JP2001521401A - Ｆ１８イー・コリ関連疾患に対して遺伝学的に耐性のブタを同定する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、高レベルの感度および特異性で、Ｆ１８イー・コリ感染に関連する疾患に対して遺伝学的に感受性のブタと耐性のブタを区別するための非侵襲性の方法および組成物を提供する。ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１（ＦＵＴ１）遺伝子におけるＤＮＡ多型性を用いて、耐性のブタと感受性のブタを区別した。本発明は、イー・コリＦ１８−接着耐性、ヘテロ接合体（キャリアー）およびホモ接合体感受性のブタを区別するための、ヌクレオチド多型性によってコードされるアミノ酸置換を有するポリペプチド、分子診断アッセイおよびキットを包含する。分子試験は、浮腫疾患および離乳後の下痢に対する感受性を高い感度および特異性で同定し、それにより、ブタ飼育家にとって耐性を増幅するための努力に有用である。本発明の多型性における情報は、イー・コリ関連腸障害の原因の理解および治療を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｆ１８イー・コリ関連疾患に対して遺伝学的に耐性のブタを同定する方法および 組成物 イー・コリ（E．coli）関連疾患、特に、フィムブリエＦ１８を有するイー・ コリ細菌株に関連する腸疾患に対して遺伝学的に耐性のブタを同定するための組 成物および非侵襲性の方法を提供する。ブタアルファ（１，２）フコシルトラン スフェラーゼ（ＦＵＴ１）遺伝子におけるＤＮＡ多型性は、耐性のブタと感受性 のブタを区別し、ブタ飼育家に有用な診断試験を提供することが同定された。 ブタの飼育における主要な問題は、病気させないでそれらを維持することであ る。離乳後の腸疾患が特に問題である。限定数の血清型の毒性エシェリキア・コ リ（Escherichia（E.）coli）株は、ブタにおける浮腫疾患および離乳後の下痢 の病原体であり、世界中のブタ飼育農家において、特に４ないし１２週齢の子豚 の間で、深刻な経済的損失を引き起こす。浮腫疾患の典型的な臨床上の徴候は、 失調症、痙攣および麻痺のような神経学的サインである。死体解剖にて、浮腫は 、典型的に、まぶたおよび額、胃壁ならびに結腸間膜のような独特な部位に存在 する。該疾患は、エンテロ細胞（腸内細胞）の主要な形態学的変化をもたらすこ となく小腸表面にコロニーを形成するイー・コリによって、各々、生産されるシ ガ様毒素ＩＩ変異型およびエンテロトキシンＬＴ、ＳＴａ、ＳＴｂによって引き 起こされる。特定の型の細菌イー・コリ株、Ｆ１８、Ｆ４およびＫ８８は、この 点に関して、主要な致命的な元凶である。「ブタの浮腫疾患は、全身性の管損傷 によって特徴付けられるエンテロトキセミアである。後者は、特定のイー・コリ 株によって生産されるシガ様毒素ＩＩ変異型という毒素によって引き起こされる 。」（Bertschingerら、1993）。イー・コリは、それらの線毛の型によって識別 される。関連する一連の接着性フィムブリエを例えば、Ｋ８８またはＦ１８と称 する（Vogeliら、1997）。 全てのブタがイー・コリ感染で死ぬわけではない。コロニー形成は、例えば、 Ｋ８８またはＦ１８と称する細菌のフィムブリエによって媒介されるエンテロ細 胞への細菌の接着に依存する。接着に対して感受性、すなわち、フィムブリエを 結合するためのブタにおけるレセプターの発現は、宿主によって遺伝学的に制御 されていることが示され、それは、優性の特性として、Ｆ１８の場合、感受性対 立遺伝子であるＢおよび耐性対立遺伝子のｂによって受け継がれる（Vogeliら、 1996；Meijerinkら、1996）。該イー・コリＦ１８レセプター（ＥＣＦ１８Ｒ）の 遺伝子座は、染色体６上のハロセン（ＨＡＬ）連鎖群のＳ遺伝子座および他の遺 伝子座へのその密接な遺伝子連鎖に基づいて、ブタ染色体６（ＳＳＣ６）に位置 決定された。Ｋ８８イー・コリのレセプターは、染色体１３上にある。 耐性のメカニズムは、耐性動物における腸の縁がイー・コリによってコロニー 形成されない、すなわち、細菌が耐性のブタの腸壁に接着しないというようであ る。腸の刷子縁膜における糖タンパク質レセプターは、いくつかのイー・コリに 関連する接着および非接着表現型の間の相違の原因であり、それにより、宿主ブ タの遺伝子型が耐性を決定することが示された。フィムブリエを有する細菌もま た研究された（WO9413811）。 Ｆ１８イー・コリ関連疾患に対して耐性であるブタを同定する現行の方法は、 １）屠殺してブタから腸試料を収集し、顕微鏡接着試験を行うこと、２）毒性の イー・コリで動物を試験すること（「コロニー形成試験」）または３）Ａ−Ｏ（ Ｓ）血液型システムの血液型分類を行うことのいずれかである。最初の２つの方 法は、飼育用家畜として有用な耐性動物を同定するために特別のものではない。 血液型分類法は耐性動物を同定するけれども、該試験は、感受性の動物が感受性 に関してホモ接合体であるかまたはヘテロ接合体であるかを決定できない。これ らの対立遺伝子（遺伝子の状態）に関して、動物の遺伝子型の知見は、好結果の 飼育プログラムを発展させるために不可欠である。飼育プログラムの目的は、離 乳後に家畜の多くを殺すＦ１８イー・コリ関連疾患に対して耐性のブタを生産す ることである。 １の出版物において、著者らは、ブタにおける浮腫疾患に関して、「適当な遺 伝子マーカーの探求が進行中である・・・」と述べ（Bertschingerら、1993、87 ページ）、WalterおよびSellwoodら（1982）による： 耐性のブタを飼育することは、有効な予防ができない疾患を防止する魅力的 な方法である。この解決法の成否は、ブタ集団における耐性をコードする遺 伝子の普及率、耐性のブタを検出する改善された方法、および耐性と同時に 選択される反対の遺伝子特性の不在に依存するであろう。 という記載を引用した。 遺伝子「マーカー」座は、関連する遺伝子座に近接であるが、必ずしもその遺 伝子座そのものではないコーディングまたは非コーディング遺伝子座である。検 出可能な表現型は、連続または不連続の特性、例えば、制限長フラグメント多型 性、生産特性、細菌接着特性、比色または酵素反応および抗生物質耐性を包含す る。Ｓ遺伝子座は、ＡおよびＯ血液型抗原の発現を制御する。Ｓ遺伝子座で劣性 のホモ接合体のブタは、ＡまたはＯ血液型抗原のいずれをも発現しない。同様の 状態がヒトに存在し、ヒト血液型Ｈをコードするアルファ（１，２）フコシルト ランスフェラーゼ遺伝子における変異が原因である（Kellyら、1994;またWO9628 967も参照）。ブタのブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝 子は、近年、配列決定された（Cohneyら、1996）。該遺伝子は、まさしく、ブタ においてＳ遺伝子座に存在する遺伝子のようである。 血液型ＨおよびＳｅ遺伝子座は、遺伝学的および物理的にヒト染色体１９ｑ１ ３．３に位置決定された。該領域は、進化論的に保存され、ブタにおける遺伝子 のＨＡＬ連鎖群に対して相同の遺伝子を含有する。血液型Ｈをコードする遺伝子 はＦＵＴ１と呼ばれ、一方、Ｓｅ遺伝子はＦＵＴ２遺伝子と等価である。ＦＵＴ １は赤血球細胞系統においてＨ抗原発現を決定し、一方、ＦＵＴ２は分泌性上皮 および唾液においてＨ抗原の発現を調節する。ＦＵＴ１遺伝子の保存は、ラット およびウサギのような下等哺乳動物において示され、ｍＲＮＡ発現は、ウサギ脳 組織およびラット結腸において示された。これらの種の全てにおいて、２つの型 のアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヒトＦＵＴ１およ びＦＵＴ２遺伝子に構造的に非常に類似するが、特に、ＦＵＴ１相同遺伝子は種 特異的発現パターンを示すことが報告された。ヒトにおいて、ＦＵＴ１遺伝子は 、赤血球細胞の前駆体におけるＨ抗原の合成の原因である。しかしながら、ブタ において、赤血球は、ヒトＬｅｗｉｓ抗原の場合のように、受動的に血清由来の Ｈ様抗原を吸着する。ブタにおいて、全てのＨ様抗原は、外分泌を行う分泌組織 に 関連し、ＦＵＴ２（分泌型）遺伝子の発現は、他の動物種の分泌組織に見出され る。したがって、抗ヒト血液型ＨおよびＡ抗体と交差反応するブタＡ−Ｏ血液型 決定基の発現は、ＦＵＴ２遺伝子により影響を及ぼされるかもしれない。 血液型およびイー・コリブタ疾患についてのさらなる情報は、血液型抗原の炭 水化物構造がいくつかの病原性微生物の宿主組織への接着を媒介すること、例え ば、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）はＬｅｗｉｓ^b血液型抗原 に接着し、尿路感染症を引き起こすイー・コリは血液型Ｐ物質に接着することを 包含する。したがって、血液型特異的炭水化物構造の形成の原因であるグリコシ ルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、宿主による細菌のコロニー形成の 制御に関する遺伝子の候補である。これらの遺伝子の局在性は、ブタの小腸にお けるＦ１８陽性イー・コリの接着／非接着の原因となる遺伝子座と同じ染色体領 域にある。ブタは、離乳後、すなわち、Ｆ１８イー・コリによって引き起こされ る疾患に罹患しやすくなる時期まで、血液型抗原ＡおよびＯを発現しない。 ブタにおけるイー・コリ関連腸疾患のための診断および治療の新規な方法が必 要とされる。遺伝子変異の検出は、いくつかのブタの障害（悪性低体温症）の診 断試験として提案された（Fujiら、1991;米国特許第5,358,649号）が、診断用の 多型性マーカーは報告されなかった。イー・コリのコロニー形成に対する耐性を 発達させるためのワクチンは記載されたが（米国特許第5,552,144号；WO8604604 ）、生ワクチンを経口的に生まれたばかりのブタに投与するのは困難であるため 、また、規定の制限のため、イー・コリ疾患を防止するための好ましい方法では ないようである。抗生物質は治療に有用であるが、予防では成功しない。 発明の概要 本発明の組成物および非侵襲性の方法は、イー・コリ関連疾患に感受性のブタ の検出および排除を提供する。イー・コリＦ１８による腸内コロニー形成に対し て耐性のブタを同定するための非侵襲性の方法は、以下の工程：ブタ由来の生物 学的試料中、コロニー形成に対する耐性に関連する遺伝的多型性が存在するかど うかを決定し；ブタが多型性¹に関してホモ接合体である場合、ブタは耐性であ ると推断する工程を包含する。（¹ 多型性とは、変異のため集団内に存在する ヌクレオチド配列における変化のことである） より詳細には、該方法は、ブタ由来の生物学的試料中、ブタのアルファ（１， ２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子における位置３０７の窒素塩基がアデニ ンであるかグアニンであるかを決定し；位置３０７の唯一の窒素塩基がアデニン である場合、ブタを耐性として同定することである。 生物学的試料中で多型性が存在するかどうかを決定するために、制限フラグメ ント長多型性を分子量によってそれらを分離するゲル上で分析する。制限エンド ヌクレアーゼは、特異的部位で核酸分子を再現可能に切断し、切断の位置によっ て種々の分子量の核酸フラグメントを生じる酵素である。 本発明は、また、イー・コリ関連腸疾患に対して耐性のブタとして同定するア ルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子における遺伝的多型性を 有する飼育用ブタを選択し、選択したブタを飼育することによって、イー・コリ 関連疾患に対して耐性のあるブタを飼育する方法に関する。 本発明の態様は、ブタにおけるアルファ（１，２）フコシルトランスフェラー ゼ１遺伝子に関して多型性であり、特に図１記載の配列であるＤＮＡ分子である 。本発明の他の態様は、図１記載の配列に相補的なヌクレオチド配列を有する分 子である。 本発明の態様は、位置３０７においてグアニンの代わりにアデニンを有する単 離ＤＮＡ分子である。該分子は、また、位置８５７においてグアニンの代わりに アデニンを結合していてもよい。本発明の他の単離ＤＮＡ分子は、図１の配列の ヌクレオチド位置２２９に変異を有する分子である（ここに、コドンＣＴＴはＴ ＴＴに変化し、アミノ酸ロイシンのかわりにフェニルアラニンをコードする）。 ヌクレオチド位置７１４の変異は、ＧＡＴ→ＧＡＣであるが、コードされる生産 物にアミノ酸置換を伴わない。 本発明のＤＮＡ分子によってコードされ、アルファ（１，２）フコシルトラン スフェラーゼ活性を有するポリペプチドもまた、本発明の態様である。 ブタにおいてイー・コリＦ１８レセプターを検出するための分子アッセイは、 （ａ）ブタの有核細胞からＤＮＡを単離し；（ｂ）プライマーとしてブタアル ファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１のＤＮＡ配列に相補的なオ リゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＤＮＡを増 幅し；（ｃ）少なくとも１つの制限酵素、例えば、ＣｆｏＩで制限酵素消化を行 い；（ｄ）得られたフラグメントをゲル電気泳動により分離し；（ｅ）フラグメ ントの各数および長さを決定し；（ｆ）Ｆ１８のフラグメントの数および長さか ら、ブタの細胞中にレセプターが存在することを決定することである。ＤＮＡバ ンドは比較的低濃度のアガロースゲル上を移動することができるので、短鎖フラ グメントよりもむしろ、本明細書に開示される長鎖増幅フラグメントを制限酵素 フラグメント長多型性分析（ＲＦＬＰ）に使用することは、あまり費用がかから ない。また、フラグメントのいくつかを生産するために、たった１つの制限酵素 が可変診断部位に隣接する一定の制限部位に必要とされる。 イー・コリＦ１８レセプターに関連する多型性を検出するためのキットは、耐 性のブタと感受性のブタを区別するブタアルファ（１，２）フコシルトランスフ ェラーゼ遺伝子１のＤＮＡ配列に相補的な別々の容器中のオリゴヌクレオチドを 使用する。該試験は、何れの歳のブタでも行うことができる。 また、多型性は、イー・コリ関連疾患に罹患したブタを治療するための薬剤の 開発に有用である。ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼの変異 型は、正常な酵素を妨げ、Ｆ１８の腸内レセプターの生産を妨げる。 図面の簡単な説明 図１は、本発明のブタα１→２フコシルトランスフェラーゼ多型性のヌクレオ チド配列（ＦＵＴ１）（下段）および予測されるアミノ酸配列（上段）を１文字 アミノ酸表記を用いて示す。アミノ酸配列の下の実線の二重線（＝）は、推定の 膜貫通領域であり；アミノ酸配列の下の点線は、３つの可能性のあるＮ結合グリ コシル化部位を示す。 □は、耐性のブタにおいてグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されている 場所である。 ＊は終止コドンを示す。 アミノ酸残基の略号は、次の通りである。Ａ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓ ｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙ ｓ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒ ｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖｌａ；Ｗ，Ｔｒｐ；およびＹ，Ｔｙｒ。 好ましい具体例の記載 イー・コリ関連疾患に対するブタの耐性に関連するＤＮＡ多型性の分子分析は 、飼育用の耐性ブタを選択するための診断アッセイを容易にした。耐性のブタは 、本発明の多型性マーカーによって同定されるように、イー・コリＦ１８レセプ ター遺伝子座にて感受性のブタと異なる。 本発明は、高レベルの感度および特異性で、Ｆ１８イー・コリ感染に関連する 疾患に遺伝学的に感受性のブタと耐性のブタを区別するための非侵襲性の方法お よび組成物を提供する。ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ（ ＦＵＴ１）遺伝子におけるＤＮＡ多型性は、耐性のブタと感受性のブタを区別す るものとして同定された。多型性は、新規な対立遺伝子を導くヌクレオチド配列 における変異（変化）によって生じた。対立遺伝子は、遺伝子の状態である。集 団において、おそらく先祖のＤＮＡ分子における変異によって引き起こされた窒 素塩基置換によって異なる遺伝子の多くの対立遺伝子が存在し得る。１以上の対 立遺伝子の１集団内における共存（ときどき、「変異型」という）は、遺伝学的 多型性と呼ばれる。そこに１以上の対立遺伝子が明らかに集団の安定な構成要素 として存在し得る遺伝子座は、多型性遺伝子座である。通常、多型性遺伝子座の １つは低い頻度で集団内に存在する。 生物学的試料、好ましくは血液から決定する場合、耐性のブタは、それらのゲ ノムにおいて、ヌクレオチド配列の位置３０７（図１参照）にて検出される唯一 の塩基がアデニンであるが、ホモ接合体の感受性のブタにおける同じ位置の塩基 はグアニンである多型性を有する。ヘテロ接合体のブタは、両方の型のＤＮＡを 示し、感受性であろう。多型性は、ブタ遺伝子配列の変異型である（Cohneyら、 1996）。 遺伝子連鎖分析をブタのファミリーにおいて行い、異系交配したブタにおいて ＦＵＴ１における多型性と疾患耐性の間の遺伝学的関連を決定した。本発明によ ると、多型性は、アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子（Ｆ ＵＴ１）において見出された。単一のヌクレオチド塩基置換を位置３０７に有す る多型性を用いて、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子とＳ−システム、ＥＣＦ １８Ｒ遺伝子座およびＨＡＬ連鎖群の他の遺伝子座の間の密接な連鎖を確立した 。 ＦＵＴ１の変異とＥＣＦ１８Ｒの密接な連鎖の検出により、イー・コリＦ１８ 接着耐性、ヘテロ接合体（キャリアー）およびホモ接合体の感受性のブタの同定 のための分子試験が発展した。該診断試験は、高い感度および特異性で、浮腫疾 患および離乳後の下痢に感受性のブタを同定する。本発明の多型性の発生率は、 ブタの品種の間で異なる。Vogeliら(1997)は、お互いに無関係の群由来の５種類 のブタの品種におけるＭ３０７対立遺伝子の頻度を提示した。本発明の多型性に ついての診断試験の有効性は、それらのブタ群由来のＥＣＦ１８Ｒ感受性対立遺 伝子を有効に排除する機会を有し、それにより、浮腫疾患および離乳後の下痢を 引き起こすイー・コリＦ１８細菌性接着のための先行条件を排除する品種を提供 する。 本発明は、さらに、ｂｐ３０７で種々の多型性を示すアルファ（１，２）フコ シルトランスフェラーゼ遺伝子１の配列の変異型であるヌクレオチド配列および アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子における多型性を同定す るための診断的な分子に基づくキットを包含する。 イー・コリＦ１８レセプター遺伝子座（ＥＣＦ１８Ｒ）についての候補遺伝子 を得るために、アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ １およびＦＵＴ２（Meijerinkら、1997）を用いて、その遺伝子を含有する５つ のコスミドおよび１つのゲノムクローンをブタゲノムライブラリーから単離した 。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるマッピングは、これらの全 てのクローンをブタ染色体６のバンドｑ１１（ＳＳＣ６ｑ１１）に位置決定した 。コスミドの配列分析は、（ａ）ヒトＦＵＴ１配列に対し８２．３％同一である 、１０９８塩基対の長さのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、およ び（ｂ）ヒトＦＵＴ２配列に対し８５％同一である、１０２３塩基対の長さの第 ２のＯＲＦという特徴を決定した。したがって、ＦＵＴ１およびＦＵＴ２遺伝子 座は、ヒト血液型Ｈおよび分泌型遺伝子座のブタ等価物であるようである。Ｆ１ ８ フィムブリエを有するイー・コリ（ＥＣＦ１８Ｒ）による接着およびコロニー形 成に感受性または耐性のいずれかのブタにおける２つのＯＲＦの直接配列決定は 、ＦＵＴ１ＯＲＦの塩基対３０７（Ｍ３Ｏ７）および塩基対８５７（Ｍ８５７） にて２つの多型性を示した。ヌクレオチド位置は、ＡＴＧ（メチオニンをコード する）から数えられた。２２１種の子孫を有するＬａｎｄｒａｃｅファミリーの ３４種の交配におけるこれらの変異の分析は、小腸におけるイー・コリＦ１８接 着およびコロニー形成に対する耐性および感受性を制御する遺伝子座（ＥＣＦ１ ８Ｒ）、および血液型インヒビターＳの遺伝子座との密接な連鎖を示した。した がって、Ｍ３０７変異は、イー・コリＦ１８接着耐性動物のマーカーに援助され る選択のための良好なマーカーである。ヌクレオチド位置２２９における別の変 異は、ロイシンをコードするコドン（ＣＴＴ）がＴＴＴ（フェニルアラニンをコ ードする）に変化した多型性を導くことが見出された。位置７１４での変異（Ｇ ＡＴ→）ＧＡＣ）（アスパラギン酸をコードする）は、アミノ酸置換を生じなか った。感受性のブタと耐性のブタを区別する多型性は、ＦＵＴ２において同定さ れなかった。 実施例 以下の実施例は本発明の具体例を提供する。 実施例１：耐性のブタについてのアッセイ 本発明の多型性は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験を用いて容易に同定される。ブタア ルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１の１６０ｂｐフラグメントを用 いた試験の１具体例は、ＰＣＲを用いて、以下のプライマー；５’ＣＣＡＡＣＧ ＣＣＴＣＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴ３’および５’ＧＴＧＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧ ＧＡＴＧＡ３’で増幅した。該具体例の好ましいＰＣＲ条件は、以下の時間およ び温度での２５サイクルである：９４℃、３０秒；６０℃、４５秒；７２℃、９ ０秒。耐性のブタ由来の増幅ＤＮＡは制限酵素Ｈｇａｌによって消化されたが、 制限酵素ＨｉｎＰＩによって消化されなかった。ホモ接合体感受性のブタ由来の 増幅ＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎＰＩによって消化された。ヘテロ接合体感受性の ブタ由来の増幅ＤＮＡは、両方の酵素によって部分的に消化された。 別法では、標準的手法にしたがって、ＤＮＡをブタの有核細胞から単離した。 異なるＥＣＦ１８Ｒ遺伝子型（Ｂｂ，ｂｂ）の動物におけるブタＦＵＴ１および ＦＵＴ２配列ならびにそれらのフランキング領域の直接配列決定により、ＦＵＴ １ ＯＲＦの位置３０７および８５７にて２つのＧ→Ａ転位（各々、Ｍ３０７お よびＭ８５７という）を同定した。Ｍ３０７転位は、ＣｆｏＩの１つの制限部位 を削除する。ブタ有核細胞から単離したＤＮＡの増幅は、標準的な手法にしたが って、プライマーＰ６およびＰ１１を用いて行った（９５℃で３分、次いで、９ ５℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で３０秒を３０サイクル、次いで、 ７２℃で７分の最終的な伸長反応）後、ＣｆｏＩ消化を行い、３％アガロースゲ ル上で分離した結果、制限酵素断片長多型性（ＲＦＬＰ）を得た。ホモ接合体Ｍ ３０７^AA動物は、２つのバンドを示した。ホモ接合体Ｍ３０７^GG動物は、９３、 ２４１および８７ｂｐフラグメントを示した。ヘテロ接合体動物は、４つのフラ グメント全てを示した。 実施例２：Ｆ１８イー・コリに対して耐性のブタの検出におけるアルファ（１ ，２）フコシルトランスフェラーゼを用いるアッセイの感度および特異性 研究は、疾患耐性とＦＵＴ１遺伝子の位置３０７における多型性との関連を決 定するために行った。１８３匹の離乳したブタ（歳２−６月の範囲）を６つの異 なる飼育群から得た。これらの群のたった１つが、該研究を始める前に耐性の動 物を含むことが知られており、該群は、ブタストレス症候群の高い発病率を有す ることが知られている。他の５つの群は、ブタストレス症候群の形跡がなく、疾 患耐性の発生率は知られていなかった。各群由来のブタを無作為に選択し、人道 的に安楽死させ、脾臓および小腸の試料を取り出した。ＤＮＡを脾臓組織から抽 出し、実施例１に記載のＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイにおいて使用した。粘膜表面 を腸から削り取ることによって腸細胞を精製し、低張性のＥＤＴＡ溶液中で細胞 を溶菌し、遠心分離によって洗浄した。精製した腸細胞刷子縁をＦ１８イー・コ リと共にインキュベートした。該混合物を位相差顕微鏡によって調べた。該アッ セイは、ブタが感受性であるか（腸試料が接着細菌を有した）、または耐性であ るか（腸試料が接着細菌を有さなかった）を決定した。多型性についてのＰＣＲ −ＲＦＬＰアッセイは、５３匹の耐性のブタのうち５３匹および１３０匹の感受 性のブタのうち１２８匹において細菌−腸細胞結合アッセイに相関した。細菌− 腸細胞結合アッセイを用いて感受性であると決定された２匹のブタは、ＰＣＲ− ＲＦＬＰアッセイを用いて耐性であると不正確に予測された。試験された６つの 群のうち２つは耐性のブタを含んだが、１つの群だけがブタストレス症候群を有 し、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイはブタストレス症候群を有さない動物において疾 患耐性の動物を同定できることを明らかにした。 実施例３：染色体６（ＳＳＣ６）上でのＦＵＴ１の局在性 プライマーＰ７およびＰ１０を用いてブタゲノムＤＮＡから得られたＦＵＴ１ ヌクレオチドプローブでコスミドライブラリーをスクリーニングした後、コスミ ドＥＴＨｓ１、−ｓ２、−ｓ３、−ｓ４および−ｓ６を同定し、ＦＩＳＨおよび ＤＩＳＣ−ＰＣＲによってバンドｑ１１における染色体６に位置決定した。 実施例４：ブタＦＵＴ１ＯＲＦの同定 サザンブロット分析の場合、ＫｓｐＩ、ＥｃｏＲＩおよびＫｓｐＩ／ＥｃｏＲ Ｉコスミド消化物と放射能標識したブタＦＵＴ１フラグメントＰ６−Ｐ１１およ びＰ７−Ｐ１０がハイブリダイズして、ＥＴＨｓ２、−ｓ４および−ｓ６につい て同一のオートラジオグラフィーシグナルを示し、一方、コスミドＥＴＨｓ１お よび−ｓ３からは異なるシグナルが得られた。コスミドＥＴＨｓ２ ＫｓｐＩか ら、サブクローン９４０ｂｐおよび６．２ｋｂの長さが単離され、それは、サザ ンブロットにおいてハイブリダイズするＫｓｐＩフラグメントの見積もりの長さ に相当した。２つのサブクローンの配列決定の結果を合わせると１５０１ｂｐ配 列になり、それはゲノムＰＣＲ産物の直接配列決定の結果と一致した。１５０１ ｂｐ配列は、８２．３％のヌクレオチドおよび８０．８％のアミノ酸同一性でヒ トＦＵＴ１ ＯＲＦに相当する１０９８ｂｐのオープン・リーディング．フレー ム（ＯＲＦ）を含有する。ＯＲＦは、ポリペプチドをコードする。 実施例５：ブタＦＵＴ２および偽遺伝子ＦＵＴＰの同定 ＥＴＨｓ１は、ＦＵＴ１配列にハイブリダイズする１つのＤＮＡフラグメント （２．７ｋｂ）を有するが、ＥＴＨｓ３は２つ（２．７ｋｂおよび８．２ｋｂ） を有する。ＥＴＨｓ１および−ｓ３の２．７ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントのサブ クローニングおよび部分的配列決定により、これらの２つのフラグメントが同一 であることを確認した。該配列は、ヒトＦＵＴ２に非常に類似するが、ＮＨ₂− および−ＣＯＯＨ末端領域において数個の変化を示す。これらの変化は、保存Ｏ ＲＦと矛盾するフレームシフトを導くので、２．７ｋｂフラグメントから得られ る配列は偽遺伝子（ＦＵＴ２Ｐ）を示すという仮説が成り立つ。ＥＴＨｓ３ Ｂ ａｍＨＩ消化物のサブクローニング後、８．２ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントに 含有されるハイブリダイズする配列を同定した。得られたサブクローンの配列は 、１０２３ｂｐ ＯＲＦを示し、ヒトＦＵＴ２配列に対してヌクレオチドレベル で８５％およびアミノ酸レベルで８３％同一である。ＮＨ₂−および−ＣＯＯＨ 末端領域における多くの相違が、ブタＦＵＴ２配列と２．７ｋｂフラグメント由 来のＦＵＴ２Ｐ配列の間に観察された。予測アミノ酸配列は、ブタ分泌型酵素の 部分的に決定されたアミノ酸配列に相当する（ThurinおよびBlaszczyk-Thurin、 1995）。得られたブタＦＵＴ１、ＦＵＴ２およびＦＵＴＰ配列をＧｅｎＢａｎｋ に提出し、各々、受託番号Ｕ７０８８３、Ｕ７０８８１およびＵ７０８８２を得 た。ＦＵＴ１およびＦＵＴ２遺伝子は、非常に相同性の配列を有する。これは、 例えば、プライマー開発において考慮されなければならない。さらに、ＦＵＴ１ およびＦＵＴ２酵素活性は、さらなる研究において区別されなければならない。 実施例６：Ｍ３０７およびＭ８５７変異の同定およびＭ３０７のキャラクタリ ゼーション 標準的手法にしたがって、ブタの有核細胞からＤＮＡを単離した。異なるＥＣ Ｆ１８Ｒ遺伝子型（Ｂｂ、ｂｂ）の動物におけるブタＦＵＴ１およびＦＵＴ２配 列ならびにそれらのフランキング領域の直接配列決定は、ＦＵＴ１ＯＲＦの位置 ３０７および８５７にて２つのＧ→Ａ転位（各々、Ｍ３０７およびＭ８５７とい う）を同定した。Ｍ３０７転位は、酵素ＣｆｏＩの１つの制限部位を削除する。 ブタの有核細胞から単離したＤＮＡの増幅は、標準的な手法にしたがって、プラ イマーＰ６およびＰ１１を用いて行った（９５℃で３分、次いで、９５℃で３０ 秒、５６℃で３０秒および７２℃で３０秒を３０サイクル、次いで、７２℃で７ 分の最終的な伸長反応）後、ＣｆｏＩ消化を行い、３％アガロースゲル上で分離 した結果、制限酵素断片長多型性（ＲＦＬＰ）を得た。ホモ接合体Ｍ３０７^AA動 物は、２つのバンド（９３−および３２８−ｂｐフラグメント）を示した。ホモ 接合体Ｍ３０７^GG動物は、８７−、９３−および２４１ｂｐフラグメントを示し た。ヘテロ接合体動物は、４つのフラグメント全てを示した。 実施例７：変異Ｍ８５７のキャラクタリゼーション Ｍ８５７変異は、１つのＡｃｉＩ部位を削除する転位である。２つの付加的な ＡｃｉＩ部位を位置８６６および８７２で不正対合するように、プライマーＰＢ ＥＳＴを設計した。プライマーＰ７およびＰＢＥＳＴを用いるＰＣＲ（９５℃で ３分、次いで、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で３０秒を３０サ イクル、次いで、７２℃で最終的な伸長反応を７分）、次いで、ＡｃｉＩ消化を 行い、３％アガロースゲル上でＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析を行った。ホモ接合体Ｍ８ ５７^AA動物は、１７４ｂｐフラグメントを示したが、Ｍ８５７^GGの増幅産物は、 １３６−および３８−ｂｐフラグメントを示した。 実施例８：ＦＵＴ１遺伝子の遺伝子マッピング Ｌａｎｄｒａｃｅブタファミリーにおいて、Ｍ３０７とＨＡＬ連鎖群（Ｓ、Ｅ ＣＦ１８Ｒ、ＲＹＲ１、ＧＰ１、ＰＧＤ）の遺伝子座との間の組換えは、組換え 率（fraction）θ＜０．０４を示した（表２）。全組換え率についてのロッドス コアＺは、２４．５〜５０．６であり、これらの遺伝子座間の連鎖の強力な証拠 を示す。これらのデータは、ＦＵＴ１によりどちらも影響を及ぼされるＳおよび ＥＣＦ１８Ｒにきわめて近接して、ＨＡＬ連鎖群にＦＵＴ１遺伝子を遺伝子マッ ピングさせる。実験的Ｌａｎｄｒａｃｅファミリーにおいて、対立遺伝子関連が ＥＣＦ１８ＲとＲＹＲ１の間に見出された。ＲＹＲ１における位置１８４３の過 剰な遺伝子型ＲＹＲ１^TT（ハロセン感受性遺伝子型）は、浮腫疾患および離乳 後の下痢に対して耐性のブタ（遺伝子型ＥＣＦ１８Ｒ^b/b）の間で観察された（ 表３）。該対立遺伝子関連は、連鎖不均衡、すなわち、観察されたハプロタイプ 頻度の対立遺伝子の独立の組み合わせ下で予想されるハプロタイプ頻度からのず れの結果である。したがって、連鎖不均衡は、連鎖した遺伝子座に属する対立遺 伝子の無作為でない関連を示す。しかしながら、低組換え率のため、他より有意 に良いと決定できた遺伝子座規則はなかった。 実施例９：Ｍ３０７^AとＥＣＦ１８^bおよびＭ３０７^GとＥＣＦ１８Ｒ^Bとの関連 Ｌａｎｄｒａｃｅ（ＳＬ）およびＬａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ（ＬＷ）親ブタにお いて、ＥＣＦ１８Ｒ^b（浮腫および離乳後の下痢耐性対立遺伝子）は、Ｍ３０７^A に１００％関連し、ＥＣＦ１８Ｒ^B（浮腫および離乳後の下痢感受性対立遺伝子 ）はＭ３０７^Gに１００％関連する（ここに、Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン）。 ＳＬブタにおいて、８８％（３０／３４）のＳ^sが各々、全てのＥＣＦ１８Ｒ^bお よびＭ３０７^Aハプロタイプの原因であった。Ｌａｒｇ ＷｈｉｔｅブタおけるＳ^S −ＥＣＦ１８Ｒ^bおよびＳＳ−Ｍ３０７^Aの両方についての対応する値は、８２ ％（９／１１）であった。実験的ＳＬファミリーにおいて、ＦＵＴ１遺伝子座で のＭ８５７^A対立遺伝子の出現率は低く、ＬＷブタにおいては存在さえしなかっ た。したがって、有意な配偶子の関連は、Ｍ８５７の対立遺伝子およびフランキ ング遺伝子の対立遺伝子との問では観察されなかった。位置ＦＵＴ１ ３０７お よびＦＵＴ１ ８５７でのＧ→Ａ転位は、Ｄｕｒｏｃ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅおよ びＰｉｅｔｒａｉｎブタにおいても種々の頻度で見出され、それらの転位は他の ブタ品種においても起こるようであった。 実施例１０：ＦＵＴ１遺伝子型の分布 表４は、ＥＣＦ１８Ｒ型の間のヌクレオチド位置３０７におけるＦＵＴ１遺伝 子型の分布が、２つの独立した仮説の下に予測された比率と有意に異なったこと を示す。１１９匹の浮腫疾患および離乳後の下痢に耐性のＥＣＦ１８Ｒ^b/b動物 のうち１１８匹がＤＮＡに基づく試験において、遺伝子型Ｍ３０７^AAを有する と決定された。１匹の耐性動物は、遺伝子型Ｍ３０７^A/Gを有した。１３１匹の 感受性のブタのうち１３０匹がＭ３０７^A/GまたはＭ３０７^G/Gであった。 イー・コリ接着に対して感受性の１匹の動物が、ＤＮＡ試験によってホモ接合体 Ｍ３０７^A/Aであることが示された。該実施例および実施例２由来のデータは、 過去の研究と一緒に、ＦＵＴ１遺伝子がブタにおけるＳ遺伝子座およびＥＣＦ１ ８遺伝子座に存在する遺伝子であることを示唆した。該実施例および実施例２に おいて４匹の動物が該ハプロタイプを否定するが、これらの動物は疾患耐性／感 受性に関して不正確に表現されたようである。 実施例１１：アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼにおけるアミノ 酸交換 アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１のｂｐ＋３０７およ びｂｐ＋８５７でのＧ→変化は、各々、コード産物に機能的な結果を有し得るア ラニン（中性−非極性）の代わりにスレオニン（中性−極性）、およびアルギニ ン（塩基性）のかわりにグルタミン（中性−極性）の予測アミノ酸置換を生じる 。ｂｐ２２９のＡＣ→Ｔ変化は、フェニルアラニン（中性−非極性）の代わりに ロイシン（中性−非極性）のアミノ酸置換を生じる。表１： 正方向（Ｆ）および逆方向（Ｒ）プライマーの配列およびブタＦＵＴ１お よびＦＵＴ２開始コドンに対するそれらの相対位置² 2 プライマーＦＵＴ１ Ｐ１０およびＦＵＴ１ Ｐ１１はヒトＦＵＴ１遺伝子由 来である。表２： Ｌａｎｄｒａｃｅ実験集団におけるＭ３０７およびＨＡＬ連鎖群の遺伝子 座に対する全組換え率（θ）、ロッドスコア（Ｚ）および有益な動物の数（Ｎ） 表３：Ｌａｎｄｒａｃｅ（ＳＬ）実験集団および無作為に選択したＬａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ（ＬＷ）ブタにおける４つの遺伝子座（Ｓ−ＦＵＴ−１（Ｍ３０７， Ｍ８５７）−ＥＣＦ１８Ｒ−ＲＹＲ１）でのハプロタイプ頻度 ³ Ｓ：ＡおよびＯ血液型のサプレッサー遺伝子座（Ｓおよびｓ）。 ＦＵＴ１（Ｍ３０７）：アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵ Ｔ１）遺伝子のヌクレオチド３０７でのアデニン（Ａ）〜グアニン（Ｇ）の改変 。ＦＵＴ１（Ｍ８５７）：ＦＵＴ１遺伝子のヌクレオチド８５７のアデニン（Ａ ）〜グアニン（Ｇ）の改変。ＥＣＦ１８Ｒ：イー・コリＦ１８レセプター。優性 感受性対立遺伝子はＢによって示され、耐性対立遺伝子はｂによって示される。 ＲＹＲ１：骨格筋リアノジンレセプター。Ｃ（シトシン）は悪性高体温の優性耐 性対立遺伝子であり、Ｔ（チミジン）は感受性対立遺伝子である。⁴ ％にぉけるハプロタイプ頻度および括弧内はハプロタイプの無名数。表４： Ｌａｎｄｒａｃｅ（ＳＬ）実験集団および無作為に選択したＬａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ（ＬＷ）ブタにおける、関連する多型性ＦＵＴ１（Ｍ３０７）および ＥＣＦ１８Ｒ遺伝子座の遺伝子型の分布、テトラコリック相関（Ｒ）および関連 の有意度（ｘ²およびｗ×ｘ²） ⁵ ｗ＝０．２（ＳＬ）および０．４（ＬＷ）の重量因子をCotterman（1947）に したがって、データ中における関連動物に包含される精度の欠落の補正に適用し た。＊＊＊ｐ＜０．００１。⁶ ＥＣＦ１８Ｒ遺伝子座で遺伝子型ｂ／ｂの動物は耐性であり、遺伝子型Ｂ／ ｂおよびＢ／Ｂの動物はＦ１８ａｂイー・コリ細菌の接着に対して感受性である 。 方法 １．プライマー ヒトＦＵＴ１遺伝子由来のプライマーをゲノムＤＮＡ由来のそのブタ相対物の 増幅に用いた。得られたブタ配列から、特異的プラマーを設計し、さらなる増幅 および配列決定反応に用いた（表１）。 ２．ブタゲノムライブラリーのスクリーニング ブタゲノムライブラリーをプライマーＰ７およびＰ１０で得られたブタＦＵＴ １プローブまたはブタＦＵＴ１ ｃＤＮＡを用いてスクリーンした。Ｓｕｐｅｒ ｃｏｓＩ（Stratagene，La Jolla，Ca，USA）において構築されたブタゲノムラ イブラリーを、プライマーＰ７およびＰ１０を用いてブタゲノムＤＮＡから得ら れたａ³²Ｐ ＡＴＰ標識した（Prime It II，Stratagene）ＦＵＴ１プローブを用 いてスクリーンした。４０℃で１５時間のレプリカフィルターのハイブリダイゼ ーション（５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ、５ｘデンハーツ、０．５％ＳＤＳ 、０．１ｇ／ｍｌサケ精液）および６５℃で３０分間の２度の洗浄（１ｘＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ）の後、Ｘ線フィルムに曝露（１５時間、−８０℃）後、陽性 コロニーを同定した。 ３．ブタ中期染色体のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション コスミドクローンＥＴＨｓ１、ＥＴＨｓ２、ＥＴＨｓ３、ＥＴＨｓ４およびＥ ＴＨｓ６をブタ中期上で、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳ Ｈ）（Solinas Toldoら、1993）または直接的ｉｎ ｓｉｔｕ染色体ＰＣＴ（ＤＩ ＳＣ ＰＣＲ）に付した。中期染色体は、ハイブリダイゼーション前にＱバンド 染色し、写真に撮った。ビオチン−１６−ｄＵＴＰを用いるランダムプライミン グによって、プローブを標識した。アビジン−ＦＩＴＣおよびビオチン化抗アビ ジンを用いて、シグナル検出および増幅を行った。染色体は、４，６−ジアミノ −２−フェニルインドールで対比染色し、コスミドの相対位置をSolinas Toldo ，1993に記載のように決定した。 ４．サブクローニング プローブ陽性ゲノムコロニーの酵素消化物をアガロースゲル上で分離し、ナイ ロン膜上に転写し、プローブ陽性バンドをＦＵＴ１配列決定のためにプラスミド 中でサブクローン化した。該方法から得られたＦＵＴ１の配列を図１に示す。 全コスミドのＫｓｐＩ−、ＥｃｏＲＩ−およびＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ消化物を ０．８％アガロースゲル上で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎナイロン膜上に転写した （Meijerinkら、1997）。該ブロットをα³²Ｐｄ ＡＴＰ標識したブタＦＵＴ１ ＰＣＲ産物（プライマーＰ６−Ｐ１１およびＰ７−Ｐ１０）でハイブリダイズし た。オートラジオグラフィーのシグナルに基づいて、ＥＴＨｓ１、−ｓ２および −ｓ３をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Stratagene）中のさらなるサブク ローニングに付し、ＦＵＴ配列をサブクローンから決定した。コスミドＥＴＨｓ ２および−ｓ３から得られた２つのＦＵＴ−様オープン・リーディング・フレー ム（ＯＲＦ）の配列（ＦＵＴ１およびＦＵＴ２）をＰＣＲ産物の直接配列決定に よって、ＥＣＦ１８Ｒ陽性（ＢＢ／Ｂｂ）および陰性（ｂｂ）動物において比較 した。 ５．ポリメラーゼ連鎖反応および直接配列決定 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉ ｎａｔｏｒキット（Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT，USA）および１０ピコモ ルのプライマーを用いて、最初の変性９５℃で５分、次いで、９５℃で３０秒、 ５０℃で１５秒および６０℃４分を２５サイクルからなる温度プログラムでサイ クル配列決定を行った。ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺 伝子の増幅および配列決定に用いられたプライマーを表１に列記する。付加的な プライマーは、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２およびＦＵＴ２偽遺伝子の高い類似性のため 、プライマーの交差アニーリングの可能性を考慮して設計された。試料は、３７ ３Ａ ＡＢＩシークエンサー（Applied Biosystems Inc.）上で分析し、ＧＣＧパ ッケージ（Devereux，1984）を用いて配列分析を行った。 ６．有益な子孫の生産 単一ヌクレオチド多型性を４匹の雄ブタと１６匹の雌ブタから生まれた２２１ 匹のＬａｎｄｒａｃｅブタおよび無関係のブタとの間の９種の交配から生まれた ２９匹のＬａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅブタにおいて分析した。ＥＣＦ１８レセプター をコードするブタ遺伝子と選択された多型性遺伝子座間の連鎖の試験のための大 量の有益な子孫を生産するために、型Ｂ／ｂｘｂ／ｂの有益なＬａｎｄｒａｃｅ 交配のみが行われた。 ７．コロニー形成試験 Bertschingerらの１９９３年の研究において、前記のＬａｎｄｒａｃｅブタは また、コロニー形成試験において、ＥＣＦ１８感受性についても試験された。こ のため、離乳後短時間にブタに血清型Ｏ１３９：Ｋ１２（Ｂ）：Ｈ１：Ｆ１８の イー・コリ株１２４／７６の細菌を接種した（Rippingerら、1995）。細菌の糞 流出を毎日モニターした。コロニー形成の範囲は、２つの最も高い糞のスコアの 平均として算出した。６．７対数コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇ以上に相当す る平均の糞スコア３．５を有するブタは、コロニー形成に対して感受性であると みなされた。この限定は、該値以下では死亡率を欠くこと、および完全に耐性の 同腹子から得られたスコアに基づく。 ８．ヌクレオチド多型性の連鎖分析 ン・ビトロ接着アッセイにおいて同定されたＥＣＦ１８Ｒに関する印刷された α−１−Ｂ−グリコプロテイン−（Ａ１ＢＧ）、リアノジンレセプター（ＲＹＲ １）、ＥＡＨ−およびＳ−遺伝子座に関する印刷されたデータと比較した。ペア の連鎖分析および組換え率の計算は、ＣＲＩ−ＭＡＰバージョン２．４プログラ ムを用いて行った（Greenら、1990）。多点連鎖分析は、前記の遺伝子座の地図 への連続的挿入によって行った。ハプロタイプ頻度は、Ｌａｎｄｒａｃｅファミ リーにおける親動物、および子孫の情報からＥＣＦ１８Ｒに関するハプロタイプ であった８匹の親Ｌａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ動物から算出した。ＥＣＦ１８ＲとＦ ＵＴ１（ＦＵＴ１／Ｍ３０７）における変異（多型性）のテトラコリック相関は 、全てのＬａｎｄｒａｃｅおよびＬａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ子孫において算出され た。 ９．サザンブロット分析 酵素ＫｓｐＩ（１、４、７）、ＥｃｏＲＩ（２、５、８）およびＫｓｐＩ／Ｅ ｃｏＲＩ（３、６、９）での消化および０．８％アガロース上での分離後、コス ミドＥＴＨｓ１（１−３）、ＥＴＨｓ２（４−６）およびＥＴＨｓ３（７−９） のサザンブロット分析を行った。α³²ＰｄＡＴＰ標識した５’ＦＵＴ１フラグメ ント（プライマーＰ６−Ｐ１１）でのハイブリダイゼーションの結果、ＫｓｐＩ 消化（レーン４）およびＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ消化（レーン６）の両方におい て同一のハイブリダイズ９４０ｂｐバンドを生じる。しかしながら、３’ＦＵＴ １フラグメント（プライマーＰ７−Ｐ１０）（表１）でのハイブリダイゼーショ ンは、レーン４における６．２ｋｂ ＫｓｐＩバンドおよびレーン６における１ ．１ｋｂ ＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩバンドを示す。５’および３’ＦＵＴ１フラグ メントの両方がレーン５において同じ４．６ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントにハイ ブリダイズする。これは、コスミドＥＴＨｓ２に含有されるＦＵＴ１遺伝子にお けるＫｓｐＩ部位の存在を示す。３’ＦＵＴ１フラグメントのクロスハイブリダ イゼーションは、２．７ｋｂ（レーン２、３、８および９）および８．２ｋｂ（ レーン８および９）バンドを検出し、その結果、ＦＵＴ２偽遺伝子（不完全ＯＲ Ｆ）およびＦＵＴ２遺伝子配列を各々、同定する。 １０．制限フラグメント多型性 ブタＦＵＴ１遺伝子における（Ａ）Ｍ３０７ＧからＡおよび（Ｂ）Ｍ８５７Ｇ からＡへの変異の検出は、種々の制限酵素を用いる制限長多型性分析によって達 成された。ＣｆｏＩ（Ａ）およびＡｃｉＩ（Ｂ）を用いる増幅ＦＵＴ１フラグメ ントの消化により、制限フラグメント多型性が生じる。最初のレーンは１００ｂ ｐマーカーである。フラグメントの長さは塩基対で示される。（Ａ）Ｍ３０７^{A/ A} 遺伝子型（レーン２）は、３２８および９３ｂｐの制限フラグメントを生じる が、Ｍ３０７^G/G遺伝子型（レーン４）は９３、２４１および８７ｂｐのフラグ メントを生じ、ヘテロ接合体Ｍ３０７^A/G遺伝子型（レーン３）は４つのフラグ メント全てを示す。 （Ｂ）Ｍ８５７^A/A遺伝子型（レーン２）の消化は、１７４ｂｐフラグメント を生じるが、Ｍ８５７^G/G遺伝子型（レーン４）においては１３６および３８ｂ ｐフラグメントを生じ、Ｍ８５７^A/G遺伝子型（レーン３）においては３つのフ ラグメント全てを生じる。 １１．ブタの供給源 Ｓｗｉｓｓ Ｌａｎｄｒａｃｅ実験的集団のデータは、チューリッヒ大学の獣 医細菌学研究所（Institute of Veterinary Bacteriology，University of Zurich）で確立された２つの血統から由来した。Ｌａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ、Ｓｗ ｉｓｓ Ｌａｎｄｒａｃｅ、Ｄｕｒｏｃ、ＨａｍｐｓｈｉｒｅおよびＰｉｅｔｒ ａｉｎ品種の全ての他のブタは、スイスの異なる飼育群から由来した。他のブタ は、米国中西部の農場から無作為に入手された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１２年７月１２日（２０００．７．１２） 【補正内容】 ７．１ 請求の範囲を別紙の通り補正します。 ７．２ 図面を別紙の通り補正します。 ７．３ 明細書を以下の通り訂正します。 （１）第１頁８行目の「飼育家」を「育種家」に訂正します。 （２）第２頁５行目の「Ｍｅｉｊｅｒｉｎｋら、１９９６」を「Ｍｅｉｊｅｒ ｉｎｋら、１９９７」に補正します。 （３）第２頁１９行目の「飼育」を「育種」に訂正します。 （４）第２頁１９行目の「特別の」を「実用的な」に訂正します。 （５）第２頁２３行目の２つの「飼育」を「育種」に訂正します。 （６）第２頁２８行目の「Ｓｅｌｌｗｏｏｄら」を「Ｓｅｌｌｗｏｏｄ」に訂 正します。 （７）第２頁２９行目の「飼育」を「育種」に訂正します。 （８）第４頁１６行目の「Ｆｕｊｉら」を「Ｆｕｊｉｉら」に訂正します。 （９）第５頁１４行目の「飼育」を「育種」に訂正します。 （１０）第６頁４〜５行目の「フラグメントの各数および長さを」を「フラグ メントの各数および長さをゲル上で」に訂正します。 （１１）第６頁５〜６行目の「Ｆ１８のフラグメントの数および長さから、ブ タの細胞中にレセプターが存在することを」を「ＦＵＴ１のフラグメントの数お よび長さから、ブタの細胞中にどのＦ１８レセプター遺伝子型が存在するか」に 補正します。 （１２）第７頁３行目の「Ｖ，Ｖｌａ」を「Ｖ，Ｖａｌ」に訂正します。 （１３）第１４頁７行目の「ＥＣＦ１８^b」を「ＥＣＦ１８Ｒ^b」に補正します 。 （１４）第１４頁１５行目の「Ｓ^S−ＥＣＦ１８Ｒ^bおよびＳ^S−３０７^A」を「 Ｓ^S−ＥＣＦ１８Ｒ^bハプロタイプおよびＳ^S−３０７^Aハプロタイプ」に訂正しま す。 （１５）第１４頁２７行目の「Ｍ３０７^AA」を「Ｍ３０７^A/A」に補正します 。 （１６）第１５頁１２行目の「Ｇ→変化」を「Ｇ→Ａ変化」に補正します。 （１７）第１５頁１５行目の「ＡＣ→Ｔ変化」を「Ｃ→Ｔ変化」に訂正します 。 （１８）第１７頁１５行目の「アデニン（Ａ）〜グアニン（Ｇ）の改変」を「 アデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への改変」に訂正します。 （１９）第１７頁１６〜１７行目の「アデニン（Ａ）〜グアニン（Ｇ）の改変 」を「アデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への改変」に訂正します。 （２０）第１８頁４行目の「ｘ²およびｗ×ｘ²」を「χ²およびｗ×χ²」に訂 正します。 （２１）第１８頁１４行目の「包含される」を「包含されることに起因する」 に訂正します。 （２２）第１８頁２４〜２５行目の「プライマーＰ７およびＰ１０で得られた ブタＦＵＴ１プローブまたはブタＦＵＴ１ ｃＤＮＡを用いて」を「プライマー Ｐ７およびＰ１０で得られたブタＦＵＴ１プローブまたはブタＦＵＴ１ ｃＤＮ Ａのいずれかを用いて」に訂正します。 （２３）第１８頁２５行目の「スクリーンした」を「スクリーニングした」に 訂正します。 （２４）第１９頁２行目の「α³²Ｐ ＡＴＰ」を「α³²Ｐ ｄＡＴＰ」に訂正 します。 （２５）第１９頁３行目の「スクリーンした」を「スクリーニングした」に訂 正します。 （２６）第１９頁３行目の「４０℃」を「４２℃」に訂正します。 （２７）第１９頁４行目の「デンハーツ」を「デンハート」に訂正します。 （２８）第１９頁５行目の「０．１ｇ／ｍｌ」を「０．１ｍｇ／ｍｌ」に訂正 します。 （２９）第１９頁１５〜１６行目の「４，６−ジアミノ−２−フェニルインド ール」を「４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール」に訂正します。 （３０）第２１頁２２〜２４行目の「酵素ＫｓｐＩ（１、４、７）、ＥｃｏＲ Ｉ（２、５、８）およびＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ（３、６、９）での消化および０ ．８％アガロース上での分離後、コスミドＥＴＨｓ１（１−３）、ＥＴＨｓ２（ ４ −６）およびＥＴＨｓ３（７−９）」を「酵素ＫｓｐＩ、ＥｃｏＲＩおよびＫｓ ｐＩ／ＥｃｏＲＩでの消化および０．８％アガロース上での分離後、コスミドＥ ＴＨｓ１、ＥＴＨｓ２およびＥＴＨｓ３」に補正します。 （３１）第２１頁２６〜２７行目の「ＫｓｐＩ消化（レーン４）およびＫｓｐ Ｉ／ＥｃｏＲＩ消化（レーン６）」を「ＫｓｐＩ消化およびＫｓｐＩ／ＥｃｏＲ Ｉ消化」に補正します。 （３２）第２２頁３〜９行目の「レーン４における６．２ｋｂ ＫｓｐＩバン ドおよびレーン６における１．１ｋｂ ＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩバンドを示す。 ５’および３’ＦＵＴ１フラグメントの両方がレーン５において同じ４．６ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントにハイブリダイズする。これは、コスミドＥＴＨｓ２に 含有されるＦＵＴ１遺伝子におけるＫｓｐＩ部位の存在を示す。３’ＦＵＴ１フ ラグメントのクロスハイブリダイゼーションは、２．７ｋｂ（レーン２、３、８ 、および９）および８．２ｋｂ（レーン８および９）バンド」を「６．２ｋｂ ＫｓｐＩバンドおよび１．１ｋｂ ＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩバンドを示す。５’お よび３’ＦＵＴ１フラグメントの両方が同じ４．６ｋｂＥｃｏＲＩフラグメント にハイブリダイズする。これは、コスミドＥＴＨｓ２に含有されるＦＵＴ１遺伝 子におけるＫｓｐＩ部位の存在を示す。３’ＦＵＴ１フラグメントのクロスハイ ブリダイゼーションは、２．７ｋｂおよび８．２ｋｂバンド」に補正します。 （３３）第２２頁１５〜２３行目の「最初のレーンは１００ｂｐマーカーであ る。フラグメントの長さは塩基対で示される。（Ａ）Ｍ３０７^A/A遺伝子型（レ ーン２）は、３２８および９３ｂｐの制限フラグメントを生じるが、Ｍ３０７^{G' G} 遺伝子型（レーン４）は９３、２４１および８７ｂｐのフラグメントを生じ、 ヘテロ接合体Ｍ３０７^A/G遺伝子型（レーン３）は４つのフラグメント全てを示 す。 （Ｂ）Ｍ８５７^A/A遺伝子型（レーン２）の消化は、１７４ｂｐフラグメント を生じるが、Ｍ８５７^G/G遺伝子型（レーン４）においては１３６および３８ｂ ｐフラグメントを生じ、Ｍ８５７^A/G遺伝子型（レーン３）」を「フラグメント の長さは塩基対で示される。（Ａ）Ｍ３０７^A/A遺伝子型は、３２８および９３ ｂｐの制限フラグメントを生じるが、Ｍ３０７^G/G遺伝子型は９３、２４１およ び８７ｂｐのフラグメントを生じ、ヘテロ接合体Ｍ３０７^A/G遺伝子型は４つの フラグメント全てを示す。 （Ｂ）Ｍ８５７^A/A遺伝子型の消化は、１７４ｂｐフラグメントを生じるが、 Ｍ８５７^G/G遺伝子型においては１３６および３８ｂｐフラグメントを生じ、Ｍ ８５７^A/G遺伝子型」とする補正を行います。請求の範囲 １．Ｅ．ｃｏｌｉによる腸コロニー形成に耐性であるブタを同定するための方法 であって、該方法が以下： ａ．コロニー形成に対する耐性に関連するα（１，２）フコシルトランスフェ ラーゼ遺伝子座における遺伝子多型性が、該ブタからの生物学的サンプルにおい て存在するかどうかを決定する工程；および ｂ．該ブタが該多型性についてホモ接合体である場合に、該ブタが耐性である と推定する工程、 を包含する、 方法。 ２．Ｅ．ｃｏｌｉに関連する腸障害に対して耐性であるブタを同定するための方 法であって、該方法が以下： ａ．該ブタからの生物学的サンプルにおいて、該ブタのα（１，２）フコシル トランスフェラーゼ遺伝子１における３０７位の唯一の窒素塩基がアデニンであ るかどうかを決定する工程；および ｂ．３０７位の該唯一の窒素塩基がアデニンである場合に、該ブタが耐性であ ると同定する工程、 を包含する、 方法。 ３．Ｅ．ｃｏｌｉ関連疾患に耐性であるブタを育種するための方法であって、該 方法が以下： ａ．Ｅ．ｃｏｌｉ関連腸疾患に耐性であるブタであるとそれらを同定する、α （１，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子において遺伝子多型性を有する 、ブタを育種するために選択する工程；および ｂ．該選択したブタを育種する工程、 を包含する、 方法。 ４．前記Ｅ．ｃｏｌｉがＦ１８株である、請求項１、２または３に記載の方法。 ５．ブタのα（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１について多型性で ある、単離されたＤＮＡ分子。 ６．以下に示されるヌクレオチド配列を有する、単離されたＤＮＡ分子。７．ヌクレオチド３０７位においてグアニンの代わりにアデニンが存在する、請 求項６に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ８．請求項６または７に記載のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列に相補的である、 単離されたＤＮＡ分子。 ９．ヌクレオチド８５７位において、グアニンの代わりにアデニンを有する、請 求項６に記載の単離されたＤＮＡ分子。 １０．ヌクレオチド２２９位においてチミンを有する、請求項６に記載の単離さ れた ＤＮＡ分子。１１．請求項５または６に記載のＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチド であって、該分子がα（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性を有する、ポ リペプチド。 １２．請求項５，６または８に記載の単離されたＤＮＡ分子の一部分であって、 該一部分が、感受性ブタからＥ．ｃｏｌｉコロニー形成耐性を識別するヌクレオ チド配列を含有する、ＤＮＡ分子の一部分。 １３．Ｅ．ｃｏｌｉレセプターを検出するための分子アッセイであって、該アッ セイは、以下： ブタの有核細胞からＤＮＡを単離する工程； 該ＤＮＡを、ブタα（１，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子のＤＮＡ 配列に相補的であるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ 連鎖反応において増幅する工程； 少なくとも１つの制限酵素で制限酵素消化を行う工程； 得られたフラグメントを、ゲル電気泳動によって分離する工程； 該フラグメントのそれぞれの数および長さを決定する工程；および どのレセ プターが存在するかを、該フラグメントのそれぞれの数および長さから決定する 工程、 を包含する、分子アッセイ。 １４．前記Ｅ．ｃｏｌｉがＦ１８株である、請求項１３に記載の分子アッセイ。 １５．前記制限酵素がＣｆ０Ｉである、請求項１３または１４に記載の分子アッ セイ。 １６．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆ１８レセプターを検出するためのキットであって、該キ ットが、別々の容器中に、ブタα（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子 １の多型性のＤＮＡ配列に相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、キット。 １７．α（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性および１０３位におけるア ミノ酸置換を有する、ブタのポリペプチド。 １８．２８６位においてアミノ酸置換を有することでさらに特徴付けられる、請 求項１７に記載のポリペプチド。 １９．Ｅ．ｃｏｌｉ関連疾患を有するブタを処置するための薬物を開発するため の、ブタα（１，２）フコシルトランスフェラーゼのヌクレオチド多型性の使用 であって、ここで、 該開発が、Ｅ．ｃｏｌｉの正常レセプターを阻害する分子を産生するように、 該ヌクレオチド多型性を変異させることによって達成される、使用。 ２０．請求項５〜１０および１２のいずれか１項に記載されるＤＮＡ分子を含む 、ベクター。 ２１．請求項２０に記載のベクターによって形質転換された、細胞。 ２２．請求項２０に記載のベクターによって形質転換された、トランスジェニッ ク動物。 ２３．請求項２０に記載のベクターを動物細胞に導入する工程を包含する、トラ ンスジェニック動物の生産方法。 【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 スイス・フェデラル・インスティテュー ト・オブ・テクノロジー・チューリヒ スイス、ツェーハー―8092チューリヒ、エ ーテーハー―ツェントゥルム、ラミシュト ラーセ101番 (72)発明者 ボスワース，ブラッド・ティ アメリカ合衆国50201アイオワ州ネバダ、 ボックス182、ルーラル・ルート・ナンバ ー１番 (72)発明者 フォーゲリ，ペーター スイス、ツェーハー―8180ビューラト、ア ダメンゲスデン・ヌメロ12番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ．ブタ由来の生物学的試料中、コロニー形成に対する耐性に関連する遺 伝的多型性が存在するかどうかを決定し； ｂ．ブタが多型性に関してホモ接合体である場合、ブタは耐性であると推断す ることからなる、イー・コリによる腸内コロニー形成に対して耐性のブタを同定 する方法。 ２． ａ．ブタ由来の生物学的試料中、ブタのアルファ（１，２）フコシルトラ ンスフェラーゼ遺伝子１における位置３０７の唯一の窒素塩基がアデニンである かどうかを決定し； ｂ．位置３０７の唯一の窒素塩基がアデニンである場合、耐性としてブタを同 定することからなる、腸障害に関連するイー・コリに対して耐性のブタを同定す る方法。 ３． ａ．イー・コリ関連腸疾患に対して耐性のブタとして同定するアルファ（ １，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子における遺伝的多型性を有する飼 育用ブタを選択し； ｂ．選択したブタを飼育することからなる、イー・コリ関連疾患に対して耐性 のブタを飼育する方法。 ４． イー・コリがＦ１８株である請求項１、２または３記載の方法。 ５． ブタにおけるアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１に 関して多型性である単離ＤＮＡ分子。 ６． 図１に記載のヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子。 ７． グアニンの代わりにヌクレオチド位置３０７にアデニンがある請求項６記 載の単離ＤＮＡ分子。 ８． 請求項６記載のヌクレオチド配列に相補的な単離ＤＮＡ分子。 ９． ヌクレオチド位置８５７においてグアニンがアデニンで置換されている請 求項６記載の単離ＤＮＡ分子。 １０． ヌクレオチド位置２２９にスレオニンを有する請求項６記載の単離ＤＮ Ａ分子。 １１． アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性を有する請求項５ または６記載のＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチド。 １２． イー・コリコロニー形成耐性のブタと感受性のブタを区別するヌクレオ チド配列を包含する、請求項５または６記載の単離ＤＮＡ分子の部分。 １３． ＤＮＡをブタの有核細胞から単離し、プライマーとしてブタアルファ（ １，２）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子のＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌ クレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応においてＤＮＡを増幅し、少なくとも １つの制限酵素で制限酵素消化を行い、得られたフラグメントをゲル電気泳動に より分離し、フラグメントの各数および長さを決定し、フラグメントの数および 長さからレセプターの存在を決定することからなる、イー・コリＦ１８レセプタ ーを検出するための分子アッセイ。 １４． 制限酵素がＣｆｏＩである請求項１４記載の分子アッセイ。 １５． 別々の容器中に、ブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ 遺伝子１の多型性のＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、イー・コ リＦ１８レセプターを検出するためのキット。 １６． アルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性および位置１０３ にアミノ酸置換を有するブタポリペプチド。 １７． さらに位置２８６にアミノ酸置換を有することを特徴とする請求項１６ 記載のポリペプチド。 １８． イー・コリ関連疾患に罹患したブタを治療するための薬剤を開発するた めのブタアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼの多型性の使用。