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JP4203108B2 - 複数の細胞を培養し、その中の単個細胞の状態を決定する方法 - Google Patents

複数の細胞を培養し、その中の単個細胞の状態を決定する方法 Download PDF

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Description

＜発明の分野＞
本発明は細胞を保持する装置に関する。本発明はより具体的には、細胞を培養する装置であって、単個細胞の配列、つまり機能的アンサンブル(functional ensenble)を、動的制御された環境の中で増殖させて、個々に分析することのできる装置に関する。
造血幹細胞は、成人の人間では、主として骨髄の中に見られ、新生児では、臍帯の血液中に存在する。造血幹細胞は人体の成熟血液細胞の前駆体(すなわちプレカーサー)であり、造血と称されるプロセスを通じて、幹細胞は、赤血球(体内の酸素を運搬するもの)、白血球(感染と戦い、人体の免疫系を構成するもの)及び血小板(血餅を作り出血を止めるもの)を含む人体の血液供給体を連続的に再生する。造血は細胞分裂(すなわち、細胞数の増加)と、細胞分化(すなわち、細胞表現型の変化)を伴う。化学療法と放射線療法は、癌患者の治療又は固形臓器(solid-organ)の移植を行なうのに重要な手段であるが、これらの方法は有益であるが、造血(すなわち血液)系に対して毒性である。その理由は、化学療法及びイオン化放射線が骨髄中の幹細胞の多くを殺すためである。体内の血液細胞が下限値にあると、感染及び出血によって生命が脅かされるため、この免疫抑制と他の血液毒性は、多くの癌治療効果に制限を与える結果となる。
これらの治療から回復するには、患者の幹細胞の再貯留(replenishment)を必要とする。生長因子(growth factor)による処置は、現在では、血液細胞の回復を促進するのに採用されているが、免疫抑制処置を伴い、ほんの部分的にしか効果がない。一方では、患者の血液細胞を再生する能力を速やかに且つ永久的に回復させるために、医師が骨髄移植により人間の幹細胞を注入するケースは増えてきている。骨髄の移植は、１９９０年には年間５０００件であったのに対し、１９９５年には年間５００００件を超えるようになった[Kline, Ronald,"New Marrow for Old, Technology Review," Nov./Dec. 1993, p. 43; Anonymous Inside Surgery, Medical Data International Ed., Vol. 3, No. 8, Feb. 1996, p. 192]。しかしながら、メディアの報告の多くは、適当な骨髄ドナーを探している人々のことを話題にしており、多くの場合、適当なドナーが見つかることは非常に稀であるため、この方法は極めて困難であることを表している。最良の骨髄ドナーは兄弟姉妹であるけれど、適合移植ドナーは兄弟姉妹でもその２５％程度にすぎない[Kline, Ronald, New Marrow for Old, Technology Review, Nov./Dec. 1993, p. 43]。
独特のバイオリアクターシステムを用いて幹細胞を自動的に生長させることが行われているが、これは癌研究及び治療のために非常に重要な進歩といえるだろう。例えば、バイオリアクターシステムの使用により、ドナーの必要性をなくすことができる：幾つかの幹細胞は、化学療法の前に患者から取り出され、化学療法の間貯蔵され、バイオリアクターシステムの中で大量の幹細胞が作られ、これが患者の中へ移植される。しかし、このやり方では、造血膨張が優先的に起こり、分化された成熟血液細胞を作り出すのに、骨髄の長期間再貯留に必要な多分化能性(最も原始的なもの)の幹細胞の数が増えるのを犠牲にするため、現在の幹細胞を生長させるための技術に適用することはできない[Van Zant, Gary, Rummel, Sue A., Koller, Manfred R., Larson, David B., Drubachevsky, Ilana, Palsson, Mahshid and Emerson, Stephen G. "Expansion in Bioreactors of Human Progenitor Populations from Cord Blood and Mobilized Peripheral Blood." Blood Cells (1994) 20:482-491; Goff, Julie P., Shields, Donna S., Petersen, Bryon E., Zajac, Valerie F., Michalopoulos, Geirge K. and Greenberger, Joel S. "Synergistic Effects of Hepatocyte Growth Factor on Human Cord Blood CD34+ Progenitor Cells are Result of c-metReceptor Expression." Stem Cells (In Press); Moore, MAS. "Clinical Implications of Positive and Negative Hematopoetic Stem Cell Regulators." Blood 1991;78:1-19; Metcalfe, D. Hematopoeitic Regulators: "Redundancy or Subtlety?" Blood 1993; 82:3515-3523; Bernstein, I.D., Andrews, R.G., Zsebo, K.M. "Recombinant Human Stem Cell Factor Enhances the formation of Colonies by CD34+ and Progeny From CD34+lin- Cells Cultured With Interleukin-3, Granulocyte Colony-Stimulating Factor, or Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor." Blood 1991; 77:2316-2321; Musashi, M.Clark, S.C., Suodo, T. et al. “Synergistic Interactions Between Interleukin-11 and Interleukin-4 in Support of Proliferation of Primitive Hematopoeitic Progenitors of Mice.” Blood 1991; 78:1448-1451; Musashi, M., Yang, Y-C, Paul, S.R. et al. "Direct and Synergistic Effects of Interleukin-11 on Murine Hemopoiesis in Culture." Proc Natl Acad Sci 1991; 88:765-769; Migliaccio, G., Migliaccio, A.R., Druzin, M.L. et al. "Long-Term generation of Colony-Forming Cells in Liquid Culture of CD34+Cord Blood Cells in the Presence of Recombinant Human Stem Cell Factor." Blood 1992; 79(10):2620-2627; Ikuta, K., Weissman, I.L. "Evidence That Hematopoeitic Stem Cells Express Mouse C-Kit but do not Depend on Steel Factor for Their Generation." Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:1502-1506; Miltenyi, S., Guth, S., Radbruch, A. et al. "Isolation of CD34+ Hematopoeitic Progenitor Cells by High-Gradient Magnetic Sorting." In: Wunder E., ed Hematopoeotic Stem Cells: Alpha Med Press 1994; 201-213; Traycoff, C.M., Kosak, S.T., Grigsby, S., Srour, E.F. “Evaluation of Ex Vivo Expansion Potential of Cord Blood and Bone Marrow Hematopoeitic Progenitor Cells Using Cell Tracking and Limiting Dilution Analysis." Blood 85, No. 8:2059-2068 (April 15) 1995; Murray, L., Chen, B., Galy, A., Chen, S., Tushinski, R., Uchida, N., Negrin, R., Tricot, G., Jagannath, S., Vesole, D., Barlogie, B., Hoffman, R., Tsukamoto,"A.Enrichment of Human Hematopoeitic Stem Cell Activity in the CD34+Thy-1+Lin- Subpopulation from Mobilized Peripheral Blood." Blood 85, No. 2:368-378 (January 15) 1995; Uchida, N., Aguila, H.L.,Fleming, W.H., Jerabek, L., Weissman, I.L. "Rapid and Sustained Hematopoeitic Recovery in Lethally Irradiated Mice Transplanted with Purified Thy-1.1 Lin-Scal+ Hematopoeitic Stem Cells." Blood 83, No. 12:3758-3779 (June 15) 1995]。
根底にある生物学的問題は、「拘束された前駆細胞(commited progenitors)」と称される分化された娘細胞が、近接真性幹細胞の増殖を抑制する分子を生成し分泌することにある[Ogata, H., Bradley, W.G., Inaba, M., Ogata, N., Ikehara, S., Good, R.A."Long-Term Repopulation of Hematolymphoid Cells With Only a Few Hemopoetic Stem Cells in Mice." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:5945-5949, June 1995; Li, C.L., Johnson, G.R."Murine Hematopoeitic Stem and Progenitor Dells: I.Enrichment and Biologic Characterization." Blood 85, No. 6:1472-1479 (March 15) 1995; Dunber, C.E., Cottler-Fox, O'Shaughnessy, J.A., Doren, S., Charter, C., Berenson, R., Brown, S., Moen, R.C., Greenblatt, J., Stewart, F.M., Leitman, S.F., Wilson, W.H., Cowan, K., Young, N.S., Nienhuis, A.W. "Retrovirally Marked CD34-Enriched Peripheral Blood and Bone Marrow Cells Contribute to Long-Term Engraftment After Autologous transplantation." Blood 85, No. 11:3048-3057 (June 1) 1995; Traycoff, C.M., Kosak, S.T., Grigsby, S., Srour, E.F. "Evaluation of Ex Vivo Expansion Potential of Cord Blood and Bone Marrow Hematopoeitic Progenitor Cells Using Cell Tracking and Limiting Dilution Analysis." Blood 85, No. 8:2059-2068 (April 15) 1995; Marray, L., Chen, B., Galy, A., Chen, S., Tushinski, R., Uchida, N., Negrin, R., Yricot, G., Jagannath, S., Vesole, D., Barlogie, B., Hoffman, R., Tsukamoto, A. "Enrichment of Human Hematopoeitic Stem Cell Activity in the CD34+Thy-1+lin-Subpopulatioin from Mobilizes Peripheral Blood." Blood 85, No. 2:368-378 (January 15) 1995; Uchida, N., Aguila, H.L.,Fleming, W.H., Jerabek, L., Weissman, I.L. "Rapid and Sustained Hematopoeitic Recovery in Lethally Irradiated Mice Transplanted with Purified Thy-1.1 Lin-Scal+ Hematopoeitic Stem Cells." Blood 83, No. 12:3758-3779 (June 15) 1995; Issaad, C., Croisille, L., Katz, A., Vainchenker, W., Coulombel, L., "A Murine Steomal Cell Line Allows the Proliferation of Very Primitive Human CD34+ +/CD38-Progenitor cells in Long-Term Cultures and Semisolid Assays." Blood 81, No. 11:2916-2924 (June 1) 1993; Pettengell, R., Luft, T., Henschler, R., Hows, J.M., Dexter, T.M., Ryder, D., Testa, N.G. "Direct Comparison by Limiting Dilution Analysis of Long-Term Culture-Initiating Cells in Human Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, and Blood Stem Cells." Blood 84, No. 11:3653-3659 (December 1) 1994; Greenberger, J.S. "Long-Term hematopoeitic Cultures." In: Golde D, (ed). "Methods in Hematology." New York: Churchill Livingston, 11:203-243, 1984; Rothstein, L., Pierce, J.H., Aaronson, S.A., Greenberger, J.S. "Amphotoropic Retrovirus Vector Transfer of the v-ras Oncogene Into Human Long-term Bone Marrow cultures." Proceedings of the Symposium on Long -Term Bone marrow Culture, kroc Foundation, September 1983, Alan R.Liss, New York, pp. 119-133, 1984; greenberger, J.S. "The hematopoeitic Microenvironment." Critical Reviews in Hem/Onc, Elsevier Science Publications B.V. 11:65-84, 1991; Goff, J.P., Shilds, D.S., Michalopoulos, G.k., Greenberger, J.S. "Synergistic Effects of hepatocyte Growth Factor on In Vitro generation of CFU-FM From Human Cord Blood CD34+ Progenitor Cells." Thirty-Sixth Annual Meeting of the American Society of Hematology, Nashville, TN, 12/1/94/-12/6/94. Blood, 84(10):Suppl. #280A, 1994; Pogue-Geile, K.L., Sakakeeny, m.A., Panza, J.L., Sell, S.L., Greenberger, J.S., "Cloning and Expression of Unique Murine Macrophage Colony Stimulating Factor Transcripts." Blood, 85:3478 3486, 1995; Goff, J.P.,Shields, D.S., Michalopoulos, G.K., Greenberger, J.S. "Effects of Hepatocyte Growth factor and IL-11 on Human Cord Blood CD34+ Progenitor Cells." International Society for Experimental Hematology meeting, Dusseldorf, Germany, 8/25/95-9/1/95]。
幹細胞を生長させる現在の技術では、幹細胞自体の数を増やすのではなく、血液細胞の総数を増やすようになっているので、この問題に取り組んだものでない[Traycoff, C.M., Kosak, S.T., Grigsby, S., Srour, E.F. “Evaluation of Ex Vivo Expansion Potential of Cord Blood and Bone Marrow Hematopoeitic Progenitor Cells Using Cell Tracking and Limiting Dilution Analysis." Blood 85, No. 8:2059-2068 (April 15) 1995; Murray, L., Chen, B., Galy, A., Chen, S., Tushinski, R., Uchida, N., Negrin, R., Tricot, G., Jagannath, S., Vesole, D., Barlogie, B., Hoffman, R., Tsukamoto,"A.Enrichment of Human Hematopoeitic Stem Cell Activity in the CD34+Thy-1+Lin- Subpopulation from Mobilized Peripheral Blood." Blood 85, No. 2:368-378 (January 15) 1995]。幹細胞の原細胞の正確なレプリカを多数生長させるために、娘細胞の分化を制限する必要がある。インサイチューにて、細胞分化の発生と、分化された細胞の存在を顕微鏡画像を用いて確認することにより、媒地交換用ｚロボットピペットを具えたバイリアクターシステムはこの問題を解決することができる。細胞分裂時、２次休止媒地(secondary quiescene medium)を用いて、凹所内の１次増殖媒地は自動的に交換されるであろう。第１の媒地は、原幹細胞の正確なレプリカへの増殖を促進し、第２の媒地は、得られた娘細胞が拘束前駆細胞へ分化するのを阻害する。
骨髄及び臍帯から得た人間の幹細胞を培養することについて、その理解と関心は最近の５年間に著しく広がってきている。人間の幹細胞の候補者は、CD34+Thy1+Lin-(lin-)として同定され、系列(lineage)の特異性抗原(lin-)でなく、細胞表面抗原CD34及びThy1を表現する。抗原は、単クローン抗体によって認識される細胞表面上の分子である。骨髄中の細胞CD34+(約１％)は、免疫磁気選択(磁場を与えながら、細胞をCD34に抗する単クローン抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いて培養する)により分離される。分化細胞又は系列拘束された細胞と関連のある抗原を表現しないCD34+細胞の部分母集団(subpopulation)もまた、適当な抗体及び免疫磁気選択を用いることにより、又はこれら抗原を蛍光色素及びフローサイトメトリーで標識することにより取り除くことができる。選別により得られたlin-細胞は、原母集団の50,000個の細胞中、およそ１を表している。
幹細胞を培養技術の開発では、これまで、母集団中のまだ拘束されていないlin-細胞の数を増大させるよりはむしろ、造血膨張(拘束された子孫核種(commited progeny)及び成熟血液細胞の数を単に増やすこと)に関心が集められていた。例えば、ステフェン・エマーソンとバーナード・パルソン(ユニバーシティ・オブ・ミシガン、アーストロム・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッドと協同)は、CD34+細胞を大量に生長させるためのバッチ式バイオリアクターを開発した。これは、幹細胞を保持するトレイが重ねられており、培養培地がトレイの上を再循環するようにしたものである[Van Zant, Gary, Rummel, Sue A., Koller, Manfred R., Larson, David B., Drubachevsky, Ilana, Palsson, Mahshid and Emerson, Stephen G. "Expansion in Bioreactors of Human Progenitor Populations from Cord Blood and Mobilized Peripheral Blood." Blood Cells (1994) 20:482-491]。廃棄物とカタボライトは、リアクターから連続的に除去される。CD34+細胞の数は、ある程度の増加が観察されたが、増殖された(amplified)幹細胞の真性系列特異性は認められなかった[Van Zant, Gary, Rummel, Sue A., Koller, Manfred R., Larson, David B., Drubachevsky, Ilana, Palsson, Mahshid and Emerson, Stephen G. "Expansion in Bioreactors of Human Progenitor Populations from Cord Blood and Mobilized Peripheral Blood." Blood Cells (1994) 20:482-491]。
CD34+細胞の数がある程度増加した、又は増加は全く認められなかったという先行文献[Van Zant, Gary, Rummel, Sue A., Koller, Manfred R., Larson, David B., Drubachevsky, Ilana, Palsson, Mahshid and Emerson, Stephen G. "Expansion in Bioreactors of Human Progenitor Populations from Cord Blood and Mobilized Peripheral Blood." Blood Cells (1994) 20:482-491; Verfaille, C.M., Catanzarro, P.M., W.Li. "Macrophage Inlfammatory protein 1α, Interleukin 3 and Diffusible marrow Stromal factors maintain Human hematopoetic Stem Cells for at Least Eight Weeks in Vitro." J. Exp. Med 1994; 179:643-649]の研究に基づき、生物学技術と工学的技術の組合せによる拡がりの下で、幹細胞分化の問題が取り組まれている。１個の細胞分裂の後、得られた２個のlin-細胞のうち１個の娘細胞は、増殖を制限し、分化を促進する抑制剤を作ることがあるという仮説がたてられた。この仮説によれば、生長条件が最適化されない場合、つまり、媒地が動的に制御されず、分化を停止する場合には、幹細胞はなくなるであろうことを示唆する。このモデルは、個々の細胞表現型がインサイチューで同定される分析試験を必要とする。異なる蛍光色素のフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)及びフィコエリトレイン(ＰＥ)で標識された単クローン抗体を用いて、CD34、Thy1及びLinの抗原を検出することにより、細胞の生存度を維持しながら、系列適合度(lineage fidelity)を確認できることが示された。これらの実験は９６の凹所が形成されたプレートの個々の凹所の中で行われた。
増殖を最大にする(すなわち、細胞分裂する時間を最少にする)という目的、及び人間の幹細胞の分化を最少にするという目的を達成するには、３０以上もの分子クローン化された生長及び抑制因子の様々な組合せ例を調べることにより、生長条件を最適化するのに必要な時間を著しく短くできる自動化技術を必要とする。現在の組織培養技術では、このやり方は実質的に不可能である[Verfaille, C.M. "Can human hematopoetic Stem Cells Be Cultured Ex Vivo?" Stem Cells 1994; 12:466-476]。
本発明の技術は、もっと広い観点から、数多くの生物学的変数(例えば、培地の組成、環境条件、及び工学遺伝子の存在)を自動的に調べることにより、細胞を生長させる組織培養及びプロトコルの媒地を開発するための画期的手段を提供するものである。その機会は、細胞生物学、分子生物学、組織培養及び生体材料のための細胞外基質の合理的開発、並びに毒物学へと拡大される。本発明は、大学研究者、応用臨床者、産業科学者などが個々の細胞の分裂及び分化の過程を理解するのに彼らの努力を集中できる点において独特のものである。現在商業的に入手可能な細胞培養のためのバイオリアクター及びシステムは、数多くの細胞の母集団の特性を調べることができるだけで、単個細胞レベルで発生して母集団の特性を制御する分化のような現象を無視するものであるから、本発明は、どんな市販のものよりもすぐれているといえる。
＜発明の要旨＞
本発明は細胞を保持する(holding)装置に関する。この装置は、動的制御された環境(dynamically controlled environment)を有する細胞培養機構を具え、この環境は動的に制御され、所望条件に維持されており、細胞は所望条件下に維持された環境の中で増殖し、検査されるものである。本発明の装置はまた、細胞の状態を判定又は決定する(determining)機構を具えている。この決定機構は培養機構に連繋されている。
本発明はまた、細胞を保持する方法に関する。この方法は、動的制御され、所望条件に維持された環境の中で細胞を培養し、培養された細胞を検査するステップを具えている。さらにまた、細胞の状態を決定するステップがある。
＜望ましい実施例の説明＞
図面を参照すると、同一又は同様な要素については、全図を通じて同じ符号を付してあり、より具体的には、図１ａ乃至１ｅ、図４ａ及び図４ｂにおいて、細胞を保持するシステム(300)が示されている。システム(300)は、動的制御された環境を有する細胞培養機構を具え、この環境は動的に制御され、所望条件に維持されており、細胞は所望条件下に維持された環境の中で増殖し、検査されるものである。システム(300)はまた、細胞の状態を決定する機構(202)を具えている。この決定機構(202)は培養機構(200)に連繋されている。
培養機構(200)は望ましくはハウジング(204)を含んでおり、該ハウジング(204)内にはバイオチャンバー(10)が設けられている。培養機構(200)は望ましくは、細胞の増殖が行われる第１の凹所(206)と少なくとも第２の凹所(208)を有している。第１の凹所(well)と第２の凹所はハウジング(204)のバイオチャンバー(10)の中に配備される。培養機構(200)は望ましくは透明プレート(207)を具えており、該プレートの中に第１及び第２の凹所が形成される。
ハウジング(204)は望ましくは第１のポート機構(210)を具えており、該機構を通じて、バイオチャンバー(10)の中の第１及び第２の凹所を観察することができる。第１のポート機構(210)は望ましくは、第１の窓部(209)がハウジング(204)の頂部に、第２の窓部(211)がハウジング(204)の底部に配備され、第２の窓部(204)は第１の窓部(209)と光学的に同一線上にあり、ハウジング(204)の外側から第１の窓部(209)へ入り、第２の窓部(211)を通ってハウジング(204)を出て行く光の光学経路を形成する。ハウジング(204)は望ましくは、バイオチャンバー(10)と流体が連通する第２のポート機構(214)を有している。
決定機構(202)は望ましくは画像機構(imaging mechanism)(210)を有しており、該画像機構は、第１及び第２の凹所内の細胞に接触する第１のポート機構(210)に隣接して配備される。画像機構(212)は望ましくは、第１の凹所(206)又は第２の凹所(208)内の細胞が増殖したかどうかを確認するためのコンピュータ(42)を具えている。コンピュータ(42)は画像機構(212)に接続され、第１及び第２の凹所の像を画像機構(212)から受信する。画像機構(212)は望ましくは、第１及び第２の凹所を観察するための顕微鏡機構(220)を具えている。顕微鏡機構(220)は第１のポート機構(210)に隣接して配備される。顕微鏡機構(220)はコンピュータ(42)に繋がっている。決定機構(202)は望ましくは、顕微鏡機構(220)が第１及び第２の凹所の細胞を観察できるように、第１及び第２の凹所を顕微鏡機構(220)に関して移動させるための移動機構(224)を含んでいる。決定機構(202)は望ましくは、顕微鏡機構(220)に接続されて、第１及び第２の凹所に対する顕微鏡機構(220)の位置を制御する操作レバー(30)を具えている。操作レバーの動作はコンピュータ(42)により直接制御できる。
画像装置(212)は望ましくは、第１及び第２の凹所内にある細胞の像を作成するためのカメラ機構(222)を具えている。カメラ機構(222)は顕微鏡機構(220)に接続されており、顕微鏡機構(220)を通して第１及び第２の凹所内の像を作る。カメラ機構(222)はコンピュータ(42)に接続される。
望ましくは、培養機構(200)はバイオチャンバー(10)内の環境の制御を行なう機構を具えている。環境制御機構(216)は第２のポート機構(214)を用いて接続される。環境制御機構(216)は望ましくは、加熱機構(218)を具えており、バイオチャンバー(10)との熱伝達により、第１及び第２の凹所内の細胞は所定温度に維持される。環境制御機構(216)は望ましくは、バイオチャンバー(10)に連通し第１及び第２の凹所内の培地のｐＨを調節する機構(226)を具えており、そしてまた望ましくは、バイオチャンバー(10)に連通しバイオチャンバー(10)内の圧力を調節する機構(228)を具えている。培地のｐＨ調節機構(228)は、望ましくはタンク(16)及びセンサー(66)を備えたＣＯ2コントローラ(14)を含んでいる。ＣＯ2は当該分野で周知の如く、凹所内の培地のｐＨに影響を及ぼす。圧力調節機構(228)は望ましくは、圧力解放口(70)と圧力解放弁(72)を含んでいる。
培養機構(200)は望ましくは、培地を第１又は第２の凹所へ自動的に供給し、また培地を凹所から自動的に取り出すロボット機構(230)を含んでいる。ロボット機構(230)は、第１及び第２の凹所に関して新鮮な培地と廃棄する培地を入れる貯蔵機構(232)を含んでいる。決定機構(202)はロボット機構(234)に連繋され、第１又は第２の凹所における所定の生物学的事象の発生を確認するための診断機構(234)を具えている。
生物学的単位は、例えば動物細胞又は植物細胞の如き原核細胞又は真核細胞のように、再生のために分裂する生物体(living organism)であればどんな種類の生物体でも構わない。生物学的単位の例として、以下のものを挙げるが、これらに限定されるものではない。
ａ．無脊椎動物の単個細胞
ｂ．脊椎動物の単個細胞
ｃ．単寄生有機体
ｄ．単微生物(原生動物、バクテリア、トリパノソーマ類、アメーバ、菌類）
ｅ．哺乳類細胞の例(但し、これらに限定されるものではない)
１．筋肉細胞
２．受精卵
３．腺細胞
４．内皮細胞
５．免疫反応性細胞(Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、マスト細胞、好酸球）
６．造血幹細胞
７．ケラチノサイト
８．グリア細胞を含むニューロン又は神経細胞
９．間葉細胞又は間葉幹細胞
１０．皮膚細胞
１１．胎児性幹細胞
ｆ．植物細胞の例(但し、これらに限定されるものではない)
１．被子植物類の細胞(双子葉植物、単子葉植物)
２．有胚植物類の細胞(裸子植物、シダ(filicineae)、コケ、ヒカゲノカズラ(lycopodmeae)、トクサ(equisetineae))
３．緑藻植物の細胞(緑藻)
また、生物学的単位は、魚類、両生類、爬虫類その他あらゆる脊椎動物などの有胚生物形態と同じ様に、原生動物、バクテリア、単細胞及び多細胞有機体であってよい。これは、前述のように、植物細胞にも適用することができ、植物細胞は、藻、スライム、カビ、イーストなどの単個細胞や、その他の小さな単細胞及び多細胞有機体の如何を問わない。これら有機体の中には、製薬又は化学産業において有用な組換え分子を作るのに際し、導入遺伝子(transgenes)を挿入する上で重要になる可能性があり、バイオチャンバー(10)はこの種のすべての実験に使用されることができる。
本発明は細胞を保持する方法に関する。その方法は、動的制御され、所望条件に維持された環境の中で細胞を培養し、培養された細胞を検査するステップを具えている。さらにまた、細胞の状態を決定するステップがある。
望ましい実施例について以下に説明する。生物学的調査に関しては、単個細胞の統計学的に意味のある配列が、個々のレベル及び派生レベルにて、リアルタイムで観察され、細胞の培養及び分化が静的環境又は動的に制御された環境でどのように変わるかを調べる。この能力は、フローサイトメトリーと連繋された浮遊培養のような現行技術からもたらされるものを超えている。現在のシステムでは、サンプリングのための培養系に欠陥があると汚染の危険を生ずるため、良好な時間分解能を有する情報を得ることができない。さらに、フローサイトメトリーは母集団を構成する情報を提供するが、母子関係の情報は分析中は保存されない。それ故、重要な情報は日常的に失われている。
システム(300)は、技術者に対して、異なる要因の組合せ(例えば、ホルモン、サイトカイン(cytokines)、放射、表面処理、環境など)が細胞の増殖、機能及びその他基質に対して相乗的及び／又は相反的に及ぼす影響について、より迅速に完全な評価を可能ならしめるだろう。システム(300)によりこの目的を達成することができる。
図１ａは自動化された単個細胞培養機構の一実施例の全体図を示しており、表１には図１ａの要素が詳細に記載されている。図１ｂ乃至１ｅは、自動化された細胞培養システム(300)の一実施例のチャンバーについてより詳細な図を表しており、表２にはバイオチャンバー(10)の要素が詳細に記載されている。
システム(300)の望ましい使用例では、容積３００μLの凹所が９６個ある使い捨て可能なプラスチック製プレート(207)の凹所の中に収容した細胞を、制御された無菌環境下にて、ロボットによる画像装置を用いて、監視と分析が定期的に行われる(図１ａ中、(20)乃至(46))。細胞は、作動距離が長い(extra-long working distance)集光レンズ、位相差のある対物レンズ及びエピフルオレセンス(epifluorescence)のアタッチメントを具えた倒立顕微鏡(20)を用いて観察される。細胞のデジタル化された位相差像は、ビデオ付(Video-Rate)ＣＣＤカメラ(32)を使って観察される。該カメラは、マッキントッシュクアドラ(Macintosh Quadra)９５０(42)にインストールされたピクセルパイプライン画像ボード(38)に対して、低速度撮影(time-lapse)ＶＣＲ(36)を通じて接続される。低速度撮影ＶＣＲは画像データの長期間保管用の画像を記録する。細胞のデジタル化された蛍光像はクアドラ９５０のインタフェースボードに直接接続された冷却式(cooled)ＣＣＤカメラ(34)を用いて獲得される。クアドラ９５０における画像操作はオンコル−イメージソフトウェア(Oncor-Image Software)を用いて行われる。位相差像と蛍光像のどちらも、クアドラ９５０にインストールされたビデオボード(44)を用いて、コンピュータモニター(46)に表示される。位相差像はまた、高解像能を有するビデオモニター(40)に表示される。
画像機構(図１ａ中、(18)及び(22)乃至(30))のロボット要素は、顕微鏡制御器(28)によって制御される。顕微鏡制御器自体は、オンコル−イメージソフトウェアを使用し、ＲＳ−２３２インタフェースを通じて、クアドラ９５０からの指令によって制御される。バイオチャンバー(10)は倒立顕微鏡(20)に配備された電動ステージ(18)の上に固定される。電動ステージ(18)は、解像度０.１μm、精度±６μm及び再現性２μmである。望ましくは、バイオチャンバー(10)は電動ステージ(18)と共に、倒立顕微鏡(20)の上に直接載せられる。各々の凹所に対する焦点調節は、倒立顕微鏡(20)の焦点調節つまみに取り付けられた電動焦点駆動装置及び制御器(22)を用いて行われる。照明は、位相差像を作成するための透過光と、蛍光像を作成するためのエピルミネーション(epillumination)との間で切り換えられ、これは透過光用高速シャッター(24)と、蛍光シャッター付高速複式フィルターホイール(26)を用いて行われる。電動焦点駆動装置及び制御器(22)、電動ステージ(18)、透過光用の高速シャッター(24)、蛍光シャッター付高速複式フィルターホイール(26)は、顕微鏡制御器(28)へ電気的に接続される。電動ステージ(18)のＸ−Ｙ位置と各凹所のＺ−焦点面の初期位置の選択は、顕微鏡制御器(28)に接続された操作レバー(30)を用いるか、又はコンピュータ(42)を用いて行われる。
上部と下部に、画像作成のための光学経路となるガラス窓が設けられ、陽極処理されたアルミニウムバイオチャンバー(10)の内部にて、制御された無菌環境(つまり、生理学的温度、ｐＨ、ｐＯ2及び湿度)の下で、細胞は、９６個の凹所のあるプレートの個々の凹所の中で保持される。装置(300)には２つの実施例がある。それは、バイオチャンバー(10)(図１ａ及び表１)と、図４ａ〜４ｄに示されるように、培地交換のためのＺ−ロボットを有するバイオチャンバー(10)である。第１実施例のバイオチャンバー(図１ｂ乃至ｅ及び表２に詳しく記載されている)のバイオチャンバー(10)は、約６"×５"×高さ２"である。温度の調節は、熱電対(58)、温度制御器(12)及び加熱カートリッジ(62)を用いて行われる。培地のｐＨは、標準の重炭酸塩系緩衡剤とＣＯ2コントローラ(14)を用いて維持され、バイオチャンバー(10)側に着脱可能に取り付けられたＣＯ2センサーからの信号に基づいてソレノイド弁を作動させて、レギュレータ(16)を具えたＣＯ2供給タンクからのＣＯ2の流れを調節することにより、大気中のｐＣＯ2は５％に設定される。バイオチャンバー(10)内の圧力は圧力解放弁(72)によって一定に保たれる。バイオチャンバー(10)内のｐＣＯ2は、２つの追加チャンバーのフロントポートにより接続されたセンサーと供給源により、同じように維持され、調節される。ハウスエアー(house air)によって駆動されるピンホイールタービン(78)を用いて、チャンバーの空気を速やかに混合することにより、迅速な応答機構と安定した制御が確保される。
バイオチャンバー(10)のいくつかの部分は、組み立てられた状態に常に維持される。ガラス観察窓(54)はチャンバー本体(50)とチャンバーカバー(52)の基部に接合される。ガラス観察窓(54)は交換のために取り外すことはできるが、取り外すときは壊す必要があるため、通常の場合には取り外すことはない。熱電対取付具(60)はチャンバー本体の右側面にネジ止めされ、ＣＯ2供給源取付具(68)、圧力解放体取付具(70)、及び３個の未使用ポートプラグ(74)はチャンバー本体の前面にネジ止めされる。タービンの組立ては、真鍮製ブッシング(82)を用いてタービンシャフト(80)にタービン(78)の１つを取り付け、タービンハウジング(76)の反対側の面に２つのハウスエアー取付具(90)をネジ込み、タービンシャフト組立体をタービンハウジングに挿入することにより行われ、タービンをタービンハウジングの中に収容される。残りのタービンについても、真鍮製ブッシング(82)を用いて残りのタービンシャフトに取り付けられる。次に、タービンハウジング用Ｏリング(86)はタービンハウジングの前面の溝の中に配置され、タービンバックプレート用Ｏリング(88)はタービンハウジングの裏面(back face)の溝に配置され、タービンハウジングのバックプレート(84)は、タービンバックプレート用Ｏリングが配備されたタービンハウジングのバックプレートの溝位置を整えることによってタービンハウジングの裏面の溝に配置され、組立体は１−１/４"×３/１６"の六角ナットヘッドのネジ２個を用いてチャンバーの裏面に取り付けられる。これらのネジを締め付けることにより、チャンバー本体とタービンハウジングの間、及びタービンハウジングとタービンハウジングのバックプレートの間でシールが形成され、ガス漏れしないようにしている。
使用前には、分解されたバイオチャンバー(10)をオートクレーブにて１２１℃の蒸気で１５分間処理し、殺菌する。熱電対(58)、ＣＯ2センサー(66)及び圧力解放弁(72)を除いて、チャンバー(表２の(50)乃至(90))の全ての要素は滅菌される。ＣＯ2センサーと熱電対は、層流フードの無菌環境下でエタノール７０％水溶液を塗布することによって殺菌される。殺菌された要素は、オートクレーブから取り出され、細胞が入れられた９６個の凹所のある使い捨て可能なプレート(207)と共に、層流フードの中に入れられる。９６個の凹所のあるプレート(207)の中に細胞が入れられた後、該プレートはＣＯ2５％の湿気雰囲気中で３７℃の温度に維持された。細胞を入れる手順については、後で説明する。プレートにはスペア用の凹所があり、そこには細胞は入れずに、１００μLの殺菌蒸留水を満たしておき、密閉チャンバー内部の湿度は９５〜１００％に維持される。ＣＯ2センサーはチャンバー本体(50)の右面にて、１−１/２"×３/１６"の六角ナットヘッドネジ２個を締め付けることにより取り付けられる。圧力解放弁(72)はタイゴン管(tygon tubing)を用いて圧力解放体取付具(70)へ接続される。次に、プレート(207)は、注意深くチャンバー本体(50)の底部の挿入口へ入れられ、バネクリップを用いて固定される。熱電対は、熱電対取付具(60)を介してチャンバーの中へ挿入され、テフロン(登録商標)締結具を用いて、熱電対取付具の適当な位置へ締め付けられる。チャンバーカバーガスケット(56)をチャンバー本体上面の溝の中へ配置し、チャンバー本体及びチャンバーカバーガスケットの上部の適当な位置にて、０.０５"×０.１９"の六角ナットヘッドのネジ８個を締め付けることにより、チャンバーカバー(52)を取り付けて、チャンバーを密閉する。２つの加熱カートリッジ(62)を、チャンバー本体の前面のポートからチャンバー本体の側壁の溝へ挿入し、各カートリッジに加熱カートリッジ保持用ネジ(64)を１個ずつ用いて固定することにより、チャンバー組立体が出来上がる。
バイオチャンバー(10)内の環境制御は、２つの制御システムを用いて、温度とＣＯ2の分圧を調整することによって維持される。熱電対(58)は電気的に絶縁された導線により、温度調節器(12)の入力端子に接続される。２つの加熱カートリッジ(62)は、電気的に絶縁された導線により、温度調節器(12)の出力端子に接続される。ＣＯ2センサー(66)は、ＣＯ2コントローラ(14)の入力端子へ電気的に接続される。ＣＯ2センサーからの出力ガスの流れは、チャンバーの前面のＣＯ2供給源取付具(68)に接続され、レギュレータ(16)を具えたＣＯ2供給タンクは、ＣＯ2センサーに向かう入力ガスの流れに接続される。組み立てられたバイオチャンバー(10)は環境制御部を具えており、電動ステージ(18)の上へ載せる前に、１〜２時間で熱的及び雰囲気的に平衡状態におくことができる。温度とｐＣＯ2は、数日間経過後には、それぞれ３７±０.５℃と５±０.２％に調節可能である。
環境制御部を具えたバイオチャンバー(10)は次に、バネ台を用いて、電動ステージ(18)に取り付けられる。観察用細胞の選択は、電動ステージ、操作レバー(30)、位相差のある蛍光レンズを用いて、凹所を走査することによって行われる。さらに調査を行なう場合、細胞が入れられた個々の凹所の画像フィールドを、像の明瞭さに基づいて選択する。各凹所に対して、１又は２以上のフィールドが選択される。望ましくは最大９６個の凹所から観察用のフィールドを選択した後、使用者は、適当なオプションを選択することにより、画像化と分析の自動化された部分を初期化する。選択された各フィールドは、次に、使用者が指定した間隔(望ましくは１〜６０分の範囲)にて連続的に走査される。なお、走査間隔は、具体的な生物学的システムの要請に応じて、より短くすることもできるし、より長くすることもできる。各フィールドの画像作成は、ビデオ付ＣＣＤカメラを用いて、位相差レンズに透過光照明を当てるか、又は冷却式ＣＣＤカメラ(34)を用いて、蛍光レンズにエピルミネーションを当てて行われる。
細胞分裂及び分化の発生は、パターン確認ソフトウェアにより検出される。光学的な傾斜転換(gradient transformation)、閾値演算(thresholding)及び膨張変換(dilation)を適用し、各細胞の周りに「ハロー(halos)」(図２参照)を検出した後、選択された各フィールドにおける「対象(objects)」の数及び二次元形状(例えば、面積と周囲)が位相差画像によって確認される。各対象が１又は２以上の細胞かどうかを表す形状パラメータの閾値は、定義されている。次に、各凹所における細胞の個数は、所定の時間間隔にて、形状パラメータの現在値と、以前の時間での値を比較することにより決定される。細胞分裂は、１の時間と２の時間の間隔での細胞数の増加として自動的に検出される。画像分析はまた(Ｘ−Ｙ)位置情報を提供する。この情報に対して、移動のための持続性ランダムウォークモデルを適用することにより、個々の細胞の速度と指向性持続時間(directional persistence time)を測定し、集団の運動性のある部分を決定し、細胞がフィールドの中央に位置するようにフィールドの位置調節を行ない、細胞の動きを調べることが可能である。各細胞に対するパラメータ速度及び指向性持続時間と、各細胞集団における運動性部分のパーセンテージは、持続性ランダムウォークに対する数学的モデルを等方的環境(isotropic environment)に適合させることによって求められ、(細胞の対照(control)におけるｘｙｌ位置)の時間系列に基づいて、各細胞の平均二乗変位データが観察される。[DiMilla, P.A., Albelda, S.M., Lauffenburger, D.A., and Quinn, J.A. 1992. "Measurement of Individual Cell Migration parameters for Human Tissue Cells."AIChE J. 38(7): 1092-1104; DiMilla, P.A., Stone, J.A., Albelda, S.M., Lauffenburger, D.A. and Quinn, J.A. 1992. "Measurement of Cell Adhesion and Migration on Protein-Coated Surfaces." In Tissue-Inducing Biomaterials, L.G. Cima and E. Ron, eds., Mater. Res. Soc. Proc. Vol. 252, pp. 205-212; DiMilla, P.A., Stone, J.A., Quinn, J.A., Albelda, S.M. and lauffenburger, D.A. 1993. "maximal Migration of Human Smooth Muscle Cells on Type IV Collagen and Fibronectin Occurs at an Intermediate Initial Attachment Strength." J. Cell Biol. 122(3): 729-737; DiMilla, P.A. "Receptor-Mediated Adhesive interactions at the Cytoskeleton/Substraum Interface During Cell Migration." InCell Mechanics and Cellular Engineering, R.M. Hochmuch, V.C. Mow, F. Guilak, and R. Tran-Son-Tay, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 490-514, 1994; Thomas, T.W. and DiMilla, P.A., "Effects of Substratum Compliance on the Motility, Morphology, and Proliferation of Adherent Human Gliblastoma Cells." In Proceedings of the 1995 Bioengineering Conference, BED-Vol. 29, R.M. Hochmuth, N.A. Langrana, and M.S. Hefzy, eds., ASME, New York, pp. 153-154, 1995]。これら全ての文献は、その引用を以て本願への記載加入とする。人間グレードのIVＳＮＢ−１９のグリア芽細胞の動きに関するデータは図３に示されており、神経科学及び癌研究に適用されることを示している。
所定種類の細胞に関する生長又は性状情報を確認するための実験が終了後、又は細胞が所望通り生長した後、コンピュータープログラムを停止し、バイオチャンバー(10)を画像装置から取り出し、環境制御装置の作動を停止させる。チャンバーは層流フードの中で分解される。チャンバーの要素は殺菌され、新たな実験のために使用される。
システム(300)の第２の実施例は、基本方策を拡張したものである。これは、ｘ−ｙ平面で異なる移動方法(translation strategy)をとるもので、各凹所レベルでの診断及び生長環境操作に改善をもたらす。
システム(300)の第２実施例は、第１実施例の特徴(数多くの凹所内単個細胞を非侵入的に連続観察すること、殺菌すること、±０.５℃以下で温度制御すること、ｐＣＯ2とｐＯ2を±０.１％以下で制御すること、オートクレーブ処理すること)に、ｚロボットピペットを付加するもので、該ピペットにより、９６個の凹所を有するプレート内の各凹所へ培地を自動的に分配し、また各凹所から培地を自動的に吸引するものである。ｚロボットは、このように装置に対し、各凹所の環境を変える能力、及び／又は生物学的事象の発生を確認するための診断試薬(diagnostic reagents)、つまり生物学的事象の確認された像を基にした診断試薬を付加する能力をもたらすものである。
第２の実施例において、標準仕様の電動ステージは、ｚロボットピペットを内蔵できるようにカスタマイズされた電動ステージと置き換えられる。バイオチャンバー(10)は、一対のステッパモータにより特定の(ｘ−ｙ)座標へ移動可能なプラッターに取り付けられた９６個の凹所を有するプレート(207)を収容する。この構造により、各凹所は、顕微鏡対物レンズの下で移動可能であり、ｚロボットピペットを使用するために選択されたどんな凹所をも移動させることができる。その概要図は図４Ａに示されている。
ｚロボット付ピペットは、細胞を浸す培地の組成を調節し、細胞の挙動に基づいて、生長因子(growth factor)及び／又は休止因子quiescene factor)を個々の凹所へ自動的に付加する。このｚロボットピペットの動作を駆動するソフトウェアは、細胞の挙動を監視するソフトウェアと統合される。システム(300)の用途によっては、使用者に選択される特定の時間間隔のような外的基準に基づいて培地を添加、除去又は変更することも可能であり、それが望ましい場合がある。ｚロボット付ピペットはまた、培地を個々の凹所から補助分析システムへ移動させる。
培地交換のためのｚロボット付ピペット自体は、改変されたマイクロピペットチップからなり、該チップは図４ｂに示されるように、ｚ軸ステッパモータに駆動された支持アームに取り付けられて上下に移動し、培地を１〜９５μL増加させる際に、培地を吸引及び分配するために、ピペットチップを上昇させ又は下降させる。典型的には１００μLの培地が、各々が３００μL容積の凹所へ加えられるけれども、凹所から培地を全部吸引すると、非常に大きな剪断力(shears)が細胞に作用するため、細胞は脱落してしまうか、そうでなくてもかき回されることになるので注意を要する。望ましくは、いかなる場合にも、最少量の培地として、５μL(１２５μmの深さに相当する)を凹所内に残すべきである。
図４ｂを参照すると、ピペット装置の主要素は注入器ポンプ(100)であり、該ポンプにより、生長因子、休止要素、又は数多くの流体貯蔵器(101)から配管を通りピペットチップ(102)へ送られるいかなる種類の液体をも導出することができる。注入器ポンプは、望ましくは、ステッパモータ(104)により駆動される５０マイクロリットル容量の注入器(103)(他のサイズの注入器を使用してもよいことは勿論である)であり、該モータは多ポートステッパモータドライバーカード(105)とコンピュータ(106)により制御される。ステッパモータ(104)は注入器(103)のプランジャー(107)を上下に動かし、これにより、分配動作(プランジャーが注入器の中へ進入する場合)又は吸引動作(プランジャーが注入器から後退する場合)が行われる。注入器は分配弁(108)のポートの１つに接続される。分配弁のポート数は３乃至８又はそれ以上であってよい。あるポートは注入器(103)へ接続され、あるポートはピペットプローブ(102)へ接続され、あるポートは選択的に設けられる洗浄ポンプ(111)へ接続され、残りのポートは種々の流体貯蔵器(101)へ接続される。分配弁(108)もまた、ステッパモータ駆動ボード(105)から駆動されるステッパモータ(109)で作動する。注入器、ステッパモータ、ステッパモータドライバー及び分配弁は、アドバーンスト・リキッド・ハンドリング社(ウイリアムズベイ，ウイスコンシン)のモデルMBP 2000から入手できる。より多くの流体貯蔵器と接続するために、第２の分配弁を、弁(108)と平行に装置の中へ取り付けることもできる。貯蔵器(101)は、生長培地及び休止培地を良好な状態で保存するために、温度調節器手段(112)により４±２℃の温度に維持されており、１/１６インチのテフロン管を通じて分配弁(108)に接続されている。
分配弁(及び注入器ポンプ)は、１/１６インチのテフロン又はステンレス鋼製の管によりピペットプローブ(102)へ配管接続される。ピペットは内径１/３２インチ(０.０３１インチ)のステンレス鋼プローブであり、チップ内径は０.０１３インチまで狭められている。ピペットチップは、凹所付プレートから培地を吸引するのと同様に、生長因子及び休止因子を凹所付プレートの中へ分配するために使用される。ピペットプローブはプローブの外側に導電性コーティングが施され、コンピュータ(106)によって読取り可能な信号を提供する。この電気信号は、プローブのある凹所の中にどれくらいの流体があるかについてフィードバックする。これは、吸引工程において、いつ流体がなくなり、吸引を停止させるべきかを知る上で有効である。ピペットプローブは、ステッパモータドライバー(105)に連繋されたステッパモータ(110)によりＺ方向へ駆動される。このステッパモータはピペットプローブを上下に移動させて、選択された凹所への分配と、該凹所からの吸引が行われる。導電性の検知部を具えたプローブは、Diba Industries, Inc.(ダンベリー，コネチカット) から入手することができる。ピペットステッパモータは、Advanced Liquid Handling(ウイリアムズベイ，ウイスコンシン)のモデルＭＢＤクローラー(Williams Bay, WI)から入手することができる。ピペットプローブはテフロン隔壁を貫通して、生体格納ボックス(biocontainment box)の中へ配備される。テフロン隔壁には、ピペットプローブの外径が締り嵌めとなる大きさの孔が開設されている。このようにして、ピぺットの外径とテフロンの孔の内径との間が密封される。この締り嵌めにより、ピペットを自由に上下に動くことができ、しかもバイオチャンバー内の環境を安定した状態に維持するためのシール手段を形成する。ピぺットは凹所の中を、凹所の頂部から３±１mmの深さまで下向きに移動し、分配される。ピぺットは凹所内の液体表面まで下向きに移動し、吸引される(プローブチップの導電体検知機構により測定されるときも同様)。そして、プローブは１０〜１３mmの隙間をあけて凹所から上向きに移動して凹所から離れ、凹所付プレートはｘ−ｙステージ上を動き回ることができる。
他の実施例では、より大きな処理量を得るために、凹所付プレートへの分配と吸引を並列で行なうことができるように、多数の分配／吸引チップを有している。生長因子、休止因子又は使用済みの培地を配管ラインから洗い流すための装置が必要である。望ましい洗浄用流体は燐酸塩緩衝塩水(ＰＢＳ)である。装置を洗浄するための流体を貯蔵する貯蔵器(101)を使用することもできる。また、装置には、洗浄ポンプ(111)を別途設けることもできる。洗浄ポンプ(111)は、高容積で大流量を流すことのできる能力を有する蠕動ポンプ(peristaltic pump)であって、コンピュータ(106)及び大流量の洗浄流体が流れるポンプによって作動される。図４ｄの符号(330)で示されるように、洗浄流体は、ピぺットチップ(102)からバイオチャンバー(10)内の洗流ステーションへ分配される。
図４ａ及び４ｃを参照すると、装置には、種々の分析決定ステップを付加することができる。第２の分配弁(114)は装置に追加され、分配弁(108)に連繋されている。この構成により、より多くのポートを装置に追加することができる。また、より多くの流体貯蔵器(101)を、装置又は補助分析装置(116)(118)に追加することもできる。これらの補助分析システムは次のように動作する。ピぺットチップ(102)を、９６個の凹所を有するプレートの中の凹所まで下降させる。注入器ポンプ(100)は、所定量の培地又は流体をピぺットチップを通じて凹所から吸引する。この流体は注入器胴体(103)まで引き入れられる。分配弁(108)と分配弁(114)は切り替えられて、注入器ポンプからの流れは、これら２つの弁を通って、補助分析システム(1)(116)若しくは(2)(118)へ、又は分配弁に接続されたどれかのポートへ向けて進む。注入器ポンプは、次に、配管及び弁から汲み出し、補助分析システムへ送り込む。これらの補助分析システムは、限定されるものでない以下の実施例のどんなものであってよい。なお、使用者の要請に基づいて、追加の補助分析システムを設けることもできる。
組織培養培地が入れられた個々の凹所から、ロボットアームにより取り除かれた組織培養培地又は栄養素は、(特別な実験的使用のために)蛋白質／栄養素分析システムの中へ置かれる。或はまた、細胞を含む全ての物質は、自動細胞計数器(Coulter, Co.)により細胞を計数するために取り除かれる。この組織培養培地は、以下の如く、生化学的、免疫化学的、生物学的及び化学的検定などの種々の検定法(assays)により分析することができるが、これらに限定されるものでないことは理解されるべきである。
１．インシュリン、生長ホルモン、プロラクチン、ガストリン、(他のペプチドホルモン)のような生成ホルモンを検出するための放射免疫検定法、又はサイトカインの細胞生産及び解放のための放射免疫検定法。サイトカインの例として次のものを例示できるが、これらに限定されるものではない。IL-1(インターロイキン1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, M-CSF, C-CSF, HGF, NGF, 塩基性FGF, 酸性FGF, PDGF)
２．セファロース４β(ファルマシア・コーポレイション)のようなカラムを使用し、グリコシル化蛋白質を検出するためのレンチルレクチンクロマトグラフィー。
３．ファットマン・コーポレイション(Whatman Corporation)製のカラムを使用したジエチルアミノエチル(DEAE)。
４．シンクロパックＡＸ３００(Thompson Instrument Company)のカラムを使用したイオン交換高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)分析。
５．プロテイン−ＰＡＫ３００ＳＷ(Millipore Corporation)のようなカラムを使用し、セントリプレップ(centriprep)又はセントリコン(centricon)-30(分子量30,000でカットオフ)のマイクロ遠心分離機用試料を使用したゲル濾過(HPLC)。
６．Vydac4 HPLC カラム(The Separations Group Corporation)の如き装置を使用し、トリフルオロ酢酸(Pierce Corporation)又はアセトニトリル(Baxter Corporation)と平衡させる逆位相(HPLC)。
７．インテグレイテッド・セパレイションズ・システムズ・インコーポレイテッドが市販している試薬を使用した、デオデシルサルフェートナトリウム／ポリアクリルアミドのゲル電気泳動(SDS/PAGE)分析。
８．ツニカマイシンによるグリコシル化又はＮ−グリコシダーゼ処理のための蛋白質分析(Wurthington Biochemical Corporation及びGenzyme Corporationから入手した試薬を使用する)。
９．増殖刺激検定(生物学的検定)；公表された方法を使用するもので、各成長因子内の種々のサイトカインの各々に反応する公知の細胞集団を用いており、ターゲット指示体の細胞集団により、所定量の組織培養培地について、トリチウム化チミジン含有の刺激を調べる[Pogue-Geile, K.L., Sakakeeny, M.A., Panza, J.L., Sell, S.L., Greenberger, J.S. "Cloning and Expression of Unique Murine Maceophage Colony Stimukating Factor Transcripts." Blood, 85:34783486, 1995]。
１０．ｐＨ、重炭酸イオン濃度、塩化物濃度、酸素濃度の分析を含み、呼吸器／酸化性生理的機能性分析。
１１．アンモニア尿素の検定を含む分解生成物の生産と、特定の培養培地に含まれるグルコース、果糖その他砂糖分子の消費(ダルベッコのモディファイドイーグル媒地、マッコイの媒地その他の組織培養媒地でGIBCOコーポレイションその他サプライヤーから入手できるものを含む)。
１２．SIGMA Pharmaceutical Company、又は一般的な病院の臨床研究所から入手できる標準の生化学的試験キットを使用した酵素分析で、プロテアーゼ、スクラーゼそして酵素を結合又は分解するその他糖に対する試験を含んでいる。検定はアミラーゼ、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、炭酸脱水酵素(carbonic anhydrase)などに対する試験を含んでいる。
前掲検定の目的は、画像機構、パターン認識ソフトウエア及びコンピュータ分析システムにより確認された細胞が、特定の物理的、化学的又は生理学的状態にあるかどうかを決定し、この状態を、前記因子の生産又は消費のどちらかと関連性のある特定の代謝プロセスと相関させることである。
要約すると、培養チャンバーの凹所内で生長した組織培養細胞からの培地は、蛋白質、単糖(simple sugar)又は複合糖(complex sugar)、個々のアミノ酸、個々のイオン及び個々の分子の生産又は分解について、物理的存在及び／又は生物学的活性が調べられる。
生体格納ボックスの他の実施例を図４ｄに示している。図４ｄは、装置の前面部を示している。Ｘ−Ｙ移動系はシステム(300)の一部として示されており、破線(302)(304)で示されるように中央部は開口空間を有している。この構成により、対物レンズ(306)はＸ−Ｙ移動テーブルへ移動可能となり、９６個の凹所を有するプレート(308)の上に焦点を合わせることができる。９６個の凹所を有するプレート(308)は、取付板(310)の上に配置され、Ｘ−Ｙ移動プレートによる移動に基づいて移動する。取付板(310)は、光学窓(328)を有しており、該光学窓の下に９６個の凹所を有するプレートがある。取付板はピペットプローブの洗流ステーション(330)を含んでおり、該ステーションはプローブを洗浄するためのポートとして用いられる。生体格納ボックス(312)は２つの壁(314)(316)を有している。これらの壁の各々は、シリコーンシール(318)を用いて、取付板(310)へ密封される。生体格納ボックスは固定されているが、取付板(310)はその下を移動する。生体格納ボックス(312)には、次の要素がさらに配備されている：ピペットプローブ(320)はテフロン製の隔壁(322)の中に配備され、ステッパモータ(332)によりＺ軸方向へ駆動される；光学窓(324)は、光がその中を通過して集光レンズ(326)へ進むことができるように配置され、対物レンズ(306)、光学窓(328)、プレート(308)及び光学窓(324)よりも上の位置にある。生体格納ボックスには、ｐＨ、ＣＯ2、湿度などの制御部がさらに設けられている(図示せず)。ピペットプローブはテフロンライン(334)を介して注入器ポンプへ接続されている。
Ｘ−Ｙ移動プレートは、対物レンズの上の凹所付プレートのどれかの凹所を移動させて、凹所内の細胞の像が作成される。Ｘ−Ｙ移動プレートはまた、培地又は細胞を分配又は吸引するために、どれかの凹所をピペットプローブの方へ移動させる。また、Ｘ−Ｙ移動プレートは洗流ステーションをプローブチップへ移動させてプローブの洗浄が行われる。
新鮮培地(fresh media)及び廃棄培地(waste media)は生長因子の個々の混合物を含んでおり、これら培地の貯蔵器はチャンバーの隣りに配置され、４℃の温度に維持される。少容量の注入器ポンプを用いて成長因子及びベース培地を、使用者指定の組成物へ供給され、廃棄培地は同じピペットを用いて凹所から吸引される。ピペットは分配と吸引の間で、ＰＢＳ溶液にて洗い流すことにより十分洗浄される。
迅速な培地交換を行なうための十分な流量を確保しつつ、細胞に加えられる流体力が最少になるように、ｚロボット付ピペットの動作は最適化されている。調べられたパラメータは次の通りである：流量の動的状態値及び定常状態値、吸引後凹所の中に維持せねばならない流量の最少値、及び凹所内におけるノズルの中心位置をずらす効果。培地は滴状で凹所へ分配される。吸引のための最適パラメータのより迅速な選択は、広く使用されている演算パッケージ(例えば、Fluent)を用いて、このプロセスの流体機構の数値シミュレーションにより行われる[DiMilla, P.A., Stone, J.A., Albelda, S.M., Lauffenburger, D.A., and Quinn, J.A. 1992. "Measurement of Individual Cell Migration parameters for Human Tissue Cells."In Tissue-Inducing Biomaterials, L.G. Cima and E. Ron, eds., Mater. Res. Soc. Proc. Vol. 252, pp. 205-212; DiMilla, P.A., Stone, J.A., Quinn, J.A., Albelda, S.M. and lauffenburger, D.A. 1993. "maximal Migration of Human Smooth Muscle Cells on Type IV Collagen and Fibronectin Occurs at an Intermediate Initial Attachment Strength." J. Cell Biol. 122(3): 729-737; DiMilla, P.A. "Receptor-Mediated Adhesive interactions at the Cytoskeleton/Substraum Interface During Cell Migration." InCell Mechanics and Cellular Engineering, R.M. Hochmuch, V.C. Mow, F. Guilak, and R. Tran-Son-Tay, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 490-514, 1994; Goldstein A.S. and DiMilla, P.A.,]。これら全ての文献は、その引用を以て本願への記載加入とする。
概して述べると、細胞表現型の変化の検出と、ｚロボット付ピペットの第１実施例の特徴との使用が統合される。位相差のある像を作成するための方法を、lin-表現型の特異性抗原へ蛍光抗体が加えられた凹所での蛍光像(冷却式ＣＣＤカメラで得られる)に適用することにより、システム(300)は例えば、幹細胞と、その他分化細胞とを識別することができる。後で詳しく説明するようにこの方法では、個々の細胞が分化し、表現型を変えるかどうか及びその時を知ることができる。そのとき、細胞分裂及び細胞分化の速度に関する動的データを得ることができる。次に、このデータは確率的手法のための工学モデルを用いて分析され、培地の変化を合理的に最適化し予測する動的パラメータが求められる。
次に、倍増事象(doubling event)の画像分析のアルゴリズムについて一般的な説明をする。細胞が分裂する時、視覚的に認識できる形態学的特徴がある。例えば、中央部がくびれてサイズが膨らむなどである。これらは、分裂中の細胞を確認するために用いられる。コンピュータの場合、これらの事象は、ｘ、ｙ位置、面積、周囲(perimeter)、球面度(sphericity)(円に対する近似性の測定)、偏心性(eccentricity)(正方形に対する近似性の測定)などの変化により認識される。新データのキュー(queue)として加えられるその他パラメータが得られる。さらに又、これらパラメータの傾向は、倍増前の時間に一致している。パラメータは、所定時間、コンピュータメモリーのキューの中に記憶される。新たな画像データが作られると、最新のものでない値は、キューから取り除かれる。このデータの傾向は、細胞分裂を示す公知の傾向と比較される。許容範囲内での一致が得られると、コンピュータには、細胞が分裂しようとしているか又は分裂途中であるという信号が送られる。例えば、幹細胞の場合、これらの細胞は分裂直前で移動を停止することが理論づけられている。これはｘ、ｙ位置の変化が小さくなる信号を送る。所定時間経過しても、変化が依然として小さいままであるとき、分裂が起こっているかもしれない。しかし、これだけでは細胞分裂の発生を保証できないから、その他パラメータの傾向についても比較される。
傾向比較の数学的性質は次のとおりである。各パラメータの細胞分裂ポイントまでの傾向は、所定時間経過後曲線適合(curve fitted)される。所定時間経過後の細胞から得られた現在のパラメータは、キューの中に記憶されており、これらパラメータはこの円滑曲線と比較され、両者の誤差が計算される。誤差が、使用者に指定された許容範囲内であるとき、細胞は分裂に近づいていると考えられる。
細胞が頻繁に視覚化されないと、分裂は見逃されることになるだろう。このため、その他凹所についても分析し、染色し、及び／又は観察しなければならない。このため、凹所の数が多すぎると、限られた時間内に各凹所へ戻ることができなくなる。この場合には、画像から得られたパラメータは、先のパラメータと比較される。経験的に確立された形態学的且つ位置的基準を用いて、２つの対象が分裂により生じたものかどうか、又は追加された対象が全て視野の中に移動したかどうかが決定される。
図５は細胞分裂の分析結果を示している。左側の写真は位相差のある像を示し、右側の写真はビットプレーン(bitplane)を示している。一番上の左側の図では、くびれが既に始まっていることを示している。
システム(300)を用いて人間の造血幹細胞を清浄化するプロトコルについて、システム(300)での細胞の使用例を挙げて説明する。
白血球フェレーシス(leukophoresis)による臍帯血液、末梢血液、又は骨髄のどちらかから得た人間の有核血液細胞は、遠心分離によって清浄化され、赤血球が除去される。次に、バフィコート白血球(Buffy coat leukocytes)が、市販の免疫ビード(immunobead)又はカラムクロマトグラフィー法のどれかを用いて清浄化され、CD34+細胞(成人人間の骨髄中の10,000個の有核細胞中のおよそ１を表している)が分離される。望ましい方法として、CellPro Ceprateカラムがあり、これはワシントン州ボセルのセルプロコーポレイションから商業的に入手できる。製造者から提供された情報に記載された技術を用いて、カラムに付着する有核細胞は、パッケージに含まれる試薬と競合させることにより、カラムなしで洗浄され、人間の造血細胞CD34+をカラムを分離する。これは、競争的置換(competition displacement)により行われる。 CD34+細胞は、溶出液(eluate)により集められる。次に、これらの細胞は、蛍光活性化細胞ソーターと系列特異性の単クローン抗体を用いて、２回目の選別が行われる。FITC、ローダミン、又はCD38を含む系列特異性抗原の蛍光標識されたインジケータを結合するCD34+細胞のサブセットは、系列陰性(蛍光抗体に対する陰性)の試薬の中で集められる。これら細胞は次に、第２のFACS(蛍光活性化細胞ソーティング)のために供され、Thy1の蛍光色素染料と陽性反応する細胞の最終母集団の中へ分離される。この母集団は、細胞の最終濃度を表し、末梢血液、骨髄又は臍帯血液の原試料から得た原有核細胞の50,000個の中の１個を表している。これらの細胞は多系列造血幹細胞に対して非常に増殖作用(enriched)があるものとして知られている。これら細胞の均一性と純化を確認する検定法として、長期にわたる培養開始細胞検定がある[Sutherland, H.J., Landsdorp, P.M., Henkelman, D.H., Eaves, A.C., "Functional Characterization of Individual Human Hematopoeitic Stem Cells Cultured at Dilution on Supportive Masrrow Stromal Layers." Proc Natl Acid Sci USA 87:2584, 1990。これら文献は引用を以て本願への記載加入とする]。また、培養後１４日目又は２１日目で丸石の島(cobblestone islands)を形成する細胞を測定するコブルストーンアイランド検定がある[Ploemacher, R., van der Sluijs, J., van Beurden, C., Baert, M., Chan, P. "Use of Limiting-Dilution Type Long-Term Marrow Cultures in Fruency Analysis of Marrow-Repopulationg and Spleen Colony-Foming Hematopoeitic Stem Cells in the Mouth." Blood 10:2527-2533; 1991。これら文献は引用を以て本願への記載加入とする]。また、CFUブラストの検定法がある[Ikebuchi, K., Wong, G., Clark, S., Ihle, J., Hirai, Y., Ogawa, M. "Interleukin 6 Enhancement of Interleukin 3 Dependent Proliferation of Multi-Potential Hemopoietic Progenitors." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9035; 1987。これら文献は引用を以て本願への記載加入とする]。また、高増殖潜在性コロニーを形成する単位培養のための検定(assay for high ptoliferative potential colony-forming unit culture)がある[Pogue-Geile, K.L., Salakeeny, M.A., Panza, J.L., Sell, S.L., Greenberger, J.S. "Cloning and Expression of Unique Murine Macrophage Colony Stimulationg Factor Transcripts." Blood, 85:3478 3486, 1995。これら文献は引用を以て本願への記載加入とする]。細胞の部分母集団CD34+Lin-Thy1+は、約1,000〜10,000倍の因子により、これら検定において、陽性の細胞の存在により増殖される。より重要なことは、これら増殖した細胞はSCID/Huマウスの髄又は異物移植研究でのNu/BIXの中で末梢血液中に多系列造血細胞を作ることが明らかにされたことである。これらの細胞は羊胎児の中で人間の造血を多系列的に再構築することも示されている[Zanjani, E.D., Almeida-Porada, G., and Flake, A.W., 1995. "Engrafment and Multilineage Expressionof human Hematopoeitic Stem Cells in Human-sheep Chimeras." Stem Cells 13:101-111]。このように、前述したインビトロ検定と同じように２種類の異物移植モデル(SCID/Huマウス及び羊の胎児)により、有核末梢血液、骨髄又は臍帯細胞のCD34+Lin-Thy1+とThy1-の部分は、幹細胞に対して大きな増殖作用があることが知られている。細胞が懸濁培養の中で、単個細胞以外の細胞として培養され、細胞分裂と自動的に連関されるバイオリアクター以外の培養方法として培養されるとき、CD34+Lin-Thy1+の表現型は、急速に消失することが知られている。[Mayani, Hector, Lansdrop, Peter M. "Proliferation of Individual Hematopoeitic Progenitors Purified From Umbilical Cord Blood." Experimental Hematoligy 23:1453-1462 (1995); Van Zant, Gary, Rummel, Sue A., Koller, Manfred R., Larson, David B., Drubachevsky, Ilana, Palsson, Mahsid and Emerson, Stephen G., "Expantion in Bioreactors of human Progenitor Populations from Cord Blood and Mobilized Periphral Blood." Blood Cells (1994) 20:482-491; Sandstrom, C.E., Bended, J.G., Papoutsakis, E.T., Miller, W.M. "Effects of CD34+ Cell Selection and Perfusion on Ex Vivo Expansion of Peripheral Blood Mononuclear Cells." Blood. 86, No. 3:958 970 (August 1) 1995。これら文献は引用を以て本願への記載加入とする]。
９６の凹所を有するプレート(LinBro Plastic Corporation製)を用いて、MB210マウスの細胞株(望ましい例)、又は人間、マウス若しくは霊長類のストロマ細胞株(stromal cell line)(ストロマ細胞株がない場合、又はストロマ細胞株の代わりとして、細胞外基質蛋白質、若しくはフィブロネクチン、ペパリン硫酸塩プロテオグリカンなどのプロテオグリカン)のどれかが、１つの凹所につき、１×１０5個の細胞が各々の凹所に入れられる。各凹所は、ダルベッコのモディファイドイーグル媒地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)が、子ウシ胎児の１０％血清で補足されており(supplemented)、培養株は高湿度の培養器の中で３７℃の温度で２４時間培養される。培養株は次に、培養器から取り出され、ストロマ細胞株の融合単層(confluent monolayer)の芝(lawn)があるかどうかが調べられる。ストロマ細胞は次に、250KVPの慣用電圧のｘ線装置(望ましい例)、又は６MeV〜２０MeVの直線加速器を用いて、焦点面が細胞の単層の組織培養表面となるようにして、1000-10,000cGy、望ましくは2000cGyまで放射される。細胞は、同じ培地の中で放射され、培養器の同じ培地へ戻される。培地は次に、各凹所を、Iscoveのモディファイド無血清培地の多洗浄液で洗浄して培地を取り除き、Iscoveのモディファイド無血清培地を各凹所に加える。Iscove培地の正確なレシピは、文献に記載されている[Goff, Julie P., Shields, Donna S., Petersen, Bryon E., Zajac, Valelie F., Michalopoulos, Geirge K. and Greenberger, Joel S. "Synergistic Effects of Hepatocyte Growth Factor on Human Cord Blood CD34+ Progenitor Cells are the Result of c-met Receptor Expression." StemCells (In Press)]。この文献は引用を以て本願への記載加入とする。無血清のIscove培地(望ましい例)は、ビタミン、栄養素、脂質代用物質、ウシの血清アルブミンその他公知の種々の添加剤で補足された市販の無血清培地と置換することができ、適当な生長因子で補足されつつ、血清の不存在下で造血プロジェニター細胞を支持する。各々の組織培養凹所は次に、100μLのIscoveの完全培地と追加量の培地-Ａ(これは、増殖培地であり、次の生長因子について夫々最適濃度を含有している：IL-11, IL-6, IL-1, HGF, G-CSF, 塩基性FGF)が供給される。この培地は、増殖培地又は培地-Ａと称する。凹所付プレート内の各々の組織培養凹所は、次に、ＦＡＣで選別された単一のCD34+Lin-Thy1+細胞を10μL滴下して補足され、「幹細胞」と称する。この「幹細胞」という用語は、この明細書中では、CD34+に対して陽性で、系列マーカー(１０〜１５種類の異なる系列マーカーの任意の組合せに使用される系列抗体マーカーの配合であり、望ましいマーカーCD38を含んでおり、Thy1+又はThy1-のどちらかである)に対して陰性の蛍光抗体結合材によって示された表現型をもつ細胞を称するものとする。「幹細胞」という用語は、Thy1+又はThy-のどちらかの細胞を称するものであり(実験によって異なるが、が望ましい)、CD38-及びCD34+と定義される。細胞は、FITC及び造血細胞表面分化マーカーに抗するPE結合抗体で染色される。図７Ａ及び７Ｂは、細胞の同じ領域を表している。実施例の細胞はCD34に対してのみ陽性で、Thy1は緑色に見える(図７Ａ、＊印)。系列マーカーを表す細胞は赤色である(図７Ｂ)。細胞が系列マーカーと同様、CD34及びThy1に対して陽性であるとき、波長が合成され、得られる蛍光は黄色となる(図７Ａ、矢じり)
各凹所に幹細胞を含むプレートは、次にバイオチャンバー(10)へ移される。
次に、バイオチャンバー(10)は閉じられる。ユニットは、各細胞分裂での培地変化に基づいて、サイクルがプログラミングされている(CD34+Lin-Thy1+表現型のパターン認識にリンクされている)。
プロトコルの各要素に関する具体的動作の詳細については、簡単にまとめて説明する。なお、異なる使用形態は可能であることは勿論であり、例えば、目的が生物学的生産又は基礎研究かによって選択できることは理解されるべきである。以下の説明は、表現型の保存と高増殖を目的としたときの代表的な生産モードである。基礎研究のための使用例は、フローチャートの形態で後で説明する。
個々の凹所は、観察用対物レンズの下方にて、プレート(207)の１サイクルが終わると、別々に追跡される。これは望ましくは毎分観察されるようにプログラミングされることができ、この間隔は、２０秒毎、又は１日１回、１週間(より長い時間も可能である)に１回のように、所望に応じて変えることができる。観察の後、ＣＣＤカメラに連繋されたコンピュータのソフトウエアの中に細胞の像が捕獲される。細胞数が２倍になったパターンが、パターン認識ソフトウエアにより確認されると、細胞の２倍事象は記録され、システム(300)の動作は、染色認識相へリンクされる。ｘ−ｙステージが凹所からｚロボットの下方へ移動すると、染色認識相が活性化して、蛍光染色の配合物が、Thy1(Thy1マーカー)へ加えられるのと同様、CD34及びCD38(系列マーカー)へ加えられる。凹所がｘ−ｙステージにより光学経路／機構へ戻され、適当時間(染色特性に依存する)待機した後、像は冷却式ＣＣＤカメラにより、数が２倍になった細胞が捕獲される。像の目的は３つあり、1)CD34について、染料の色を検出すること、2)CD38について、染料の色を検出すること、3)Thy1について染料の色を検出すること、である。パターン認識ソフトウエアは次に、２倍になった細胞が存在し、パターンが保存されることになっている凹所を確認し(両細胞CD34+、又は両細胞CD34-は、後者の両細胞CD38-と置換される)。凹所は、次に、ｘ−ｙステージによりｚロボットの所まで移され、培地変更が実行される。これについては後で詳しく説明する。培地は次に、培地-Ｂ(休止培地)と置換される。これについては後で詳しく説明する。全サイクルは、規則正しい間隔(望ましくは毎分ごとであるが、２０秒から１週間より長い時間まで変えることができる)でその凹所を観察しながら継続して行われ、ステージはその凹所をｚロボットへ移動させるように指示され、培地は培地-Ａ又は生長因子へ戻される。全サイクルは再び繰り返され、パターン認識ソフトウエアはその凹所を分析し、４個の細胞が出現するのを待機し、記録する。４個の細胞の存在が検出され記録されると、ｚロボットの比色蛍光染色機構は比色染料を加える。適当な時間が経過した後(望ましくは５分間)、冷却式ＣＣＤカメラを用いてより多くの像が撮影され、像分析されて３つの蛍光色素の各々を検出する。これらの凹所はCD34+CD38-Thy1+の表現型では４つの細胞全部に対して陽性であり、ｚロボットへ再び移され、培地-Ａを抽出し、培地は培地-Ｂと置換される。次に、８個の細胞が存在するかどうかについて再びサイクルが繰り返され、さらに、３２個の細胞が存在するか、さらにまた６４個の細胞が存在するかどうか、最後に１２８個の細胞が存在するかどうかについて全てのサイクルが再び繰り返される。或はまた、各細胞分裂において、例えば、３、４、５、６、……１２８個の細胞が存在するとき、培地が培地-Ａから培地-Ｂへ変化するように、システム(300)を運転することもできる。凹所が１２８個の細胞を含むと、像作成プロトコルは終了し、全ての細胞(培地-Ｂ(休止培地))は凹所から取り出され、収納場所へ移される。収納場所がプレート内の各凹所の中身(1000個以上の細胞を表す)で一杯になると、その収容場所の中身は他の使用場所へ移され、遺伝子移植、骨髄幹細胞の待機患者への移植、或は遺伝子治療又は待機患者のために後日使用される凍結保存施設での使用に供される。
次に、具体的なプロトコルについて説明する。９６個の凹所を有するプレートは、殺菌された組織培養フード(フォーマット型又は同様な型式のもの)の中に入れられる。1.0mL容量のエッペンドルフ型チューブの中には、ソーティングされたCD34+Lin-Thy1+幹細胞で補足された無血清Iscove培地が10-20μL入れられており、該チューブの中身は、パスツール型ピペットを用いてプレートの夫々の凹所へ移される。各凹所は、既に、Iscove培地を100μL含んでおり、単個細胞が入っているこの培地10-20μLで補足される。９６個の凹所を有するプレートは次に、バイオチャンバー(10)へ移される。各凹所は100-120μLであり、培地-Ａに含まれる所定濃度の種々の生長因子を含んでいる(各因子の濃度範囲は次の通りである：肝細胞生長因子[HGF]、10ng/ml〜1μg/ml、望ましくは10μg/ml；IL-11、1ng/ml〜100μg/ml、望ましくは10μg/ml；IL-1、10ng/ml〜100μg/ml、望ましくは10μg/ml；G-CSF、1ng/ml〜100μg/ml、望ましくは10μg/mlである)。
これら生長因子は、イムネックス(Immunex)及びアムゲン(Amgen)を含む商業的サプライヤーから入手できる。なお、これらは、培地-Ａ又は増殖培地の例であることに留意すべきである。異なる種類の増殖培地があってもよく、細胞の形式によっては培地-Ａだけに限らない。細胞が健全性を以て再生できるものであれば、どんな増殖培地でも構わない。細胞は次に、バイオチャンバー(10)の中へ入れられ、３７℃(３１℃〜４９℃の範囲で変更可能)の温度、７％ＣＯ2(０.１％〜４０％の範囲で変更可能)に設定され、湿度は高レベル(低レベル又は非常に高いレベルでも可)に維持される。
バイオチャンバーのステージは、各凹所が顕微鏡の対物レンズの上で、光学経路の中に位置するように移動させられる。使用者は、ステージを移動させて、単個細胞が位置する正確な座標を確認する。これは手操作で行われ、通常１５分かかる(各細胞の位置を確認するには、１分〜１４時間かかる)。次に、個々の細胞の座標が記録され、細胞の観察サイクルは２０〜４０倍の倍率、望ましくは４０倍で開始される。個々の細胞の位置は、画像分析によって求められ、その位置と形態学的パラメータはコンピュータＹ２によって記録される。コンピュータは、冷却式ＣＣＤカメラを用いて、この細胞を６秒間(１秒〜５分の間で変更可能)観察し、個々の凹所の像を捕獲するサイクルを実施するように設定される。冷却式ＣＣＤカメラが各凹所へ焦点を合わせる時間は、許容範囲内の信号−ノイズ比で像が捕獲されるように十分長い時間(１秒〜２０分の間で変更可能であり、２０秒が望ましい)に設定される。各凹所において単個細胞のデジタル化された像が記録され、ステージは次に９６の各位置(凹所１箇所につき１位置)でサイクルを実行し、細胞の動きを追跡し、十字線(cross hairs)に関する細胞の位置を記録する。十字線は、捕獲された初期像の中での細胞の位置を規定するように設定されている。各凹所の観察はサイクルの中で実行される。デジタル化された像が各凹所毎に連続的に記録され、コンピュータのメモリの中へ記憶される。像は、１つの細胞が２つになるのに要する時間が経過すると互いに比較され、９６個の凹所の各々について行われる。増殖培地培地-Ａが各凹所の中にあると、望ましくは６時間以内(１０分〜２か月の範囲)に、細胞分裂が各細胞の中で起こることが予想される。
細胞が倍増したことが検出された時、特定の凹所に関するサイクルの実行時に捕獲され、一時的傾向としてコンピュータに記憶された像群に対する形態学的パラメータの中で反映され、パターン認識ソフトウエアにより細胞の倍増が登録されるので、細胞の倍増した凹所がｚロボットの下方に位置するように、ステージは機械的に移動し、蛍光染料が添加されて、ダブレット(doublet)からなる２つの細胞の表現型が調べられる。ロボット式ピペットが下降し、FITCが標識された抗CD34及びフィコエリトリンが標識された抗CD38を含む２種類の蛍光染料の配合物10μLを加える。染料の濃度は、製造者から供給されたままであり、商業的に入手可能である。各々の単クローン抗体を検出するための蛍光色素(例えば、Pharmingen, Becton Dickinson, Dakocorp., Immunotechから入手可能)は各抗体に結合され、重複しない２つの別々の色は各々が適当な蛍光フィルター(シグマ(Sigma)とクロマ(Chroma)があるがこれに限定されない)で検出され、前記の色は識別可能であり、２種類の特定像の夫々によって記録される。染料が、ダブレットの細胞を有する凹所へ加えられた後、２つの連続蛍光像(successive fluorescent images)は、適当な励起フィルター(蛍光シャッターを具えた高速複式フィルターホイールにより光学経路の中に配置される)と冷却式ＣＣＤカメラを具えたエピルミネーションを用いて、倒立顕微鏡からなる作像機構により獲得され、コンピュータ上でデジタル化された像として記憶される。各像は、緑色又は赤色のどちらか特定の色に、０.１秒〜１００秒間曝される。各染料に対する最適曝露時間は、システム(300)の作動前に、細胞表面に対する染料の蛍光強度を検出することにより決定され、製造者の指示書に基づく染料の陽性対照試験(positive control test)の試料と相関関係を有している。２つの連続画像の中で、第１の像は、可視光線スペクトルの緑色領域における放射の像を作成できるフィルターを用いて得られ(ダブレットの細胞の表面に存在するいかなるCD34マーカーに対する抗CD-34抗体の結合を検出する)、第２の像は可視光線スペクトルの赤色領域における放射の像を作成できるフィルターを用いて得られる(ダブレットの細胞の表面に存在するいかなるCD38マーカーに対する抗CD-38抗体の結合を検出する)。この検出法は、２種類の着色抗体に対する連続試験(successive examination)に限定されるものではなく、細胞表現型のより細かな識別を行なう細胞表面に対する追加のマーカーの存在まで検出することができる。２種類の検出法は、このような拡大された検出にまで実行することができる。第１の方法では、赤色又は緑色以外の色で、各染料の放射帯域が重複しない着色染料にて標識された追加の抗体を、第３の細胞表面マーカーの存在を検出するために、抗体カクテルの中に含めることができる。この方法は、各染料の放射が明瞭に識別できるものであれば、細胞表面のマーカーに対する識別抗体を標識するために、第４の色、第５の色及びそれ以上の色の染料をさらに使用することができる。細胞の表現型の検出能力を拡大するための第２の方法では、緑色及び赤色の励起フィルターを用いて２つの連続初期画像を獲得した後、凹所はＰＢＳで十分に洗浄され、緑色発光染料及び／又は赤色発光染料で標識された他の抗体群を含む他のカクテルが追加される。再び、像は緑色及び赤色励起フィルターで夫々、逐次的に獲得される。この第２の方法と、検出できる種類を拡げるための第１の方法は、互いに相反するものではなく、両者を組み合わせて、さらなる洗浄を行ない、染料標識された抗体を加えることにより、所望数の細胞表面決定子(cell-surface determinants)を検出することができる。抗体の第２の添加には、Thy1に対して緑色標識された抗Thy1抗体を含めることが望ましい。各々の識別染料及び抗体に対して獲得された各々の蛍光像は、コンピュータメモリの中へ記憶され、像はコンピュータによりデジタル的に重ねられ、自動的に判読(interpretation)される。抗CD34、抗CD38及び抗Thy1抗体での連続培養による上記方法の場合、処理された像群は、緑色陽性(つまり、連続緑色像の細胞表面に対して緑色染色の陽性が検出されたCD34+とThy1+)と、赤色陰性(つまり、赤色像の細胞表面に対して赤色染色が不存在のCD38-)が記録され、ｚロボットは培地の変更を実行する。凹所中の細胞像の中で、緑色陽性／赤色陰性の基準に合致しないが、細胞ダブレットとして認識されるものは、保存表現型(conserved phenotype)が得られなかったのであり、像獲得、パターン認識、蛍光色素標識された抗体分析、及び幹細胞増加プロセスの残部に対する培地交換についての調査サイクルから取り除かれる。非保存表現型(non-conserved phenotype)の存在は、幹細胞の表現型が消失したこと、及びこの凹所では幹細胞のさらなる増加はないことを意味する。
前述のように、パターン認識ソフトウエアとステージ動作は、個々の細胞が適当な表現型と共に２個の細胞を含んでいることを記録しており、これについて説明する。この凹所は次に、ｚロボットの下方のｘ−ｙステージにより移動させられ、廃棄培地はバイオチャンバー(10)内のレセプタクル培地(receptacle vehicle)の中へ入れられる(図４ａ乃至４ｄ参照)。取り出された培地の範囲は、10-200μLであってよく、100μLが望ましい。培地を変更するための標準条件は、蛍光分析の後の細胞ダブレットの検出と関連づけられている。培地-Ａを取り除いた後、休止培地を含む培地-Ｂが加えられる。これは、前述したようにIscoveのモディファイド無血清培地100μLを含み、MIP-1αとTGFβを含んでおり、夫々の最適濃度は、10ng/ml乃至100ng/mLで、10ng/mlが望ましい。この休止培地は一例であって、その他にも多くの休止培地が可能である。休止培地は、２０秒〜５分間、単独添加された無血清培地、又はTGFβ若しくはMIP-1α又はTNFを有する培地であってよい。なお、与えられた細胞の中で成熟又は分化工程を停止させ、本質的に現在の状態で細胞を維持することができるものであれば、その他にも数多くの休止培地が可能である。
バイオリアクターシステム(300)は次に、継続してその他の全ての凹所を周期的に検査し、この凹所を観察し、これに培地-Ｂが加えられる。システムの操作を行なうコンピュータプログラムの中のタイマーは、培地-Ｂが加えられなかった凹所に関して、追加の細胞倍増事象のパターン認識のための像作成を除いて、そのまま６時間(これは１０分〜２か月間の範囲の中で望ましい時間)放置(undisturbed)するように設定される。培地-Ｂの選択された時間が経過した後、この凹所はｘ−ｙステージによりｚロボットの下方へ自動的に戻され、細胞ダブレットを確認するために、再びパターン認識のために作像される。休止培地は当然のことながら細胞分裂を促進しないので、それらの形状と同様、ダブレットにおける細胞の位置についても同様に、休止培地が存在した間隔が開始(６時間前)した時間と比較される。
ｚロボットは次に、培地-Ｂを吸引し、この培地をバイオリアクター内のレセプタクル容器の中へ収容する。ｚロボットは次に、等量の培地-Ａ(当初の増殖培地)を加える。培地-Ｂから除去される最適量は100μLであり、最適な置換量は100μL(10μL-200μLの範囲であってよい)。
２個の細胞が入っているバイオリアクターへ培地-Ａを加えた後、像作成、パターン認識、蛍光分析及び培地交換からなる凹所の検査シーケンスが再び開始される。当該凹所の休止期間(quiescence period)の経過後、各々について、予め設定された間隔で通常の監視が再び始められる。この間隔は１０秒から２か月の範囲とすることができる。凹所は次に、４個の細胞が存在するかどうか調べられる。４個の細胞を確認するために、特定の凹所に対して、パターン認識ソフトウエアが再設定される。４個の細胞の存在が認識されると、凹所はｚロボットの下方へ移動し、前述したように、20μLの染料配合物が加えられる。同じ染料が前述したのと同じ濃度で加えられる。蛍光染料で適当時間(１分〜２０分の範囲で５分間が望ましい)培養した後、緑色励起フィルター及び赤色励起フィルターで４つの細胞の像を夫々作成するために回転させられる。曝露時間は前述の時間と同じである。像は次に処理されて、(緑色陽性のCD34+、赤色陰性のCD38-)の表現型を有する４個の細胞を含む凹所は、実験が維持されるべきのとして登録される。非保存表現型を有する４個の細胞を１又は２以上含むこれら凹所は実験から取り除かれる。ｚロボットは次に、保存表現型を有する凹所の上でこの位置を維持し、培地-Ａを100μL取り除き、その代わりに、前述の如く、休止培地-Ｂを100μL加える。除去され置換される培地の量は10μL〜200μLの範囲である。
次に、その特定のバイオリアクターの凹所に対する休止培地の間隔はリセットされ、休止間隔(２分〜２か月の範囲の中で６時間が望ましい)のための各サイクルの間、通常の観察を行なうことを除いて、凹所はそのまま放置される。
バイオリアクターシステム(300)は、凹所について、オクタプレット(octuplet)を表す８個の細胞の存在が調べられるようにリセットされる。バイオリアクターシステム(300)はその観察期間中、９６の凹所の各々に対してサイクルを継続して実行し、８個の細胞、次に１６個の細胞、そのつぎに３２個の細胞、さらに６４個の細胞、さらにまた１２８個の細胞に対してパターン認識プログラムを続ける。細胞のダブレットの数の増加を確認するのに用いられる機械的及びコンピュータアルゴリズム、保存表現型の存在、及び培地交換、さらに計画作成は、細胞の閾値が増加することを除くと、前述した通りである。
パターン認識ソフトウエアは、その凹所にある８個の細胞の存在を認識すると、ｚロボットは前述した濃度の染料を２つの色の夫々に添加し、画像作成装置を用いて緑色蛍光及び赤色蛍光の像を獲得し、緑色陽性、赤色陰性の保存表現型を有する８個の細胞を含むこれら凹所が記録される。ｚロボットは次に、100μLの増殖培地(培地-Ａ)を除去し、その代わりに100μLの休止培地(培地-Ｂ)を添加し、クロックの休止間隔(１分〜２か月の間で６時間が望ましい)をリセットする。前述したように、サイクルが再び開始される。
パターン認識ソフトウエアが凹所内に１６個の細胞の存在を認識すると、ｚロボットが移動し、染料を添加し、緑色陽性と赤色陰性の表現型を探し出し、１６個の細胞全部が緑色陽性、赤色陰性の表現型を有する凹所を登録する。前述したように、ｚロボットは100μLの増殖培地を取り除き、その代わりに100μLの休止培地を加える。凹所は次に、休止中であると登録される。サイクルは前述したように、再び開始される。
緑色陽性、赤色陰性の表現型を有する３２個の細胞が入っている凹所に対して、パターンが前述したように繰り返される。ロボットアームはこの場所まで移動し、100μLの培地-Ｂを取り除き、その代わりに100μLの増殖培地(培地-Ａ)を加える。サイクルは前述したように、再び開始される。
パターン認識ソフトウエアにより、６４個の細胞が含まれることが認識された凹所は、前述したように操作され、ｚロボットは着色染料を加え、２つのフィルターを夫々用いて像が獲得される。これらの凹所は、緑色陽性、赤色陰性の表現型を有する６４この細胞を含んでおり、除去された100μLの増殖培地(培地-Ａ)と、加えられた100μLの休止培地(培地-Ｂ)を有している。休止中の時間間隔(６時間が望ましい)は再び開始される。休止培地を増殖培地と交換する前に、前述の如く、サイクルが再び開始される。
パターン認識ソフトウエアは再び開始され、増殖培地が入っている凹所に１２８個の細胞が検出されるまで観察される。ｚロボットは次に、蛍光色素標識された抗体及び像(夫々の励起フィルターを用いて)を、凹所内の標識された細胞へ移動させる。緑色陽性、赤色陰性の１２８個の対象が入っている凹所は、その実験において、保存される幹細胞表現型を維持し、最適な細胞分裂数を達成したものとして記録される。これは実際的にも望ましい実験である。これが、問題の個々の実験に望ましい場合、その数は２５６以上の数にも到達することができる。さらに、プレートは９６以上の凹所があっても差し支えないから、凹所は９６に限定されるものではない。
バイオリアクターシステム(300)は、次に凹所内の増殖培地を取り除き、100μLの休止培地で置き換える。ｚロボットは、凹所の中味(１２８の幹細胞を含む)を全部回収し、「終了(finished)」と記された特定のレセプタクルの中へ入れる。このレセプタクル(レセプタクルは１又は２以上であってよい)は、冷蔵庫の温度(−２７０℃から３７℃の範囲で３℃が好ましい)で、休止培地の中で維持される。1200以上の幹細胞が入っている未終了(unfinished)の凹所が１０個得られると、バイオリアクターシステム(300)から取り出され、「完全(completed)」の表示がされたレセプタクルの中へ入れられ、遺伝子治療の使用に供され、或は後での患者移植のために冷凍保存される。また、幹細胞移植のために増殖した幹細胞を必要とする医師又は臨床医のもとへ届けられる。
使用例の他の実施例を、図６に示すフローチャートに示している。図示の形態により、とりわけ、指向性生長(directing growth)に関する情報を最適ターゲット(例えば、先行例)へ供給することができる反応を研究するために、細胞環境を操作しつつ、時間経過における細胞事象を記録するという目的を達成できるものである。技術的適用の可能性、分裂中の幹細胞表現型の保存に関しては、モードを休止培地に切り替え、第１の分裂事象の表現型の結果(outcome)が診断される。
(1)まず始めに配列が初期化される；細胞座標は先に記録された像パラメータ(例えば、球面度)と共に記録される。(2)その後、位相差モード又は蛍光モードにて、最適な走査サイクルが開始する。(3)(4)各凹所内の細胞が観察され、像パラメータが獲得され、先行値と比較される。(5)細胞分裂のような事象に対する閾値基準が得られる時、(6)培地変更のある凹所に対してフラグが立てられる。(7)もし走査サイクルが終了していないとき(凹所内の細胞は依然として検査されるべきである)、配列中のつぎの細胞が観察され、分析され、パラメータが記録される。
凹所内の全ての細胞の像が作成されると、(8)培地の走査と診断試薬追加サイクルが開始する。ステージはｚロボットステーションへ移動し、(9)細胞分裂開始を表すものとしてフラグが立てられた列にある各凹所はピペットの下へ移される。(10)ピペット装置は古い培地を吸引し、休止培地を加える。凹所は次の抗原分析のためにフラグが立てられ、この分析は分裂後に実行される。(11)凹所に培地変更のフラグが立てられていない場合、(12)他の凹所へ移動する前に、細胞の表現型の決定をすることができるかどうかについて、凹所の診断を行なう必要がある。決定は、先行培地の変更の後にフラグが立てられ、最新に記憶された像パラメータを基に分裂を受けたものとして記録されているものに基づいて行われる。(13)診断用試薬の添加にフラグが立てられると、ｚロボットは必要とされることを追加する。凹所は次に、蛍光又は別の分析のためにフラグが立てられ、これは凹所の走査サイクルが一旦再スタートすると実施される(フラグが立てられると、必要なフィルター、照明源、及び再スタートした像サイクル内での画像作成コードの関連部分を自動的に作動する)。(14)(15)ｚロボットが、培地変更又は追加診断のどちらかにフラグが立てられた凹所全部に対して仕事をするまで、この操作は継続して行われる(備考：全ての培地変更が最初に行われる場合、装置は他の動作を実行することができ、走査サイクルは再スタートし、その後、追加診断が行われる。このモードは、事象に時間の拡がりがあるときにより適しており、培地の変更と試薬の追加を並列化する必要はない)。(14)ｚロボットの運転サイクルが終了する(YES)と、走査サイクルは再スタートし、分裂の開始を検出し、追加の診断試薬が指示した休止培地の中で行われた分裂の開始を記録する。
休止培地の使用は次のように行われる。
細胞分裂の転写調節剤(transcriptional regulators)は、付着に関連するもの及び時間による細胞分化とは分離されることができる。換言すれば、特定の生長培地を追加すると、生長因子を休診培地と置き換えることにより、「３台の列車(trains)が３台のトラック(tracks)になる」ので、より多くの追加生長因子(細胞分裂)の効果とは独立して、１台の列車は非常に小さなトラックの終端へ進む。このように、ある位置では、未分化状態では２つの細胞は両方とも停止する。生長因子を増殖培地の中へ再添加すると、３台の列車は再び３台のトラックになり、休止培地を加えると、列車は２台目と３台目が停止する。これは何度も何度も起こる。休止培地の時間は、細胞が回復するかどうかを決定し、３台の列車を３台のトラックへ開始させることができる。バイオリアクターはまた、理想状態を最適化するために、休止培地の時間長さを決めるのに用いることもできる(１台の列車が終了まで進み、２台目と３台目の列車は停止する)。
細胞の研究を行なうために使用するバイオリアクターは、細胞に関する先行情報がない場合には、以下の要領にて使用される。ダルベッコのモディファイドイーグルス培地、RPMI1640、その他市販のサプライヤーから入手可能な組織培養液のような塩基性組織培養培地が用いられ、どんな追加血清又は生長因子も用いられない。測定対象の細胞は、リアクターの中へ入れられ、細胞の形状が監視される。細胞が生存している場合、サイズは変化せず、細胞の数は２倍になる。細胞が死にかけている場合、又は毒性作用を受けている場合、サイズは縮んで、分裂しない。それゆえ、バイオリアクターは、まず最初、細胞を生存(及び／又は分裂)させておくために、市販の異なる培地を濾過し、次に、子ウシの胎児、ウマ、羊、その他市販の血清を加えて、生長を補足することを調べる。これらのパラメータは、細胞のサイズ維持性(size survivability)及び分裂について同じ様相を示すだろう。その場合、組換え生長因子はここに掲げた通りのものである。
例示した前記実施例において、本発明を詳細に説明したが、それらの詳細は単なる説明のためであって、当該分野の専門家であれば、添付の請求の範囲に記載された事項を除いて、発明の精神及び範囲から逸脱することなく変形をなすことができることは理解されるべきである。
Figure 0004203108
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添付の図面の中に、本発明の望ましい実施例と、発明を実施するための望ましい方法が示されている。
本発明の第１実施例の要素の概要を示す図である。 本発明の第１実施例のチャンバーの詳細図である。 本発明の第１実施例のチャンバーの詳細図である。 本発明の第１実施例のチャンバーの詳細図である。 本発明の第１実施例のチャンバーの詳細図である。 細胞分裂を検出できる顕微鏡ソフトウエアにより作成された認識パターンを示す図である。 人間の腫細胞(glioblastoma cells)(共通の原細胞に重ね合わされた)１０個について、１２時間経過後の経路を示す図である。 本発明の他の実施例を上から見た図である。 培地交換作業のためのｚロボットピペットの側面図である。 診断要素を具えたｚロボットピペットを説明する図である。 チャンバーを具えたハウジングの他の実施例を説明する図である。 幹細胞の分裂を示す一連の写真である。 システムの動作のフローチャート図である。 CD34、Thy1及び系列特異性マーカーの表現に対して、免疫蛍光染色された人間の臍帯の血液細胞である。 CD34、Thy1及び系列特異性マーカーの表現に対して、免疫蛍光染色された人間の臍帯の血液細胞である。

Claims (7)

  1. 複数の細胞を培養し、その中の単個細胞の状態を決定する方法であって、
    動的制御され所望条件に維持されたバイオチャンバーを有するハウジングの中で複数の細胞を培養するステップであって、ハウジングのバイオチャンバーに設けられた第１の凹所及び少なくとも第２の凹所の中で、細胞を増殖させることを含むステップと、
    バイオチャンバーが動的制御され所望条件に維持された状態で、複数の細胞の中の単個細胞を個々に経時的に検査するステップと、
    バイオチャンバーが動的制御され所望条件に維持された状態で、経時的に、複数の細胞の中の単個細胞の状態を自動的に決定するステップと、
    を有しており、
    自動的に決定するステップは、バイオチャンバーの中の第１及び第２の凹所を観察することができるハウジングの第１ポート機構を通じて、画像機構により、第１及び第２の凹所の中の細胞の像を作成し、画像機構で作成された第１及び第２の凹所の像を、画像機構に接続されたコンピュータで受けるようになし、画像機構及びコンピュータにより、第１の凹所又は第２の凹所内の細胞の状態を決定することによって行われる方法。
  2. 培養するステップは、ハウジングの第２ポート機構を通じて、バイオチャンバーを制御するステップを含んでいる請求項１の方法。
  3. 制御するステップは、第１及び第２の凹所内の細胞を所定温度に維持するステップを含んでいる請求項２の方法。
  4. 自動的に決定するステップは、コンピュータ及び画像機構により、第１の凹所又は第２の凹所内の細胞が増加したかどうかを確認するステップを含んでいる請求項１の方法。
  5. コンピュータに連繋された顕微鏡機構が、第１ポート機構に隣接して配備され、確認するステップは、顕微鏡機構により、第１及び第２の凹所を観察するステップを含んでいる請求項４の方法。
  6. 顕微鏡機構による第１及び第２の凹所内の細胞の像を、コンピュータに接続されたカメラ機構によって撮影するステップを含んでいる請求項５の方法。
  7. 決定するステップは、顕微鏡機構が第１及び第２の凹所内の細胞を観察できるように、第１及び第２の凹所を顕微鏡機構に関して移動させるステップを含んでいる請求項６の方法。
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US (6) US6008010A (ja)
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DE (1) DE69740113D1 (ja)
WO (1) WO1998020108A1 (ja)

Families Citing this family (188)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6008010A (en) * 1996-11-01 1999-12-28 University Of Pittsburgh Method and apparatus for holding cells
AU9786798A (en) * 1997-10-10 1999-05-03 Biosepra Inc. Aligned multiwell multiplate stack and method for processing biological/chemicalsamples using the same
US7244349B2 (en) 1997-12-17 2007-07-17 Molecular Devices Corporation Multiaperture sample positioning and analysis system
US20020144905A1 (en) * 1997-12-17 2002-10-10 Christian Schmidt Sample positioning and analysis system
EP1040349B2 (de) * 1997-12-17 2012-12-19 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Positionierung und elektrophysiologische charakterisierung einzelner zellen und rekonstituierter membransysteme auf mikrostrukturierten trägern
EP1088096B1 (en) * 1998-02-18 2005-10-12 Herman H. Vandenburgh Methods of screening compounds for bioactivity in organized tissue
US20060105357A1 (en) * 1998-02-18 2006-05-18 Myomics, Inc. Tissue sensor and uses thereof
US6743576B1 (en) 1999-05-14 2004-06-01 Cytokinetics, Inc. Database system for predictive cellular bioinformatics
US7151847B2 (en) * 2001-02-20 2006-12-19 Cytokinetics, Inc. Image analysis of the golgi complex
US6651008B1 (en) 1999-05-14 2003-11-18 Cytokinetics, Inc. Database system including computer code for predictive cellular bioinformatics
EP1203227A4 (en) * 1999-06-04 2003-01-02 Bioseparations Inc PRENATAL DIAGNOSIS SCREENING SYSTEM AND METHOD
US6545004B1 (en) 1999-10-27 2003-04-08 Cytokinetics, Inc. Methods and compositions utilizing quinazolinones
US7230000B1 (en) 1999-10-27 2007-06-12 Cytokinetics, Incorporated Methods and compositions utilizing quinazolinones
US7485454B1 (en) 2000-03-10 2009-02-03 Bioprocessors Corp. Microreactor
JP4402249B2 (ja) * 2000-03-31 2010-01-20 正仁 田谷 細胞培養方法、細胞培養装置及び記録媒体
GB0013261D0 (en) * 2000-05-31 2000-07-19 Surface Measurement Systems Lt Controlled sample environment for analytical devices
EP1322788A2 (en) * 2000-06-23 2003-07-02 Cytokinetics, Inc. Image analysis for phenotyping sets of mutant cells
US6833920B2 (en) * 2000-07-11 2004-12-21 Maven Technologies Llc Apparatus and method for imaging
US7023547B2 (en) 2000-07-11 2006-04-04 Maven Technologies, Llc Apparatus including a biochip for imaging of biological samples and method
US6594011B1 (en) 2000-07-11 2003-07-15 Maven Technologies, Llc Imaging apparatus and method
US7126688B2 (en) * 2000-07-11 2006-10-24 Maven Technologies, Llc Microarray scanning
US7518724B2 (en) * 2000-07-11 2009-04-14 Maven Technologies Image acquisition, processing, and display
US7193711B2 (en) * 2000-07-11 2007-03-20 Maven Technologies, Llc Imaging method and apparatus
US7270730B2 (en) 2000-08-04 2007-09-18 Essen Instruments, Inc. High-throughput electrophysiological measurement system
US7067046B2 (en) 2000-08-04 2006-06-27 Essen Instruments, Inc. System for rapid chemical activation in high-throughput electrophysiological measurements
US20020146817A1 (en) * 2000-10-02 2002-10-10 Cannon Thomas F. Automated bioculture and bioculture experiments system
JP4195287B2 (ja) * 2000-10-02 2008-12-10 エフ．キャノン トーマス 自動化されたバイオカルチャー及びバイオカルチャー実験システム
US7198940B2 (en) * 2000-10-25 2007-04-03 Shot Hardware Optimization Technology, Inc. Bioreactor apparatus and cell culturing system
US6699665B1 (en) * 2000-11-08 2004-03-02 Surface Logix, Inc. Multiple array system for integrating bioarrays
US7374906B2 (en) 2000-11-08 2008-05-20 Surface Logix, Inc. Biological assays using gradients formed in microfluidic systems
US6844184B2 (en) * 2000-11-08 2005-01-18 Surface Logix, Inc. Device for arraying biomolecules and for monitoring cell motility in real-time
US7326563B2 (en) 2000-11-08 2008-02-05 Surface Logix, Inc. Device and method for monitoring leukocyte migration
US6864065B2 (en) * 2000-11-08 2005-03-08 Surface Logix, Inc. Assays for monitoring cell motility in real-time
US7033819B2 (en) 2000-11-08 2006-04-25 Surface Logix, Inc. System for monitoring cell motility in real-time
US7033821B2 (en) * 2000-11-08 2006-04-25 Surface Logix, Inc. Device for monitoring cell motility in real-time
US6893851B2 (en) 2000-11-08 2005-05-17 Surface Logix, Inc. Method for arraying biomolecules and for monitoring cell motility in real-time
US6936811B2 (en) 2000-11-13 2005-08-30 Genoptix, Inc. Method for separating micro-particles
US20020121443A1 (en) * 2000-11-13 2002-09-05 Genoptix Methods for the combined electrical and optical identification, characterization and/or sorting of particles
US20030007894A1 (en) * 2001-04-27 2003-01-09 Genoptix Methods and apparatus for use of optical forces for identification, characterization and/or sorting of particles
US7218764B2 (en) * 2000-12-04 2007-05-15 Cytokinetics, Inc. Ploidy classification method
US6555365B2 (en) 2000-12-07 2003-04-29 Biocrystal, Ltd. Microincubator comprising a cell culture apparatus and a transparent heater
US6589780B2 (en) 2000-12-15 2003-07-08 Council Of Scientific And Industrial Research Bio-reactor for enhancing the biomass yield of plant organs
US6599694B2 (en) 2000-12-18 2003-07-29 Cytokinetics, Inc. Method of characterizing potential therapeutics by determining cell-cell interactions
US6635441B2 (en) 2001-02-08 2003-10-21 Irm, Llc Multi-sample fermentor and method of using same
FR2820756B1 (fr) * 2001-02-09 2004-01-23 Daniel Attias Incubateur et procede d'incubation menageant l'organisme mis a incuber
US6956961B2 (en) * 2001-02-20 2005-10-18 Cytokinetics, Inc. Extracting shape information contained in cell images
US7016787B2 (en) * 2001-02-20 2006-03-21 Cytokinetics, Inc. Characterizing biological stimuli by response curves
JP2002315566A (ja) * 2001-04-24 2002-10-29 Takagi Ind Co Ltd 細胞・組織培養装置
US20040023310A1 (en) * 2001-04-27 2004-02-05 Genoptix, Inc Quantitative determination of protein kinase C activation using optophoretic analysis
US20030124516A1 (en) * 2001-04-27 2003-07-03 Genoptix, Inc. Method of using optical interrogation to determine a biological property of a cell or population of cells
US6830931B2 (en) * 2001-07-12 2004-12-14 Automated Cell, Inc. Method and apparatus for monitoring of proteins and cells
US7285412B2 (en) * 2001-07-27 2007-10-23 Surface Logix Inc. Device for magnetic immobilization of cells
US7169577B2 (en) * 2001-07-27 2007-01-30 Surface Logix, Inc. Cell isolation and screening device and method of using same
US7169578B2 (en) * 2001-07-27 2007-01-30 Surface Logix, Inc. Cell isolation and screening device and method of using same
US6673595B2 (en) 2001-08-27 2004-01-06 Biocrystal, Ltd Automated cell management system for growth and manipulation of cultured cells
US20040071328A1 (en) * 2001-09-07 2004-04-15 Vaisberg Eugeni A. Classifying cells based on information contained in cell images
TW581119U (en) * 2001-12-19 2004-03-21 Univ Nat Cheng Kung Petri dish for microscope
US7672369B2 (en) 2002-02-13 2010-03-02 Reify Corporation Method and apparatus for acquisition, compression, and characterization of spatiotemporal signals
EP1480980A4 (en) 2002-02-15 2005-04-20 Cytokinetics Inc SYNTHESIS OF QUINAZOLINONES
WO2003086637A1 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Instrumentation Laboratory Company Immunoassay probe
US7507579B2 (en) * 2002-05-01 2009-03-24 Massachusetts Institute Of Technology Apparatus and methods for simultaneous operation of miniaturized reactors
US20040033539A1 (en) * 2002-05-01 2004-02-19 Genoptix, Inc Method of using optical interrogation to determine a biological property of a cell or population of cells
US20060199260A1 (en) * 2002-05-01 2006-09-07 Zhiyu Zhang Microbioreactor for continuous cell culture
WO2003097053A1 (en) 2002-05-09 2003-11-27 Cytokinetics, Inc. Compounds, compositions, and methods
BR0309892A2 (pt) 2002-05-09 2011-04-05 Cytokinetics Inc composto, composição, métodos para modular a atividade da cinesina de ksp, para inibir a ksp, e para o tratamento de uma doença proliferativa celular, e, uso de um composto
EP1576121A4 (en) * 2002-05-17 2008-04-23 Automated Cell Inc DETERMINING THE FUNCTION OF A PROTEIN
EP1513820A4 (en) 2002-05-23 2006-09-13 Cytokinetics Inc COMPOUNDS, COMPOSITIONS AND METHODS
WO2003106426A1 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Cytokinetics, Inc. Compounds, compositions, and methods
WO2004009036A2 (en) 2002-07-23 2004-01-29 Cytokinetics, Inc. Compounds compositions and methods
US11243494B2 (en) 2002-07-31 2022-02-08 Abs Global, Inc. Multiple laminar flow-based particle and cellular separation with laser steering
US20040042997A1 (en) * 2002-09-03 2004-03-04 Donnie Rudd Method of regenerating human tissue
US20040076605A1 (en) * 2002-09-03 2004-04-22 Donnie Rudd Method of regenerating human tissue
US20040043009A1 (en) * 2002-09-03 2004-03-04 Donnie Rudd Method of repairing primate mammalian tissue
US20040077985A1 (en) * 2002-09-03 2004-04-22 Donnie Rudd Method of replenishing cells damaged by treatment for cancer
US20040076620A1 (en) * 2002-09-03 2004-04-22 Donnie Rudd Method of repairing primate mammalian tissue
US20040044300A1 (en) * 2002-09-03 2004-03-04 Donnie Rudd Method of replenishing cells damaged by treatment for cancer
CA2500392C (en) 2002-09-27 2012-11-27 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and uses thereof
JP2006501306A (ja) 2002-09-30 2006-01-12 サイトキネティクス・インコーポレーテッド 化合物、組成物および方法
US20040128077A1 (en) * 2002-12-27 2004-07-01 Automated Cell, Inc. Method and apparatus for following cells
US7091035B2 (en) * 2002-12-30 2006-08-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cell culturing and storage systems, devices and methods
FI115060B (fi) * 2003-04-22 2005-02-28 Chip Man Technologies Oy Analyysi- ja kasvatuslaitteisto
US7235353B2 (en) * 2003-07-18 2007-06-26 Cytokinetics, Inc. Predicting hepatotoxicity using cell based assays
US20050014217A1 (en) * 2003-07-18 2005-01-20 Cytokinetics, Inc. Predicting hepatotoxicity using cell based assays
EP1646926A2 (en) * 2003-07-18 2006-04-19 Cytokinetics, Inc. Characterizing biological stimuli by response curves
AU2004269406B2 (en) 2003-08-28 2010-12-16 Progenity, Inc. Methods and apparatus for sorting cells using an optical switch in a microfluidic channel network
US7799559B2 (en) * 2003-10-24 2010-09-21 Olympus Corporation Culture microscope apparatus
JP2007513154A (ja) 2003-12-08 2007-05-24 サイトキネティクス・インコーポレーテッド 化合物、組成物及び方法
US20050273271A1 (en) * 2004-04-05 2005-12-08 Aibing Rao Method of characterizing cell shape
US20050282268A1 (en) * 2004-05-26 2005-12-22 Olympus Corporation Culture microscope and computer program controlling culture microscope
CA2568438C (en) * 2004-05-26 2016-08-02 Millenium Biologix Inc. Advanced tissue engineering system
US8211386B2 (en) 2004-06-08 2012-07-03 Biokit, S.A. Tapered cuvette and method of collecting magnetic particles
KR100563297B1 (ko) * 2004-06-16 2006-03-27 시 명 김 골프공 이송장치
US20060228795A1 (en) * 2004-06-30 2006-10-12 Parker Clayton R Apparatus for enhancing proliferation of cells in a small-scale cell culturing container
US7456019B2 (en) 2004-06-30 2008-11-25 Regenetech, Inc. Three-dimensional cell to tissue development process
US20080044890A1 (en) * 2004-06-30 2008-02-21 Parker Clayton R Interchangable sleeve for enhancing proliferation of cells in a rotating bioreactor
FI117899B (fi) * 2004-07-09 2007-04-13 Chip Man Technologies Oy Solujen kasvatusalusta ja sen käyttö
FI116946B (fi) * 2004-07-09 2006-04-13 Chip Man Technologies Oy Laitteisto solujen kuvaamiseksi
US7323318B2 (en) * 2004-07-15 2008-01-29 Cytokinetics, Inc. Assay for distinguishing live and dead cells
US20070031818A1 (en) * 2004-07-15 2007-02-08 Cytokinetics, Inc., A Delaware Corporation Assay for distinguishing live and dead cells
US20060133657A1 (en) * 2004-08-18 2006-06-22 Tripath Imaging, Inc. Microscopy system having automatic and interactive modes for forming a magnified mosaic image and associated method
JP2006197880A (ja) * 2005-01-21 2006-08-03 Fujitsu Ltd 細胞捕捉装置および細胞捕捉方法
JP4214124B2 (ja) * 2005-03-14 2009-01-28 株式会社バイオエコーネット 耳式体温計
US9741110B2 (en) * 2005-03-22 2017-08-22 Medinet Co., Ltd. Cell culture evaluation system for measuring suspension cells, cell culture evaluation method for measuring suspension cells, and cell culture evaluation program for measuring suspension cells
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
JP2007024576A (ja) * 2005-07-13 2007-02-01 Fujifilm Holdings Corp 細胞重層培養物における毒性試験装置
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
JP5010867B2 (ja) * 2005-09-22 2012-08-29 オリンパス株式会社 培養顕微鏡装置
US8383395B2 (en) * 2005-11-01 2013-02-26 Medinet Co., Ltd. Cell culture apparatus, cell culture method, cell culture program and cell culture system
JP4821279B2 (ja) * 2005-11-11 2011-11-24 株式会社ニコン 培養装置
JP5086559B2 (ja) * 2006-04-10 2012-11-28 株式会社島津製作所 反応容器及び反応容器処理装置
WO2007122814A1 (ja) * 2006-04-13 2007-11-01 Research Organization Of Information And Systems マルチウェルインキュベーション装置及びこれを用いた分析方法
JP4921858B2 (ja) 2006-06-07 2012-04-25 オリンパス株式会社 画像処理装置および画像処理プログラム
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US8372584B2 (en) 2006-06-14 2013-02-12 The General Hospital Corporation Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
JP2007334141A (ja) * 2006-06-16 2007-12-27 Sanyo Electric Co Ltd 培養物観察システム
JP5021254B2 (ja) * 2006-09-06 2012-09-05 オリンパス株式会社 顕微鏡装置の制御方法、顕微鏡装置
US20080180793A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Cellomics, Inc. High content screening system with live cell chamber
US7867783B2 (en) 2007-02-22 2011-01-11 Maven Technologies, Llc Apparatus and method for performing ligand binding assays on microarrays in multiwell plates
US20080206845A1 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Emilio Barbera-Guillem Bioreactor analysis system
US7863037B1 (en) 2007-04-04 2011-01-04 Maven Technologies, Llc Ligand binding assays on microarrays in closed multiwell plates
US20090041633A1 (en) * 2007-05-14 2009-02-12 Dultz Shane C Apparatus and method for performing ligand binding assays on microarrays in multiwell plates
US7799558B1 (en) 2007-05-22 2010-09-21 Dultz Shane C Ligand binding assays on microarrays in closed multiwell plates
JP5446082B2 (ja) * 2007-10-05 2014-03-19 株式会社ニコン 細胞観察装置および細胞観察方法
US8969257B1 (en) * 2007-12-28 2015-03-03 Intermolecular, Inc. Combinatorial flow system and method
US9921576B2 (en) 2008-05-05 2018-03-20 Finesse Solutions, Inc. Virtual transmitter for bioreactor automation system
US8039270B2 (en) * 2008-05-22 2011-10-18 Maven Technologies, Llc Apparatus and method for performing ligand binding assays on microarrays in multiwell plates
US7981664B1 (en) 2008-05-22 2011-07-19 Maven Technologies, Llc Apparatus and method for performing ligand binding assays on microarrays in multiwell plates
JP5191292B2 (ja) * 2008-07-08 2013-05-08 オリンパス株式会社 培養装置
DK200801722A (en) 2008-12-05 2010-06-06 Unisensor As Optical sectioning of a sample and detection of particles in a sample
JPWO2011004568A1 (ja) * 2009-07-08 2012-12-20 株式会社ニコン 受精卵観察の画像処理方法、画像処理プログラム及び画像処理装置、並びに受精卵の製造方法
IN2012DN02452A (ja) 2009-08-22 2015-08-21 Univ Leland Stanford Junior
RU2548597C2 (ru) 2009-12-04 2015-04-20 Юнисенсор А/С Система и способ для связанной со временем микроскопии биологических организмов
US8355133B2 (en) * 2009-12-30 2013-01-15 Maven Technologies, Llc Biological testing with sawtooth-shaped prisms
US8865630B2 (en) 2010-02-26 2014-10-21 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput platform for in-vivo sub-cellular screens on vertebrate larvae
CN102792148B (zh) 2010-03-04 2016-06-01 皇家飞利浦有限公司 柔性样本容器
WO2012047678A2 (en) 2010-09-27 2012-04-12 Auxogyn, Inc. Apparatus, method, and system for the automated imaging and evaluation of embryos, oocytes, and stem cells
JP2014502146A (ja) * 2010-10-25 2014-01-30 政彦 佐藤 弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置及び方法
US8941062B2 (en) 2010-11-16 2015-01-27 1087 Systems, Inc. System for identifying and sorting living cells
US20120225475A1 (en) 2010-11-16 2012-09-06 1087 Systems, Inc. Cytometry system with quantum cascade laser source, acoustic detector, and micro-fluidic cell handling system configured for inspection of individual cells
US10908066B2 (en) 2010-11-16 2021-02-02 1087 Systems, Inc. Use of vibrational spectroscopy for microfluidic liquid measurement
US8834794B2 (en) * 2010-11-22 2014-09-16 Mehdi M Yazdanpanah Apparatus and methods for detection of tumor cells in blood
EP2484750A1 (en) 2011-02-07 2012-08-08 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Monitoring system for cell culture
CA2827945C (en) 2011-02-23 2021-10-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of detecting aneuploidy in human embryos
DE202011000688U1 (de) * 2011-03-25 2011-06-09 Leica Microsystems CMS GmbH, 35578 Vorrichtung zur Aufnahme von Filtern für Mikroskope
JP5707601B2 (ja) * 2011-03-28 2015-04-30 日本光電工業株式会社 細胞培養装置
WO2012140264A2 (en) * 2011-04-15 2012-10-18 Fluofarma System and method to visualize and analyze data from image-based cellular assays or high content screening
US8974606B2 (en) 2011-05-09 2015-03-10 Intermolecular, Inc. Ex-situ cleaning assembly
JP5802751B2 (ja) * 2011-06-27 2015-11-04 株式会社日立製作所 細胞培養装置および細胞培養方法
US8858929B2 (en) * 2012-01-04 2014-10-14 Technion Research & Development Foundation Limited Optically sensitive cell network
JP2013145318A (ja) * 2012-01-13 2013-07-25 Sony Corp 測定装置、プログラム及び測定方法
US8741247B2 (en) 2012-03-27 2014-06-03 Alstom Technology Ltd Method and system for low energy carbon dioxide removal
JP2013255447A (ja) * 2012-06-12 2013-12-26 Nippon Koden Corp 細胞単離装置
JP5954079B2 (ja) * 2012-09-25 2016-07-20 ソニー株式会社 培養観察装置及び培養観察方法
WO2014121200A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Auxogyn, Inc. Abnormal syngamy phenotypes observed with time lapse imaging for early identification of embryos with lower developmental potential
CN113308373A (zh) * 2013-03-01 2021-08-27 格尼亚Ip控股私人有限公司 用于培养样品发育监测的装置，方法和系统
KR102257305B1 (ko) * 2013-03-28 2021-05-28 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 미세유동 장치 및 분비물의 다세포 검정법에서의 그의 사용 방법
DE102013007463A1 (de) 2013-04-30 2014-10-30 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Einrichtung zur Sterilisation eines Probenraums in einem Lebendzellmikroskop
US20140340499A1 (en) * 2013-05-14 2014-11-20 Life Technologies Corporation Systems and methods for sample image capture using integrated control
US8961904B2 (en) 2013-07-16 2015-02-24 Premium Genetics (Uk) Ltd. Microfluidic chip
US11796449B2 (en) 2013-10-30 2023-10-24 Abs Global, Inc. Microfluidic system and method with focused energy apparatus
EP4137798A1 (en) 2015-02-19 2023-02-22 1087 Systems, Inc. Scanning infrared measurement system
US11494578B1 (en) * 2015-09-21 2022-11-08 Ares Trading S.A. Systems and methods for automated assessment of embryo quality using image based features
US10510143B1 (en) * 2015-09-21 2019-12-17 Ares Trading S.A. Systems and methods for generating a mask for automated assessment of embryo quality
WO2017087698A1 (en) * 2015-11-18 2017-05-26 President And Fellows Of Harvard College Incubator insert for automated culture experimentation
US10691773B2 (en) 2015-12-30 2020-06-23 General Electric Company Cell processing techniques
US9995696B2 (en) * 2016-02-02 2018-06-12 Daniel Marc Himmel Open-air crystallization plate cooler
WO2017147427A1 (en) * 2016-02-26 2017-08-31 Seattle Biomedical Research Institute System and method for microscopic observation of microbial fitness
US10453551B2 (en) * 2016-06-08 2019-10-22 X Development Llc Simulating living cell in silico
EP3487981B1 (en) * 2016-07-19 2022-06-08 The Automation Partnership (Cambridge) Limited Liquid filtration and pump system
US20180057784A1 (en) 2016-08-27 2018-03-01 3D Biotek, Llc Bioreactor
US10144537B2 (en) 2016-11-30 2018-12-04 Mallinckrodt Nuclear Medicine Llc Systems and methods for dispensing radioactive liquids
WO2019046766A2 (en) 2017-09-01 2019-03-07 Lonza Walkersville, Inc. AUTOMATION OF CELLULAR THERAPY FROM END TO END
US10247724B1 (en) 2017-09-28 2019-04-02 Autobiologic Inc. Optically clear sealable petri dish bioreactor
DE102017124840B3 (de) * 2017-10-24 2018-12-13 Testo SE & Co. KGaA Inkubator, Probenbehälter, Set und Verfahren zur Untersuchung eines Probenmaterials
WO2019226790A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Abs Global, Inc. Systems and methods for particle focusing in microchannels
US10988726B2 (en) 2018-08-19 2021-04-27 Cytera Cellworks Limited Systems and methods for automated cell culturing
KR20210107749A (ko) 2018-12-21 2021-09-01 옥테인 바이오테크 인코포레이티드 모듈식 생물학적 생산 유닛들을 위한 캐러셀
EP3898994A4 (en) 2018-12-21 2022-12-14 Lonza Walkersville, Inc. AUTOMATED VIRAL VECTOR PRODUCTION
CA3123458A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Octane Biotech Inc. Cell culture and tissue engineering systems with controlled environmental zones
JP7536026B2 (ja) 2019-02-08 2024-08-19 ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッド 自動化バイオリアクターにおける使用のための細胞濃縮方法および細胞濃縮デバイス
CA3132973A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 Forever Labs, Inc. Dynamic incubator system and method
US11889830B2 (en) 2019-04-18 2024-02-06 Abs Global, Inc. System and process for continuous addition of cryoprotectant
WO2021068060A1 (en) * 2019-10-07 2021-04-15 Incuvers Inc. Incubator imaging system
JP2022554178A (ja) 2019-10-24 2022-12-28 オクタン バイオテック インコーポレーテッド 改善された細胞接触面を有する細胞培養チャンバ
WO2021092612A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Colgate-Palmolive Company Apparatus, system, and method for testing biological samples
US12163146B2 (en) 2019-11-11 2024-12-10 Lonza Walkersville, Inc. Quality control methods for automated cell processing
US11628439B2 (en) 2020-01-13 2023-04-18 Abs Global, Inc. Single-sheath microfluidic chip
WO2022108840A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 Abs Global, Inc. Modular flow cytometry systems and methods of processing samples

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5212982A (en) * 1975-07-22 1977-01-31 Olympus Optical Co Ltd Apparatus for automatic incubation
US4210724A (en) * 1977-03-28 1980-07-01 Olympus Optical Co., Ltd. Apparatus for liquid disposal and distribution in automatic culture system
US4344816A (en) 1980-12-19 1982-08-17 Bell Telephone Laboratories, Incorporated Selectively etched bodies
JPS58155087A (ja) 1982-03-12 1983-09-14 Olympus Optical Co Ltd 細胞の自動培養装置
US5310674A (en) * 1982-05-10 1994-05-10 Bar-Ilan University Apertured cell carrier
US4647531A (en) 1984-02-06 1987-03-03 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Generalized cytometry instrument and methods of use
US4711851A (en) * 1984-05-21 1987-12-08 State University Of New York Test apparatus for determining a metabolic characteristic of microorganisms
FR2567538B1 (fr) * 1984-07-12 1986-12-26 Inst Nat Sante Rech Med Automate pour l'analyse et le clonage de cultures cellulaires ainsi que pour l'analyse bacteriologique
WO1986001824A1 (fr) * 1984-09-18 1986-03-27 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Installation de triage de cellules
US4673988A (en) 1985-04-22 1987-06-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Electronic mosaic imaging process
US4676951A (en) * 1985-07-01 1987-06-30 American Hospital Supply Corp. Automatic specimen analyzing system
US4859584A (en) 1986-10-31 1989-08-22 Smithkline Beckman Corporation Cell growth rate determination by measurement of changes in cyanine dye levels in plasma membranes
US4762701A (en) 1986-10-31 1988-08-09 Smithkline Beckman Corporation In vivo cellular tracking
US4783401A (en) 1986-10-31 1988-11-08 Smithkline Beckman Corporation Viable cell labelling
US4892830A (en) * 1987-04-02 1990-01-09 Baylor College Of Medicine Environmentally controlled in vitro incubator
US5162204A (en) * 1988-05-06 1992-11-10 Hitachi, Ltd. Apparatus and method of culturing and diagnosis of animal cells using image processing
DE3836716A1 (de) 1988-10-28 1990-05-03 Zeiss Carl Fa Verfahren zur auswertung von zellbildern
US5107422A (en) 1989-10-02 1992-04-21 Kamentsky Louis A Method and apparatus for measuring multiple optical properties of biological specimens
US5072382A (en) 1989-10-02 1991-12-10 Kamentsky Louis A Methods and apparatus for measuring multiple optical properties of biological specimens
JP2510771B2 (ja) * 1990-07-25 1996-06-26 株式会社日立製作所 培養生体の活性診断方法及びシステム
US5548661A (en) 1991-07-12 1996-08-20 Price; Jeffrey H. Operator independent image cytometer
US5790710A (en) 1991-07-12 1998-08-04 Jeffrey H. Price Autofocus system for scanning microscopy
JPH0549467A (ja) 1991-08-23 1993-03-02 Tokimec Inc 培養細胞観察装置
US5612188A (en) * 1991-11-25 1997-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Automated, multicompartmental cell culture system
US5670113A (en) 1991-12-20 1997-09-23 Sibia Neurosciences, Inc. Automated analysis equipment and assay method for detecting cell surface protein and/or cytoplasmic receptor function using same
GB9212164D0 (en) 1992-06-09 1992-07-22 Medical Res Council Preparation of nucleic acids
US5355215A (en) 1992-09-30 1994-10-11 Environmental Research Institute Of Michigan Method and apparatus for quantitative fluorescence measurements
WO1994008759A1 (en) * 1992-10-16 1994-04-28 Thomas Jefferson University Method and apparatus for robotically performing sanger dideoxynucleotide dna sequencing reactions
ATE403491T1 (de) 1994-08-01 2008-08-15 Abbott Lab Vorrichtung und verfahren zur vorbereitung einer flüssigkeit
US5656499A (en) * 1994-08-01 1997-08-12 Abbott Laboratories Method for performing automated hematology and cytometry analysis
US5732150A (en) 1995-09-19 1998-03-24 Ihc Health Services, Inc. Method and system for multiple wavelength microscopy image analysis
US6103479A (en) 1996-05-30 2000-08-15 Cellomics, Inc. Miniaturized cell array methods and apparatus for cell-based screening
US6008010A (en) * 1996-11-01 1999-12-28 University Of Pittsburgh Method and apparatus for holding cells
US5885840A (en) 1997-02-10 1999-03-23 Compucyte Corp. Multiple assays of cell specimens
US6416959B1 (en) 1997-02-27 2002-07-09 Kenneth Giuliano System for cell-based screening

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