CN101401829A - 一种野金柴活性提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种野金柴提取物及其制备方法和应用。本发明所述的野金柴活性提取物以江西野金柴壳斗科植物多穗石柯(Lithocarpus polystachyus(wall)Rehd或L.litseifolius(Hamce)Chun.)药材为原料，采用低温差压式提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、柱色谱法、膜分离浓缩技术、喷雾干燥技术、冷冻干燥技术中任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备。其特征在于采用现代先进的低温差压式提取技术配合膜分离浓缩技术、喷雾干燥技术制备野金柴活性提取物，利用大孔吸附树脂、聚酰胺分离富集技术配合冷冻干燥技术制备高纯度的野金柴总黄酮提取物。本发明野金柴活性提取物含有10～90％总黄酮，该活性提取物保肝降脂、抗2型糖尿病及糖尿病并发症等药理活性高于常规水提物、醇提物。

Description

一种野金柴活性提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及野金柴一种活性提取物和应用。

技术背景

野金柴来源主要有蔷薇科野金柴、绣球花科土常山、壳斗科多穗石柯、葡萄科显齿蛇葡萄等植物的幼嫩梢、叶。本发明所指野金柴，亦称野金柴主要来源于江西壳斗科植物多穗石柯(Lithocarpus polystachyus(wall)Rehd或L.litseifolius(Hamce)Chun.)全部植株或任何部位，如根、根茎、茎、叶、花穗等。多穗石柯以野生状态分布于长江以南各省区海拔400米以上的低山密林中.尤以江西、广西、湖南、安徽等省资源丰富而集中，广东、云南、四川、福建等省次之，以江西、福建交界的武夷山脉分布最广，资源极为丰富。野金柴提取物主要用于制备甜味剂与着色剂，还用于清热利尿，防治湿热痢疾，皮肤瘙痒，痈疽恶疮。长期饮用该茶，能滋肝养胃，清热润肺，生津止渴，提神解乏，降压减肥，对高血压及冠心病有疗效。

对于多穗柯叶的研究多集中于用作茶和提取甜味剂及色素的原料，其香气浓郁，色泽鲜艳，味甘甜持久，风味独特。杨永耀等(野生野金柴的开发与利用，茶叶机械杂志，2000年02期)对野生植物多穗柯嫩叶的水浸提液进行了理化成分分析，结果表明，该浸提液营养丰富，富含人体所需的17种氨基酸及多种微量元素、维生素以及多种黄酮类成分。王雅茜(多穗柯的研究与应用，中国野生植物资源，1999年第18卷第4期)报道从多穗柯提取物中分离得到三种二氢查尔酮葡萄糖甙、根皮甙、三叶甙和3-羟基根皮甙。其中以三叶甙含量最高，达95％，其甜度为蔗糖的300倍。而从湖南野金柴提取物中分离到两种含量极高的天然甜素，总含量为12.6％，经化学结构鉴定为二氢查尔酮-葡萄糖甙，指出多穗柯提取物中还存在八种三萜类化合物，为齐墩果烷，达玛烷，环菠萝蜜烷等类物质，此类化合物可能是野金柴止咳有效成分。另外，多穗柯浸提液还含有K、Na、Ca、等常量元素及多种人体必需的微量元素，氨基酸，维生素。李晚谊等(云南野金柴过敏有效成分初步研究，云南大学学报，2001年第23卷第6期)从云南野金柴(多穗柯)的乙酸乙酯提取物中分离得到具有抑制透明质酸酶活性的2个化合物，经光谱分析、化学反应和文献对照等方法，初步鉴定证实有效成分为二氢查尔酮-2’-β-D-吡喃葡萄糖甙(dihydrochareone-2’-β-D-glu-copyranoside)和二氢查尔酮-4’-β-D-吡喃葡萄糖甙(dihydrocharcone4’-β-D-glucopyranoside)。穗柯棕色素是由叶提取、分离，其产率可达干叶重的10％左右，属酚酸类化合物。该色素能用于糖果、冷饮、饮料、配制酒及糕点等的着色，亦可用于药品的糖衣着色，已由卫生部批准实施标准为GB2760-36。

诸多关于多穗石柯叶化学成分及其药理作用的研究，其应用也局限于保健茶、饮料及其甜味成分的研究，具茶、糖、药三种经济价值为一身的野金柴，对其“药”方面的功效急待开发，而江西野金柴在此方面的研究报道更少，且无制剂方面的报道。本发明对江西野金柴进行药学、药效学的全面研究，采用现代先进的低温差压式提取技术配合膜分离浓缩技术、喷雾干燥技术制备野金柴活性提取物，利用大孔吸附树脂、聚酰胺分离富集技术配合冷冻干燥技术制备高纯度的野金柴总黄酮提取物，且其保肝降脂、抗2型糖尿病及糖尿病并发症等药理作用优于常规水提物、醇提物；根据需要制成了胶囊、片剂、丸剂等剂型，方法简单，操作简便，利于工业生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有明确指标的野金柴活性提取物。

本发明的另一目的是提供该种野金柴活性提取物的制备方法。

本发明所指的野金柴，特指为江西壳斗科植物多穗石柯(Lithocarpuspolystachyus(wall)Rehd或L.litseifolius(Hamce)Chun.)全部植株或任何部位，如根、根茎、茎、叶、花穗等，还包括经过各种炮制方法的炮制品。

本发明所述的野金柴活性提取物，含有10％～90％总黄酮，其颜色为淡黄色至棕色。定性鉴别实验显示：盐酸-镁粉反应呈阳性。更进一步地，该野金柴活性提取物，含有45％～60％的总黄酮。

本发明所述的野金柴活性提取物高效液相指纹图谱285nm检测有26个特征峰，其中6个峰为主要峰，占总峰面积的89％以上；提取物高效液相指纹图谱345nm检测有26个特征峰，其中14个峰为主要峰，占总峰面积的95％以上。

本发明所述的野金柴活性提取物用浓度2％～6％(体积比)的盐酸水解，水解温度90℃，水解时间为60分钟，高效液相指纹图谱有4个特征峰，当盐酸浓度达到6％但低于12％时色谱图中细小的峰明显增多，盐酸浓度的增高化合物被水解成的碎片越多，当浓度达到12％时，高效液相指纹图谱中无色谱峰，化合物基本被水解氧化完全。

本发明所述的总黄酮含量检测方法采用以柚皮苷为对照品，紫外分光光度法；总黄酮含量检测方法参照药典2005年版，附录VA紫外-可见分光光度法。

本发明所述的野金柴活性提取物中黄酮类成分，可以与碱氢氧化钠、氢氧化钾中的任一种和金属盐碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、醋酸锌中的任一种，形成的金属盐类衍生物以及与铁、铝、锌、铜、钡、铬、锶中的任一种金属离子形成的金属离子络合物，这些衍生物和络合物具有与上述野金柴总黄酮提取物相同或相近的药理活性或用途。

本发明的所述的野金柴提取物制备方法：溶剂提取法、低温差压式提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、柱色谱法、膜分离浓缩技术、喷雾干燥技术、冷冻干燥技术中任意一种方法或这些方法的任意组合进行制备。其中优选为低温差压式提取法、大孔吸附树脂法、聚酰胺柱色谱法、膜分离浓缩技术、喷雾干燥技术、冷冻干燥技术。优选地，本发明开创性使用低温差压式提取法对野金柴进行提取，并发现获得的提取物具有非常好的性质。

在使用这些方法进行制备时，包括以下几个步骤：

(1)提取：所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或是由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂；提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、低温差压式提取等。

优选的提取工艺为：

野金柴药材加0～95％乙醇，回流提取2～3次，每次提取1～2小时，溶剂用量为5～20倍量(ml/g)。

野金柴药材经粉碎机械解碎为粒度为10mm以下的颗粒，加入0～80％乙醇10～50倍量，搅拌保持动态，在-35℃～40℃，“常压-真空-加溶媒-常压-加压-常压”不断循环进行差压提取，真空度根据需要保持在13.33Pa～1.00MPa，压力根据需要保持在1MPa～25.00MPa，循环次数根据需要选择4～8次。

(2)过滤：包括离心、抽滤、超滤、微滤等方法，使用或不使用以下任一种澄清剂或其组合：醇沉液剂、明胶、高岭土、硅澡土、各种树脂、聚乙二醇、聚乙三醇、壳聚糖以及天然澄清剂成品101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂中的任一种。

(3)浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发、煎煮浓缩、膜浓缩技术、悬浮冷冻浓缩、渐进冷冻浓缩、自然外循环两相流浓缩、外循环式冷冻浓缩、喷雾冷冻浓缩中的任一种。

(4)干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥中的任一种。

当采用溶剂萃取法进行制备时，先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、醚类溶剂萃取除去脂溶性杂质，然后用合适的溶剂，可以是氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇中的一种，或是这些溶剂的混合物，萃取获得野金柴总黄酮类成分。

当使用大孔吸附树脂法进行制备时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、极性、弱碱性或弱酸性任何一种类型，可以是D101、X-5、NKA、S-8、NKA-9、HPD-600、ADS-7、AB-8、LSA-5B、HPD-722、ADS-17、DM130、HPD-826、DN-300、DN-603、FL-1、FL-2、FL-3中的任一种，其中优选的为弱极性、中等极性或极性的树脂，包括AB-8、ADS-17、HPD-600中的任一种，所用的洗脱剂可以为水、含水乙醇、甲醇、丙酮中的任一种，其中优选为0～100％乙醇。

当使用柱色谱以聚酰胺为固定相时，所用的层析聚酰胺树脂是30-60目、60-120目、100-120目，其中优选为30-60目的树脂，所用的洗脱剂为水、含水乙醇、甲醇、丙酮中的任一种，其中优选为0～100％乙醇。

优选野金柴总黄酮类成分纯化工艺为：选用包括AB-8、ADS-17、HPD-600中的任一种弱极性、中等极性或极性的大孔吸附树脂和30～60目的层析聚酰胺树脂作为纯化用树脂，野金柴提取物以生药量计上样液稀释倍数为1∶5～1∶10，吸附流速2～5BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶10，以生药量计上样量为0.1～1g/ml，以1～4倍树脂体积的纯化水除杂，除杂流速为2～5BV/h，用10％～95％乙醇洗脱2～8倍树脂体积，洗脱流速为2～5BV/h。

当采用柱色谱法进行制备时，其处理对象可以是上述提取步骤所获得的产物，也可以是上述溶剂提取法、溶剂萃取法或大孔吸附树脂法初步纯化后的产物。所用的固定相可以是硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡聚糖、C-8、C-18、活性炭、纤维素中的任一种，所用的洗脱液因固定相的不同而不同，一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚中任一种或几种组成的混合溶剂。

当使用膜分离浓缩技术时，其微滤截留直径大小在0.1μm以上的物质；超滤截留分子量在1000～500000之间的可溶性物质；纳滤截留分子量在150以上、直径在1nm左右的物质。其使用的材质可以是有机类包括醋酸纤维素、聚丙稀、聚碳酸酯、聚砜、聚酰胺和无机类包罗陶瓷、金属、金属氧化物、炭、多孔玻璃。

该提取物可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料、巴布剂中的任一种。

本发明所述倍数是指溶剂体积用量(ml)是药材质量用量(g)的倍数。

本发明所述的乙醇浓度是指体积浓度(v/v)。

本发明所述的野金柴活性提取物制备方法原料丰富，制作工艺简易方便。

本发明所述的野金柴活性提取物在制备治疗高血脂、冠心病等心血管系统疾病和脂肪肝、糖尿病及糖尿病并发症等疾病药物中的应用。

附图说明

图1是野金柴提取物紫外扫描图谱。

图2a、b是野金柴总提取物的HLPC指纹图谱(285nm和345nm)。

图3a、b是野金柴提取物的2％盐酸水解后的HPLC图谱(285nm和345nm)。

图4a、b是野金柴提取物的4％盐酸水解后的HPLC图谱(285nm和345nm)。

图5a、b是野金柴提取物的6％盐酸水解后的HPLC图谱(285nm和345nm)。

图6是与正常组比较的模型组糖尿病大鼠血清糖化血清蛋白(GSP)、甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、肾组织过氧化产物(MDA)水平。

具体实施方式

所涉及的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段，但以下实施示例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。

实施例1

野金柴药材5kg，经粉碎机械解碎为粒度为10mm以下的颗粒，加入20倍量的水，搅拌保持动态，在0℃～5℃的条件下，通过“常压-真空-加溶媒-常压-加压-常压”不断循环进行差压提取，真空度保持在14Pa，压力保持10.00MPa，进行4次循环提取。将提取液经固液分离机械进行固液分离至澄清，得澄清的提取液，将澄清的提取液连续进行微滤和超滤得浓缩液，喷雾干燥得野金柴总提取物。以柚皮苷为对照品，紫外分光光度法测定野金柴活性提取物中总黄酮含量约为60％。

实施例2

取野金柴药材5kg，经粉碎机械解碎为粒度为10mm以下的颗粒，加入20倍量的工艺用水，搅拌保持动态，在0℃～5℃，“常压-真空-加溶媒-常压-加压-常压”不断循环进行差压提取，真空度保持在14Pa，压力保持10.00MPa，进行4次循环提取。将提取液经固液分离机械进行固液分离至澄清，得提取液。取提取液200ml，加等倍量水稀释，过AB-8型大孔吸附树脂，水洗至无色，70％乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，干燥得野金柴活性提取物。以柚皮苷为对照品，紫外分光光度法测定野金柴活性提取物中总黄酮含量约为48％。

实施例3

取野金柴药材5kg，经粉碎机械解碎为粒度为10mm以下的颗粒，加入20倍量的工艺用水，搅拌保持动态，在0℃～5℃，“常压-真空-加溶媒-常压-加压-常压”不断循环进行差压提取，真空度保持在14Pa，压力保持10.00MPa，进行4次循环提取。将提取液经固液分离机械进行固液分离至澄清，得提取液。取提取液200ml，加等倍量的水稀释，过聚酰胺柱(30～60目)，水洗至无色，80％乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，干燥得野金柴活性提取物。以柚皮苷为对照品，紫外分光光度法测定野金柴活性提取物中总黄酮含量约为52％。

实施例4

取野金柴低温差压式提取物的喷雾干燥药粉15g，加蒸馏水200ml使溶解，过AB-8大孔吸附树脂，水洗至无色，然后70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，过聚酰胺柱(30～60目)，水洗至无色，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，干燥得野金柴活性提取物。以柚皮苷为对照品，紫外分光光度法测定野金柴提取物中总黄酮含量约为45％。

实施例5

取野金柴低温差压式提取物的喷雾干燥药粉100g，加等倍量羧甲基淀粉钠，混匀，干压制粒，装胶囊，得胶囊剂。

实施例6

取野金柴低温差压式提取物的喷雾干燥药粉100g，加等倍量蔗糖、等倍量糊精及适量淀粉，制成颗粒，干燥，整粒，制成1000g，分装成10克每包。

实施例7

取野金柴低温差压式提取物的喷雾干燥药粉100g，加蒸馏水1000ml使溶解，加乙醇至含醇量为80％，静置过夜，取上清液浓缩至约500ml，加0.1％活性炭煮沸半小时，过滤，滤液过0.2μm微孔滤膜，得到活性提取物，其中总黄酮含量约为39％。将上述野金柴活性提取物加注射用水至1000ml，分装(每瓶100ml)，灭菌消毒，即得野金柴注射液。

实施例8

取野金柴低温差压式提取物的喷雾干燥药粉100g，淀粉100g，混合均匀，加滑石粉适量，压制成1000片。

实施例9

取野金柴低温差压式提取物的喷雾干燥药粉10g三份，分别加入2％、4％、6％盐酸溶液200ml，90℃水浴加热1小时进行水解，取出，放冷，用水饱和乙酸乙酯萃取5次，每次100ml，合并乙酸乙酯液，低温减压回收溶剂，得残渣，用甲醇100ml溶解。其水解后产物的HPLC图谱如图4ab、5ab、6ab。

实施例10

取野金柴低温差压式提取物的喷雾干燥药粉10g，加入蒸馏水200ml溶解，用水饱和正丁醇萃取5次，每次100ml，合并正丁醇液，低温减压回收溶剂，得残渣，用甲醇100ml溶解。以柚皮苷为对照品，紫外分光光度法测定野金柴活性提取物水解物总黄酮含量约为55％。

实施例11

取野金柴药材5kg，经粉碎机械解碎为粒度为10mm以下的颗粒，加入30倍量的工艺用水，搅拌保持动态，在5℃～10℃，“常压-真空-加溶媒-常压-加压-常压”不断循环进行差压提取，真空度保持在0.4MPa，压力保持15.00MPa，进行4次循环提取。将提取液经固液分离机械进行固液分离至澄清，得提取液，提取液进行微滤和超滤得浓缩液，喷雾干燥得野金柴提取物。以柚皮苷为对照品，紫外分光光度法测定野金柴活性提取物中总黄酮含量约为62％。

实施例12

取野金柴药材5kg，经粉碎机械解碎为粒度为10mm以下的颗粒，加入40倍量的工艺用水，搅拌保持动态，在10℃～15℃，“常压-真空-加溶媒-常压-加压-常压”不断循环进行差压提取，真空度保持在0.8MPa，压力保持20.00MPa，进行4次循环提取。将提取液经固液分离机械进行固液分离至澄清，得提取液，提取液进行微滤和超滤得浓缩液，喷雾干燥得野金柴提取物。以柚皮苷为对照品，紫外分光光度法测定野金柴活性提取物中总黄酮含量约为55％。

药效学资料

一、实验材料

1、受试药物与对照药物

实施例1的方法制得的野金柴低温差压式提取物(简称“活性提取物”)，野金柴常规水提物(简称“常规水提物”)，野金柴常规醇提物(简称“常规醇提物”)，均由广州中医药大学新药开发研究中心提供。

阳性对照药：达美康，天津华津制药厂，批号：070813。诺和灵，批号：SVG0426，丹麦诺和诺德公司生产。氯化钠注射液(500ml，湖南科伦制药有限公司，041221)。

2、实验动物

SD大鼠，SPF级，雌雄各半，由广州中医药大学实验动物中心提供，正常饲养3天后供试。

3、主要仪器与试剂

BS110S电子天平，Sartorius公司生产；722光栅分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产；SN-695B型智能放免r测量仪，上海原子核研究所日环一厂生产。

血清生化试剂盒(AST，ALT，TG，TC，BUN、CREA)，由北京中生北控生物科技有限公司提供；MDA试剂盒，由南京建成生物有限公司提供。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，Sigma公司，临用前用柠檬酸缓冲液配成浓度为3％的STZ溶液。罗康全血糖仪、血糖试纸(批号：449497)，均瑞士罗氏制药公司提供。胰岛素试剂盒，北京科美东雅生物技术有限公司提供，批号：20071025。盐酸氨基胍(批号：396494)，sigma公司提供。糖化血清蛋白测定试剂盒(批号：20070621)，由南京建成生物工程研究所提供。葡萄糖试剂盒(批号：20070804)，上海利欣生物技术研究所提供。尿糖试纸(批号：20070410)，广州市花都高尔宝生物技术有限公司提供。

4、统计学方法

使用SPSS12.0进行数据分析。数据均用均数±标准差(x±s)表示。各指标采用单因素方差分析及t检验；对方差不齐的数据采用Kruskal-Wallis H检验及q检验

二、方法和结果

1.对酒精性脂肪肝的保护作用

取SD雌性大鼠160～200g，随机分成正常对照组、模型组、水飞蓟素阳性对照组、联本双酯阳性对照组、野金柴活性提取物、野金柴常规水提物、野金柴常规醇提物。正常组每天上、下午分别灌服10ml/kg、20ml/kg饮用水；模型组上午灌服55°乙醇溶液10ml/kg，下午灌服20ml/kg饮用水；各给药组每天上午灌服55°乙醇溶液10ml/kg，下午灌服不同浓度的药液20ml/kg。正常组饲以普通饲料，自由饮水；模型组、各给药组饲以自制20％的高脂低营养饲料，自由饮水。4周后，动物禁食12h后，眼眶取血，分离血清测定总胆固醇(TG)、总甘油三酯(TC)、谷丙转氨酶(ALT)，麻醉处死各组动物。测体重，取肝脏称重，计算脏器系数。结果见表1。

表1野金柴提取物对酒精性脂肪肝大鼠的治疗作用(x±s)

注：模型组与正常组比较#p＜0.05，##p＜0.01；给药组与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

结果显示：与正常组比较，灌服酒精及饲以高脂饲料后，模型组肝脏明显肿胀，肝系数极显著升高(p＜0.01)，同时血脂总胆固醇、总甘油三酯、谷丙转氨酶水平显著升高(p＜0.05或p＜0.01)。与模型组比较，阳性对照药水飞蓟素能显著减轻肝脏肿大程度及抑制血脂总胆固醇、总甘油三酯的升高(p＜0.05或p＜0.01)；阳性对照药联苯双酯亦能极显著抑制血脂总胆固醇、总甘油三酯的升高(p＜0.01)；野金柴活性提取物能著抑制血脂总胆固醇、总甘油三酯的升高(p＜0.05或p＜0.01)；野金柴常规提取物能著抑制血脂总胆固醇、总甘油三酯的升高(p＜0.05)，但效果弱于活性提取物。各治疗组除联苯双酯外，均减轻肝脏系数及降低谷丙转氨酶水平作用，但无统计学差异。结果提示：野金柴活性提取物对酒精加高脂饲料所致的慢性肝损伤有治疗作用，能明显降低血脂，改善肝功能，效果优于常规水、醇提物。

2.对2型糖尿病大鼠的治疗作用

2.1对2型糖尿病大鼠的治疗作用

随机抽取9只大鼠作为正常对照组给普通饲料喂养。其余大鼠作为模型组，模型组大鼠给予高脂饲料(1％胆固醇，10％猪油，10％蛋黄粉，2％蔗糖，77％基础饲料)喂养，喂养4周后将模型组的动物禁食(不禁水)12小时后，静脉注射柠檬酸缓冲液(PH4.6)配置的4％STZ溶液30mg/kg，溶液先用微孔滤膜过滤。正常对照组腹腔注射同体积的柠檬酸缓冲液。3d后，尾静脉用采血针取血测血糖，同时测尿糖。全血血糖≥11mmol/L，尿糖+++~++++，维持1周以上确定为造模成功。将造模成功的糖尿病大鼠分为4个组，分别为模型组(9只)、野金柴活性提取物饮料组(9只)、野金柴常规水提物灌胃组(9只)、野金柴常规醇提物灌胃组(9只)，组间及组内动物分别作标记。正常对照组给予正常饲料、饮用自来水。模型组给予高脂饲料、饮用自来水。其它各给药组均给予高脂饲料、相应的野金柴提取物，每天换/给药1次，连续给药4周。给药后每周检测各组动物的尿糖、尿蛋白和体重一次并作记录。形体枯瘦、体重增长缓慢、尿糖、尿蛋白强阳性动物每周皮下注射胰岛素5u/kg以防止动物死亡。药液饮用配制：取10ml药液用蒸馏水稀释至250mL大鼠直接饮用。连续给药4周后，动物禁食12h，乌拉坦腹腔注射麻醉，称体重并记录，腹主动脉采血后，3000转/min离心10min分离血清(取血的同时用血糖仪测空腹血糖值)。取部分血清测SOD、MDA、GSP水平；其余血清测胰岛素(FNS)、甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)水平。解剖大鼠取肝和肾，称重，计算脏器系数；取一侧肾和肝大叶，5％的甲醛溶液固定，作常规病理组织学检查。结果见表2、3、4及图1。

表11各组大鼠治疗4周后FBG、FNS、Ln(ISI)结果比较(x±s)

注：与空白组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较：*p＜0.05，**p＜0.01。

注射STZ后，模型大鼠毛色枯燥松散，无光泽，自发活动减少，对外界刺激性的敏感性下降，大便较正常组动物稀溏，明显出现多尿，多饮，多食症状。各治疗组大鼠给药后三多症状均有一定程度改善，毛色较造模组润泽，自发活动增多，对外界的刺激较敏感。每周对尿葡萄糖进行检测时，未治疗组大鼠显著呈强阳性。从表2可以看出，与空白组比较，模型组治疗4周后，空腹血糖极显著高于空白组(P＜0.01)，空腹胰岛素血清水平升高，但无统计学差异(P＞0.05)，而胰岛素敏感指数明显下降，有显著统计学差异(P＜0.01)；与模型组比较，野金柴活性提取物组治疗4周后，空腹血糖降低，有统计学差异(P＜0.05)，空腹胰岛素血清水平降低，无统计学差异(P＞0.05)，胰岛素敏感指数明显升高，有显著统计学差异(P＜0.01)；与模型组比较，野金柴常规水提物、醇提物组治疗4周后，空腹血糖降低，胰岛素敏感指数略有所升高，但空腹胰岛素血清水平升高，均无统计学差异(p＞0.05)。提示：野金柴活性提取物一定程度上能降低血糖的同时又能升高2型糖尿病大鼠胰岛素敏感指数，即改善胰岛素抵抗；效果优于常规水、醇提物。

表3各组大鼠治疗4周后肮脏、肾脏系数结果比较(x±s)

注：与空白组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较：*p＜0.05，**p＜0.01。

正常组大鼠肝脏、肾脏肉眼观察颜色鲜红、表面光滑；高脂饲料饲养8周后，模型组糖尿病大鼠肝脏有点呈赭黄色、表面粗糙无光泽，肾脏体积增大；野金柴各给药组肝脏、肾脏的颜色、表面光泽程度较模型组稍有改善。从表12亦可以看出：模型组肝、肾系数均大于正常组，有显著性差异(P＜0.01)，提示模型组大鼠造模喂以高脂饲料饲养后可引起肝、肾损伤，致其肿大。与模型组比较，野金柴活性提取物组具有不同程度抑制肝、肾肿大的作用，效果优于常规水、醇提物，但均无统计学差异。提示野金柴活性提取物一定程度上能改善2型糖尿病大鼠肝肾的损伤程度，可能与其活血化瘀、增加机体对胰岛素敏感性的作用有关。

表4各组大鼠治疗4周后GSP、TG、TC及肾组织MDA、SOD结果比较(x±s)

注：与空白组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较：*p＜0.05，**p＜0.01。

表4显示：与正常组比较，模型组糖尿病大鼠血清糖化血清蛋白(GSP)、甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、肾组织过氧化产物(MDA)水平极显著升高(P＜0.01)，而肾组织超氧化物歧化酶(SOD)极显著下降(P＜0.01)，提示用链脲佐菌素及高脂饲料造模的糖尿病大鼠血脂水平较高、高血糖诱发糖基化产物及过氧化产物增多。与模型组比较，野金柴活性提取物组大鼠血清GSP、TG及MDA水半下降，SOD升高，均有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)，胆固醇(TC)水平有一定程度的下降，但无统计学差异(p＞0.05)；常规水、醇提物组GSP、TG、TC、MDA、SOD水平无统计学差异，效果弱于活性提取物。结果提示：野金柴活性提取物饮用能够降低2型糖尿病大鼠高血脂程度、糖基化产物、组织过氧化物的产生，提高组织抗高血糖所致过氧化损伤的能力，具有防治制糖尿病并发症产生或加重的作用。

图1不同给药组糖尿病大鼠肝脏、肾脏病理组织学改变

病理组织学检查结果：模型组大鼠9例出现肝细胞严重水肿，胞浆疏松化，5例出现明显脂肪变；部分动物肾小管上皮组织分布不均匀；野金柴活性提取物饮用9例出现肝细胞轻微水肿，1例脂肪变，肾脏未发现明典型病变；野金柴提取物水提物组出现6例肝细胞水肿，3例轻微水肿，2例脂肪变，程度均轻于模型组，肾脏未发现明典型病变；野金柴提取物醇提物组出现5例肝细胞水肿，4例轻微水肿，1例脂肪变，程度均轻于模型组，肾脏未发现明典型病变。

26.2对糖尿病大鼠糖代谢的影响

随机抽取6只大鼠作为正常对照组给普通饲料喂养。其余大鼠作为模型组，模型组大鼠给予高脂饲料(1％胆固醇，10％猪油，10％蛋黄粉，10％蔗糖，69％基础饲料)喂养，4周后将模型组的动物禁食(不禁水)过夜，腹腔注射柠檬酸缓冲液(PH4.4)配置的STZ溶液30mg/kg。正常对照组腹腔注射同体积的柠檬酸缓冲液。3d后禁食过夜，尾静脉用采血针采血测血糖。全血血糖≥11mmol/L，尿糖+++~++++，维持1周以上确定为糖尿病模型。将糖尿病大鼠分为3个组，分别为模型组、达美康给药组、野金柴活性提取物组、野金柴常规水提物组、野金柴常规醇提物组，每组10只，组间及组内动物分别作标记。正常对照组给予正常饲料，其余各组均给予高脂高糖饲料。各给药组给药剂量见下表，模型对照组与正常对照组每天灌服等容量的蒸馏水，每天给药1次，连续给药5周。于给药前、给药后2周，动物禁食12h，乌拉坦腹腔注射麻醉，眼球采血，分离血清，测定给药前后血糖(FBG)及胰岛素水平(INS)，计算胰岛素敏感指数(ISI)，结果见表5。于给药第21天，动物禁食3h，采0min血后，灌服葡萄糖溶液2.0g/kg，于灌服后30min、1h、2h分别测定血糖。于给药第25天，未禁食状态下取血测定0min血糖值，立即皮下注射诺和灵(40倍生理盐水稀释)0.5u/kg，于注射后40min、80min、120min测定血糖，结果见表6。

表5野金柴提取物对糖尿病大鼠胰岛素敏感指数的影响(x±s)

注：模型组与正常组比较#p＜0.05，##p＜0.01；给药前与给药后比较，*p＜0.05，**p＜0.01

表5结果显示：与正常组大鼠比较，模型组大鼠给药前后胰岛素敏感指数均极显著低于正常大鼠，提示糖尿病大鼠胰岛素敏感指数下降。与给药前比较，正常组的胰岛素敏感指数给药前后无变化，模型组的胰岛素敏感指数略有下降但无统计学差异(p＞0.05)，阳性对照达美康、野金柴活性提取物组的胰岛素敏感指数均有显著提高(p＜0.05)；野金柴常规水、醇提物组的胰岛素敏感指数均有提高，但无统计学差异。提示野金柴活性提取物与达美康一样能提高糖尿病大鼠的胰岛素敏感指数，改善糖代谢。

表6野金柴提取物对糖尿病大鼠胰岛素耐量、糖耐量的影响(x±s)

在胰岛素耐量试验中，大鼠皮下注射胰岛素后，血糖开始下降，不同给药组大鼠血糖达到最低值时间各有不同。表6结果显示：注射胰岛素40min时，正常大鼠、野金柴活性提取物、野金柴常规水提物、野金柴常规醇提物组动物的血糖降到最低，而模型组、阳性对照药达美康组血糖则在80min时才达到最低值，提示正常组、野金柴各提取物给药组大鼠较模型组与达美康给药组大鼠对外源性胰岛素的敏感性大，野金柴提取物能增强糖尿病大鼠对外源性胰岛素的敏感性，其中以活性提取物的效果最佳。在糖耐量试验中，大鼠灌服一定剂量的葡萄糖后，血糖开始上升，不同给药组大鼠血糖达到峰值时间不同：正常组、达美康给药组、野金柴常规水提物、野金柴常规醇提物组组血糖出现峰值的时间为30min，随后血糖开始下降，而模型组血糖持续提高，在60min时达到高峰，随后才开始下降，提示模型组大鼠糖耐量比正常组及给药组差，野金柴各提取物能改善糖尿病大鼠的糖耐量、改善糖代谢，其中活性提取物组的血糖升高幅度小于常规水、醇提物组。综合以上两个试验结果发现：野金柴活性提取物不仅能增强糖尿病大鼠对外源性胰岛素的敏感性，同时能改善糖耐量、促进血糖代谢，抑制摄糖后血糖持续升高，表明野金柴活性提取物对2型糖尿病大鼠有良好的治疗作用。

本发明人进一步用实施例2-4制得的提取物以及其余实施例制得的制剂进行各种药效学试验和对照试验，获得与用实施例1制得的提取物相类似的效果，这里不再重复。本领域技术人员应当可以理解本发明的提取方法获得的提取物均能达到“提取物含有10～90质量％总黄酮，以及提取物颜色为淡黄色至棕色”的效果，并且由此推断得知这些提取物相对于根据现有技术制得的常规水提物或醇提物具有更好的药效性质。这些提取方法均是本发明人通过大量试验获得的并首次提出的，在现有技术中均未见记载，并且这些提取方法由于能获得相接近的效果而使得这些提取方法之间具有单一性。

Claims (14)

1、一种野金柴活性提取物，其特征在于采用大孔吸附树脂法、柱色谱法、膜分离浓缩技术、喷雾干燥技术、冷冻干燥技术中任意一种或多种方法和低温差压式提取法的组合进行制备获得，该提取物含有10～90质量％总黄酮，提取物颜色为淡黄色至棕色。

2、如权利要求1所述的野金柴活性提取物，其特征在于该提取物高效液相指纹图谱285nm检测有26个特征峰，其中6个峰为主要峰，占总峰面积的89％以上；提取物高效液相指纹图谱345nm检测有26个特征峰，其中14个峰为主要峰，占总峰面积的95％以上。

3、如权利要求1所述的野金柴活性提取物，其特征在于该提取物用体积比为浓度2％～6％的盐酸水解，水解温度90℃，水解时间60分钟，高效液相指纹图谱有4个特征峰，当盐酸浓度达到6％但低于12％时色谱图中细小的峰明显增多，盐酸浓度的增高化合物被水解成的碎片越多，当浓度达到12％时，高效液相指纹图谱中无色谱峰，化合物基本被水解氧化完全。

4、权利要求1所述的野金柴活性提取物，其特征在于野金柴为江西壳斗科植物多穗石柯(Lithocarpus polystachyus(wall)Rehd或L.litseifolius(Hamce)Chun.)整个植株或任何部位以及其经过各种炮制方法制得的炮制品。

5、权利要求1所述的野金柴活性提取物，其特征在于所述黄酮类成分包括与碱和金属盐形成的金属盐类衍生物以及与金属离子形成的金属离子络合物。

6、权利要求1所述的野金柴活性提取物的制备方法，其特征在于包括以下一个或几个步骤：

提取：所用溶剂是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或是由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂；提取方法是低温差压式提取、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取中的一种或多种；

过滤：包括离心、抽滤、超滤、微滤，使用或不使用以下任一种澄清剂或其组合：醇沉液剂、明胶、高岭土、硅澡土、各种树脂、聚乙二醇、聚乙三醇、壳聚糖以及天然澄清剂成品；

浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发、煎煮浓缩、膜分离浓缩技术、悬浮冷冻浓缩、渐进冷冻浓缩、自然外循环两相流浓缩、外循环式冷冻浓缩、喷雾冷冻浓缩；

干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥。

7、权利要求1所述的野金柴活性提取物的制备方法，其特征在于当使用大孔吸附树脂法时，所用的大孔树脂是非极性、弱极性、中等极性、极性、弱碱性或弱酸性中的任何一种类型，如D101、X-5、NKA、S-8、NKA-9、HPD-600、ADS-7、AB-8、LSA-5B、HPD-722、ADS-17、DM130、HPD-826、DN-300、DN-603、FL-1、FL-2、FL-3等，其中优选的为弱极性、中等极性或极性的树脂，如AB-8、ADS-17、HPD-600等，所用的洗脱剂为水、含水乙醇、甲醇、丙酮等。

8、权利要求1所述的野金柴活性提取物的制备方法，其特征在于当使用柱色谱以聚酰胺为固定相时，所用的层析聚酰胺树脂是30-60目、60-120目、100-120目，其中优选为30-60目的树脂，所用的洗脱剂为水、含水乙醇、甲醇、丙酮。

9、权利要求1所述的野金柴活性提取物的制备方法，其特征在于当使用低温差压式提取法时，同时联合使用膜分离浓缩技术、喷雾干燥技术制备野金柴活性提取物，该方法是：在-35℃～40℃的温度条件，通过“常压-真空-加溶媒-常压-加压-常压”不断循环的压力变化来提取化学成分，真空度根据需要在13.33Pa～0.99MPa范围选择，压力根据需要在0.99MPa～25.00MPa范围选择，循环次数根据需要在1～100次范围选择；溶媒根据需要选取水、有机溶剂或它们的混合物，加入量根据需要按被提取物与溶媒的重量体积比在1∶1～1∶500的范围选择。

10、权利要求1所述的野金柴活性提取物的制备方法，其特征在于当使用膜分离浓缩技术时，可采用微滤截留直径大小在0.1μm以上的物质、超滤截留分子量在1000～500000之间的可溶性物质、纳滤截留分子量在150以上及直径在1nm左右的物质中的任两种方式的组合进行分离浓缩，使用的材质是有机类醋酸纤维素、聚丙稀、聚碳酸酯、聚砜、聚酰胺或无机类陶瓷、金属、金属氧化物、炭、多孔玻璃中的任一种。

11、权利要求7和8任一项所述的野金柴活性提取物的制备方法，其特征在于：选用AB-8、ADS-17、HPD-600的弱极性、中等极性或极性的大孔吸附树脂和30～60目的层析聚酰胺树脂作为纯化用树脂，野金柴提取物上样液以生药量计稀释倍数为1∶1～1∶20，吸附流速0.5～10BV/h，树脂柱径高比1∶1～1∶15，以生药量计上样量为0.1～1g/ml，以1～10倍树脂体积的纯化水除杂，除杂流速为1～10BV/h，用10％～95％乙醇洗脱1～10倍树脂体积，洗脱流速为1～10BV/h。

12、权利要求1所述的野金柴活性提取物的制备方法，其特征在于取野金柴干品，粉碎成100目粉，加10倍量水常温浸泡1.5小时后用低温差压式提取，温度20℃，压力10.00MPa，循环次数30次，使用聚碳酸酯膜分离浓缩技术进行浓缩，可采用微滤截留直径大小在0.1μm以上的物质、超滤截留分子量在1000～500000之间的可溶性物质、纳滤截留分子量在150以上及直径在1nm左右的物质中的任两种方式的组合进行分离浓缩，将所得浓缩提取液用AB-8中等极性大孔吸附树脂纯化，以生药量计上样液稀释倍数为1∶10，吸附流速6BV/h，树脂柱径高比1∶12，以生药量计上样量为0.5g/ml，以6倍树脂体积的纯化水除杂，除杂流速为8BV/h，用10％～95％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为6BV/h，提取液经真空干燥，所得浸膏即为野金柴提取物。

13、权利要求1所述的野金柴活性提取物的应用，其特征在于该提取物可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品。

14、权利要求13所述的应用，其特征在于所制得的药物或功能性食品是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料、巴布剂。

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