JP5461872B2 - アラビノシルビテキシンを含有する経口摂取用組成物の製造方法とその用途 - Google Patents
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Description
また、本発明は、前記経口摂取用組成物からなる飲食品、医薬品に関する。
一般的には植物のフラボノイドは、酵素作用を受けやすい‘O−グルコシドフラボノイド’(O−グルコシド骨格を有するフラボノイド配糖体)、もしくは水不溶性の‘アグリコン’(構成糖を含まないフラボノイド)の形態で存在している場合がほとんどである。
しかし、C−グルコシドフラボノイドは、それを含有する原料の植物自体ならびにその含有量も非常に少なく(非特許文献2)、効率よい抽出法の試みもみられる(特許文献1)が、十分な状況ではない。また、例えば、Cotoneaster thymaefoliaという植物(バラ科コトネアスター属、中国・ヒマラヤに分布する低木)の葉に、C−グルコシドフラボノイドの一種である2''−O−α−D−アラビノフラノシルビテキシンが含有されることが知られている(非特許文献3参照)が、植物原料の大量入手が困難である。加えて、当該植物は食用植物ではなく、当該植物のC−グルコシドフラボノイドを抽出する原料としての当該植物の利用は現実的ではない。
また、アラビノフラノシルビテキシンは、加水分解することで、アラビノース部分とビテキシン(C−グルコシドフラボノイドの本体)に、容易に分離できることを見出した。
即ち、請求項1に係る本発明は、ツルムラサキ(Basella alba)を原料として用いることを特徴とする、アラビノフラノシルビテキシンの抽出方法を提供するものである。
請求項2に係る本発明は、前記アラビノフラノシルビテキシンが、2''−O−α−D−アラビノフラノシルビテキシンである、請求項1に記載の抽出方法を提供するものである。
請求項3に係る本発明は、前記抽出方法が、前記原料であるツルムラサキを刻むか、砕片化するか、擂潰するかのいずれかの処理を行う工程、;その後、溶液抽出を行って抽出液を得る工程、;を含むものである、請求項1又は2に記載の抽出方法を提供するものである。
請求項4に係る本発明は、前記抽出方法が、エタノールを用いて溶液抽出を行って抽出液を得る工程、;を含むものである、請求項1〜3のいずれかに記載の抽出方法を提供するものである。
請求項5に係る本発明は、前記抽出方法が、前記抽出液を得た後、カラムを用いて精製する工程、;を含むものである、請求項3又は4に記載の抽出方法を提供するものである。
請求項6に係る本発明は、2''−O−α−D−アラビノフラノシルビテキシンを有効成分として含有する鎮静剤および/または睡眠導入剤を提供するものである。
即ち、本発明では、有効成分の抽出原料として、葉菜として容易に入手が可能なツルムラサキを用いるため、原料の入手が極めて容易である。また、経口摂取の上でも安全性が高いものである。
また、本発明の有効性分である化合物(C−グルコシドフラボノイド)は、‘水への溶解性も高く’さらに‘配糖体として分解し難く安定性の高い’性質を有するため、様々な処理等を伴う幅広い加工品への応用も可能となる。
本発明は、ツルムラサキ(Basella alba)を原料として用いることを特徴とする、アラビノフラノシルビテキシンおよび/またはその加水分解物であるビテキシンを含有する経口摂取用組成物の製造方法に関し、詳しくは、前記化合物を有効成分として含有する、鎮静作用および/または睡眠導入作用を有する経口摂取用組成物の製造方法に関する。
本発明の原料として用いるツルムラサキの植物体の部位としては、植物体のどの部分を用いてもよいが、その含有量の点で地上部(主に葉、茎)が好ましい。なお、地上部(主に葉、茎)は、葉菜であるツルムラサキの可食部分である。
また、生の植物体、乾燥物、加熱処理品、凍結品、等を用いることができるが、特には、生の植物体、乾燥物を用いることが好ましい。なお、後記した抽出工程において、‘水を全く含まない溶媒’(例えば、100%のエタノール等)を用いる場合には、原料としても水分を含まない乾燥物を用いることが望ましい。
当該工程は、前記原料であるツルムラサキを、いくつかの破片に大きめに刻むこと、細かい小片に細断すること、破砕すること、擂り潰すこと、等、幅広い行為を含むものである。好ましくは、1〜数cm程度に大きめに刻んだ状態にすることによって、行うことができる。
従って、本発明の経口摂取用組成物の製造において、アラビノフラノシルビテキシンを含有させるためには、前記ツルムラサキの植物体原料(好ましくは上記のようにこれを刻むか、砕片化するか、擂潰するかのいずれかの処理を行ったもの)を含有させればよく、例えば、当該原料(好ましくは上記のようにこれを刻むか、砕片化するか、擂潰するかのいずれかの処理を行ったもの)をそのまま用いて含有させて組成物の形態にすることもできる。
しかしながら、純度の点を鑑みると、本発明の経口摂取用組成物の製造においては、溶液抽出を行って抽出液を得ることが望ましい。
溶液抽出工程に用いる溶媒は、水、緩衝液、有機溶媒、またはそれらの含水溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノールのような低級脂肪族アルコールや、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム等が挙げられる。
これらの溶媒の中でも、水、エタノールあるいは含水エタノールが抽出効率や取り扱いやすさ、安全性の面で特に好ましい。
また、特には、終濃度55%以上、好ましくは終濃度60%以上、さらに好ましくは終濃度80%以上のエタノールを用いて抽出を行うことで、不純物である多糖類の溶出を抑制でき、アラビノフラノシルビテキシンの抽出効率を向上できるため好ましい。
得られた抽出液は、凍結乾燥やエバポレーター等を用いて乾燥させることで、濃縮乾固物とすることができる。
また、溶液抽出工程は、異なる複数の溶媒で、複数回行うこともできる。特に、一度目の抽出を水や低濃度の含水アルコールで行った場合、次に前記特定濃度以上のエタノールを用いた抽出を行うことで、2''−O−α−D−アラビノフラノシルビテキシンの抽出効率を向上させることができる。
なお、酵素や酸による加水分解処理は、前記抽出工程の後に、独立した工程として行うこともでき、後記した精製工程後に行うこともできる。
また、これらに対して、精製工程を行うことによって、純度をさらに高めることができる。
例として、「2''−O−α−D−アラビノフラノシルビテキシン」を高純度化するための精製条件を例示する。
まず、前記加水分解処理を行っていない抽出液(具体的には終濃度60%以上のエタノール抽出を経た抽出液)の‘濃縮乾固物’の水可溶物を、水で平衡化した多孔性合成吸着樹脂(具体的には、ダイヤイオンHP−20〔三菱化学社製〕)のカラムに供する。そして、水溶出する成分を除去した後、15〜30%エタノール(具体的には約20%エタノール)で溶出される溶出する液を回収することにより、高純度化した「2''−O−α−D−アラビノフラノシルビテキシン含有組成物(精製物)」を得ることができる。
なお、上記括弧内に記載した好適な条件で抽出および精製を行うことにより、純度80%以上の2''−O−α−D−アラビノフラノシルビテキシン含有組成物(精製物)を得ることができる。
また、‘他の分子構造を有するアラビノフラノシルビテキシン’や‘加水分解物であるビテキシン’についても、エタノールの好適範囲が上記と若干異なることを除いて、上記とほぼ同様の操作で精製を行うことが可能である。
これらは、アグリコンと構成糖の結合がC−グリコシドであるため、加熱、加水分解、酵素等に対して分解され難く、フラボノイド配糖体として安定性の高い化合物である。また、これらは配糖体であるので水溶解性を有するが、特に、アラビノフラノシルビテキシンは水溶解性に優れる。
なお、前記したように、抽出工程の際、抽出工程の後、精製工程の後に、加水分解処理を行うことで、ビテキシンを分離することができる。
従って、前記化合物を含有する経口摂取用組成物は、鎮静作用および/または睡眠導入作用を有するものである。
なお、本発明における経口摂取用組成物は、鎮静作用と睡眠導入作用の両方の生理活性機能を有するものであるが、有効成分である前記化合物の摂取量が少ない場合には、鎮静作用のみが奏される可能性がある。
すなわち、上記工程で得られる各組成物(‘原料を直接含有する組成物’‘溶液抽出物’‘精製物’)や、‘単離物’を、各種原料に混合した組成物とすることで、食品や医薬品の形態として製造することができる。
なお、本発明における有効成分である前記化合物は、C−グルコシドフラボノイドであるため、加熱や加水分解に対して構成糖とフラボノイド部分との結合が安定であると同時に、水への溶解性に優れる物質である。従って、O−グルコシドフラボノイドやそのアグリコンを用いた場合では応用が難しいとされた形態への応用も可能となる。
また、医薬品である剤の形態としては、粉末状、砕粒状、顆粒状、などとすることができ、カプセルに充填する形態の他、水に分散した溶液の形態、賦型剤等と混和して得られる錠剤の形態、などにすることができる。
(1)アラビノシルビテキシンの抽出および精製
生のツルムラサキ(Basella alba)地上部(主に葉)5kgを刻んで砕片し、80%エタノール15Lを加えて室温で3日間抽出し、抽出液を得た。
次に、得られた抽出液を、ろ紙フィルターでろ過し、ろ液をロータリエバポレータで濃縮乾固した。そして、水1Lを加えて水溶成分を抽出し、遠心分離により上清を得た。
得られた上清をあらかじめ水で平衡化したダイヤイオンHP20(多孔性合成吸着樹脂カラム)に供し、3Lの水で非吸着成分を除いた後、2Lの20%エタノールで溶出させた。
そして、得られた溶出液を、ロータリエバポレータで濃縮乾固し、約85%純度のアラビノシルビテキシン精製物5.8gを得た。なお、得られた精製物におけるアラビノシルビテキシンの純度は、分取HPLCカラム(TSK GEL ODS、東ソー社製、4.6mm×25cm)に供し、25%(v/v)アセトニトリルの移動層によって、ピーク面積比より測定した。
上記で得られたアラビノシルビテキシン精製物200mgを、TSK GEL ODS(東ソー社製、20mm×25cm)分取HPLCカラムに供し、20%(v/v)アセトニトリルの移動層で溶出し、目的のピーク画分を採取してアラビノシルビテキシンの純品を単離した。
そして、得られたアラビノシルビテキシン単離物について、MALDI−TOFマススペクトル(アプライドバイオシステム社製)によって、分子量を測定した。
また、1H−NMR、13C−NMRにより構造解析を行った。測定装置としては、JNM−AL400(NMR)(日本電子社製)を用いて、1H−NMRは400MHzで、13C−NMRは100MHzで、DMSO−d6におけるシグナルを検出することによって測定を行い、本物質の1Hと13Cについて、δH(ppm)とδC(ppm)を測定した。結果を表1に示す。
なお、表1において、δH(ppm)の数値右の記号は、シグナル分裂のパターンを表し、「s」はシングレット、「d」はダブレット、「dd」はダブルダブレット、「m」はマルチプレットを表す。
以上の解析結果から総合的に得られた分子構造式および1H−1HCOSYおよびHMBCシグナルについてまとめたものを図1に示す。
また、NMRによる本物質の1Hと13Cに関するδH(ppm)とδC(ppm)の測定結果について、COSYならびにHMBCの解析を行った結果から、全炭素シグナルのうち、107.6ppm(No.1''')、82.0ppm(No.2''')、75.7ppm(No.3''')、82.7ppm(No.4''')、58.9ppm(No.5''')が、アラビノースを構成する炭素であると示唆された。
また、同様の解析から71.8ppm(No.1'')、74.6ppm(No.2'')、79.1ppm(No.3'')、70.7ppm(No.4'')、81.7ppm(No.5'')、61.6ppm(No.6'')が、グルコースを構成する炭素であると示唆された。
なお、その他の炭素、水素シグナルについても同様の解析を加えたところ、ビテキシン構成炭素、水素に帰属することが明らかになった。
これに対応するメチルプロトン(4.91ppm)から、グルコースを構成する74.6ppmの炭素(No.2'')にHMBCシグナルが観測された。
このことから『アラビノース1'''位とグルコース2''位とが、直接グルコシド結合する』ことが示唆された。
(1)アラビノシルビテキシンの精製
実施例1の(1)で得られた約85%純度のアラビノシルビテキシン精製物1.5gを、クロロホルム/メタノール/水(65:25:4)の溶媒系で、フラッシュクロマトグラフィー(Hi FLASH カラム、26×100mm、シリカゲル40μm 30g 山善社製)を行い、目的画分を採取した。
エバポレータおよび窒素気流下で濃縮乾固し、アラビノシルビテキシン単離物(TCLで単一スポットを示す)720mgを得た。
上記(1)で得られたアラビノシルビテキシン単離物を用い、鎮静および睡眠導入効果を検討した。ICRマウス40〜45gを6匹ずつ用い、被検物の経口投与を行った。
被検物として生理食塩水に溶解した‘アラビノシルビテキシン(100mg/kg体重)’を経口投与した。なお、陽性対照群としては睡眠導入効果のある‘ジアゼパム(2mg/kg体重)’を生理食塩水に溶解したものを、また陰性対照群としては‘生理食塩水のみ’を、それぞれ経口投与した。
そして、被検物の経口投与の45分後に、マウスの行動が活発化するチオペンタールナトリウム(30mg/kg体重)の腹腔内投与を行って、マウスケージ(17cm×27cm)に1匹ずつ入れた。
そして、チオペンタールナトリウムの投与開始から40分後までの間において、動き回り行動を1分以上止めて睡眠状態に入った時間の総時間を計測することで、鎮静および睡眠導入効果の判定を評価した。
なお、図2において、「**」は、Dunnet多重比較検定によって、危険率1%未満(p<0.01)で陰性対照群に比べて有意差があることを示す。
実施例1の(1)で得られた約85%純度のアラビノシルビテキシン精製物1gに0.4N HClを100ml添加して100℃で20分間加熱し、3,000rpmで15分間、遠心分離することにより、不溶物を得た。
この不溶物に水20mlを加えて懸濁し、3,000rpmで15分間、遠心分離することにより、再度不溶物を得た。この操作を3回繰り返した。
次に、得られた不溶物にエタノール10mlを加えて攪拌し、同様に遠心分離を行い不溶物を得た。この操作を3回繰り返した。そして、得られた不溶物の残存するエタノールを乾燥し、純品の‘ビテキシン’480mgを得た。
尚、得られた物質がビテキシンであることは、HPLC分析において、標準試薬のビテキシン(8−β−D−グルコピラノシル−アピゲニン)(ChromaDex, Inc社製)と保持時間、UVスペクトラムが一致することからも確認できた。
Claims (6)
- ツルムラサキ(Basella alba)を原料として用いることを特徴とする、アラビノフラノシルビテキシンの抽出方法。
- 前記アラビノフラノシルビテキシンが、2''−O−α−D−アラビノフラノシルビテキシンである、請求項1に記載の抽出方法。
- 前記抽出方法が、前記原料であるツルムラサキを刻むか、砕片化するか、擂潰するかのいずれかの処理を行う工程、;その後、溶液抽出を行って抽出液を得る工程、;を含むものである、請求項1又は2に記載の抽出方法。
- 前記抽出方法が、エタノールを用いて溶液抽出を行って抽出液を得る工程、;を含むものである、請求項1〜3のいずれかに記載の抽出方法。
- 前記抽出方法が、前記抽出液を得た後、カラムを用いて精製する工程、;を含むものである、請求項3又は4に記載の抽出方法。
- 2''−O−α−D−アラビノフラノシルビテキシンを有効成分として含有する鎮静剤および/または睡眠導入剤。
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