KR100383435B1 - 고순도 아카보스 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 합성흡착제를 사용하여 일정수준 이상의 순도로 예비 정제된 아카보스를 1단계의 단일상 강산성 양이온교환제로 흡착시켜 당뇨병 치료제로서 유용한 일반식(I)로 표시되는 아카보스를 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

고순도 아카보스 제조방법{A process for preparing acarbose with high purity}

본 발명은 당뇨병 치료제인 아카보스를 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 합성흡착제를 사용하여 일정수준 이상의 순도로 예비 정제된 아카보스를 1단계의 단일상 강산성 양이온교환제로 흡착시켜 일반식(I)로 표시되는 고순도 아카보스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

아카보스는 글루코시다제 억제제로서 인체내 소장의 당흡수를 지연시킴으로써 인체내 혈중 당농도를 감소시키며 이로 인해 인슐린 비의존성 당뇨병 치료제로서 널리 사용된다. 상기 억제제는 방선균 악티노플라네스 종을 발효시켜 얻어지며(DE 제2,209,832호, DE 제 2,209,834호 및 DE 제2,064,092호 참조), 이 발효액으로부터 아카보스를 단리하기 위한 많은 방법이 공지되어 있다.

미국특허 제4,062,950호에 의하면, 발효액을 원심분리한 후 상등액을 산성의 조건하에서 활성탄이나 비선택적 흡착수지로 색소를 제거시키고 이온성 물질등을 제거하기 위하여 중성의 조건하에서 활성탄에 흡착시킨다. 이어서, 산성의 조건하에서 알코올류나 아세톤 용액으로 용출시키고 강산성 양이온교환수지나 약산성 양이온교환수지에 결합시킨 후 산 또는 염기의 수용액으로 용출시킨다. 상기 용출시킨 수용액을 이온교환수지로 중화시키고 진공 감압하여 농축시킨 후 친액화(lyophilization)시키거나 유기용매로 침전시켜 결정화시킨다. 이때 얻어진 아카보스는 건조물로서 건조한 물질중의 아카보스 85%의 함량을 갖는다(HPLC 방법). 보다 순수한 상태로 정제하기 위하여 증류수에 재용해시키고 셀루로오스를 기질로 사용한 이온교환수지상에서 크로마토그래피한 후 활성 분획을 모아 농축시킨 다음 친액화시키거나 유기용매로 침전키는 방법을 사용한다. 그러나, 이러한 방법은 활성탄 사용 및 여러 단계의 고가의 이온교환수지를 사용하여 공정이 복잡하고 경제적 부담이 큰 단점이 있다.

또한, 미국특허 제4,174,439호에서는 발효배양액에 강산성 양이온교환제와 음이온교환제를 도입시켜 아카보스를 흡착시킨 후 시브 스크루 원심분리기로 균사체와 혼상 이온교환수지를 분리시킨다. 혼상 이온교환수지를 증류수로 세척하여 제 1 컬럼에 넣은 후 흡착되어 있는 아카보스 혼합물을 묽은 염산용액으로 용출시킨다. 이 용출액을 하층부에 음이온교환제와 상층부에 고밀도로 가교화된 강산성 양이온교환제로 충진된 제 2 컬럼에 통과시키고 이 용출액을 다시 강산성 양이온교환제에 흡착시켜 소량의 증류수로 세척한 후 묽은 염산으로 용출하여 분획을 실시한다. 활성분획을 음이온교환제로 중성화시킨 후 진공에 의한 농축, 여과에 의한 살균, 친액화 또는 분무 건조시켜 전체 건조한 물질 중에서 52%∼58%의 수율로 아카보스를 회수한다.

한편, 미국특허 제4,666,776호와 제4,767,850호에서는 미국특허 제 4,174,439호의 1∼5공정으로부터 회수된 아카보스를 포함한 용출액을 강산성 양이온교환제에 흡착시키고 소량의 증류수로 세척 후 용출액으로 묽은 염산을 사용하여 크로마토그래피를 수행한다. 이후 활성분획을 음이온교환제로 중화시킨 후 친액화시켜 얻어진 아카보스는 구간수율이 79∼82%였으며 78∼88%의 순도를 갖는다(HPLC 방법).

종래의 이러한 정제방법들은 양이온교환제와 음이온교환제를 혼합한 수지공정을 중복수행하고 양이온교환제에 의한 크로마토그래피 공정을 또다시 반복 사용하여 아카보스를 회수하는 복잡한 공정임에도 불구하고 인체 의약품으로 사용하기에는 부적합한 순도를 나타내었다.

미국특허 제4,904,769호에는, 상기 공지기술에 따라 예비 정제시킨 아카보스 용액을 고순도 아카보스로 제조하기 위한 방법이 기재되어 있다. 충전제로서 카르복실기를 함유하며 덱스트란, 아가로스 및 셀룰로오스를 기재로 하는 고가의 약산성 양이온교환제를 사용하고 충전제의 pH 평형과 크로마토그래피를 실시하는 동안정온을 유지하면서 82% 이상의 구간수율로 90중량% 이상의 함량을 갖는 아카보스를 얻었다. 이 방법은 상기 공지기술에 따라 예비 정제시킨 아카보스 용액을 사용하고 다시 한번 약산성 양이온교환제를 사용함으로써 정제공정이 더욱 복잡해졌으며, 고가의 이온교환제 사용으로 인한 경제적 부담 역시 크다.

PCT 제WO99/07720호에는 상기에 기술한 미국특허 제4,062,950호, 제4,767,850호와 제4,904,769호의 방법에 의해 발효배양액 내의 아카보스를 예비 정제시킨 후 비방향족 강산성 양이온교환제에 의해 98% 이상의 순도의 아카보스를 회수하였다. 이 방법 역시 상기 공지기술에 따라 예비 정제시킨 아카보스 용액을 회수함으로써 정제공정이 복잡하며, 고가의 비방향족 강산성 양이온교환제 및 과량의 용리액을 사용함으로써 산업상 적용시 역시 큰 경제적 부담을 갖는다.

본 발명자들은 공정상의 복잡성 및 그로 인한 경제적 부담을 극복하고자 별도의 정제방법 연구를 수행하여 고가의 약산성 양이온교환제를 사용하지 않고 합성흡착제를 사용하여 일정 수준 이상의 순도로 아카보스를 예비 정제시킴으로써 1단계의 단일상 강산성 양이온교환제 만으로도 당뇨병 치료제로서 사용되는 아카보스가 고순도로 회수됨을 확임함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 아카보스의 정제시 기존의 활성탄 사용 및 5∼6단계의 수지공정을 대체할 수 있는 방법으로써 합성흡착제를 사용하여 예비 정제한 아카보스를 1단계의 단일상 강산성 양이온교환제로 흡착시켜 고순도 아카보스를 제조한다.

발효가 완료된 배양액에서 균사체를 여과 분리한 후 여과액속에 존재하는 아카보스 이외의 양이온성 물질들에 의해 양이온교환제로의 아카보스 흡착이 용이하지 않으므로, 종래의 방법에서 사용된 활성탄 및 과량의 이온교환제의 사용을 대체하고자 고다공성 스티렌계, 고다공성 스티렌계에 브롬을 화학적으로 조성시킨 합성흡착제, 고다공성 스티렌/다이비닐 중합체, 거대그물모양이 가교화된 중합체, 거대 그물모양이 가교화된 지방족 중합체, 거대 그물모양이 가교화된 방향족 중합체, 메타크릴계를 기재로 하는 합성흡착제 및 고다공성이며 스티렌/다이비닐벤젠 이온교환수지를 기재로 하는 탄소(질)의 합성흡착제를 사용하여 아카보스 수용액중의 착색물질 제거 및 아카보스와 그 유사체를 제외한 기타의 불순물을 제거시킨다. 그 예로서는 시판 중인 DIAION^ⓡSP207, SP700, SP825, SP850, HP20, HP21, HP2MG(Mitsubishi Chemical co.); AMBERLITE^ⓡXAD 4, XAD 7, XAD 16, XAD 1600T; AMBERSORB^ⓡ563, 572, 600(ROHM and HAAS co.); Lewatit^ⓡVP OC 1064, VP OC 1066, EP 63(Bayer co.)이 있다. 이후 증류수로 상기 합성흡착제를 세척한 다음 pH가 조절된 수용액이나 유기용매에 의해 흡착된 아카보스를 용출시킨다. 이어서 아카보스가 포함된 용출액을 음이온교환제에 빠른 유속으로 통과시켜 탈색 및 중성화시킨다. 상기 음이온교환제의 예로서는 시판 중인 DIAION^ⓡSA11A(Mitsubishi Chemical co.); AMBERLITE^ⓡIRA 67(ROHM and HAAS co.); Lewatit^ⓡMP 64(Bayer co.)가 있다. 상기의 용출액을 단일상(monodisperse)으로 육각형의 층상구조를 갖고 황산기를 함유하며 가교화된 폴리스티렌 계열의 겔제인 강산성 양이온교환제(입자크기는 0.15∼0.3mm, 바람직하기로는 0.21∼0.25mm; 그 예로써 시판중인 MFG 210, MFG 250(Finex co.)이 있다.)에 흡착시킨 다음, 묽은 염산으로 크로마토그래피하여 잔류염 및 당함유 염기성 2차성분, 아카보스 유사체 등을 제거시킴으로써 간단히 3단계의 수지 공정만으로도 98% 이상의 고순도를 갖는 아카보스를 회수할 수 있었다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

발효배양액을 여과한 후 아카보스 수용액의 pH를 3∼9(바람직하게는 pH 5∼7)로 조절하여 합성흡착제에 도입하여 흡착된 아카보스를 pH 1∼5(바람직하게는 pH 1∼3)의 증류수로 용출시키거나 알코올 또는 아세톤이 함유된 증류수(바람직하게는 5∼30% 아세톤 수용액)로 용출시킬 때, 회수된 아카보스는 HPLC 방법으로 50% 이상의 순도를 나타낸다. 이후 아카보스가 함유된 용출액을 빠른 유속으로 음이온교환제에 통과시켜 색소 잔존물 제거 및 중성화시킨다. 상기의 용출액을 강산성 양이온교환제에 흡착시킨 후 소량의 증류수로 세척한다. 강산성 양이온교환제에 흡착되어있는 아카보스를 단리시키기 위한 가장 결정적인 요인은 가해지는 용출액의 pH이다. 따라서 pH 1.0∼3.0의 증류수로 용출시켜 HPLC 순도 98% 이상의 고순도 아카보스를 회수한다. 바람직하게는 pH 1.5∼2.5의 증류수로 용출시키며, 보다 바람직하게는 pH 2.1∼2.5의 증류수로 2차 유사당 성분을 먼저 용출시킨 후 pH 1.5∼2.1의 증류수로 고순도 아카보스를 신속히 용출시킬 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의하면 상기 공지기술에 비해 공정이 간략하며 특히, 활성탄 및 5∼6단계의 수지공정을 대체한 합성흡착제의 사용으로 HPLC 순도 50% 이상의 예비 정제시킨 아카보스를 수득할 수 있었으며, 고가의 약산성 양이온교환제를 사용하지 않고 저가의 단일상 강산성 양이온교환제를 사용하여 간단히 HPLC 순도 98% 이상의 아카보스를 분리, 회수할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기 예에만 국한되지 않는다.

실시예 1.

직경 4cm, 길이 12cm의 크로마토그래피 컬럼에 합성흡착제인 Lewatit^ⓡEP 63(Bayer co.) 150ml를 충진시켰다. 사용하는 시험물질로서, 약 0.25g의 아카보스가 함유된 150ml의 배양 여과액을 pH 5로 적정하였다. 아카보스가 함유된 상기 여과액을 2.3ml/min의 유속으로 컬럼에 가하고 실온에서 증류수로 세척하였다. 10% 아세톤이 함유된 증류수로 용출한 후 주요 분획물을 합하였다. 이때 0.2g의 아카보스가 함유된 HPLC 순도 50.1% 용액을 얻었다. 컬럼은 1M 가성소다 용액 200ml를 사용하여 재생시키고 이어 증류수 400ml로 세척하였다.

실시예 2.

직경 2.5cm, 길이 8cm의 크로마토그래피 컬럼에 음이온교환제인 AMBERLITE^ⓡIRA 67(ROHM and HAAS co.) 20ml를 충진시켰다. 사용하는 시험물질로서, 실시예 1에서 예비 정제시킨 아카보스를 0.2g 함유한 70ml의 용액을 3.5ml/min의 유속으로 컬럼에 가하였다. 이후 실온에서 컬럼을 증류수로 세척하였다. 이때 탈색 및 중성화된 0.2g의 아카보스가 함유된 96ml의 용액을 얻었다.

실시예 3.

직경 4cm, 길이 12cm의 크로마토그래피 컬럼에 합성흡착제인 AMBERLITE^ⓡXAD 1600T(ROHM and HAAS co.) 150ml를 충진시켰다. 사용하는 시험물질로서, 약 0.45g의 아카보스가 함유된 300ml의 배양 여과액을 pH 5로 적정하였다. 아카보스가 함유된 상기 여과액을 2.5ml/min의 유속으로 컬럼에 가하고 실온에서 증류수로 세척하였다. 10% 아세톤이 함유된 증류수로 용출한 후 주요 분획물을 합하였다. 이때 0.4g의 아카보스가 함유된 HPLC 순도 52% 용액을 얻었다. 컬럼은 1M 가성소다 용액 200ml를 사용하여 재생시키고 이어 증류수 400ml로 세척하였다. 얻어진 아카보스 용액을 실시예 2와 같은 방법으로 AMBERLITE^ⓡIRA 67(ROHM and HAAS co.)을 통과시켜 탈색 및 중성화된 0.39g의 아카보스가 함유된 95ml의 용액을 얻었다.

실시예 4.

직경 6cm, 길이 40cm의 크로마토그래피 컬럼에 합성흡착제인 DIAION^ⓡSP850(Mitsubishi Chemical co.) 1L를 충진시켰다. 사용하는 시험물질로서, 약 3.9g의 아카보스가 함유된 3L의 배양 여과액을 pH 5로 적정하였다. 아카보스가 함유된 상기 여과액을 16.7ml/min의 유속으로 컬럼에 가하고 실온에서 증류수로 세척하였다. 10% 아세톤이 함유된 증류수로 용출한 후 주요 분획물을 합하였다. 이때 3.5g의 아카보스가 함유된 HPLC 순도 50.7% 용액을 얻었다. 컬럼은 1M 가성소다 용액 1L를 사용하여 재생시키고 이어 증류수 2L로 세척하였다. 얻어진 아카보스 용액을 실시예 2와 같은 방법으로 AMBERLITE^ⓡIRA 67(ROHM and HAAS co.)을 통과시켜 탈색 및 중성화된 3.5g의 아카보스가 함유된 750ml의 용액을 얻었다.

실시예 5.

직경 6cm, 길이 40cm의 크로마토그래피 컬럼에 합성흡착제인 DIAION^ⓡSP207(Mitsubishi Chemical co.) 1L를 충진시켰다. 사용하는 시험물질은 약 4.9g의 아카보스가 함유된 10L의 배양여과액을 pH 5로 적정하였다. 아카보스가 함유된 상기 여과액을 15.2ml/min의 유속으로 컬럼에 가하고 실온에서 증류수로 세척하였다. pH 1의 증류수로 용출한 후 주요 분획물을 합하였다. 이때 4.2g의 아카보스가 함유된 HPLC 순도 69% 용액을 얻었다. 컬럼은 1M 가성소다 용액 1L를 사용하여 재생시키고 이어 증류수 2L로 세척하였다. 얻어진 아카보스 용액을 실시예 2와 같은 방법으로 AMBERLITE^ⓡIRA 67(ROHM and HAAS co.)을 통과시켜 탈색 및 중성화된 4.1g의 아카보스가 함유된 660ml의 용액을 얻었다.

실시예 6.

직경 3.5cm, 길이 40cm의 크로마토그래피 컬럼에 강산성 양이온교환제인 MFG 210(Finex co.) 200ml를 충진시켰다. 사용하는 시험물질로서, 실시예 4에서 예비 정제시킨 아카보스를 3.5g 함유한 750ml의 용액을 3.3ml/min의 유속으로 컬럼에 가하였다. 이후 실온에서 컬럼을 증류수로 세척하였다. pH 2.1인 증류수로 2차 유사당 성분을 용출시킨 후 아카보스가 용출되는 시점에서 pH 2.0의 증류수로 용출하였다. 주요 분획물을 합하여 HPLC 순도 98.1%의 아카보스 2.7g을 함유한 용액을 얻었다.

실시예 7.

직경 3.5cm, 길이 40cm의 크로마토그래피 컬럼에 강산성 양이온교환제인 MFG 250(Finex co.) 200ml를 충진시켰다. 사용하는 시험물질로서, 실시예 5에서 예비 정제시킨 아카보스를 3.1g 함유한 500ml의 용액을 3.1ml/min의 유속으로 컬럼에 가하였다. 이후 실온에서 컬럼을 증류수로 세척하였다. pH 2.1인 증류수로 2차 유사당 성분을 용출시킨 후 아카보스가 용출되는 시점에서 pH 2.0의 증류수로 용출하였다. 주요 분획물을 합하여 HPLC 순도 98.7%의 아카보스 2.4g을 함유한 용액을 얻었다.

본 발명은 복잡한 정제 공정을 생략하여 간단한 3단계의 수지 공정만으로도 당뇨병 치료제로서 유용한 아카보스를 98% 이상의 고순도로 제조할 수 있고, 종래의 활성탄 사용 및 5∼6단계의 수지공정 대신에 합성흡착제를 사용하여 일정 수준 이상의 고순도로 아카보스를 예비 정제한 후 1단계의 단일상 강산성 양이온교환제 만으로 고순도의 아카보스를 회수함으로써 정제 비용을 절감할 수 있음은 물론 시간을 단축할 수 있어 산업적 및 경제적으로 유용한 발명이다.

Claims (6)

1. 아카보스가 함유된 발효배양액을 여과한 후 아카보스 수용액의 pH를 3∼9로 조절하여 합성흡착제에 흡착시킨 후, 흡착된 아카보스를 pH 1∼5의 증류수로 용출시키거나, 아세톤이 함유된 증류수로 용출시키고, 상기 용출액을 음이온교환제에 빠른 유속으로 통과시켜 탈색 및 중성화시키고 강산성 양이온교환제에 흡착시킨 후, pH 1.0 내지 pH 3.0의 증류수로 용출시켜 HPLC 순도 98% 이상의 고순도로 아카보스를 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 합성흡착제가 고다공성 스티렌계, 고다공성 스티렌계에 브롬을 화학적으로 조성시킨 합성흡착제, 고다공성 스티렌/다이비닐 중합체, 거대 그물모양이 가교화된 중합체, 거대 그물모양이 가교화된 지방족 중합체, 거대 그물모양이 가교화된 방향족 중합체, 메타크릴계를 기재로 하는 합성흡착제 및 고다공성이며 스티렌/다이비닐벤젠 이온교환수지를 기재로 하는 탄소(질)의 합성흡착제 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 고순도로 아카보스를 제조하는 방법.
3. 제 1항 내지 2 항에 있어서, 합성흡착제에 흡착된 아카보스를 5∼30%의 아세톤이 함유된 증류수로 용출시키거나, pH 1 내지 3의 증류수로 용출시키는 것을 특징으로 하는 고순도로 아카보스를 제조하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 용출시킨 용액내에 HPLC 순도 50% 이상의 아카보스를 함유하는 것을 특징으로 하는 고순도로 아카보스를 제조하는 방법.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 강산성 양이온교환제가 단일상(monodisperse)으로 육각형의 층상구조를 갖고 황산기를 함유하며 가교화된 폴리스티렌 계열의 겔제인 강산성 양이온교환제(입자크기 0.15∼0.3mm)인 것을 특징으로 하는 고순도로 아카보스를 제조하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 용출액을 강산성 양이온교환제에 흡착시킨 후, pH 2.1의 증류수로 2차 유사당 성분을 용출시킨 후 아카보스가 용출되는 시점에서 pH 2.0의 증류수로 용출시켜 HPLC 순도 98% 이상의 고순도로 아카보스를 제조하는 방법.