JP3941956B2

JP3941956B2 - Ｆ１８イー・コリ関連疾患に対して遺伝学的に耐性のブタを同定する方法および組成物

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Publication number: JP3941956B2
Application number: JP2004299458A
Authority: JP
Inventors: ボスワースブラッド・ティ; フォーゲリペーター
Original assignee: バイオテクノロジーリサーチアンドディベロップメントコーポレイション; ユナイテッドステイツオブアメリカ，アズレプレゼンテッドバイザセクレタリーオブアグリカルチャー; スイスフェデラルインスティテュートオブテクノロジーチューリヒ
Priority date: 1997-05-20
Filing date: 2004-10-13
Publication date: 2007-07-11
Anticipated expiration: 2018-05-20
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Description

イー・コリ（E．coli）関連疾患、特に、フィムブリエＦ１８を有するイー・コリ細菌株に関連する腸疾患に対して遺伝学的に耐性のブタを同定するための組成物および非侵襲性の方法を提供する。ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１）遺伝子におけるＤＮＡ多型性は、耐性のブタと感受性のブタを区別し、ブタ育種家に有用な診断試験を提供することが同定された。

ブタの飼育における主要な問題は、病気させないでそれらを維持することである。離乳後の腸疾患が特に問題である。限定数の血清型の毒性エシェリキア・コリ（Escherichia（E.）coli）株は、ブタにおける浮腫疾患および離乳後の下痢の病原体であり、世界中のブタ飼育農家において、特に４ないし１２週齢の子豚の間で、深刻な経済的損失を引き起こす。浮腫疾患の典型的な臨床上の徴候は、失調症、痙攣および麻痺のような神経学的サインである。死体解剖にて、浮腫は、典型的に、まぶたおよび額、胃壁ならびに結腸間膜のような独特な部位に存在する。該疾患は、エンテロ細胞（腸内細胞）の主要な形態学的変化をもたらすことなく小腸表面にコロニーを形成するイー・コリによって、各々、生産されるシガ様毒素ＩＩ変異型およびエンテロトキシンＬＴ、ＳＴａ、ＳＴｂによって引き起こされる。特定の型の細菌イー・コリ株、Ｆ１８、Ｆ４およびＫ８８は、この点に関して、主要な致命的な元凶である。「ブタの浮腫疾患は、全身性の管損傷によって特徴付けられるエンテロトキセミアである。後者は、特定のイー・コリ株によって生産されるシガ様毒素ＩＩ変異型という毒素によって引き起こされる。」（Bertschingerら、1993）。イー・コリは、それらの線毛の型によって識別される。関連する一連の接着性フィムブリエを例えば、Ｋ８８またはＦ１８と称する（Vogeliら、1997）。

全てのブタがイー・コリ感染で死ぬわけではない。コロニー形成は、例えば、Ｋ８８またはＦ１８と称する細菌のフィムブリエによって媒介されるエンテロ細胞への細菌の接着に依存する。接着に対して感受性、すなわち、フィムブリエを結合するためのブタにおけるレセプターの発現は、宿主によって遺伝学的に制御されていることが示され、それは、優性の特性として、Ｆ１８の場合、感受性対立遺伝子であるＢおよび耐性対立遺伝子のｂによって受け継がれる（Vogeliら、1996；Ｍｅｉｊｅｒｉｎｋら、１９９７）。該イー・コリＦ１８レセプター（ＥＣＦ１８Ｒ）の遺伝子座は、染色体６上のハロセン（ＨＡＬ）連鎖群のＳ遺伝子座および他の遺伝子座へのその密接な遺伝子連鎖に基づいて、ブタ染色体６（ＳＳＣ６）に位置決定された。Ｋ８８イー・コリのレセプターは、染色体１３上にある。

耐性のメカニズムは、耐性動物における腸の縁がイー・コリによってコロニー形成されない、すなわち、細菌が耐性のブタの腸壁に接着しないというようである。腸の刷子縁膜における糖タンパク質レセプターは、いくつかのイー・コリに関連する接着および非接着表現型の間の相違の原因であり、それにより、宿主ブタの遺伝子型が耐性を決定することが示された。フィムブリエを有する細菌もまた研究された（WO9413811）。
Ｆ１８イー・コリ関連疾患に対して耐性であるブタを同定する現行の方法は、１）屠殺してブタから腸試料を収集し、顕微鏡接着試験を行うこと、２）毒性のイー・コリで動物を試験すること（「コロニー形成試験」）または３）Ａ−Ｏ（Ｓ）血液型システムの血液型分類を行うことのいずれかである。最初の２つの方法は、育種用家畜として有用な耐性動物を同定するために実用的なものではない。血液型分類法は耐性動物を同定するけれども、該試験は、感受性の動物が感受性に関してホモ接合体であるかまたはヘテロ接合体であるかを決定できない。これらの対立遺伝子（遺伝子の状態）に関して、動物の遺伝子型の知見は、好結果の育種プログラムを発展させるために不可欠である。育種プログラムの目的は、離乳後に家畜の多くを殺すＦ１８イー・コリ関連疾患に対して耐性のブタを生産することである。

１の出版物において、著者らは、ブタにおける浮腫疾患に関して、「適当な遺伝子マーカーの探求が進行中である・・・」と述べ（Bertschingerら、1993、87ページ）、WalterおよびSellwood（1982）による：
耐性のブタを育種することは、有効な予防ができない疾患を防止する魅力的な方法である。この解決法の成否は、ブタ集団における耐性をコードする遺伝子の普及率、耐性のブタを検出する改善された方法、および耐性と同時に選択される反対の遺伝子特性の不在に依存するであろう。
という記載を引用した。

遺伝子「マーカー」座は、関連する遺伝子座に近接であるが、必ずしもその遺伝子座そのものではないコーディングまたは非コーディング遺伝子座である。検出可能な表現型は、連続または不連続の特性、例えば、制限長フラグメント多型性、生産特性、細菌接着特性、比色または酵素反応および抗生物質耐性を包含する。Ｓ遺伝子座は、ＡおよびＯ血液型抗原の発現を制御する。Ｓ遺伝子座で劣性のホモ接合体のブタは、ＡまたはＯ血液型抗原のいずれをも発現しない。同様の状態がヒトに存在し、ヒト血液型Ｈをコードするアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子における変異が原因である（Kellyら、1994;またWO9628967も参照）。ブタのブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、近年、配列決定された（Cohneyら、1996）。該遺伝子は、まさしく、ブタにおいてＳ遺伝子座に存在する遺伝子のようである。

血液型ＨおよびＳｅ遺伝子座は、遺伝学的および物理的にヒト染色体１９ｑ１３．３に位置決定された。該領域は、進化論的に保存され、ブタにおける遺伝子のＨＡＬ連鎖群に対して相同の遺伝子を含有する。血液型Ｈをコードする遺伝子はＦＵＴ１と呼ばれ、一方、Ｓｅ遺伝子はＦＵＴ２遺伝子と等価である。ＦＵＴ１は赤血球細胞系統においてＨ抗原発現を決定し、一方、ＦＵＴ２は分泌性上皮および唾液においてＨ抗原の発現を調節する。ＦＵＴ１遺伝子の保存は、ラットおよびウサギのような下等哺乳動物において示され、ｍＲＮＡ発現は、ウサギ脳組織およびラット結腸において示された。これらの種の全てにおいて、２つの型のアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヒトＦＵＴ１およびＦＵＴ２遺伝子に構造的に非常に類似するが、特に、ＦＵＴ１相同遺伝子は種特異的発現パターンを示すことが報告された。ヒトにおいて、ＦＵＴ１遺伝子は、赤血球細胞の前駆体におけるＨ抗原の合成の原因である。しかしながら、ブタにおいて、赤血球は、ヒトＬｅｗｉｓ抗原の場合のように、受動的に血清由来のＨ様抗原を吸着する。ブタにおいて、全てのＨ様抗原は、外分泌を行う分泌組織に関連し、ＦＵＴ２（分泌型）遺伝子の発現は、他の動物種の分泌組織に見出される。したがって、抗ヒト血液型ＨおよびＡ抗体と交差反応するブタＡ−Ｏ血液型決定基の発現は、ＦＵＴ２遺伝子により影響を及ぼされるかもしれない。
血液型およびイー・コリブタ疾患についてのさらなる情報は、血液型抗原の炭水化物構造がいくつかの病原性微生物の宿主組織への接着を媒介すること、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacterpylori）はＬｅｗｉｓ^b血液型抗原に接着し、尿路感染症を引き起こすイー・コリは血液型Ｐ物質に接着することを包含する。したがって、血液型特異的炭水化物構造の形成の原因であるグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、宿主による細菌のコロニー形成の制御に関する遺伝子の候補である。これらの遺伝子の局在性は、ブタの小腸におけるＦ１８陽性イー・コリの接着／非接着の原因となる遺伝子座と同じ染色体領域にある。ブタは、離乳後、すなわち、Ｆ１８イー・コリによって引き起こされる疾患に罹患しやすくなる時期まで、血液型抗原ＡおよびＯを発現しない。

ブタにおけるイー・コリ関連腸疾患のための診断および治療の新規な方法が必要とされる。遺伝子変異の検出は、いくつかのブタの障害（悪性低体温症）の診断試験として提案された（Ｆｕｊiｉら、1991;米国特許第5,358,649号）が、診断用の多型性マーカーは報告されなかった。イー・コリのコロニー形成に対する耐性を発達させるためのワクチンは記載されたが（米国特許第5,552,144号；WO8604604）、生ワクチンを経口的に生まれたばかりのブタに投与するのは困難であるため、また、規定の制限のため、イー・コリ疾患を防止するための好ましい方法ではないようである。抗生物質は治療に有用であるが、予防では成功しない。

項目１．ａ．ブタ由来の生物学的試料中、コロニー形成に対する耐性に関連する遺伝的多型性が存在するかどうかを決定し；
ｂ．ブタが多型性に関してホモ接合体である場合、ブタは耐性であると推断することからなる、イー・コリによる腸内コロニー形成に対して耐性のブタを同定する方法。
項目２．ａ．ブタ由来の生物学的試料中、ブタのアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１における位置３０７の唯一の窒素塩基がアデニンであるかどうかを決定し；
ｂ．位置３０７の唯一の窒素塩基がアデニンである場合、耐性としてブタを同定することからなる、腸障害に関連するイー・コリに対して耐性のブタを同定する方法。
項目３．ａ．イー・コリ関連腸疾患に対して耐性のブタとして同定するアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子における遺伝的多型性を有する飼育用ブタを選択し；
ｂ．選択したブタを飼育することからなる、イー・コリ関連疾患に対して耐性のブタを飼育する方法。
項目４．イー・コリがＦ１８株である項目１、２または３記載の方法。
項目５．ブタにおけるアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１に関して多型性である単離ＤＮＡ分子。
項目６．図１に記載のヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子。
項目７．グアニンの代わりにヌクレオチド位置３０７にアデニンがある項目６記載の単離ＤＮＡ分子。
項目８．項目６記載のヌクレオチド配列に相補的な単離ＤＮＡ分子。
項目９．ヌクレオチド位置８５７においてグアニンがアデニンで置換されている項目６記載の単離ＤＮＡ分子。
項目１０．ヌクレオチド位置２２９にスレオニンを有する項目６記載の単離ＤＮＡ分子。
項目１１．アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性を有する項目５または６記載のＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチド。
項目１２．イー・コリコロニー形成耐性のブタと感受性のブタを区別するヌクレオチド配列を包含する、項目５または６記載の単離ＤＮＡ分子の部分。
項目１３．ＤＮＡをブタの有核細胞から単離し、プライマーとしてブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子のＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応においてＤＮＡを増幅し、少なくとも１つの制限酵素で制限酵素消化を行い、得られたフラグメントをゲル電気泳動により分離し、フラグメントの各数および長さをゲル上で決定し、フラグメントの数および長さからレセプターの存在を決定することからなる、イー・コリＦ１８レセプターを検出するための分子アッセイ。
項目１４．制限酵素がＣｆｏＩである項目１４記載の分子アッセイ。
項目１５．別々の容器中に、ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１の多型性のＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、イー・コリＦ１８レセプターを検出するためのキット。
項目１６．アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性および位置１０３にアミノ酸置換を有するブタポリペプチド。
項目１７．さらに位置２８６にアミノ酸置換を有することを特徴とする項目１６記載のポリペプチド。
項目１８．イー・コリ関連疾患に罹患したブタを治療するための薬剤を開発するためのブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼの多型性の使用。

発明の概要
本発明の組成物および非侵襲性の方法は、イー・コリ関連疾患に感受性のブタの検出および排除を提供する。イー・コリＦ１８による腸内コロニー形成に対して耐性のブタを同定するための非侵襲性の方法は、以下の工程：ブタ由来の生物学的試料中、コロニー形成に対する耐性に関連する遺伝的多型性が存在するかどうかを決定し；ブタが多型性¹に関してホモ接合体である場合、ブタは耐性であると推断する工程を包含する。（¹ 多型性とは、変異のため集団内に存在するヌクレオチド配列における変化のことである）。

より詳細には、該方法は、ブタ由来の生物学的試料中、ブタのアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子における位置３０７の窒素塩基がアデニンであるかグアニンであるかを決定し；位置３０７の唯一の窒素塩基がアデニンである場合、ブタを耐性として同定することである。

生物学的試料中で多型性が存在するかどうかを決定するために、制限フラグメント長多型性を分子量によってそれらを分離するゲル上で分析する。制限エンドヌクレアーゼは、特異的部位で核酸分子を再現可能に切断し、切断の位置によって種々の分子量の核酸フラグメントを生じる酵素である。

本発明は、また、イー・コリ関連腸疾患に対して耐性のブタとして同定するアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子における遺伝的多型性を有する育種用ブタを選択し、選択したブタを飼育することによって、イー・コリ関連疾患に対して耐性のあるブタを飼育する方法に関する。

本発明の態様は、ブタにおけるアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子に関して多型性であり、特に図１記載の配列であるＤＮＡ分子である。本発明の他の態様は、図１記載の配列に相補的なヌクレオチド配列を有する分子である。
本発明の態様は、位置３０７においてグアニンの代わりにアデニンを有する単離ＤＮＡ分子である。該分子は、また、位置８５７においてグアニンの代わりにアデニンを結合していてもよい。本発明の他の単離ＤＮＡ分子は、図１の配列のヌクレオチド位置２２９に変異を有する分子である（ここに、コドンＣＴＴはＴＴＴに変化し、アミノ酸ロイシンのかわりにフェニルアラニンをコードする）。
ヌクレオチド位置７１４の変異は、ＧＡＴ→ＧＡＣであるが、コードされる生産物にアミノ酸置換を伴わない。

本発明のＤＮＡ分子によってコードされ、アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドもまた、本発明の態様である。
ブタにおいてイー・コリＦ１８レセプターを検出するための分子アッセイは、（ａ）ブタの有核細胞からＤＮＡを単離し；（ｂ）プライマーとしてブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１のＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＤＮＡを増幅し；（ｃ）少なくとも１つの制限酵素、例えば、ＣｆｏＩで制限酵素消化を行い；（ｄ）得られたフラグメントをゲル電気泳動により分離し；（ｅ）フラグメントの各数および長さをゲル上で決定し；（ｆ）ＦＵＴ１のフラグメントの数および長さから、ブタの細胞中にどのＦ１８レセプター遺伝子型が存在するか決定することである。ＤＮＡバンドは比較的低濃度のアガロースゲル上を移動することができるので、短鎖フラグメントよりもむしろ、本明細書に開示される長鎖増幅フラグメントを制限酵素フラグメント長多型性分析（ＲＦＬＰ）に使用することは、あまり費用がかからない。また、フラグメントのいくつかを生産するために、たった１つの制限酵素が可変診断部位に隣接する一定の制限部位に必要とされる。イー・コリＦ１８レセプターに関連する多型性を検出するためのキットは、耐性のブタと感受性のブタを区別するブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１のＤＮＡ配列に相補的な別々の容器中のオリゴヌクレオチドを使用する。該試験は、何れの歳のブタでも行うことができる。また、多型性は、イー・コリ関連疾患に罹患したブタを治療するための薬剤の開発に有用である。ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼの変異型は、正常な酵素を妨げ、Ｆ１８の腸内レセプターの生産を妨げる。

好ましい具体例の記載イー・コリ関連疾患に対するブタの耐性に関連するＤＮＡ多型性の分子分析は、飼育用の耐性ブタを選択するための診断アッセイを容易にした。耐性のブタは、本発明の多型性マーカーによって同定されるように、イー・コリＦ１８レセプター遺伝子座にて感受性のブタと異なる。

本発明は、高レベルの感度および特異性で、Ｆ１８イー・コリ感染に関連する疾患に遺伝学的に感受性のブタと耐性のブタを区別するための非侵襲性の方法および組成物を提供する。ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１）遺伝子におけるＤＮＡ多型性は、耐性のブタと感受性のブタを区別するものとして同定された。多型性は、新規な対立遺伝子を導くヌクレオチド配列における変異（変化）によって生じた。対立遺伝子は、遺伝子の状態である。集団において、おそらく先祖のＤＮＡ分子における変異によって引き起こされた窒素塩基置換によって異なる遺伝子の多くの対立遺伝子が存在し得る。１以上の対立遺伝子の１集団内における共存（ときどき、「変異型」という）は、遺伝学的多型性と呼ばれる。そこに１以上の対立遺伝子が明らかに集団の安定な構成要素として存在し得る遺伝子座は、多型性遺伝子座である。通常、多型性遺伝子座の１つは低い頻度で集団内に存在する。

生物学的試料、好ましくは血液から決定する場合、耐性のブタは、それらのゲノムにおいて、ヌクレオチド配列の位置３０７（図１参照）にて検出される唯一の塩基がアデニンであるが、ホモ接合体の感受性のブタにおける同じ位置の塩基はグアニンである多型性を有する。ヘテロ接合体のブタは、両方の型のＤＮＡを示し、感受性であろう。多型性は、ブタ遺伝子配列の変異型である（Cohneyら、1996）。

遺伝子連鎖分析をブタのファミリーにおいて行い、異系交配したブタにおいてＦＵＴ１における多型性と疾患耐性の間の遺伝学的関連を決定した。本発明によると、多型性は、アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子（ＦＵＴ１）において見出された。単一のヌクレオチド塩基置換を位置３０７に有する多型性を用いて、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子とＳ−システム、ＥＣＦ１８Ｒ遺伝子座およびＨＡＬ連鎖群の他の遺伝子座の間の密接な連鎖を確立した。

ＦＵＴ１の変異とＥＣＦ１８Ｒの密接な連鎖の検出により、イー・コリＦ１８接着耐性、ヘテロ接合体（キャリアー）およびホモ接合体の感受性のブタの同定のための分子試験が発展した。該診断試験は、高い感度および特異性で、浮腫疾患および離乳後の下痢に感受性のブタを同定する。本発明の多型性の発生率は、ブタの品種の間で異なる。Vogeliら(1997)は、お互いに無関係の群由来の５種類のブタの品種におけるＭ３０７対立遺伝子の頻度を提示した。本発明の多型性についての診断試験の有効性は、それらのブタ群由来のＥＣＦ１８Ｒ感受性対立遺伝子を有効に排除する機会を有し、それにより、浮腫疾患および離乳後の下痢を引き起こすイー・コリＦ１８細菌性接着のための先行条件を排除する品種を提供する。

本発明は、さらに、ｂｐ３０７で種々の多型性を示すアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１の配列の変異型であるヌクレオチド配列およびアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子における多型性を同定するための診断的な分子に基づくキットを包含する。
イー・コリＦ１８レセプター遺伝子座（ＥＣＦ１８Ｒ）についての候補遺伝子を得るために、アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ１およびＦＵＴ２（Meijerinkら、1997）を用いて、その遺伝子を含有する５つのコスミドおよび１つのゲノムクローンをブタゲノムライブラリーから単離した。蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるマッピングは、これらの全てのクローンをブタ染色体６のバンドｑ１１（ＳＳＣ６ｑ１１）に位置決定した。コスミドの配列分析は、（ａ）ヒトＦＵＴ１配列に対し８２．３％同一である、１０９８塩基対の長さのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、および（ｂ）ヒトＦＵＴ２配列に対し８５％同一である、１０２３塩基対の長さの第２のＯＲＦという特徴を決定した。したがって、ＦＵＴ１およびＦＵＴ２遺伝子座は、ヒト血液型Ｈおよび分泌型遺伝子座のブタ等価物であるようである。Ｆ１８フィムブリエを有するイー・コリ（ＥＣＦ１８Ｒ）による接着およびコロニー形成に感受性または耐性のいずれかのブタにおける２つのＯＲＦの直接配列決定は、ＦＵＴ１ＯＲＦの塩基対３０７（Ｍ３Ｏ７）および塩基対８５７（Ｍ８５７）にて２つの多型性を示した。ヌクレオチド位置は、ＡＴＧ（メチオニンをコードする）から数えられた。２２１種の子孫を有するＬａｎｄｒａｃｅファミリーの３４種の交配におけるこれらの変異の分析は、小腸におけるイー・コリＦ１８接着およびコロニー形成に対する耐性および感受性を制御する遺伝子座（ＥＣＦ１８Ｒ）、および血液型インヒビターＳの遺伝子座との密接な連鎖を示した。したがって、Ｍ３０７変異は、イー・コリＦ１８接着耐性動物のマーカーに援助される選択のための良好なマーカーである。ヌクレオチド位置２２９における別の変異は、ロイシンをコードするコドン（ＣＴＴ）がＴＴＴ（フェニルアラニンをコードする）に変化した多型性を導くことが見出された。位置７１４での変異（ＧＡＴ→）ＧＡＣ）（アスパラギン酸をコードする）は、アミノ酸置換を生じなかった。感受性のブタと耐性のブタを区別する多型性は、ＦＵＴ２において同定されなかった。

以下の実施例は本発明の具体例を提供する。

実施例１：耐性のブタについてのアッセイ本発明の多型性は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験を用いて容易に同定される。ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１の１６０ｂｐフラグメントを用いた試験の１具体例は、ＰＣＲを用いて、以下のプライマー；５’ＣＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴ３’および５’ＧＴＧＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡ３’で増幅した。該具体例の好ましいＰＣＲ条件は、以下の時間および温度での２５サイクルである：９４℃、３０秒；６０℃、４５秒；７２℃、９０秒。耐性のブタ由来の増幅ＤＮＡは制限酵素Ｈｇａｌによって消化されたが、制限酵素ＨｉｎＰＩによって消化されなかった。ホモ接合体感受性のブタ由来の増幅ＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎＰＩによって消化された。ヘテロ接合体感受性のブタ由来の増幅ＤＮＡは、両方の酵素によって部分的に消化された。
別法では、標準的手法にしたがって、ＤＮＡをブタの有核細胞から単離した。
異なるＥＣＦ１８Ｒ遺伝子型（Ｂｂ，ｂｂ）の動物におけるブタＦＵＴ１およびＦＵＴ２配列ならびにそれらのフランキング領域の直接配列決定により、ＦＵＴ１ＯＲＦの位置３０７および８５７にて２つのＧ→Ａ転位（各々、Ｍ３０７およびＭ８５７という）を同定した。Ｍ３０７転位は、ＣｆｏＩの１つの制限部位を削除する。ブタ有核細胞から単離したＤＮＡの増幅は、標準的な手法にしたがって、プライマーＰ６およびＰ１１を用いて行った（９５℃で３分、次いで、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で３０秒を３０サイクル、次いで、７２℃で７分の最終的な伸長反応）後、ＣｆｏＩ消化を行い、３％アガロースゲル上で分離した結果、制限酵素断片長多型性（ＲＦＬＰ）を得た。ホモ接合体Ｍ３０７^AA動物は、２つのバンドを示した。ホモ接合体Ｍ３０７^GG動物は、９３、２４１および８７ｂｐフラグメントを示した。ヘテロ接合体動物は、４つのフラグメント全てを示した。

実施例２：Ｆ１８イー・コリに対して耐性のブタの検出におけるアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼを用いるアッセイの感度および特異性研究は、疾患耐性とＦＵＴ１遺伝子の位置３０７における多型性との関連を決定するために行った。１８３匹の離乳したブタ（歳２−６月の範囲）を６つの異なる飼育群から得た。これらの群のたった１つが、該研究を始める前に耐性の動物を含むことが知られており、該群は、ブタストレス症候群の高い発病率を有することが知られている。他の５つの群は、ブタストレス症候群の形跡がなく、疾患耐性の発生率は知られていなかった。各群由来のブタを無作為に選択し、人道的に安楽死させ、脾臓および小腸の試料を取り出した。ＤＮＡを脾臓組織から抽出し、実施例１に記載のＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイにおいて使用した。粘膜表面を腸から削り取ることによって腸細胞を精製し、低張性のＥＤＴＡ溶液中で細胞を溶菌し、遠心分離によって洗浄した。精製した腸細胞刷子縁をＦ１８イー・コリと共にインキュベートした。該混合物を位相差顕微鏡によって調べた。該アッセイは、ブタが感受性であるか（腸試料が接着細菌を有した）、または耐性であるか（腸試料が接着細菌を有さなかった）を決定した。多型性についてのＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイは、５３匹の耐性のブタのうち５３匹および１３０匹の感受性のブタのうち１２８匹において細菌−腸細胞結合アッセイに相関した。細菌−腸細胞結合アッセイを用いて感受性であると決定された２匹のブタは、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイを用いて耐性であると不正確に予測された。試験された６つの群のうち２つは耐性のブタを含んだが、１つの群だけがブタストレス症候群を有し、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイはブタストレス症候群を有さない動物において疾患耐性の動物を同定できることを明らかにした。

実施例３：染色体６（ＳＳＣ６）上でのＦＵＴ１の局在性プライマーＰ７およびＰ１０を用いてブタゲノムＤＮＡから得られたＦＵＴ１ヌクレオチドプローブでコスミドライブラリーをスクリーニングした後、コスミドＥＴＨｓ１、−ｓ２、−ｓ３、−ｓ４および−ｓ６を同定し、ＦＩＳＨおよびＤＩＳＣ−ＰＣＲによってバンドｑ１１における染色体６に位置決定した。

実施例４：ブタＦＵＴ１ＯＲＦの同定サザンブロット分析の場合、ＫｓｐＩ、ＥｃｏＲＩおよびＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩコスミド消化物と放射能標識したブタＦＵＴ１フラグメントＰ６−Ｐ１１およびＰ７−Ｐ１０がハイブリダイズして、ＥＴＨｓ２、−ｓ４および−ｓ６について同一のオートラジオグラフィーシグナルを示し、一方、コスミドＥＴＨｓ１および−ｓ３からは異なるシグナルが得られた。コスミドＥＴＨｓ２ＫｓｐＩから、サブクローン９４０ｂｐおよび６．２ｋｂの長さが単離され、それは、サザンブロットにおいてハイブリダイズするＫｓｐＩフラグメントの見積もりの長さに相当した。２つのサブクローンの配列決定の結果を合わせると１５０１ｂｐ配列になり、それはゲノムＰＣＲ産物の直接配列決定の結果と一致した。１５０１ｂｐ配列は、８２．３％のヌクレオチドおよび８０．８％のアミノ酸同一性でヒトＦＵＴ１ＯＲＦに相当する１０９８ｂｐのオープン・リーディング．フレーム（ＯＲＦ）を含有する。ＯＲＦは、ポリペプチドをコードする。

実施例５：ブタＦＵＴ２および偽遺伝子ＦＵＴＰの同定ＥＴＨｓ１は、ＦＵＴ１配列にハイブリダイズする１つのＤＮＡフラグメント（２．７ｋｂ）を有するが、ＥＴＨｓ３は２つ（２．７ｋｂおよび８．２ｋｂ）
を有する。ＥＴＨｓ１および−ｓ３の２．７ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントのサブクローニングおよび部分的配列決定により、これらの２つのフラグメントが同一であることを確認した。該配列は、ヒトＦＵＴ２に非常に類似するが、ＮＨ₂−および−ＣＯＯＨ末端領域において数個の変化を示す。これらの変化は、保存ＯＲＦと矛盾するフレームシフトを導くので、２．７ｋｂフラグメントから得られる配列は偽遺伝子（ＦＵＴ２Ｐ）を示すという仮説が成り立つ。ＥＴＨｓ３ＢａｍＨＩ消化物のサブクローニング後、８．２ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントに含有されるハイブリダイズする配列を同定した。得られたサブクローンの配列は、１０２３ｂｐＯＲＦを示し、ヒトＦＵＴ２配列に対してヌクレオチドレベルで８５％およびアミノ酸レベルで８３％同一である。ＮＨ₂−および−ＣＯＯＨ末端領域における多くの相違が、ブタＦＵＴ２配列と２．７ｋｂフラグメント由来のＦＵＴ２Ｐ配列の間に観察された。予測アミノ酸配列は、ブタ分泌型酵素の部分的に決定されたアミノ酸配列に相当する（ThurinおよびBlaszczyk-Thurin、1995）。得られたブタＦＵＴ１、ＦＵＴ２およびＦＵＴＰ配列をＧｅｎＢａｎｋに提出し、各々、受託番号Ｕ７０８８３、Ｕ７０８８１およびＵ７０８８２を得た。ＦＵＴ１およびＦＵＴ２遺伝子は、非常に相同性の配列を有する。これは、例えば、プライマー開発において考慮されなければならない。さらに、ＦＵＴ１およびＦＵＴ２酵素活性は、さらなる研究において区別されなければならない。

実施例６：Ｍ３０７およびＭ８５７変異の同定およびＭ３０７のキャラクタリゼーション標準的手法にしたがって、ブタの有核細胞からＤＮＡを単離した。異なるＥＣＦ１８Ｒ遺伝子型（Ｂｂ、ｂｂ）の動物におけるブタＦＵＴ１およびＦＵＴ２配列ならびにそれらのフランキング領域の直接配列決定は、ＦＵＴ１ＯＲＦの位置３０７および８５７にて２つのＧ→Ａ転位（各々、Ｍ３０７およびＭ８５７という）を同定した。Ｍ３０７転位は、酵素ＣｆｏＩの１つの制限部位を削除する。
ブタの有核細胞から単離したＤＮＡの増幅は、標準的な手法にしたがって、プライマーＰ６およびＰ１１を用いて行った（９５℃で３分、次いで、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で３０秒を３０サイクル、次いで、７２℃で７分の最終的な伸長反応）後、ＣｆｏＩ消化を行い、３％アガロースゲル上で分離した結果、制限酵素断片長多型性（ＲＦＬＰ）を得た。ホモ接合体Ｍ３０７^AA動物は、２つのバンド（９３−および３２８−ｂｐフラグメント）を示した。ホモ接合体Ｍ３０７^GG動物は、８７−、９３−および２４１ｂｐフラグメントを示した。ヘテロ接合体動物は、４つのフラグメント全てを示した。

実施例７：変異Ｍ８５７のキャラクタリゼーションＭ８５７変異は、１つのＡｃｉＩ部位を削除する転位である。２つの付加的なＡｃｉＩ部位を位置８６６および８７２で不正対合するように、プライマーＰＢＥＳＴを設計した。プライマーＰ７およびＰＢＥＳＴを用いるＰＣＲ（９５℃で３分、次いで、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で３０秒を３０サイクル、次いで、７２℃で最終的な伸長反応を７分）、次いで、ＡｃｉＩ消化を行い、３％アガロースゲル上でＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析を行った。ホモ接合体Ｍ８５７^AA動物は、１７４ｂｐフラグメントを示したが、Ｍ８５７^GGの増幅産物は、１３６−および３８−ｂｐフラグメントを示した。

実施例８：ＦＵＴ１遺伝子の遺伝子マッピングＬａｎｄｒａｃｅブタファミリーにおいて、Ｍ３０７とＨＡＬ連鎖群（Ｓ、ＥＣＦ１８Ｒ、ＲＹＲ１、ＧＰ１、ＰＧＤ）の遺伝子座との間の組換えは、組換え率（fraction）θ＜０．０４を示した（表２）。全組換え率についてのロッドスコアＺは、２４．５〜５０．６であり、これらの遺伝子座間の連鎖の強力な証拠を示す。これらのデータは、ＦＵＴ１によりどちらも影響を及ぼされるＳおよびＥＣＦ１８Ｒにきわめて近接して、ＨＡＬ連鎖群にＦＵＴ１遺伝子を遺伝子マッピングさせる。実験的Ｌａｎｄｒａｃｅファミリーにおいて、対立遺伝子関連がＥＣＦ１８ＲとＲＹＲ１の間に見出された。ＲＹＲ１における位置１８４３の過剰な遺伝子型ＲＹＲ１^TT（ハロセン感受性遺伝子型）は、浮腫疾患および離乳後の下痢に対して耐性のブタ（遺伝子型ＥＣＦ１８Ｒ^b/b）の間で観察された（表３）。該対立遺伝子関連は、連鎖不均衡、すなわち、観察されたハプロタイプ頻度の対立遺伝子の独立の組み合わせ下で予想されるハプロタイプ頻度からのずれの結果である。したがって、連鎖不均衡は、連鎖した遺伝子座に属する対立遺伝子の無作為でない関連を示す。しかしながら、低組換え率のため、他より有意に良いと決定できた遺伝子座規則はなかった。

実施例９：Ｍ３０７^AとＥＣＦ１８Ｒ^ｂおよびＭ３０７^GとＥＣＦ１８Ｒ^Bとの関連Ｌａｎｄｒａｃｅ（ＳＬ）およびＬａｒｇｅＷｈｉｔｅ（ＬＷ）親ブタにおいて、ＥＣＦ１８Ｒ^b（浮腫および離乳後の下痢耐性対立遺伝子）は、Ｍ３０７^Aに１００％関連し、ＥＣＦ１８Ｒ^B（浮腫および離乳後の下痢感受性対立遺伝子）はＭ３０７^Gに１００％関連する（ここに、Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン）。

ＳＬブタにおいて、８８％（３０／３４）のＳ^sが各々、全てのＥＣＦ１８Ｒ^bおよびＭ３０７^Aハプロタイプの原因であった。ＬａｒｇＷｈｉｔｅブタおけるＳ^Ｓ−ＥＣＦ１８Ｒ^ｂハプロタイプおよびＳ^Ｓ−３０７^Ａハプロタイプの両方についての対応する値は、８２％（９／１１）であった。実験的ＳＬファミリーにおいて、ＦＵＴ１遺伝子座でのＭ８５７^A対立遺伝子の出現率は低く、ＬＷブタにおいては存在さえしなかった。したがって、有意な配偶子の関連は、Ｍ８５７の対立遺伝子およびフランキング遺伝子の対立遺伝子との問では観察されなかった。位置ＦＵＴ１３０７およびＦＵＴ１８５７でのＧ→Ａ転位は、Ｄｕｒｏｃ、ＨａｍｐｓｈｉｒｅおよびＰｉｅｔｒａｉｎブタにおいても種々の頻度で見出され、それらの転位は他のブタ品種においても起こるようであった。

実施例１０：ＦＵＴ１遺伝子型の分布表４は、ＥＣＦ１８Ｒ型の間のヌクレオチド位置３０７におけるＦＵＴ１遺伝子型の分布が、２つの独立した仮説の下に予測された比率と有意に異なったことを示す。１１９匹の浮腫疾患および離乳後の下痢に耐性のＥＣＦ１８Ｒ^b/b動物のうち１１８匹がＤＮＡに基づく試験において、遺伝子型Ｍ３０７^A／Aを有すると決定された。１匹の耐性動物は、遺伝子型Ｍ３０７^A/Gを有した。１３１匹の感受性のブタのうち１３０匹がＭ３０７^A/GまたはＭ３０７^G/Gであった。
イー・コリ接着に対して感受性の１匹の動物が、ＤＮＡ試験によってホモ接合体Ｍ３０７^A/Aであることが示された。該実施例および実施例２由来のデータは、過去の研究と一緒に、ＦＵＴ１遺伝子がブタにおけるＳ遺伝子座およびＥＣＦ１８遺伝子座に存在する遺伝子であることを示唆した。該実施例および実施例２において４匹の動物が該ハプロタイプを否定するが、これらの動物は疾患耐性／感受性に関して不正確に表現されたようである。

実施例１１：アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼにおけるアミノ酸交換アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１のｂｐ＋３０７およびｂｐ＋８５７でのＧ→Ａ変化は、各々、コード産物に機能的な結果を有し得るアラニン（中性−非極性）の代わりにスレオニン（中性−極性）、およびアルギニン（塩基性）のかわりにグルタミン（中性−極性）の予測アミノ酸置換を生じる。ｂｐ２２９のＣ→Ｔ変化は、フェニルアラニン（中性−非極性）の代わりにロイシン（中性−非極性）のアミノ酸置換を生じる。
表１：正方向（Ｆ）および逆方向（Ｒ）プライマーの配列およびブタＦＵＴ１およびＦＵＴ２開始コドンに対するそれらの相対位置²

2 プライマーＦＵＴ１Ｐ１０およびＦＵＴ１Ｐ１１はヒトＦＵＴ１遺伝子由来である。
表２：Ｌａｎｄｒａｃｅ実験集団におけるＭ３０７およびＨＡＬ連鎖群の遺伝子座に対する全組換え率（θ）、ロッドスコア（Ｚ）および有益な動物の数（Ｎ）

表３：Ｌａｎｄｒａｃｅ（ＳＬ）実験集団および無作為に選択したＬａｒｇｅＷｈｉｔｅ（ＬＷ）ブタにおける４つの遺伝子座（Ｓ−ＦＵＴ−１（Ｍ３０７，Ｍ８５７）−ＥＣＦ１８Ｒ−ＲＹＲ１）でのハプロタイプ頻度

³ Ｓ：ＡおよびＯ血液型のサプレッサー遺伝子座（Ｓおよびｓ）。
ＦＵＴ１（Ｍ３０７）：アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１）遺伝子のヌクレオチド３０７でのアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）の改変。ＦＵＴ１（Ｍ８５７）：ＦＵＴ１遺伝子のヌクレオチド８５７のアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）の改変。ＥＣＦ１８Ｒ：イー・コリＦ１８レセプター。優性感受性対立遺伝子はＢによって示され、耐性対立遺伝子はｂによって示される。
ＲＹＲ１：骨格筋リアノジンレセプター。Ｃ（シトシン）は悪性高体温の優性耐性対立遺伝子であり、Ｔ（チミジン）は感受性対立遺伝子である。
⁴ ％にぉけるハプロタイプ頻度および括弧内はハプロタイプの無名数。
表４：Ｌａｎｄｒａｃｅ（ＳＬ）実験集団および無作為に選択したＬａｒｇｅＷｈｉｔｅ（ＬＷ）ブタにおける、関連する多型性ＦＵＴ１（Ｍ３０７）およびＥＣＦ１８Ｒ遺伝子座の遺伝子型の分布、テトラコリック相関（Ｒ）および関連の有意度（χ²およびｗ×ｘ²）

⁵ ｗ＝０．２（ＳＬ）および０．４（ＬＷ）の重量因子をCotterman（1947）にしたがって、データ中における関連動物に包含されることに起因する精度の欠落の補正に適用した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
⁶ ＥＣＦ１８Ｒ遺伝子座で遺伝子型ｂ／ｂの動物は耐性であり、遺伝子型Ｂ／ｂおよびＢ／Ｂの動物はＦ１８ａｂイー・コリ細菌の接着に対して感受性である。
方法１．プライマーヒトＦＵＴ１遺伝子由来のプライマーをゲノムＤＮＡ由来のそのブタ相対物の増幅に用いた。得られたブタ配列から、特異的プラマーを設計し、さらなる増幅および配列決定反応に用いた（表１）。
２．ブタゲノムライブラリーのスクリーニングブタゲノムライブラリーをプライマーＰ７およびＰ１０で得られたブタＦＵＴ１プローブまたはブタＦＵＴ１ｃＤＮＡのいずれかを用いてスクリーニングした。ＳｕｐｅｒｃｏｓＩ（Stratagene，La Jolla，Ca，USA）において構築されたブタゲノムライブラリーを、プライマーＰ７およびＰ１０を用いてブタゲノムＤＮＡから得られたα^３２ＰｄＡＴＰ標識した（PrimeIt II，Stratagene）ＦＵＴ１プローブを用いてスクリーニングした。４２℃で１５時間のレプリカフィルターのハイブリダイゼーション（５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ、５ｘデンハート、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精液）および６５℃で３０分間の２度の洗浄（１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）の後、Ｘ線フィルムに曝露（１５時間、−８０℃）後、陽性コロニーを同定した。
３．ブタ中期染色体のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションコスミドクローンＥＴＨｓ１、ＥＴＨｓ２、ＥＴＨｓ３、ＥＴＨｓ４およびＥＴＨｓ６をブタ中期上で、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Solinas Toldoら、1993）または直接的ｉｎｓｉｔｕ染色体ＰＣＴ（ＤＩＳＣＰＣＲ）に付した。中期染色体は、ハイブリダイゼーション前にＱバンド染色し、写真に撮った。ビオチン−１６−ｄＵＴＰを用いるランダムプライミングによって、プローブを標識した。アビジン−ＦＩＴＣおよびビオチン化抗アビジンを用いて、シグナル検出および増幅を行った。染色体は、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで対比染色し、コスミドの相対位置をSolinasToldo，1993に記載のように決定した。
４．サブクローニングプローブ陽性ゲノムコロニーの酵素消化物をアガロースゲル上で分離し、ナイロン膜上に転写し、プローブ陽性バンドをＦＵＴ１配列決定のためにプラスミド中でサブクローン化した。該方法から得られたＦＵＴ１の配列を図１に示す。
全コスミドのＫｓｐＩ−、ＥｃｏＲＩ−およびＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ消化物を０．８％アガロースゲル上で分離し、ＨｙｂｏｎｄＮナイロン膜上に転写した（Meijerinkら、1997）。該ブロットをα³²ＰｄＡＴＰ標識したブタＦＵＴ１ＰＣＲ産物（プライマーＰ６−Ｐ１１およびＰ７−Ｐ１０）でハイブリダイズした。オートラジオグラフィーのシグナルに基づいて、ＥＴＨｓ１、−ｓ２および−ｓ３をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（Stratagene）中のさらなるサブクローニングに付し、ＦＵＴ配列をサブクローンから決定した。コスミドＥＴＨｓ２および−ｓ３から得られた２つのＦＵＴ−様オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列（ＦＵＴ１およびＦＵＴ２）をＰＣＲ産物の直接配列決定によって、ＥＣＦ１８Ｒ陽性（ＢＢ／Ｂｂ）および陰性（ｂｂ）動物において比較した。
５．ポリメラーゼ連鎖反応および直接配列決定ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（PerkinElmer Cetus，Norwalk，CT，USA）および１０ピコモルのプライマーを用いて、最初の変性９５℃で５分、次いで、９５℃で３０秒、５０℃で１５秒および６０℃４分を２５サイクルからなる温度プログラムでサイクル配列決定を行った。ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅および配列決定に用いられたプライマーを表１に列記する。付加的なプライマーは、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２およびＦＵＴ２偽遺伝子の高い類似性のため、プライマーの交差アニーリングの可能性を考慮して設計された。試料は、３７３ＡＡＢＩシークエンサー（Applied Biosystems Inc.）上で分析し、ＧＣＧパッケージ（Devereux，1984）を用いて配列分析を行った。
６．有益な子孫の生産単一ヌクレオチド多型性を４匹の雄ブタと１６匹の雌ブタから生まれた２２１匹のＬａｎｄｒａｃｅブタおよび無関係のブタとの間の９種の交配から生まれた２９匹のＬａｒｇｅＷｈｉｔｅブタにおいて分析した。ＥＣＦ１８レセプターをコードするブタ遺伝子と選択された多型性遺伝子座間の連鎖の試験のための大量の有益な子孫を生産するために、型Ｂ／ｂｘｂ／ｂの有益なＬａｎｄｒａｃｅ交配のみが行われた。
７．コロニー形成試験 Bertschingerらの１９９３年の研究において、前記のＬａｎｄｒａｃｅブタはまた、コロニー形成試験において、ＥＣＦ１８感受性についても試験された。このため、離乳後短時間にブタに血清型Ｏ１３９：Ｋ１２（Ｂ）：Ｈ１：Ｆ１８のイー・コリ株１２４／７６の細菌を接種した（Rippingerら、1995）。細菌の糞流出を毎日モニターした。コロニー形成の範囲は、２つの最も高い糞のスコアの平均として算出した。６．７対数コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇ以上に相当する平均の糞スコア３．５を有するブタは、コロニー形成に対して感受性であるとみなされた。この限定は、該値以下では死亡率を欠くこと、および完全に耐性の同腹子から得られたスコアに基づく。
８．ヌクレオチド多型性の連鎖分析

ン・ビトロ接着アッセイにおいて同定されたＥＣＦ１８Ｒに関する印刷された

α−１−Ｂ−グリコプロテイン−（Ａ１ＢＧ）、リアノジンレセプター（ＲＹＲ１）、ＥＡＨ−およびＳ−遺伝子座に関する印刷されたデータと比較した。ペアの連鎖分析および組換え率の計算は、ＣＲＩ−ＭＡＰバージョン２．４プログラムを用いて行った（Greenら、1990）。多点連鎖分析は、前記の遺伝子座の地図への連続的挿入によって行った。ハプロタイプ頻度は、Ｌａｎｄｒａｃｅファミリーにおける親動物、および子孫の情報からＥＣＦ１８Ｒに関するハプロタイプであった８匹の親ＬａｒｇｅＷｈｉｔｅ動物から算出した。ＥＣＦ１８ＲとＦＵＴ１（ＦＵＴ１／Ｍ３０７）における変異（多型性）のテトラコリック相関は、全てのＬａｎｄｒａｃｅおよびＬａｒｇｅＷｈｉｔｅ子孫において算出された。

９．サザンブロット分析
酵素ＫｓｐＩ、ＥｃｏＲＩおよびＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩでの消化および０．８％アガロース上での分離後、コスミドＥＴＨｓ１、ＥＴＨｓ２およびＥＴＨｓ３のサザンブロット分析を行った。α³²ＰｄＡＴＰ標識した５’ＦＵＴ１フラグメント（プライマーＰ６−Ｐ１１）でのハイブリダイゼーションの結果、ＫｓｐＩ消化およびＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ消化の両方において同一のハイブリダイズ９４０ｂｐバンドを生じる。しかしながら、３’ＦＵＴ１フラグメント（プライマーＰ７−Ｐ１０）（表１）でのハイブリダイゼーションは、６．２ｋｂＫｓｐＩバンドおよび１．１ｋｂＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩバンドを示す。５’および３’ＦＵＴ１フラグメントの両方が同じ４．６ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントにハイブリダイズする。これは、コスミドＥＴＨｓ２に含有されるＦＵＴ１遺伝子におけるＫｓｐＩ部位の存在を示す。３’ＦＵＴ１フラグメントのクロスハイブリダイゼーションは、２．７ｋｂおよび８．２ｋｂバンドを検出し、その結果、ＦＵＴ２偽遺伝子（不完全ＯＲＦ）およびＦＵＴ２遺伝子配列を各々、同定する。

１０．制限フラグメント多型性ブタＦＵＴ１遺伝子における（Ａ）Ｍ３０７ＧからＡおよび（Ｂ）Ｍ８５７ＧからＡへの変異の検出は、種々の制限酵素を用いる制限長多型性分析によって達成された。ＣｆｏＩ（Ａ）およびＡｃｉＩ（Ｂ）を用いる増幅ＦＵＴ１フラグメントの消化により、制限フラグメント多型性が生じる。フラグメントの長さは塩基対で示される。（Ａ）Ｍ３０７^Ａ／Ａ遺伝子型は、３２８および９３ｂｐの制限フラグメントを生じるが、Ｍ３０７^Ｇ／Ｇ遺伝子型は９３、２４１および８７ｂｐのフラグメントを生じ、ヘテロ接合体Ｍ３０７^Ａ／Ｇ遺伝子型は４つのフラグメント全てを示す。

（Ｂ）Ｍ８５７^Ａ／Ａ遺伝子型の消化は、１７４ｂｐフラグメントを生じるが、Ｍ８５７^Ｇ／Ｇ遺伝子型においては１３６および３８ｂｐフラグメントを生じ、Ｍ８５７^Ａ／Ｇ遺伝子型においては３つのフラグメント全てを生じる。
１１．ブタの供給源ＳｗｉｓｓＬａｎｄｒａｃｅ実験的集団のデータは、チューリッヒ大学の獣医細菌学研究所（Institute of VeterinaryBacteriology，University ofZurich）で確立された２つの血統から由来した。ＬａｒｇｅＷｈｉｔｅ、ＳｗｉｓｓＬａｎｄｒａｃｅ、Ｄｕｒｏｃ、ＨａｍｐｓｈｉｒｅおよびＰｉｅｔｒａｉｎ品種の全ての他のブタは、スイスの異なる飼育群から由来した。他のブタは、米国中西部の農場から無作為に入手された。

図１は、本発明のブタα１→２フコシルトランスフェラーゼ多型性のヌクレオチド配列（ＦＵＴ１）（下段）および予測されるアミノ酸配列（上段）を１文字アミノ酸表記を用いて示す。アミノ酸配列の下の実線の二重線（＝）は、推定の膜貫通領域であり；アミノ酸配列の下の点線は、３つの可能性のあるＮ結合グリコシル化部位を示す。□は、耐性のブタにおいてグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されている場所である。＊は終止コドンを示す。アミノ酸残基の略号は、次の通りである。Ａ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；およびＹ，Ｔｙｒ。

Claims

ブタにおいて、ＦＵＴ１によって生成される炭水化物構造ＥＣＦ１８Ｒに結合し得るＥ．ｃｏｌｉによる腸コロニー形成に耐性であるブタを同定するための方法であって、該方法が以下：
ａ．遺伝子多型性が、該ブタからの生物学的サンプルにおいて存在するかどうかを決定する工程であって、該遺伝子多型性が３０７位にアデニンを有するＦＵＴ１多型性と対立遺伝子関連にある多型性である、工程；および
ｂ．該ブタが該ＦＵＴ１多型性、または該ＦＵＴ多型性と対立遺伝子関連にある多型性についてホモ接合体である場合に、該ブタが耐性であると推定する工程、
を包含する、方法。
ブタにおいて、ＦＵＴ１によって生成される炭水化物構造ＥＣＦ１８Ｒに結合し得る微生物によって生じる疾患に耐性であるブタを育種するための方法であって、該方法が以下：
ａ．Ｅ．ｃｏｌｉ関連腸疾患に耐性であるブタであるとそれらを同定する、遺伝子多型性についてホモ接合性またはヘテロ接合性である育種のためのブタを選択する工程であって、該遺伝子多型性が３０７位にアデニンを有するＦＵＴ１多型と対立遺伝子関連にある多型性である、工程；および
ｂ．該選択したブタを育種する工程、
を包含する、方法。
前記Ｅ．ｃｏｌｉがＦ１８株である、請求項１または２に記載の方法。
ＨＡＬ連鎖群の遺伝子座において多型性であるとしてさらに特徴付けられる、３０７位においてアデニンを有するα（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１多型性と対立遺伝子関連にある、多型性。
３０７位にアデニンを有するα（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１と対立遺伝子関連にある、単離されたＤＮＡ分子。