（天野エンザイム）を焙焼デキストリン１００質量部に対して０．１質量部加え、５５℃、２４時間加水分解した。
得られた加水分解物の平均重合度は３．５、食物繊維量は３８〜４５質量％であった。

なお、平均重合度はグルコースを標準としてＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で還元糖を、Ｐｈｅｎｏｌ−硫酸法で全糖を測定し（「還元糖の定量法」、学会出版センター１９９０年１０月２５日発行の９〜１１頁及び５０〜５２頁）、次式により算出した。
平均重合度 ＝全糖（質量％）÷還元糖（質量％）
また、食物繊維量は、衛新１３号（栄養表示基準における栄養成分等の分析方法等について）（「新開発食品ハンドブック」、中央法規出版（株）平成１１年９月２５日発行の４１５〜４２３頁）に記載されている高速液体クロマトグラフ法（酵素‐ＨＰＬＣ法）により測定した。

この加水分解物１２．５ｋｇを水５０ｋｇに溶解し、擬似移動床クロマトグラフィー（樹脂：ＣＲ１３２０Na型、オルガノ社製、１１Ｌを充填したもの）に通し、大部分のグルコースを除去した組成物（平均重合度５．３、食物繊維量９０質量％）５．１ｋｇを得た。その一部をスルホン化ポリエーテルスルホン系ルーズＲＯ膜ＮＴＲ７４５０（食塩の阻止率５０％、日東電工）で分画を行い、その膜透過液を全芳香族ポリアミド系ルーズRO膜ＮＴＲ７５９（阻止率９９．５%、日東電工）にてさらに分画を行い、濃縮液（固形分１．８ｇ）を得た。得られた濃縮液を、ＯＤＳカラム：ＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＢＰ、２０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍＬ（ダイソー（株）、溶出：蒸留水、カラム温度：室温、流速：３ｍｌ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーによってさまざまなオリゴ糖を単離し、その中でマルターゼに対する阻害活性の高いオリゴ糖２３．９ｍｇを得た（図１）。

実施例２（オリゴ糖の構造解析）
実施例１で得られたオリゴ糖を、メチル化分析およびＮＭＲ解析により構造解析を行なった。
メチル化分析はＣｉｕｃａｎｕらの方法に従った。すなわち、オリゴ糖のすべての水酸基をメチル化し、次いで酸加水分解して部分メチル化単糖とした。これを還元して糖アルコールとし、次いでアセチル化して部分メチル化アルジトールアセテートを得た。これを試料にして、キャピラリーカラムＤＢ−２２５(Ｊ&Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ)を用いてＧＣ−ＭＳにより分析した結果、１,５−ジ−Ｏ−アセチル−２,３,４,６−テトラ−Ｏ−メチルへキシトール（図２のピークＡ）と１,４,５,６−テトラ−Ｏ−アセチル−２,３−ジ−Ｏ−メチルへキシトール（図２のピークＢ）が２：１で検出された（図２）。
ＮＭＲ解析は、ＣＯＳＹ、ＨＯＨＡＨＡ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣの２次元ＮＭＲを測定した（図３−６）。その結果から得られたケミカルシフトを表１に示す。

*ND：not determined

メチル化分析及びＮＭＲ分析の結果から、実施例１で得られたオリゴ糖は、式（ＩＩ）で表される、新規なα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）］−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコピラノシドであると決定した。

実施例３（オリゴ糖のマルターゼ阻害活性）
市販ラット小腸粘膜酵素アセトンパウダー（シグマ）を０．１Ｍマレイン酸バッファー(ｐＨ６．０)で懸濁(１５ｇ／１００ｍｌ)し、ホモジナイズした後、３０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、その上清を粗酵素液とした。基質としてマルトースを０．１Ｍマレイン酸バッファー(ｐＨ６．０)に溶解し、０．１Ｍの溶液を調製した。また被検物質も０．１Ｍマレイン酸バッファー(ｐＨ６．０)に溶解し、１．２%の溶液を調製した。
反応液の組成は０．１Ｍマレイン酸バッファー(ｐＨ６．０)４６４μＬ、マルトース溶液３６μＬ、各被検液５０μＬおよび８倍希釈した粗酵素液５０μＬを混合し、計０．６ｍＬとした。
反応は、３７℃で行い、反応時間１、１０、２０分で反応溶液１５０μＬを０．５Ｍ過塩素酸５０μＬと混合して反応を停止し、酵素反応で生成したグルコース量をグルコースCIIテストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。各反応でのグルコース量の経時変化から１分当たりのグルコース生成速度を求め、下記の式により阻害活性を算出した。

阻害活性（％）＝｛Ａ−（Ｂ−Ｃ）｝／Ａ×１００
Ａ：被検物質無添加でのグルコース生成速度
Ｂ：被検物質添加でのグルコース生成速度
Ｃ：被検物質のみでのグルコース生成速度
これらの結果を表２に示した。
表２に示したとおり、新規オリゴ糖は、マルターゼに対して強い阻害活性を持つことが知られているＤ―キシロースより強い阻害活性を示した。同じ分岐オリゴ糖であるイソマルトース、セロビオース、ゲンチオビオースおよびイソマルトトリオースの阻害活性は非常に弱く、またパノースにおいても強い阻害活性を示すものの、新規オリゴ糖の阻害活性はパノースの約1.8倍であることから、新規オリゴ糖のマルターゼに対する阻害活性が非常に強いことが判明した。

本発明のオリゴ糖をHPLCで分離したときのチャートを示す。 Ｃｉｕｃａｎｕらの方法でメチル化した試料をＧＣ−ＭＳ分析した結果のチャートを表す。図中、ピークＡ及びＢは、それぞれ１,５−ジ−O−アセチル−２,３,４,６−テトラ−O−メチルへキシトール及び１,４,５,６−テトラ−Ｏ−アセチル−２,３−ジ−Ｏ-メチルへキシトールのピークを示す。 ＣＯＳＹにより測定した２次元NMRスペクトルを表す。 ＨＯＨＡＨＡにより測定した２次元NMRスペクトルを表す。 ＨＳＱＣにより測定した２次元NMRスペクトルを表す。 ＨＭＢＣにより測定した２次元NMRスペクトルを表す。

Claims (2)

1. 下記式（ＩＩ）で表されるオリゴ糖を有効成分として含むα―グルコシダーゼ阻害剤。
   

   
2. 焙焼デキストリンを酸で加水分解し、さらにα−アミラーゼ、次いでグルコアミラーゼで消化して得られる分解物から、ルーズ逆浸透膜による分画及び分取逆相クロマトグラフィーにより、請求項１に記載のオリゴ糖を採取することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴ糖の製造方法。

Images