JP4220381B2 - 操作性に優れた還元型補酵素ｑ１０結晶の製造法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、還元型補酵素Ｑ_１０結晶の製造法に関する。還元型補酵素Ｑ_１０は、酸化型補酵素Ｑ_１０に比べて高い経口吸収性を示し、優れた食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、飲料、飼料、動物薬、化粧品、医薬品、治療薬、予防薬等として有用な化合物である。
背景技術
広く生物界に分布するベンゾキノン誘導体である酸化型補酵素Ｑ_１０は、そのビタミン様の機能からビタミンＱとも呼ばれており、弱った細胞活性を健康な状態に戻す栄養源として身体を若返らせる成分である。一方、還元型補酵素Ｑ_１０は、酸化型補酵素Ｑ_１０の２電子還元体であり、酸化型補酵素Ｑ_１０が橙色結晶であるのに対し、還元型補酵素Ｑ_１０は白色結晶である。還元型補酵素Ｑ_１０及び酸化型補酵素Ｑ_１０は、ミトコンドリア、リソゾーム、ゴルジ体、ミクロソーム、ペルオキシソーム、或いは細胞膜等に局在し、電子伝達系の構成成分としてＡＴＰ産生賦活、生体内での抗酸化作用、膜安定化に関与している事が知られている生体の機能維持に必要不可欠な物質である。
還元型補酵素Ｑ_１０は、例えば、合成、発酵、天然物からの抽出等の従来公知の方法により補酵素Ｑ_１０を得た後、クロマトグラフィーにより流出液中の還元型補酵素Ｑ_１０区分を濃縮する方法等により得られることが知られている（特開平１０−１０９９３３号公報）。この場合には、上記還元型補酵素Ｑ_１０中に含まれる酸化型補酵素Ｑ_１０を、水素化ホウ素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム（次亜硫酸ナトリウム）等の還元剤を用いて還元した後、クロマトグラフィーによる濃縮を行っても良いこと、また、還元型補酵素Ｑ_１０は、既存の高純度補酵素Ｑ_１０（酸化型）に上記還元剤を作用させる方法によっても得られることも、当該公報中に記載されている。
しかしながら、このようにして得られる還元型補酵素Ｑ_１０は、好適に結晶化させるのが必ずしも容易ではなく、酸化型補酵素Ｑ_１０をはじめとする不純物を含有する低純度結晶、半固体状や油状物で得られやすい。また、なんとか結晶化できたとしても、スラリー性状等が悪いために、スラリーの流動性が悪くて撹拌しにくい、晶析缶から払い出しにくい、濾過性が悪くて結晶分離に長時間かかるといった問題があった。さらに、還元型補酵素Ｑ_１０は、各種有機溶媒に対する溶解度が高い傾向もあり、晶析収率が必ずしも高くないといった問題があった。
また、還元型補酵素Ｑ_１０は、分子酸素によって酸化型補酵素Ｑ_１０に酸化されやすい性質を有する。工業的規模での製造においては、完全な酸素の除去は極めて難しく、さらに、個々の操作に要する時間はラボスケールでの製造とは異なり、かなり長時間になるため、残存する酸素が大きな悪影響を及ぼす。単離操作の長時間化は上記酸化のリスクを増大させ、難除去性の酸化型補酵素Ｑ_１０の副生及び製品への混入といった収率、品質面の問題に直結する。
このような状況下、スラリー性状や結晶性状を改善し、還元型補酵素Ｑ_１０を高収率で、濾過性良く取得する晶析法の確立、又、高純度の還元型補酵素Ｑ_１０結晶を得るための、結晶分離を含む単離プロセス、あるいは、その単離プロセスを含む全プロセスが最短化、且つ、簡便化された製造法の確立が強く望まれていた。
発明の要約
本発明は、上記に鑑み、還元型補酵素Ｑ_１０結晶を得るための工業的規模での生産に適した優れた製造法を提供することを目的とする。
本発明者らは、還元型補酵素Ｑ_１０結晶を良好に結晶成長させるべく、鋭意研究した結果、還元型補酵素Ｑ_１０をアルコール類及び／又はケトン類の溶液から晶析することにより、スラリー性状や結晶性状の優れた還元型補酵素Ｑ_１０結晶を高収率で得ることができることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、還元型補酵素Ｑ_１０をアルコール類及び／又はケトン類の溶液中で晶析することを特徴とする還元型補酵素Ｑ_１０結晶の製造法に関する。
また、本発明は、酸化型補酵素Ｑ_１０をアルコール類及び／又はケトン類の溶液中で還元型補酵素Ｑ_１０に還元することにより得られた、還元型補酵素Ｑ_１０を含有するアルコール類及び／又はケトン類の溶液から、還元型補酵素Ｑ_１０を晶析する上記製造法に関する。
本発明の方法によれば、結晶分離を含む単離プロセス、あるいは、その単離プロセスを含む全プロセスが最短化、且つ、簡便化でき、高純度の還元型補酵素Ｑ_１０を高収率で得ることができる。
発明の詳細な開示
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、還元型補酵素Ｑ_１０結晶の製造法、すなわち、還元型補酵素Ｑ_１０の晶析法について説明する。
本発明の還元型補酵素Ｑ_１０結晶の製造法は、アルコール類及び／又はケトン類の溶液中で、還元型補酵素Ｑ_１０を晶析するものである。好ましくは、アルコール類が用いられる。
晶析に用いる還元型補酵素Ｑ_１０は、例えば、合成、発酵、天然物からの抽出等の従来公知の方法により得ることができる。好ましくは、還元型補酵素Ｑ_１０中に含まれる酸化型補酵素Ｑ_１０を還元、或いは、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元することにより得られたものであり、より好ましくは、後述する本発明の還元反応を用いて得られたものである。
本発明の晶析法は、酸化型補酵素Ｑ_１０を比較的多く含有するものについても適用できるが、後述する還元方法等により調製された高純度の還元型補酵素Ｑ_１０に対して特に有効である。本発明においては、従来公知の方法により得られた、あるいは、後述する還元方法等により製造された、還元型補酵素Ｑ_１０を含有する反応液や抽出液に含有される不純物の除去も兼ねて精製晶析するのが特に効果的である。このとき、不純物を母液に除去することが好ましい。これにより、共存する不純物、特に、通常除去するのが必ずしも容易ではない構造の類似した類縁化合物（具体的には、還元型補酵素Ｑ_９、還元型補酵素Ｑ_８、還元型補酵素Ｑ_７等）を除去することができる。アルコール類及び／又はケトン類は、上記の構造の類似した化合物を除去するのに特に効果的な溶媒でもある。また、言うまでもなく、上記精製晶析は、還元型補酵素Ｑ_１０結晶を再精製するための再結晶法としても非常に有効である。
本発明における最も好ましい態様は、酸化型補酵素Ｑ_１０をアルコール類及び／又はケトン類（好ましくはアルコール類）の溶液中で還元型補酵素Ｑ_１０に還元した溶液から、還元型補酵素Ｑ_１０を晶析（好ましくは精製晶析）する直接単離法（ワンポット法）である。これにより、極めて簡便且つ効率的に、高収率で性状のよい高品質結晶を取得することができる。
本発明で用いるアルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、飽和のものが好ましく用いられる。例えば、１価アルコールとしては炭素数１〜２０のものが挙げられ、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６、さらに好ましくは炭素数１〜５、特に好ましくは炭素数１〜４、とりわけ好ましくは炭素数１〜３のものである。最も好ましくは炭素数２〜３の１価アルコールである。また、炭素数２〜５、好ましくは炭素数２〜３の２価アルコール、炭素数３の３価アルコール等も好適に用いられる。上記のうち、炭素数１〜５の１価アルコールは、水と相溶性の高いアルコールであり、水との混合溶媒として使用する場合に好適に用いられる。
１価アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等を挙げることができる。
好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノールである。より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコールである。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコールである。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールであり、とりわけ好ましくは、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールであり、最も好ましくは、エタノールである。
２価アルコールとしては、例えば、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等を挙げることができる。好ましくは、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオールであり、最も好ましくは、１，２−エタンジオールである。
３価アルコールとしては、例えばグリセリン等を好適に用いることができる。
ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくは、アセトンである。
晶析方法としては、特に制限されず、冷却晶析、濃縮晶析、溶媒置換晶析等のうちの少なくとも一つを用いて実施することができる。上記アルコール類及び／又はケトン類中での還元型補酵素Ｑ_１０の溶解度は、極めて好適な温度依存性を示し、これは還元型補酵素Ｑ_１０の溶解量を好適に減じて結晶状態へ高収率で移行させる上で好適に寄与する。この特性を最大限に発揮するためには、冷却晶析、又は、冷却晶析に他の晶析方法を組み合わせて行うのが特に好ましい。
晶析濃度は、一つの重要な因子であり、晶析終了時の濃度、つまり、晶析終了時の晶析溶媒の重量に対する還元型補酵素Ｑ_１０の重量として、好ましくは約１５ｗ／ｗ％以下、より好ましくは約１３ｗ／ｗ％以下、さらに好ましくは約１０ｗ／ｗ％以下である。上記濃度を維持することによって、工業的規模での操作性に耐えうる好適な晶析が可能となる。生産性の観点から、濃度の下限は、通常約１ｗ／ｗ％以上であり、好ましくは約２ｗ／ｗ％以上である。
上記晶析は、強制流動下に実施するのが好ましい。過飽和の形成を抑制し、スムースに核化・結晶成長を行うため、また、高品質化の観点から、単位容積当たりの撹拌所要動力として、通常約０．０１ｋＷ／ｍ^３以上、好ましくは約０．１ｋＷ／ｍ^３以上、より好ましくは約０．３ｋＷ／ｍ^３以上の流動が好ましい。上記の強制流動は、通常、撹拌翼の回転により与えられるが、上記流動が得られれば必ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、例えば、液の循環による方法等を利用しても良い。
晶析に際しては、過飽和の形成を抑制し、スムースに核化・結晶成長を行うために、種晶を添加することも好ましく行われる。
還元型補酵素Ｑ_１０の晶析温度（晶析時の冷却温度）は、特に制限されないが、収率等の観点より、好ましくは２５℃以下、より好ましくは２０℃以下、さらに好ましくは１５℃以下、特に好ましくは１０℃以下である。下限は、系の固化温度である。よって、当該冷却温度を、好ましくは０〜２５℃程度とすることにより、晶析を好適に実施できる。
晶析時には、単位時間当たりの結晶の晶出量を制御して、過飽和の形成を制御するのが好ましい。好ましい単位時間当たりの晶出量は、例えば、単位時間当たり全晶出量の約５０％量が晶出する速度以下（即ち、最大で５０％量／時間）であり、好ましくは、単位時間当たり全晶出量の約２５％量が晶出する速度以下（即ち、最大で２５％量／時間）である。冷却晶析の場合、冷却速度として、通常、約４０℃／時間以下、好ましくは約２０℃／時間以下である。
本発明の晶析法においては、通常、晶析によって得られるスラリー性状や結晶性状の観点から、上記溶媒を用いるのが好ましいが、上記アルコール類及び／又はケトン類の溶液に他の溶媒を共存させる又は添加することもできる。
これらの他の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、脂肪酸類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類、水等を挙げることができる。
炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類としては、還元反応の溶媒として後述する溶媒を好適に使用することができる。
脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等を挙げることができる。好ましくはギ酸、酢酸であり、最も好ましくは酢酸である。
ニトリル類を除く窒素化合物類としては、例えば、ニトロメタン、トリエチルアミン、ピリジン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等を挙げることができる。
硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。
これらの他の溶媒は、還元型補酵素Ｑ_１０の溶解度、晶析濃度、収率、スラリー性状、結晶性状等の晶析条件を左右する条件を改善するために、これらの他の溶媒の特性に従って、好ましい割合で上記アルコール類及び／又はケトン類の溶液と共に用いると効果的である。
上記他の溶媒のうち、還元型補酵素Ｑ_１０の溶解性を好適に減じて高い収率を得る、スラリー性状を改善する、そして特に注目すべきことであるが、固液分離性（濾過性）を大きく改善するという観点から、特に水を好ましく用いることができる。
これらの他の溶媒と上記アルコール類及び／又はケトン類との割合は、溶媒の種類によっても異なるので一律に規定できず、実質的に上記アルコール類及び／又はケトン類を主成分とする溶媒であれば特に制限されない。好ましくは、溶媒中の上記アルコール類及び／又はケトン類の割合が、アルコール類とケトン類の合計として約８０ｗ／ｗ％以上であり、より好ましくは約９０ｗ／ｗ％以上であり、さらに好ましくは約９３ｗ／ｗ％以上である。
特に、先述の固液分離性の改善という観点から、補助的溶媒として水を用いる場合、溶媒中の上記アルコール類及び／又はケトン類の割合は、下限は、約９０ｗ／ｗ％以上、好ましくは約９１ｗ／ｗ％以上、より好ましくは約９２ｗ／ｗ％以上、さらに好ましくは約９３ｗ／ｗ％以上であり、上限は、約９９．５ｗ／ｗ％以下、好ましくは約９９ｗ／ｗ％以下、より好ましくは約９８ｗ／ｗ％以下、さらに好ましくは約９７ｗ／ｗ％以下である。通常、約９０〜約９９．５ｗ／ｗ％で好適に実施でき、約９３〜約９７ｗ／ｗ％で最も好適に実施できる。
このようにして得られる還元型補酵素Ｑ_１０の結晶は、好ましくは、例えば、遠心分離、加圧濾過、減圧濾過等による固液分離、さらに、必要に応じて、上記アルコール類又はケトン類をはじめとする本発明に記載される溶媒を用いてケーキ洗浄を行って湿体として取得し、さらに、内部を不活性ガスに置換した減圧乾燥器（真空乾燥器）に湿体を仕込み、減圧下、乾燥し、乾体として取得することができるし、乾体として取得するのが好ましい。
本発明の製造法は、脱酸素雰囲気下で実施することが、酸化防護の上で効果的である。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。
次に、本発明に使用するに好適な還元型補酵素Ｑ_１０の合成法、すなわち、酸化型補酵素Ｑ_１０から還元型補酵素Ｑ_１０に還元する反応について述べる。
先述のように、上記還元反応は、上記の晶析法で述べたアルコール類及び／又はケトン類の溶液中で行い、直接単離法（ワンポット法）に付すのが好ましい。これにより、操作を簡便化且つ最短化して、分子酸素による酸化を最小化することができる。この場合の特に好適な還元剤は、後述するアスコルビン酸類である。
また、操作が長時間に及んでも還元型補酵素Ｑ_１０が分子酸素により酸化されるのを防護するために、上記還元反応及び／又は抽出・水洗操作を、酸化防護効果の高い溶媒を用いて実施するのも好ましい。
このような酸化防護効果の高い溶媒としては、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種を用いるのが好ましく、最も好ましくは炭化水素類である。
炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。
脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２のものが用いられる。
具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、シクロペンタン、２−ペンテン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、１−ヘキセン、シクロヘキセン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２、３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、メチルシクロヘキサン、１−ヘプテン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、エチルシクロヘキサン、１−オクテン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、１−ノネン、デカン、１−デセン、ｐ−メンタン、ウンデカン、ドデカン等を挙げることができる。
中でも、炭素数５〜８の飽和脂肪族炭化水素がより好ましく、炭素数５のペンタン、２−メチルブタン、シクロペンタン（ペンタン類と称す）；炭素数６のヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン（ヘキサン類と称す）；炭素数７のヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、メチルシクロヘキサン（ヘプタン類と称す）；炭素数８のオクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、エチルシクロヘキサン（オクタン類と称す）；及びこれらの混合物が好ましく用いられる。とりわけ、上記ヘプタン類は酸化からの防護効果が特に高い傾向がありさらに好ましく、ヘプタンが最も好ましい。
芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼンである。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリンであり、最も好ましくは、クメンである。
ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、非環状のものが好ましく用いられる。塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素がより好ましく、塩素化炭化水素がさらに好ましい。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが用いられる。
具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。
好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタンである。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタンである。
脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。酢酸エステル、ギ酸エステルが好ましく、酢酸エステルがより好ましい。エステル基としては、特に制限されないが、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数１〜８のアラルキルエステル、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステル、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルが用いられる。
プロピオン酸エステルとしては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチルである。
酢酸エステルとしては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシルである。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチルであり、最も好ましくは、酢酸エチルである。
ギ酸エステルとしては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチルであり、最も好ましくは、ギ酸エチルである。
エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。
具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。
好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルである。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルである。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。
ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８のものが用いられる。
具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。
好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、クロロプロピオニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリルである。より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルである。
上記溶媒の中でも、例えば、溶解度を高めるための適度な加温ができ、且つ、湿体からの溶剤の乾燥除去や晶析濾液等からの溶剤回収の行いやすい沸点（１気圧下、約３０〜１５０℃）、室温での取り扱い時でも室温以下に冷却した時でも固化しにくい融点（約２０℃以下、好ましくは約１０℃以下、より好ましくは約０℃以下）を持ち、粘性が低い（２０℃において約１０ｃｐ以下等）等の、沸点、粘性等の性質を考慮して選定するのが好ましい。工業的な作業上の観点から、常温で揮発し難いものが好ましく、例えば、沸点が約８０℃以上のものが好ましく、約９０℃以上のものがより好ましい。
還元型補酵素Ｑ_１０は高濃度の溶液ほど酸化されにくい傾向にある。上記溶媒に対して還元型補酵素Ｑ_１０は高い溶解性を示し、上記溶媒はこの点でも酸化防護に好適である。還元型補酵素Ｑ_１０の酸化を防護するために好ましい濃度は、溶媒の種類等により一律に規定できないが、上記溶媒に対する還元型補酵素Ｑ_１０の濃度として、通常１ｗ／ｗ％以上、好ましくは２ｗ／ｗ％以上である。上限は、特に制限されないが、実際的な操作性という観点から、４００ｗ／ｗ％以下、好ましくは２００ｗ／ｗ％以下、より好ましくは１００ｗ／ｗ％以下、さらに好ましくは５０ｗ／ｗ％以下である。
このように、上記溶媒の使用によって、望ましくない酸素の副反応は、還元工程を通して最小化される。
還元反応は、水素化金属化合物、鉄（金属又は塩としての鉄）、亜鉛（金属としての亜鉛）、次亜硫酸類、アスコルビン酸類等を還元剤として用いて実施することができる。
また、水素化金属化合物、鉄（金属又は塩としての鉄）、亜鉛（金属としての亜鉛）、次亜硫酸類を用いる還元は、上記の酸化防護効果の高い溶媒中で好ましく実施される。さらに、アスコルビン酸類を用いる還元は、上記の酸化防護効果の高い溶媒の他、アルコール類及び／又はケトン類等の種々の溶媒を用いて実施できるが、好ましくは、アルコール類（特に好ましくは、水と相溶性の高いアルコール）、水と相溶性の高いエーテル類、水と相溶性の高いニトリル類及び水と相溶性の高いケトン類を用いて実施できる。
水素化金属化合物としては、特に制限されないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化リチウムアルミニウム等を挙げることができる。上記水素化金属化合物の使用量は、水素化金属化合物の種類により異なり、一律に規定できないが、通常、理論水素当量の１〜３倍量で好適に実施できる。
鉄又は亜鉛を用いる還元は、通常、酸を使用して実施される。酸としては、特に制限されないが、例えば、酢酸等の脂肪酸、メタンスルホン酸等のスルホン酸、塩酸や硫酸等の無機酸等を挙げることができる。好ましくは無機酸であり、より好ましくは硫酸である。
鉄の使用量は、特に制限されないが、酸化型補酵素Ｑ_１０の仕込み重量に対して、例えば、約１／５重量以上で好適に実施できる。上限は特に制限されないが、経済性の観点等から、約２倍重量以下である。なお、鉄は、金属鉄のみならず、硫酸鉄（ＩＩ）等の塩の形態でも使用できる。
また、亜鉛の使用量は、特に制限されないが、酸化型補酵素Ｑ_１０の仕込み重量に対して、例えば、約１／１０重量以上で好適に実施できる。上限は特に制限されないが、経済性の観点等から、約２倍重量以下である。
次亜硫酸類としては特に制限されず、通常、次亜硫酸の塩である。次亜硫酸の塩としては特に制限されず、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が好ましく、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩がより好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。上記次亜硫酸類の使用量は、特に制限されないが、通常、酸化型補酵素Ｑ_１０の仕込み重量に対して、約１／５重量以上、好ましくは約２／５重量以上、より好ましくは約３／５重量以上である。多くても特に支障はないが、経済的な観点から、通常、約２倍重量以下、好ましくは同重量以下で用いられる。よって、約２／５重量〜約同重量の範囲でより好適に実施できる。
アスコルビン酸類としては、特に制限されず、例えば、アスコルビン酸のみならず、ｒｈａｍｎｏ−アスコルビン酸、ａｒａｂｏ−アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏ−アスコルビン酸、ｆｕｃｏ−アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏｈｅｐｔｏ−アスコルビン酸、ｘｙｌｏ−アスコルビン酸、ｇａｌａｃｔｏ−アスコルビン酸、ｇｕｌｏ−アスコルビン酸、ａｌｌｏ−アスコルビン酸、ｅｒｙｔｈｒｏ−アスコルビン酸、６−デスオキシアスコルビン酸等のアスコルビン酸に類するものが挙げられ、また、それらのエステル体や塩であってもかまわない。さらに、これらはＬ体、Ｄ体、或いは、ラセミ体であっても良い。より具体的には、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、Ｄ−ａｒａｂｏ−アスコルビン酸等を挙げることができる。還元型補酵素Ｑ_１０の製造において、上記アスコルビン酸類をいずれも好適に使用できるが、生成した還元型補酵素Ｑ_１０との分離のしやすさ等を考慮すると、上記のアスコルビン酸類のうち、特に水溶性のものが好適に用いられ、最も好ましくは、入手容易性、価格等の観点から、Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−ａｒａｂｏ−アスコルビン酸等のフリー体である。
上記のアスコルビン酸類の使用量は、特に制限されず、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元型補酵素Ｑ_１０に変換しうる有効量であればよく、酸化型補酵素Ｑ_１０に対して、通常１倍モル量以上、好ましくは１．２倍モル量以上である。上限は特に制限されないが、経済性を考慮して、通常１０倍モル量以下、好ましくは５倍モル量以下、より好ましくは３倍モル量以下である。
上記還元剤のうち、還元能力、収率、品質といった観点から、亜鉛、次亜硫酸類、アスコルビン酸類が好ましく、次亜硫酸類（具体的には、次亜硫酸塩）、アスコルビン酸類がより好ましい。
還元反応においては、水及び／又はアルコール類を好適に併用することができる。水は、特に還元剤として鉄、亜鉛、次亜硫酸類を用いる場合に好適である。還元剤として水素化金属化合物を用いる場合には、アルコール類を併用することができる。水、アルコール類の併用は、これら水、アルコール類の特性が発揮され、反応速度の向上や反応収率の向上等に寄与する。
以下に好ましい還元方法についてより詳細に述べる。
上記次亜硫酸類を用いる還元は、水を併用して、上記の炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種の有機溶媒（好ましくは炭化水素類、より好ましくは脂肪族炭化水素、さらに好ましくはヘプタン類、特に好ましくはヘプタン）と水との混合溶媒系で実施するのが好ましい。その際、反応時のｐＨは、収率等の観点から、通常ｐＨ７以下、好ましくはｐＨ３〜７、より好ましくはｐＨ３〜６で実施される。上記ｐＨは、酸（例えば、塩酸や硫酸等の無機酸）や塩基（例えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物）を用いて、調整することができる。
上記次亜硫酸類を用いる還元において、水の使用量は、特に制限されず、還元剤である次亜硫酸類を適度に溶解する量であれば良く、例えば、上記次亜硫酸類の水に対する重量が、通常、３０ｗ／ｗ％以下、好ましくは２０ｗ／ｗ％以下になるように調整するのが良い。又、生産性等の観点から、通常、１ｗ／ｗ％以上、好ましくは５ｗ／ｗ％以上、より好ましくは１０ｗ／ｗ％以上であるのが良い。
上記アスコルビン酸類を用いる還元は、上記の炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類のうち、特に水と相溶性の高い溶媒、なかでも水と相溶性の高いエーテル類及びニトリル類、具体的には、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル等を用いて好適に実施することができるが、前記の本発明の晶析法で用いられるアルコール類及び／又はケトン類（好ましくは、水と相溶性の高いアルコール類及び／又はケトン類（具体的には、アルコール類としては、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜３の１価又は２価（好ましくは１価）のアルコール、ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン等））を使用するのが特に好ましい。
又、アスコルビン酸類を用いる還元においては、反応促進の観点から（例えば、反応温度の低下、反応時間の短縮等）、塩基性物質や亜硫酸水素塩等の反応促進効果を有する添加剤を共存させて実施することができる。
上記塩基性物質としては、特に制限されず、例えば、無機化合物、有機化合物を問わず使用しうる。上記無機化合物としては、特に制限されないが、例えば、金属（好ましくは、アルカリ金属、アルカリ土類金属等）の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩やアンモニア等を挙げることができる。その代表的なものとして、例えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、炭酸マグネシウム等のアルカリ土類金属炭酸塩等を挙げることができる。上記有機化合物としては、特に制限されないが、例えば、トリエチルアミン等のアミン等を挙げることができる。上記の塩基性物質のうち、金属（好ましくは、アルカリ金属、アルカリ土類金属等）の炭酸塩、炭酸水素塩、アンモニア等の無機化合物；トリエチルアミン等のアミン等の有機化合物といった弱い塩基性物質（弱塩基又は弱アルカリ）を好ましく使用できる。より好ましくは上記の弱塩基性の無機化合物である。
また、上記亜硫酸水素塩としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等のアルカリ金属亜硫酸水素塩等を好適なものとして挙げることができる。
上記添加剤の量は、期待する程度の反応促進効果を発揮しうる量（有効量）であればよく、特に制限されないが、経済性も考慮して、アスコルビン酸類に対して、通常２０倍モル量以下、好ましくは１０倍モル量以下、より好ましくは５倍モル量以下、さらに好ましくは２倍モル量以下である。下限は、特に制限されないが、通常０．０１倍モル量以上、好ましくは０．０５倍モル量以上、より好ましくは０．１倍モル量以上、さらに好ましくは０．２倍モル量以上である。
本発明において記載される還元反応は、強制流動下に実施するのが好ましい。単位容積当たりの撹拌所要動力として、通常約０．０１ｋＷ／ｍ^３以上、好ましくは約０．１ｋＷ／ｍ^３以上、より好ましくは約０．３ｋＷ／ｍ^３以上の流動が好ましい。上記の強制流動は、通常、撹拌翼の回転により与えられるが、上記流動が得られれば必ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、例えば、液の循環による方法等を利用しても良い。
還元温度は、還元剤の種類や量によって異なり、一律に規定できない。例えば、次亜硫酸類を用いる還元においては、通常１００℃以下、好ましくは８０℃以下、より好ましくは６０℃以下で実施される。下限は、系の固化温度である。よって、還元は、通常、０〜１００℃程度、好ましくは０〜８０℃程度、より好ましくは０〜６０℃程度で好適に実施できる。また、アスコルビン酸類を用いる還元においては、通常３０℃以上、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃以上で実施される。上限は系の沸点である。よって、還元は、通常、３０〜１５０℃程度、好ましくは４０〜１２０℃程度、より好ましくは５０〜１００℃程度で好適に実施できる。
反応濃度は、特に制限はないが、溶媒の重量に対する酸化型補酵素Ｑ_１０の重量として、通常約１ｗ／ｗ％以上、好ましくは３ｗ／ｗ％以上、より好ましくは１０ｗ／ｗ％以上、さらに好ましくは１５ｗ／ｗ％以上である。上限は、特に制限されないが、通常約６０ｗ／ｗ％以下、好ましくは５０ｗ／ｗ％以下、より好ましくは４０ｗ／ｗ％以下、さらに好ましくは３０ｗ／ｗ％以下である。よって、反応濃度は、約１〜６０ｗ／ｗ％、好ましくは約３〜５０ｗ／ｗ％、より好ましくは約１０〜４０ｗ／ｗ％で好適に実施できる。
還元反応は、還元剤の種類や量によって異なり、一律に規定できないが、通常、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１０時間以内、さらに好ましくは５時間以内に完了させることができる。
なお、還元反応は、脱酸素雰囲気下で実施するのが極めて好ましく、驚くべきことには、特に次亜硫酸類を用いた還元反応では、還元反応の収率向上や還元剤量の削減に大きく寄与することも見い出した。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。
このようにして得られた還元反応液から、生成した還元型補酵素Ｑ_１０を含有する有機相を採取し、必要に応じて（好ましくは）、さらに有機相を水や食塩水等を用いて繰り返し水洗して、夾雑物を完全に除去した後、アルコール類及び／又はケトン類に溶媒置換して、上述の晶析法に用いることができる。
酸化防護の観点からは、還元型補酵素Ｑ_１０が、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種の溶媒に溶解された溶液を、アルコール類及び／又はケトン類に溶媒置換するのが好ましい。
特に、還元剤として、次亜硫酸ナトリウム等の上記次亜硫酸類を用いる場合には、次亜硫酸類由来の夾雑物を完全に除去したり、水相のｐＨを安定させるために、繰り返し水洗することが望ましい。
又、上述したように、本発明の晶析法で用いられるアルコール類及び／又はケトン類（好ましくは、水と相溶性の高いアルコール類及び／又はケトン類（具体的には、アルコール類としては、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜３の１価又は２価（好ましくは１価）のアルコール、ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン等））を用いて、アスコルビン酸類で還元を行った場合は、前述の晶析法に従って、還元反応液から直接還元型補酵素Ｑ_１０を晶析する（直接単離法（ワンポット法））のが極めて簡便且つ効率的な晶析法である。その場合、上記方法において還元反応を行った後、好ましくは、冷却又は濃縮又は貧溶媒添加（好ましくは水添加）して、より好ましくは冷却又は濃縮して、さらに好ましくは冷却して、還元型補酵素Ｑ_１０を晶出するのが良い。尚、この場合、還元反応における溶媒は、特に制限されないが、上記アルコール類及び／又はケトン類を主成分とする溶媒であるのが好ましい。
通常、反応速度、反応収率の点から、溶媒中の上記アルコール類及び／又はケトン類の割合は、約５０ｗ／ｗ％以上、好ましくは約６０ｗ／ｗ％以上、より好ましくは約７０ｗ／ｗ％以上であるが、引き続く晶析への利用も考慮すると、さらに好ましくは約８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは約９０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは約９３ｗ／ｗ％以上である。
反応時に水を併用した場合は、溶媒中の上記アルコール類及び／又はケトン類の割合は、下限は、約９０ｗ／ｗ％以上、好ましくは約９１ｗ／ｗ％以上、より好ましくは約９２ｗ／ｗ％以上、さらに好ましくは約９３ｗ／ｗ％以上であり、上限は、約９９．５ｗ／ｗ％以下、好ましくは約９９ｗ／ｗ％以下、より好ましくは約９８ｗ／ｗ％以下、さらに好ましくは約９７ｗ／ｗ％以下である。約９３〜９７ｗ／ｗ％が最も好適である。
本発明により、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０結晶を作業性、経済性良く得ることができる。本発明により得られる還元型補酵素Ｑ_１０結晶は、還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比が、９６／４以上、好ましくは９８／２以上、より好ましくは９９／１以上が期待できる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。また、実施例中の還元型補酵素Ｑ_１０の純度、還元型補酵素Ｑ_１０と酸化型補酵素Ｑ_１０との重量比は、下記ＨＰＬＣ分析により求めたが、得られた還元型補酵素Ｑ_１０の純度は本発明における純度の限界値を規定するものではなく、また、同様に、還元型補酵素Ｑ_１０と酸化型補酵素Ｑ_１０との重量比も、その上限値を規定するものではない。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム；ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ製），２５０ｍｍ（長さ），４．６ｍｍ（内径）、移動相；Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ：ＣＨ_３ＯＨ＝４：３（ｖ：ｖ）、検出波長；２１０ｎｍ、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ、還元型補酵素Ｑ_１０の保持時間；９．１ｍｉｎ、酸化型補酵素Ｑ_１０の保持時間；１３．３ｍｉｎ。
（実施例１）
１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（酸化型補酵素Ｑ_９を０．４０％含有、純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇのヘプタンに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）１００ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、脱気した飽和食塩水１０００ｇでヘプタン相を６回水洗した。以上、すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。このヘプタン相を減圧下にて溶媒置換し、５０℃の還元型補酵素Ｑ_１０の７％（ｗ／ｗ）エタノール溶液を調製した（還元型補酵素Ｑ_１０を１００ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．４０％含有）を含む）。さらに、窒素雰囲気下にて撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら１０℃／時間の冷却速度で、２℃まで冷却し、結晶を析出させた。スラリーは良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９５ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．１９％含有、除去率５３％）を得た（有姿収率９５モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．３／０．７、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．０％であった。なお、スラリーのろ過には濾紙を敷いた直径２０ｃｍのヌッチェを用い、アスピレーターで減圧した。ろ過の所要時間は１２分であった。
（実施例２）
実施例１とまったく同条件下にて還元反応から水洗までの一連の操作を行い、還元型補酵素Ｑ_１０のヘプタン溶液を得た（還元型補酵素Ｑ_１０を１００ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．４０％含有）を含む）。このヘプタン溶液を減圧下にて溶媒置換し、５０℃の還元型補酵素Ｑ_１０の７％（ｗ／ｗ）２−プロパノール溶液を調製した。この溶液を窒素雰囲気下にて撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら１０℃／時間の冷却速度で、２℃まで冷却し、結晶を析出させた。スラリーは良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。得られたスラリーを減圧ろ過し（実施例１と同様、濾過性は良好）、湿結晶を冷２−プロパノール、冷水、冷２−プロパノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９４ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．２０％含有、除去率５０％）を得た（有姿収率９４モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．３／０．７、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．０％であった。
（実施例３）
１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（酸化型補酵素Ｑ_９を０．４０％含有、純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇのヘキサンに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）１００ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、脱気した飽和食塩水１０００ｇでヘキサン相を６回水洗した。以上、すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。このヘキサン相を減圧下にて溶媒置換し、５０℃の還元型補酵素Ｑ_１０の７％（ｗ／ｗ）アセトン溶液を調製した（還元型補酵素Ｑ_１０を１００ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．４０％含有）を含む）。この溶液を窒素雰囲気下にて撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら１０℃／時間の冷却速度で、２℃まで冷却し、結晶を析出させた。スラリーは良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。得られたスラリーを減圧ろ過し（実施例１と同様、濾過性は良好）、湿結晶を冷アセトン、冷水、冷アセトンで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９３ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．２１％含有、除去率４８％）を得た（有姿収率９３モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．２／０．８、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９８．９％であった。
（実施例４）
実施例１とまったく同条件下にて還元反応、さらには溶媒置換を行い、５０℃の還元型補酵素Ｑ_１０の７％（ｗ／ｗ）エタノール溶液を調製した（還元型補酵素Ｑ_１０を１００ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．４０％含有）を含む）。このエタノール溶液に水５０ｇを添加し、撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら、１０℃／時間の冷却速度で２℃まで冷却して結晶を析出させた。スラリーは非常に良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し（実施例１と比べ、濾過性は極めて良好）、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９７ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．２１％含有、除去率４８％）を得た（有姿収率９７モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．２／０．８、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９８．９％であった。
（実施例５）
１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇの酢酸エチルに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）１００ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、脱気した飽和食塩水１０００ｇで酢酸エチル相を６回水洗した。以上、すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。この酢酸エチル相１１００ｇを減圧下、４８℃にて３００ｇに濃縮し、窒素雰囲気下で同温を維持しながらエタノール１１００ｇおよび水５０ｇを添加後、撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら１０℃／時間の冷却速度で、２℃まで冷却して結晶を析出させた。スラリーは良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。得られたスラリーを減圧ろ過し（実施例１と比べ、濾過性は極めて良好）、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９１ｇを得た（有姿収率９１モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．１／０．９、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９８．８％であった。
（実施例６）
１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇのヘプタンに溶解させ、２．９Ｎ硫酸１１００ｇおよび亜鉛粉末１５ｇを添加し、撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら、２５℃で６時間の還元反応を行った。濃塩酸１０００ｇを添加後、反応液から水相を除去し、脱気した飽和食塩水１０００ｇでヘプタン相を６回水洗した。以上、すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。このヘプタン相を減圧下にて溶媒置換し、５０℃の還元型補酵素Ｑ_１０の７％（ｗ／ｗ）エタノール溶液を調製した。さらに、窒素雰囲気下にて撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら１０℃／時間の冷却速度で、２℃まで冷却し、結晶を析出させた。スラリーは良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。なお、得られたスラリーを減圧ろ過し（実施例１と同様、濾過性は良好）、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９５ｇを得た（有姿収率９５モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．３／０．７、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．０％であった。
（比較例１）
実施例１とまったく同様にして、飽和食塩水にて水洗後の還元型補酵素Ｑ_１０１００ｇを含むヘプタン相（還元型補酵素Ｑ_９を０．４０％含有、純度９９．４％）を得た。このヘプタン相を撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら１０℃／時間の冷却速度で、５０℃から２℃まで冷却し、結晶を析出させた。得られたスラリーは流動性が悪く、晶析容器からの払い出しが実施例１に比べ困難であった。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷ヘプタン、冷エタノール、冷水、冷エタノール、冷ヘプタンで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９３ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．２９％含有、除去率２８％）を得た（有姿収率９３モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．６／０．４、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．２％であった。なお、スラリーのろ過には濾紙を敷いた直径２０ｃｍのヌッチェを用い、アスピレーターで減圧した。ろ過の所要時間は３７分であった。また、得られた結晶を実施例１〜６の結晶と共に光学顕微鏡で観察したところ、実施例１〜６と比較して明らかに小さな針状結晶であった。
（実施例７）
１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇのヘキサンに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）４０ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、脱気した飽和食塩水１０００ｇでヘキサン相を６回水洗した。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。このヘキサン相を減圧下にて溶媒置換し、５０℃の還元型補酵素Ｑ_１０の７％（ｗ／ｗ）エタノール溶液を調製した。さらに、窒素雰囲気下にて撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら１０℃／時間の冷却速度で、２℃まで冷却し、結晶を析出させた。スラリーは良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９５ｇを得た（有姿収率９５モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．２／０．８、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９８．９％であった。
（実施例８）
使用した酸化型補酵素Ｑ_１０中の純度が９８．４％（酸化型補酵素Ｑ_９を１．００％、酸化型補酵素Ｑ_８を０．３０％、及び、酸化型補酵素Ｑ_７を０．０４％含有）であること以外は、実施例１とまったく同様にして、５０℃の還元型補酵素Ｑ_１０の７％（ｗ／ｗ）エタノール溶液を調製した（還元型補酵素Ｑ_９を１．００％、還元型補酵素Ｑ_８を０．３０％、及び、還元型補酵素Ｑ_７を０．０４％含有）。このエタノール溶液に水５０ｇを添加し、撹拌（撹拌所要動力０．３ｋｗ／ｍ^３）しながら、３℃／時間の冷却速度で２℃まで冷却して結晶を析出させた。スラリーは非常に良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し（実施例１と比べ、濾過性は極めて良好）、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９５ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．５２％含有、除去率４８％、還元型補酵素Ｑ_８及び還元型補酵素Ｑ_７は検出されず）を得た（収率９７モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．３／０．７、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９８．７％であった。
（実施例９）
１０００ｇのエタノール中に、１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（純度９９．４％）、６０ｇのＬ−アスコルビン酸を加え、７８℃にて撹拌し、還元反応を行った。３０時間後、５０℃まで冷却し、同温を保持しながらエタノールを４００ｇ添加した。このエタノール溶液を撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、１０℃／時間の冷却速度で２℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。スラリーは良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。得られたスラリーを減圧ろ過し（実施例１と同様、濾過性は良好）、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９５ｇを得た（有姿収率９５モル％）。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．５／０．５、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．２％であった。
（実施例１０）
１０００ｇのエタノール中に、１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（純度９９．４％）、６０ｇのＬ−アスコルビン酸を加え、７８℃にて撹拌し、還元反応を行った。３０時間後、５０℃まで冷却し、同温を保持しながらエタノール３３０ｇと水７０ｇ添加した。このエタノール溶液を撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、１０℃／時間の冷却速度で２℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。スラリーは非常に良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。得られたスラリーを減圧ろ過し（実施例１と比べ、濾過性は極めて良好）、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９７ｇを得た（有姿収率９７モル％）。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．５／０．５、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．２％であった。
（実施例１１）
１０００ｇのアセトン中に、１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（純度９９．４％）、６０ｇのＬ−アスコルビン酸、３０ｇの炭酸水素ナトリウムを加え、５０℃にて撹拌し、還元反応を行った。４５時間後、同温を保持しながらアセトンを４００ｇ添加した。このアセトン溶液を撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、１０℃／時間の冷却速度で２℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。スラリーは良好な流動性を示し、容易に晶析容器より払い出しが可能であった。得られたスラリーを減圧ろ過し（実施例１と同様、濾過性は良好）、湿結晶を冷アセトン、冷水、冷アセトンで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９３ｇを得た（有姿収率９３モル％）。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．５／０．５、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．２％であった。
（参考例１）
表１に示す各種溶媒２０ｇに１ｇの還元型補酵素Ｑ_１０（還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．６／０．４）を、２５℃下で溶解した。大気中、２５℃で２４時間の撹拌後、液中の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比を測定した結果を表１に示す。

（参考例２）
表２に示す各種溶媒１００ｇに１ｇの還元型補酵素Ｑ_１０（還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．６／０．４）を、３５℃下で溶解した。大気中、３５℃で２４時間の撹拌後、液中の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比を測定した結果を表２に示す。

産業上の利用可能性
本発明は、上述の構成よりなるので、工業的規模での作業性、経済性に優れた方法で、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０結晶を簡便且つ効率的に得ることができる。

Claims (35)

1. 還元型補酵素Ｑ_１０をアルコール類及び／又はケトン類の溶液中で晶析することを特徴とする還元型補酵素Ｑ_１０結晶の製造法であって、
   溶媒中のアルコール類及び／又はケトン類の割合が８０ｗ／ｗ％以上である製造法。
2. 還元型補酵素Ｑ_１０をアルコール類の溶液中で晶析する請求の範囲第１項記載の製造法。
3. アルコール類が炭素数１〜２０の１価アルコールである請求の範囲第１項又は２項記載の製造法。
4. アルコール類が炭素数１〜５の１価アルコールである請求の範囲第１項又は２項記載の製造法。
5. 炭素数１〜５の１価アルコールがエタノールである請求の範囲第４項記載の製造法。
6. 還元型補酵素Ｑ_１０をケトン類の溶液中で晶析する請求の範囲第１項記載の製造法。
7. ケトン類が炭素数３〜６のケトンである請求の範囲第１項又は６項記載の製造法。
8. 炭素数３〜６のケトンがアセトンである請求の範囲第７項記載の製造法。
9. 補助的溶媒として水を併用する請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の製造法。
10. 溶媒中のアルコール類及び／又はケトン類の割合が９０〜９９．５ｗ／ｗ％である請求の範囲第９項記載の製造法。
11. 晶析は、冷却晶析、又は、冷却晶析に他の晶析方法を組み合わせて行う請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の製造法。
12. 晶析時の冷却温度は、２５℃以下である請求の範囲第１１項記載の製造法。
13. 冷却速度は、４０℃／時間以下である請求の範囲第１１項又は１２項記載の製造法。
14. 晶析濃度は、晶析終了時の晶析溶媒の重量に対する還元型補酵素Ｑ_１０の重量として１５ｗ／ｗ％以下である請求の範囲第１〜１３項のいずれかに記載の製造法。
15. 晶析は、単位容積当たりの撹拌所要動力として０．０１ｋＷ／ｍ^３以上の強制流動下に実施する請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の製造法。
16. 晶析に際して種晶を添加する請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の製造法。
17. 脱酸素雰囲気下で実施する請求の範囲第１〜１６項のいずれかに記載の製造法。
18. 不純物を母液に除去する請求の範囲第１〜１７項のいずれかに記載の製造法。
19. 除去される不純物が、還元型補酵素Ｑ_９、還元型補酵素Ｑ_８、及び、還元型補酵素Ｑ_７から選ばれる少なくとも１種である請求の範囲第１８項記載の製造法。
20. 還元型補酵素Ｑ_１０のアルコール類及び／又はケトン類の溶液は、還元型補酵素Ｑ_１０が炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種の溶媒に溶解された溶液を、アルコール類及び／又はケトン類に溶媒置換して得られたものである請求の範囲第１項記載の製造法。
21. 還元型補酵素Ｑ_１０が炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種の溶媒に溶解された溶液は、酸化型補酵素Ｑ_１０を、還元剤として水素化金属化合物、鉄、亜鉛、次亜硫酸類、又は、アスコルビン酸類を用い、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種を溶媒として用いて還元した後、生成した還元型補酵素Ｑ_１０を含有する有機相を採取し、必要に応じ、該有機相をさらに水洗したものである請求の範囲第２０項記載の製造法。
22. 還元剤として、次亜硫酸類を用いる請求の範囲第２１項記載の製造法。
23. 次亜硫酸類を用いる還元は、水共存下、ｐＨ３〜７で行われる請求の範囲第２２項記載の製造法。
24. 還元剤として、アスコルビン酸類を用いる請求の範囲第２１項記載の製造法。
25. 還元は、脱酸素雰囲気下に行われる請求の範囲第２１〜２４項のいずれかに記載の製造法。
26. 酸化型補酵素Ｑ_１０をアルコール類及び／又はケトン類の溶液中で還元型補酵素Ｑ_１０に還元することにより得られた、還元型補酵素Ｑ_１０を含有するアルコール類及び／又はケトン類の溶液から、還元型補酵素Ｑ_１０を晶析する請求の範囲第１〜１９項のいずれかに記載の製造法。
27. 酸化型補酵素Ｑ_１０をアルコール類の溶液中で還元型補酵素Ｑ_１０に還元することにより得られた、還元型補酵素Ｑ_１０を含有するアルコール類の溶液から、還元型補酵素Ｑ_１０を晶析する請求の範囲第２６項記載の製造法。
28. アルコール類が炭素数１〜２０の１価アルコールである請求の範囲第２６項又は２７項記載の製造法。
29. アルコール類が炭素数１〜５の１価アルコールである請求の範囲第２６項又は２７項記載の製造法。
30. 炭素数１〜５の１価アルコールがエタノールである請求の範囲第２９項記載の製造法。
31. 酸化型補酵素Ｑ_１０をケトン類の溶液中で還元型補酵素Ｑ_１０に還元することにより得られた、還元型補酵素Ｑ_１０を含有するケトン類の溶液から、還元型補酵素Ｑ_１０を晶析する請求の範囲第２６項記載の製造法。
32. ケトン類が炭素数３〜６のケトンである請求の範囲第２６項又は３１項記載の製造法。
33. 炭素数３〜６のケトンがアセトンである請求の範囲第３２項記載の製造法。
34. 還元剤としてアルコルビン酸類を用いる請求の範囲第２６〜３３項のいずれかに記載の製造法。
35. 塩基性物質又は亜硫酸水素塩の共存下に還元を行う請求の範囲第３４項記載の製造法。