JPH04187092A

JPH04187092A - マイトマイシンｃの精製法

Info

Publication number: JPH04187092A
Application number: JP2315234A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Iwata; 敏岩田; Michio Shiomi; 道夫塩見
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1990-11-20
Filing date: 1990-11-20
Publication date: 1992-07-03
Anticipated expiration: 2014-11-02
Also published as: JP2971128B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、マイトマイシンＣの培養液からマイトマイシ
ンＣを精製する方法に関する。

従来の技術マイトマイシンＣは、ストレプトミセス・ケスビトーズ
スの菌株を培養することによって得られる抗腫瘍性抗生
物質であり、広く臨床に供せられている。

従来、上記菌株を培養して得られる培養液からマイトマ
イシンＣを精製する方法としては、菌体を分離して得ら
れる培養Ｐ液に活性炭を加えて吸着させ、有機溶媒で溶
出させる活性炭吸着法、あるいは培養Ｐ液から有機溶媒
に転溶して得られるマイトマイシンＣの濃縮液を、アル
ミナクロマトグラフィー法もしくは向流分配法に付し精
製する方法が知られている（Ａ法；特公昭３５−１７８
９７号公報）。

また、その改良法として、培養Ｐ液を逆相吸着樹脂に吸
着させた後、アセトン、メタノールまたはエタノール等
の溶媒で溶出し、溶出液を濃縮して溶媒を除去し、食塩
を飽和してクロロホルムに転溶し、クロロホルム抽出液
をアルミナカラムクロマトグラフィーに付し、マイトマ
イシンＣの吸着帯をメタノールで溶出し、溶出液を濃縮
してエーテル、石油エーテル、ベンジンまたはりグロビ
ンを加えてマイトマイシンＣの結晶を得る方法が知られ
ている（Ｂ法；特公昭３６−９０９４号公報）。

発明が解決しようとする１ｌｌＨ前記Ａ法においては、活性炭吸着後の溶出、あるいは有
機溶媒への転溶等の操作が非箭率的で、マイトマイシン
Ｃの回収率が低い等の問題点を有している。

さらに、Ｂ法においても例えば、逆相吸着樹脂として具
体的に例示されているデュオライ）Ｓ−３０（デュオラ
イト社）は、マイトマイシンＣの吸着力が低く、大量の
樹脂および溶媒を使用する必要がある。クロロホルムに
転溶する際、抽出率が低く多量のクロロホルムを使用し
、また抽出操作を繰り返す必要がある。また、クロマト
後アルミナ吸着帯からのマイトマイシンＣを溶出単離す
る工程は操作が煩雑であり、また作業環境上望ましいも
のではない。さらに、得られる溶出液の純度も良好なも
のではなく、該溶出液から晶析して得られる結晶は、再
結晶しなければ純度的に充分なものではなく、また精製
工程全体に要する時間が長い等の種々の問題点を有して
いる。

従って、該改良法においても工業的精製法としては、作
業性、生産性等の観点から必ずしも十分ではなく、さら
に有用な精製法の開発が望まれている。

課題を解決するための手段本発明により、工業的規模でのマイトマイシンＣの有利
な精製法が提供される。すなわち、本発明はａ、　マイトマイシンＣ生産菌の培養液を逆相吸着樹脂
で処理して、マイトイシンＣを該樹脂に吸着させる工程
、ｂ、　該樹脂から酢酸エチルでマイトマイシンＣを溶出
させる工程、Ｃ０溶出液にリン酸緩衝液を加えた後、蒸留して酢酸エ
チルを留去する工程、ｄ、　蒸留残液を粒径の小さい逆相吸着剤を充填したカ
ラムに加圧下に通液し、マイトマイシンＣを該樹脂に吸
着させる工程、ｅ、　該樹脂から加圧下に含水メタノールで溶出する工
程、ｆ、　溶出液を逆相吸着樹脂で処理し、マイトマイシン
Ｃを該樹脂に吸着させる工程、ｇ、　該樹脂からメタノールでマイトイシンＣを溶出さ
せる工程、ｈ、　メタノール溶出液を濃縮してマイトマイシンＣを
晶析させる工程から成ることを特徴とするマイトマイシンＣの精製法に
関する。

以下に、本発明の精製法についてより詳細に説明する。

公知の方法（例えば、特公昭３５−１７８９７号公報）
により得られるマイトマイシンＣの培養液かう菌体等を
分離して得られる培養Ｐ液を冷却し、ｐｕをリン酸で６
．８〜７．０に調整した後、逆相吸着樹脂に通液する。

ここで、逆相吸着樹脂としては、従来使用されていたフ
ェノール系樹脂であるデュオライト５−３０に代えて、
ポリスチレンジビニルベンゼン系樹脂が好適に用いられ
る。該樹脂の具体例としてはダイヤイオン５Ｐ−２０７
（三菱化成）があげられ、樹脂の使用量はマイトマイシ
ン１ｇに対して、従来、デュオライ）Ｓ−３０が３１必
要であるのに対して、ダイヤイオン５Ｐ−２０７では３
００〜５００ｍ１の範囲であり、通常４００ｍ１で充分
である。

次いで、マイトマイシンＣを吸着させた樹脂を洗浄後、
酢酸エチルで溶出する。溶出に使用される酢酸エチルの
量は、通常樹脂１１に対し１．５〜２１である。

吸着樹脂としてデュオライ）Ｓ−３０に代えてダイヤイ
オン５Ｐ−２０７を使用することにより、マイトマイシ
ンＣの樹脂への吸着力の向上および溶出溶媒の使用量の
大幅な減少がはかられる。

次に、得られた酢酸エチル溶出液に対して１〜２倍量の
ｐＨが６，５〜８．０のリン酸緩衝液（０，０１モル／
１　リン酸す）　ＩＪウム）を加え、減圧下に酢酸エチ
ルを留去することによりマイトマイシンを含有したリン
酸緩衝液が得られる。なお、該処理方法は従来のクロロ
ホルムへの転溶法に比べ、大量の有機溶媒を使用するこ
となく操作も簡便であり、緩衝液を使用することにより
濃縮中にマイトマイシンＣの分解を防止することもでき
る。

このようにして調製されたマイトマイシンＣを含有した
リン酸緩衝液は、粒径の小さい逆相吸着剤を充填したカ
ラムに通液し、水で洗浄後吸着したマイトマイシンＣを
含水メタノールで溶出させる。通常、該操作は、多量の
試料を短時間に分離性良く、かつ高収率にマイトマイシ
ンＣを得るために加圧下に処理する方法（いわゆる、高
速液体クロマトグラフィー法；以下、ＨＰＬＣ法という
）が効率的である。

該ＨＰＬＣ法において、工業的規模で、多量の試料を処
理するのに好適な逆相吸着剤としては、例えばオクタデ
シル化シリカゲルが使用され、該シリカゲルの具体例と
しては、０ＤＳ−ＡＱ６０あるいは０ＤＳ−ＡＱＩ　２
０　（山村化学）などがあげられる。

充填剤（吸着剤）は、試料の処理量、分離性などの観点
より粒径１０〜２００μ、望ましくは５０μ練度であり
、通常マイトマイシンｃ、ｇに対して２００〜３００ｍ
使用される。マイトマイシンＣの吸着および溶出時の圧
力は１０〜５０ｋｇ／ｃ＋ｎ”であり、溶出に用いられ
る含水メタノールの濃度は２０〜４０％が好ましく、溶
出時の流速はｓＶ１〜５である。

ＨＰＬＣ法は、従来のアルミナカラムクロマトグラフィ
ー法に比べて精製度、操作性あるいは作業理境等におい
て優れた方法である。

次に、クロマト分離で希釈されたマイトマイシンＣを濃
縮するため、マイトマイシンＣの溶出画分を含むメタノ
ール水溶液のメタノール濃度を１０％以下に調製し、再
度少量の逆相吸着樹脂に通液する。吸着樹脂としては、
前記と同様のポリスチレンジビニルベンゼン系樹脂が好
ましく、例えばダイヤイオン５Ｐ−２０７が用いられ、
使用量はマイトマイシンｃ、ｇに対して８０〜１００ｍ
１である。溶出はメタノールで行い、通常樹脂１１に対
して２〜３１使用される。

マイトマイシンＣの両分を含むメタノール溶出液は、減
圧下に約２００〜２５０ｇ／ｊ！に濃縮し、５〜１０℃
で５〜１０時間放置することにより晶析させる。析出し
た結晶をｐ取、乾燥することにより高純度のマイトマイ
シンＣを得ることができる。

従来、クロマト処理後さらに再結晶することにより高純
度の製品としていたのに対して、本晶析法においては、
再結晶することな〈従来品と同等の高純度のマイトマイ
シンＣを得ることが可能である。

本発明の精製法は上記した特徴の他に、精製収率の向上
、操作時間の短縮等の特徴をあげることができる。

以下の実施例および比較例で本発明の詳細な説明する。

なお、実施例および比較例中のマイトマイシンＣの純度
は下記条件下のＨＰＬＣで分析した。

カラム、ＹＭＣＡＭ−３１２・０ＤＳ６φＸ１５０ｍｍＬ溶出液；２０％メタノール二８０％Ｏ，０１Ｍ酢酸アン
モニウム　ＰＩＩ６．５溶出速度；１ｍｌ／分温度；３５℃ 検出：　ＵＶ　（２５４％ｍ）実施例マイトマイシンＣ５００ｇを含む培養液４３００矛に、
濾過助剤ラジトライト＃５００（昭和化学工業）を３０
０ｋｇ加え、フィルタープレスで濾過した。得られたｐ
液５０００ｆにリン酸を加えｐＨを７に調整したのち、
ダイヤイオン５Ｐ−２０７２００Ｉ！を充填したカラム
へ１００ＯＪ／時の流速で通液した。カラムを水洗後、
酢酸二チル４００１を２００１７時の流速で流し、溶出
液４００１を得た。溶出液はマイトイシンＣ４３６ｇを
含有していた。ｐ　Ｈ７，５のリン酸緩衝液４００１を
加え、減圧下に濃縮し酢酸エチルを留去した。得られた
水溶液３００１を○ＤＳ−Ａ１２０−５５０８０１！を
充填した工業用）ＩＰＬＣカラムに２０ｋｇ／工２の圧
力下に２００１７時の流速で通液した。

次いで、１０％メタノール水溶液８０Ｊで洗浄したのち
、３０％メタノール水溶液６００１でＳ■３の流速で溶
出した。マイトマイシンＣ４０６ｇを含有した溶出画分
８０１へ水１６０βを加え、ダイヤイオン５Ｐ−２０７
３０Ｊを充填したカラムへＩ　５０１／時の流速で通液
した。樹脂内の水を押出したのち、メタノールで溶出し
、マイトマイシンＣ３８０ｇ（純度９７．６％）を含有
したメタノール溶液６０１を得た。減圧下に１．９１ま
で濃縮し、５℃で１０時間熟成した。析出した結晶を戸
数し、真空乾燥することによりマイトマイシンＣ３５０
ｇ（純度　９９．７％）を得た。

参考例実施例と同様にして得られる培養Ｐ液５０００１にリン
酸を加えてｐＨを７に調整したのちデュオライト５−３
０　１５００１を充填したカラムへ２０００１７時の流
速で通液した。カラムを水洗後、アセトン２０００１／
時の流速で流し、溶出液２０００１を得た。溶出液はマ
イトマイシンＣ４３４ｇを含有していた。水５００１を
加え、減圧下に濃縮しアセトンを留去し、３００１の水
溶液を得た。食塩３５ｋｇを加え溶解したのち、クロロ
ホルＡ３００１を加え攪拌した。クロロボルム層を分離
したのち、水層へ再度クロロポルムを添加し、攪拌後ク
ロロホルム層を分離した。この操作を５回纏り返し、ク
ロロホルム抽出液１５００１を得た。マイトマイシンＣ
の含有量は４１５ｇであった。抽出液を１５Ｏ１ずつに
分割し、あらかじめ１２０℃で２０時間乾燥して活性化
したアルミナ３１を充填したカラム１ｏ本へ、それぞれ
通液した。次いで各々のカラムに３％のメタノールを含
有したクロロホルム４ノを流した。

溶媒を抜き取ったのち、アルミナ層をカラムより抜き取
り、１０本分のマイトマイシンＣの吸着帯を切り取り、
５０１のメタノール中で３０分間攪拌し濾過することに
よりマイトマイシン０３３６ｇ（純度８０．４％）を含
有したＰ液を得た。減圧下に１．７１まで濃縮し、５０
℃で１０時間熟成した。析出した結晶を戸数し、真空乾
燥することによりマイトマイシンＣ２９６ｇ（Ｋ度９７
．４％）を得た。

この結晶を９０１のメタノールに溶解し、減圧下に１．
５１まで濃縮し、５℃で１０時間熟成した。

析出した結晶を戸取し、真空乾燥することによりマイト
マイシンＣ２７２ｇ（純度９９．７％）を得た。

発明の効果本発明により、マイトマイシンＣの工業的規模での効率
的精製法が提供される。

特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社代表者　　
加　藤　幹　夫、？ぞさ、

Claims

【特許請求の範囲】１）ａ、マイトマイシンＣ生産菌の培養液を逆相吸着樹
脂で処理して、マイトマイシンＣを該樹脂に吸着させる工程、ｂ、該樹脂から酢酸エチルでマイトマイシンＣを溶出さ
せる工程、ｃ、溶出液にリン酸緩衝液を加えた後、蒸留して酢酸エ
チルを留去する工程、ｄ、蒸留残液を粒径の小さい逆相吸着剤を充填したカラ
ムに加圧下に通液し、マイトマイシンＣを該樹脂に吸着させる工程、ｅ、該樹脂から加圧下に含水メタノールで溶出する工程
、ｆ、溶出液を逆相吸着樹脂で処理し、マイトマイシンＣ
を該樹脂に吸着させる工程、ｇ、該樹脂からメタノールでマイトイシンＣを溶出させ
る工程、ｈ、メタノール溶出液を濃縮してマイトマイシンＣを晶
析させる工程から成ることを特徴とするマイトマイシンＣの精製法。２）マイトマイシンＣ生産菌の培養液および含水メタノ
ールでの溶出液を処理しマイトマイシンＣを吸着させる
逆相吸着樹脂が、ポリスチレンジビニルベンゼン系樹脂
である請求項（１）記載の精製法。３）リン酸緩衝液のｐＨが、６．５〜８．０である請求
項（１）記載の精製法。４）加圧処理時のカラムの充填剤として使用される粒径
の小さい逆相吸着剤が、オクタデシル化シリカゲルであ
る請求項（１）記載の精製法。５）オクタデシル化シリカゲルの粒径が、１０〜２００
μである請求項（４）記載の精製法。６）マイトマイシンＣ含有のリン酸緩衝液の通液時およ
び含水メタノールで溶出時の圧力が、１０〜５０ｋｇ／
ｃｍ＾２である請求項（１）記載の精製法。７）溶出用含水メタノール濃度が、２０〜５０％である
請求項（１）記載の精製法。