JPS6075294A - 補酵素ｑの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、還元型補酵素Ｑから補酵素Ｑを製造する方法
に関する。

補酵素Ｑは生体内ではｔ子伝達糸に関与し、各種疾病に
対して優れた薬理効果を示す物質である。粗製の補酵素
Ｑは合成、発酵あるいは天然物より得られるが、高純度
の補＃素ＱＫ精製することは、それ自体が非常に不安定
な化合物である上に、各々類似した夾雑物を含むために
極めて困難であった。従来、補酵素Ｑの精製方法として
はシリカゲル、アルミナ、フロリジルなどの無機物を用
いたクロマトグラフィーが知られている。この無機吸着
剤を用いたクロマトグラフィーは類似した夾雑物を含む
目的物に対しては効果の大きい精製手段ではあるが、工
業的には無機吸着剤は比重が太きいために操作上困難な
点が多く、また反復使用の点でも問題がある。またポリ
エチレン粉末を吸着剤とする方法も知られていたが、そ
れらは表面積が小さく工業的精製手段とはなり得なかっ
た。

本発明者らは商業的に実施し得る高純度の補酵素Ｑを製
造する方法につき種々検討した結果本発明を完成するに
至った。

すなわち、本１発明は、予め原料物質たる還元型補酵素
Ｑを多孔性合成樹脂で処理して夾雑物を除去し次いで処
理した還元型補酵素Ｑを酸化する補酵素Ｑの製造法であ
る。

本発明に用いられる多孔性合成樹脂としては例えばスチ
レン−ジビニルベンセン共重合体〔アンバーライトＸＡ
Ｄ　−２（ローム・アンド・ハース社製）、アンバーラ
イトＸＡＤ　−４（ローム・アンド・ハース社製）、ハ
イポーラスポリマーＨＰ（三菱化成工業株式会社製〕〕
のような非極性合成樹脂、ポリアクリルエステル〔アン
バーライトＸＡＤ　−７（ローム・アンド・ハース社製
）。

アンバーライ）　ＸＡＤ　−８（ローム・アンド・ハー
ス社製）〕、スルホキシド〔アンバーライトＸＡＤ　−
９（ローム・アンド・ハース社製）〕、アミド（Ａｍｉ
ｃｌ、ｅ）（アンバーライトＸＡＤ　−１１（ローム・
アンド・ハース社製）〕のような極性合成樹脂が挙げら
れる。またこれらの多孔性合成樹脂は、樹脂の単位表面
積が大きいほど好適であるが、通常１００　ｍ２７１以
上、好ましくは４００ｒｎ２／２以上のものである。多
孔性合成樹脂の孔径は処理する化合物の分子の大きさの
約６倍以上、通常５０λ以上が好適であり、且つ平均孔
径が大きいほど好ましい結果が得られる。

本発明方法をさらに詳しく説明すると合成、発酵および
天然物から抽出したものをそのままあるいは必要に応じ
て一般的な還元剤例えば、ハイドロサルファイドソーダ
、水素化磯素ナトリウム等を添加して常法により還元型
補酵素Ｑとなしてから、前記多孔性合成樹脂を通常の溶
媒によるクロマトグラフィーの担体として使用し、流出
液中の還元型補酵素Ｑ区分を濃縮する。

次に得られた還元型補酵素Ｑを常法の穏和な酸化剤で処
理して補酵素Ｑを製造する。次に、得られた精製補酵素
Ｑのうち室温以上の融点を有するものは一般的な精製手
段である結晶化、例えはアセント中で結晶化することに
よって高純度の補酵素Ｑ１０を得ることができる。なお
、本発明に係る還元型補酵素Ｑとしては、補酵素Ｑの還
元物であるハイドロキノン体の外、ハイドロキノン核の
水酸基がアセチル化されたハイドロキノン・モノエステ
ル、ハイドロキノン・ジ・エステル等が挙げられる。

還元型補酵素Ｑが補酵素Ｑモノ・エステルあるいはジ・
エステルの場合は、補酵素Ｑの巣なる還元物の場合と同
様に多孔性合成樹脂でクロマトグラフィーを行い、次い
でケン化した後酸化工程に付せばよい。

本発明において使用される展出・溶出溶媒としてはメタ
ノール、エタノール、インプロパツール、ｎ−プロパツ
ール、アセトン、メチルエチルケトン、インプロピルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルセル
ソルブ、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、
石油エーテル、石油ベンジン、インペンタン、四塩化炭
素、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、水等の工業
的に安価な極性または非極性の溶媒を単独であるいは種
々の割合に混合した混合溶媒として使用することができ
る。溶媒を使用するに際し例えばスチレン・ジビニルベ
ンセン共重合体のような非極性多孔性合成樹脂に対して
はメタノールのような極性溶媒を用いて、比較的非極性
の夾雑物を吸着させ、次にメタノールにアセトンを加え
て、極性を弱めた混合溶媒で展開し、目的物質を溶出さ
せる。またアクリル酸エステル重合体のような極性多孔
性合成樹脂に対しては逆にヘキサンのような非極性溶媒
により展開溶出させる。溶出操作が終了した樹脂は夾雑
物が全く吸着しない溶媒で洗浄すれば再使用が可能であ
る。洗浄溶媒はアセトン、インフロビルエーテル、ベン
ゼン等の比較的非極性有機溶媒が効果的である。

本発明において特に好ましい方法としては多孔性・５合
成樹脂として非極性合成樹脂を用い、溶出溶媒として水
、アルコール類、ケトン類、ジメチルスルホキシド、　
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルなどの
極性溶媒を使用して展開する方法が好適である。この場
合使用される極性溶媒としては一般には炭素数１〜５の
アルコール類、炭素数６〜６０ケトン類を基本とする混
合溶媒、例えばメタノールと水、メタノールとアセトン
、メタノールとｎ−ヘキサン、アセトンと水などの組合
せが工業的に有利である。またその他の種々の組合せ、
又は単一溶媒の使用が可能なことは勿論である。

本発明方法は一般に次の順序によって実施される。

塔長径比１．０以上のカラムに水を満たし、自然沈降に
よって目的物の６倍（容積７型量）以上の多孔性合成樹
脂を充填する。次に還元型補酵素Ｑが浴出しない溶媒で
カラムを置換したのち、処理する還元型補酵素Ｑをカラ
ムの上部から流動させる。クロマトグラフィーは一般の
方法と同様に行うが、還元型補酵素Ｑの結晶が析出する
場合は必要に応じてカラムを加温してもよい。流出液は
区分して採取し目的物質を含む溶出区分を？ａ縮すれば
目的物質が得られる。次にアセトン、ベンセン、エーテ
ル、エステル類などの溶出力の大きい浴剤によりカラム
を洗浄し、吸着物質を除き、溶剤でカラムを置換するこ
とにより再び精製クロマトグラフィーを実施することが
できる。

また本発明方法に使用される多孔性合成樹脂は無機吸着
剤、イオン交換樹脂などと異なり化学的に不活性である
ことから、溶出力の太きい溶剤例えばアセトンなどによ
り吸着物を溶出させることによって容易にしかも完全に
元の状態に再生されるので工業的にきわめて有、利であ
る。

本発明は従来法と比較し次のごとく著しく優れた効果を
有するものである。即ち分離選択性が極めて大きいこと
、また多孔性合成樹脂に対する夾雑物の吸着量が極めて
大きく、且つ無機吸光剤と異なり、吸着点がないため分
解が起らず、多孔性合成樹脂処理操作中における損失が
全くなく、回収率が著しく高いこと、多孔性合成樹脂を
繰り返し使用することができること、無機物の１＆漬剤
と炭化水素類、エーテル類などの疎水性溶媒を用いる従
来方法と異なり、静電気等による火災の危険性の少ない
より安全な溶媒の選択が可能となったこと、簡単な精製
法で高純度の補酵素Ｑが得られること等の経済性および
実用性共に満足し得るものである。

次に本発明の実施例を示すが本発明は以下の実施例に限
定されるものではない。

実施例　１ ハイポーラスポリマーＨＰ−２０（比表面積７１．８０
ｍ２／　ｔ、細孔容積１．０７７ｍｇ、＃、４０メツシ
ユ、三菱化成工業株式会社製）２００−をガラス製カラ
ム（ｇ３４５＋ｍｘ３００叫）に充填し、アセトン：メ
タノール（３ニア）混合液にて逆洗した後静甑する。こ
れにインデカプレノールと２，３−ジメトキシ−５−メ
チル−ハイドロキノンとを三弗化ホウ素・エーテル錯体
触媒の存在下に縮合して得た２、６−シメトキシー５−
メチル−６−ゾカプレニルハイドロキノン（還元型補酵
素Ｑ１ｏ）を含む油脂状物６０９（純良４８％）を前記
混合液６０ｍ１で攪拌乳濁させて充填カラム中を流動さ
せる。次いで同一混合液で流出させる。流出液は約１０
０ｍづつ区分し、それぞれの区分液の極微小量について
シリカゲル薄層クロマトグラフィーを行って２，６−シ
メトキシー５−メチル−６−デカプレニルハイドロキノ
ンを含む区分を集合させ、溶媒を減圧濃縮によって留去
する。

得られた処理物をイソプロピルエーテル４００−に溶解
させ、５％水酸化カリウム水２０−を加え、室温で攪拌
下に３０分間空気を導入して酸化する。次いでイソプロ
ピルエーテル層を水洗し、溶媒を乾燥してから減圧留去
すると補酵素Ｑ１０を含む赤色油状物１６．１Ｆが得ら
れる。得られた赤色油状物を再度多孔性合成樹脂で処理
した後薄層クロマトグラフィーを行うと純度９６チの補
酵素ＣＪ１ｏ　１１９ｔが得られた。

実施例　２ ハイポーラスポリマー）ＩＰ−２０（４０メツシユ、三
菱化成工業株式会社製）２００−を４５ｆｉＯのカラム
に充填しアセトン：メタノール（２：８）混合液で満た
した。次にソラネソールと２，６−シメトキシー５−メ
チル−ハイドロキノンとを塩化亜鉛触媒の存在下に縮合
させて得た２、３−ジメトキシ−５−メチル−６−ノナ
プレニルハイドロキノン（還元型補酵素Ｑ９　）を含む
油脂３０２（純度４６％）を前記混合液６０づに添加し
て攪拌乳濁させてから充填カラム中を流動させる。次い
で同一混合液で流出させる。次に２．６−シメトキシー
５−メチル−６−ノナプレニルハイドロキノンを含む区
分を減圧濃縮ｔ７て得た処理物をインプロピルエーテル
４００−に溶解させ二酸化鉛３６？を添加し４時間攪拌
する。

酸化鉛を沢別したのち減圧濃縮すると補酵素Ｑ９を含む
赤色油状物１６．１’が得られる。

実施例　６ Ｐ５ｅｕｄ、０ｍ０ｎａａ属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
、ｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓｌＮＲＲＬ　Ｂ−１
６６５（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｅｏｎｒｉａ、工
１１１ｏｎｉｓ　６１６０４　）　〕を培養し、遠心分
離により集菌して得た湿薗体ペーストを水酸化ナトリウ
ムおよびピロガロールの存在下に、ヘキサン：メタノー
ル混合液で加熱抽出する。次にヘキサン層を５チハイド
ロサルフアイトソーダ水で洗浄し、さらに水洗して芒硝
で脱水後減圧濃縮する。次いで濃縮物のアセトン可溶部
を取り、アセトンを留去Ｉ−て得た２、３−ジメトキシ
−５−メチル−６−シカプレニルハイドロキノン（還元
型補酵素Ｑ、、　）を含む油状物６０２（純度５５襲）
を以下実施例１と同様に処理し補酵素Ｑ１０を含む赤色
油状物１９．２１を得る 実施例　４ ハイポーラスポリマーＨＰ−４０（比表面積７０４．７
ｍ２／ｒ、細孔容積０．６８７ｍｅ／ｖ、４０メツシユ
、三菱化成工業株式会社製）　２０　Ｄ７！をガラス製
円柱（０４５ｍ＋ｎＸ３００ｔＭＩＬ）に流入し、アセ
トン：メタノール（３ニア）混合液にて逆洗し、静置し
た。次に充填カラム上にイソデカプレノールと２．３−
ジメトキシ−５−メチル−ハイドロキノ／−４−モノア
セテートとを三弗化ホウ素・ニーチル錯体触媒により縮
合することによって製造した２、６−シメトキシー５−
メチル−６−ゾカプレニルハイドロキノンー４−モノア
セテート（還元型補酵素ＱＩＯのエステル）を含む油脂
２０ｆ（純度６８チ）を前記混合液２０−で攪拌乳濁さ
せてから仕込む。次いで同一混合液で流出させる。流出
液は約１００−づつ区分し、それぞれの区分液の極微小
量についてシリカゲル薄層クロマトグラフィーを行って
２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−ゾカプレニル／
１イドロキノン−４−モノアセテートを含む区分を集合
させ、溶媒を減圧濃縮によって留去する。得られた油状
物９．０２をイソプロピルエーテル１５０ゴに溶解し、
これに１０％苛性カリを含むメタノール１０−を加え３
０分間放置後、水３０ｍ１を加え、室温で攪拌下に６０
分間空気を導入して酸化する。次にインプロピルエーテ
ル層を水洗し溶媒を減圧留去すると補酵素Ｑ１０を含む
赤色油状物８．６７が得られる。

特許出願人　日清製粉株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）還元型補酵素Ｑを多孔性合成樹脂で処理し、次いで
   処理した還元型補酵素Ｑを酸化することを特徴とする補
   酵素Ｑの製造法。 ２）多孔性合成樹脂が非極性多孔性合成樹脂である場合
   極性溶媒を使用する特許請求の範囲第１項記載の補酵素
   Ｑの製造法。 ３）多孔性合成樹脂が極性多孔性合成樹脂である場合非
   極性溶媒を使用する特許請求の範囲第１項記載の補酵素
   Ｑの製造法。