CZ298021B6 - Zpusoby pro identifikaci prasat resistentních na kolonizaci streva E. coli, izolovaná molekula DNA,polypeptid, fragment, vektor a bunka - Google Patents

Abstract

Je popsán zpusob pro identifikaci prasat resistentních na kolonizaci streva E. coli, které je schopno vazby ECF18R u prasete, izolovaná molekula DNA,kodující pro gen pro .alfa.(1,2)fukosyltransferasu 1 u prasat, polypeptid kodovaný takovou molekulou DNA, fragment takové izolované molekuly DNA a vektor obsahující takovou molekulu DNA, jakož i bunky transformované tímto vektorem. Jsou tak dosaženyneinvazivní vysoce sensitivní a specifické zpusoby a prostredky pro odlišení prasat geneticky sensitivních na onemocnení zpusobená infekcí F18 E. coli od resistentních prasat.

Description

Je popsán způsob pro identifikaci prasat resistentních na kolonizaci střeva E. coli, které je schopno vazby ECF18R u prasete, izolovaná molekula DNA, kódující pro gen pro a(l,2)íukosyltransferasu 1 u prasat, polypeptid kódovaný takovou molekulou DNA, fragment takové izolované molekuly DNA a vektor obsahující takovou molekulu DNA, jakož i buňky transformované tímto vektorem. Jsou tak dosaženy neinvazivní vysoce sensitivní a specifické způsoby a prostředky pro odlišení prasat geneticky sensitivních na onemocnění způsobená infekcí F18 E. coli od resistentních prasat.

Způsoby pro identifikaci prasat resistentních na kolonizaci střeva E. coli, izolovaná molekula DNA, polypeptíd, fragment, vektor a buňka

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu pro identifikaci prasat resistentních na kolonizaci střeva E. coli, které je schopno vazby ECF18R u prasete, izolované molekuly DNA, kódující pro gen pro oc(l,2)fukosyltransferasu 1 u prasat, polypeptidů kódovaného takovou molekulou DNA, fragmentu takové izolované molekuly DNA a vektoru obsahujícího takovou molekulu DNA, jakož i buňky transformované tímto vektorem.

Dosavadní stav techniky

Hlavním problémem chovu prasat je udržení prasata bez onemocnění. Omezený počet serotypů toxigenních kmenů Escherichia (E.) coli je příčinou edematosního onemocnění a průjmu po odstavení u prasat, kde tato onemocnění způsobují značné ekonomické ztráty prasečích farem v celém světě, zejména mezi selaty stáří 4 až 12 týdnů. Typickými klinickými příznaky edematosního onemocnění jsou neurologické příznaky jako je ataxie, křeče a paralýza. Při pitvě je edém obvykle přítomen na charakteristických místech, jako jsou oční víčka a čelo, stěna žaludku a mesokolon. Onemocnění je způsobeno variantou Shiga-like toxinu II a enterotoxiny LT, STa a STb, které jsou produkovány E. coli, která kolonizuje povrch tenkého střeva bez toho, že by způsobovala velké morfologické změny enterocytů (střevních buněk). Určité typy bakteriálních kmenů E. coli, F18 a F4 (K88), jsou hlavními příčinami v tomto ohledu. Edematosní choroba prasat je enterotoxemie charakterizovaná generálizovaným poškozením cév. Toto poškození cév je způsobeno toxinem, variantou Shiga-like toxinu II, který je produkován určitými kmeny E. coli (Bertschinger a kol., 1993). E. coli se dělí podle typů řasinek. Skupina adhesivních fimbrií, která souvisí s tímto onemocněním, je označena například jako K88 nebo F18 (Vogeli a kol., 1997).

Ne všechna prasata podléhají infekcím E. coli. Kolonizace závisí na adherenci bakterií na enterocyty, které je zprostředkována bakteriálními fimbriemi označenými například F18 nebo K88. Bylo prokázáno, že citlivost k adhesi, tj. exprese receptorů u prasete vhodných pro vazbu fimbrií, je geneticky řízena hostitelem a je děděna jako dominantní rys, kdy v případě F18 je B alela způsobující citlivost na adhesi a b je alela způsobující resistencí (Vogeli a kol., 1996; Meijerink a kol, ,1996). Genetický lokus pro tento receptor pro F18 E. coli (ECF18R) byl mapován na prasečí chromosom 6 (SSC6), na základě jeho těsné genetické vazby na S lokus a na delší lokusy halothanové (HAL) vazebné skupiny na chromosomu 6. Receptor pro K88 E. coli je na chromosomu 13.

Zdá se, že mechanismus resistence spočívá v tom, že lem střeva resistentních zvířat není kolonizován E. coli, tj. bakterie neadherují na stěnu střeva resistentních prasat. Bylo prokázáno, že glykoproteinové receptory kartáčového lemu membrány střeva jsou odpovědné za rozdíly mezi adhesivními a neadhesivními fenotypy pro určité E. coli, a proto že genotyp hostitelského prasete určuje resistencí. Také byly studovány bakterie nesoucí fimbrie (WO 94/13811).

Současné způsoby pro identifikaci prasat, která jsou resistentní na onemocnění způsobená F18 E. coli jsou: (1) odběr vzorků střeva od prasat při pokožce a povedení mikroskopického testu adhese; (2) infekce zvířat virulentní E. coli („kolonizační test“); nebo (3) provedení typizace A-O(S) systému krevních skupin. První dvě metody nejsou praktické pro identifikaci chovných resistentních zvířat. Ačkoliv způsob stanovení krevní skupiny identifikuje resistentní zvířata, není možno tímto testem určit, zda jsou zvířata sensitivní na onemocnění homozygotní nebo heterozygotní pro sensitivitu. Znalost genotypu zvířat s ohledem na tyto alely (stavy genu) je zásadní

-1 CZ 298021 B6 pro vývoj úspěšného chovného programu. Účelem tohoto chovného programuje produkce prasat, která jsou resistentní na onemocnění způsobená F18 E. coli, která decimuje chov po odstavení.

V jedné publikaci autoři uvádějí, s ohledem na edematosní onemocnění prasat, že „probíhá výzkum vhodných genetických markérů... (Bertschinger a kol., 1993, str. 87) a citují Walterse a Sellwooda (1982):

„Křížení resistentních prasat je atraktivní metodou pro prevenci onemocnění, pro která neexistuje účinná profylaxe. Proveditelnost tohoto přístupu závisí na prevalenci genu(ů) kóduj ícího(ch) resistenci v populaci prasat, lepších metodách pro detekci resistentních prasat a na absenci negativních genetických rysů selektovaných současně s touto resistenci.“

Genetický „markerový“ lokus je kódující nebo nekódující lokus, který je v blízkosti vybraného lokusu, ale nemusí tomu tak být nutně. Detekovatelné fenotypy zahrnují kontinuální nebo diskontinuální rysy, například polymorfísmus délky restrikčních fragmentů, produkci rysů, bakteriální adhesi rysů, kolorimetrické a enzymatické reakce a resistenci na antibiotika. S lokus řídí expresi antigenů A a O krevních skupin. Prasata homozygotně recesivní v S lokusu neexprimují A ani O antigeny krevních skupin. Podobná situace existuje u lidí a je způsobena mutacemi genu pro a(l,2)fokusyltransferasu, která kóduje lidskou krevní skupinu H (Kelly a kol., 1994; viz také WO 96/28967). Nedávno byl sekvencován gen pro prasečí a(l,2)fokusyltransferasu (Cohney a kol., 1996). Tento gen je s velkou pravděpodobností přítomen v S lokusu u prasat.

Krevní skupiny H a Se byly mapovány geneticky a fyzikálně na lidský chromosom 19ql3.3. Tento region je evolučně konzervován a obsahuje geny homologní k HAL vazebné skupině genů u prasat. Gen kódující krevní skupinu H se také nazývá FUT1, zatímco Se gen je ekvivalentní FUT2 genu. FUT1 určuje expresi H antigenů v erytroidní buněčné linii, zatímco FUT2 reguluje expresi H antigenů v sekrečním epitelu a slinách. Konzervace FUT1 genu byla prokázána u nižších savců, jako jsou krysy a králíci, a exprese mRNA byla prokázána v králičí mozkové tkáni a krysím tlustém střevu. U všech těchto druhů byly popsány dva druhy genů pro oc(l,2)fukosyltransferasu, které jsou strukturálně velmi podobné lidským FUT1 a FUT2 genům, ale zejména u genů homologních s FUT1 byla prokázán velmi specifický charakter exprese. U lidí je FUT1 gen odpovědný za syntézu H antigenů v prekursorech erytrocytů. Nicméně, u prasat se erytrocyty pasivně adsorbují na H-podobné antigeny ze séra, podobně jako v případě lidských Lewis antigenů. H prasat všechny H-podobné antigeny souvisejí s exokrinně sekreční tkání a exprese FUT1 (sekrečního - „Sekretor“) genu je pozorována v sekrečních tkáních jiných živočišných druhů. Proto může být exprese detemunant A-O krevních skupin prasat, které zkříženě reagují s protilátkami proti lidským krevním skupinám H a A, ovlivněna FUT2 genem.

Další informace o krevních skupinách a onemocnění prasat způsobených E. coli zahrnují to, že uhlohydrátové struktury antigenů krevních skupin zprostředkují adhesi některých patogenních mikroorganismů na tkáně hostitele, například Helicobacter pylori adheruje na antigeny Lewis^B krevní skupiny a E. coli, způsobují infekci močových cest, adheruje na substance krevní skupiny P. Geny kódující glykosyltransferasy, které jsou odpovědné za tvorbu specifických uhlohydrátových struktur krevních skupin, proto představují kandidáty pro řízení bakteriální kolonizace hostitelem. Lokalizace těchto genů je ve stejném chromosomálním regionu jako lokus odpovědný za adhesi/non—adhesi F18 pozitivních E. coli v tenkém střevu prasat, prasata neexprimují antigeny krevních skupin A a O do odstavení, což je stejná doba, kdy se stanou sensitivními na onemocnění způsobená F18 E. coli.

Existuje potřeba nových diagnostických testů a terapie pro onemocnění prasat způsobená E. coli. Pro některá onemocnění prasat byla navržena detekce genetických mutací jako diagnostický test (maligní hypotermie) (Fujii a kol., 1991; patent US 5 358 649), ale pro diagnostiku nebyly popsány polymorfní markéry. Byly popsány vakcíny pro vývoj resistence na kolonizaci E. coli (patent US 5 552 144; WO 86/04604), ale není pravděpodobné, že by byly výhodným způsobem pro prevenci onemocnění způsobených E. coli, vzhledem k obtížnosti podávání orální živé vakcí

-2CZ 298021 B6 ny novorozeným selatům a z důvodu regulačních omezení. Existují účinná antibiotika pro léčbu, ale nejsou úspěšnou profylaxí.

Nyní byly nalezeny prostředky a neinvazivní způsoby pro identifikaci prasat geneticky resistentních na onemocnění E. coli, zvláště resistentních na střevní onemocnění způsobená bakteriemi kmene E. coli vybaveným fimbriemi F18. Byly identifikovány polymorfismy v genu pro prasečí a(l,2)-fukosyltransferasu (FUT1), které odlišují resistentní prasata od prasat sensitivních na onemocnění a které poskytují diagnostický test užitečný pro chovatele prasat.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob pro identifikaci prasat resistentních na kolonizaci střeva E. coli, které je schopno vazby ECF18R u prasete, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje

a) určení, zdaje přítomen genetický polymorfismus v genu prasete pro a(l,2)fukosyltransferasu 1 o SEQ ID NO: 12, kde dusíkatou bází v pozici 307 je adenin, nebo polymorfismus v alelické asociaci s polymorfismem v genu pro FUT1, který má adenin v pozici 307, v biologickém vzorku od prasete; a

b) pokud je prase homozygotní pro polymorfismus v genu pro FUT1 nebo polymorfismus v alelické asociaci s ním, tak určení prasete jako resistentního prasete.

Výhodné provedení vynálezu spočívá ve způsobu pro identifikaci prasat resistentních na střevní onemocnění způsobená mikroorganismem E. coli F18 schopných se vázat na ECF18R u prasete, který zahrnuje

a) určení toho, zda v biologickém vzorku od prasete je dusíkatou bází v pozici 307 v genu pro a(l,2)fukosyltransferasu 1 o SEQ ID NO: 12 pouze adenin; a

b) identifikaci prasete jako resistentního tehdy, je-li dusíkatou bází v pozici 307 adenin.

Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu, při kterém E. coli je kmen F18.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je izolovaná molekula DNA, kódující pro gen pro ot(l,2)— fukosyltransferasu 1 u prasat, kde dusíkatou bází v genu pro α( 1,2)fukosyltransferasu 1 v pozici 307 prasat je adenin, přičemž gen pro FUT1 obsahuje SEQ ID NO: 12.

Podle tohoto vynálezu je výhodná izolovaná molekula DNA, která má sekvenci nukleotidů uvedenou jako SEQ ID NO: 12. Zvláště výhodná je izolovaná molekula DNA, ve které je místo guaninu v nukleotidové pozici 307 adenin. Jiné výhodné řešení spočívá v izolované molekule DNA se substitucí adeninu za guanin v nukleotidové pozici 857, jakož i v izolované molekule DNA s thyminem v nukleotidové pozici 229.

Podle tohoto vynálezu je také výhodná izolovaná molekula DNA, která je komplementární k nukleotidové sekvenci popsané svrchu.

Jiným předmětem tohoto vynálezu je polypeptid kódovaný molekulou DNA popsanou svrchu, kde uvedená molekula má a(l,2)fukosyltransferasovou aktivitu.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž fragment izolované molekuly DNA popsané svrchu, který obsahuje pozici 307.

Předmětem tohoto vynálezu je též vektor obsahující molekulu DNA popsanou svrchu.

-3 CZ 298021 B6

Předmětem tohoto vynálezu je konečně buňka transformovaná vektorem uvedeným svrchu.

Dále se uvádějí některé detailnější údaje vztahující se k předmětnému vynálezu.

Předmětný vynález obsahuje prostředky a neinvazivní způsoby pro detekci a eliminaci prasat, která jsou sensitivní na onemocnění způsobená E. coli. Neinvazivní způsob pro identifikaci prasat resistentních na střevní kolonizaci E. coli F18 obsahuje následující kroky: určení toho, zdaje v biologickém vzorku od prasete přítomný genetický polymorfismus spojený s resistencí na kolonizaci; a vyvození toho, že prase je resistentní, pokud je prase homozygotní pro polymorfismus. Polymorfismem se zde rozumí změna v nukleotidové sekvenci způsobená mutací, která existuje v populaci.

Uvedeno přesněji, způsob spočívá v určení toho, zda v biologickém vzorku získané od prasete v genu pro α( 1,2)fukosyltransferasu báze v pozici 307 je pouze adenin neboje guanin; a identifikaci prasete jako resistentního, pokud je bází v pozici 307 adenin.

Pro stanovení toho, zdaje v biologickém vzorku přítomen polymorfismus, je analyzována délka restrikčních fragmentů („částí“) na gelu, který je separuje podle své molekulové hmotnosti. Restrikční enzymy jsou endonukleasy, které reprodukovatelně štěpí molekuly nukleové kyseliny ve specifických místech, což vede ke vzniku fragmentů nukleové kyseliny rozdílných molekulových hmotností, podle lokalizace míst štěpení.

Na vynálezu je založen způsob křížení prasat tak, aby byla resistentní na onemocnění způsobená E. coli, za použití selekce takových prasat pro chov, která mají genetický polymorfismus v genu pro a(l,2)fukosyltransferasu 1, spočívá na určení, zda jsou prasata resistentní na onemocnění způsobená E. coli, a potom křížením takových prasat.

Jedním aspektem vynálezu je molekula DNA, která je polymorfní pro gen pro α( 1,2)fukosyltransferasu 1 u prasat, která má zvláště sekvenci uvedenou na obr. 1. Dalšími aspekty tohoto vynálezu jsou molekuly se sekvencí nukleotidů komplementární k sekvenci podle obr. 1 a resistentní v pozicích nukleotidů vytvářejících resistencí.

Jiným aspektem vynálezu je izolovaná molekula DNA se substitucí adeninu za guanin v pozici 307. Tato molekula může také obsahovat substituci adeninu za guanin v pozici 857. Jiné izolované molekuly DNA podle vynálezu jsou ty molekuly, které obsahují mutaci v nukleotidové pozici 229 sekvence podle obr. 1, kde je kodon CTT změněn na TTT, takže místo aminokyseliny leucinu kóduje fenylalanin. Mutace v nukleotidové pozici 714 je z GAT na GAC, ale při této změně nedochází ke změně aminokyseliny v kodonovém produktu.

Polypeptidy kódované DNA molekulami podle vynálezu a mající a(l,2)fukosyltransferasovou aktivitu jsou také aspektem předkládaného vynálezu.

Molekulární test pro detekci receptorů pro F18 E. coli u prasat spočívá v: (a) izolaci dna z jaderných buněk prasete; (b) amplifikaci DNA v polymerasové řetězové reakci (PCR) za použití oligonukleotidů jako primerů, které jsou komplementární k DNA sekvenci trávení restrikčními enzymy za použití alespoň jednoho restrikčního enzymu, například Cfol; (d) separaci výsledných fragmentů gelovou elekroforesou; (e) určení příslušného počtu a délky fragmentů na gelu; a (f) stanovení toho, které receptory F18 genotypu jsou přítomné na prasečích buňkách, podle počtu a délky fragmentů FUT1. Použití zde popsaných větších amplifikovaných fragmentů pro analýzu polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) - oproti použití menších fragmentů - je méně nákladné, protože DNA proužky mohou být analyzovány na agarosových gelech v relativně nízké koncentraci. Také je pro produkci některých fragmentů potřebný pouze jeden restrikční enzym pro konstantní restrikční místo sousedící s variabilním diagnostickým místem.

-4CZ 298021 B6

Kit pro detekci polymorfismu spojeného s F18 receptoru E. coli obsahuje oligonukleotidy v oddělených kontejnerech, které jsou komplementární k DNA sekvenci genu pro prasečí a(l,2)fukosyltransferasu 1 a které odlišují resistentní prasata od sensitivních prasat. Test může být proveden na prasatech jakéhokoliv věku.

Polymorfismy jsou také užitečné pro vývoj léků pro léčbu prasat trpících onemocněním způsobeným E. coli. Mutovaná forma prasečí oc(l,2)fukosyltransferasy může interferovat s normálním enzymem, což může bránit produkci střevního receptoru pro F18.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci (FUT1) (níže) a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci (výše) polymorfismu prasečí a(l~>2)fukosyltransferasy podle předkládaného vynálezu, za použití jednopísmenného kódu aminokyselin. Nepřerušovaná dvojitá čára po aminokyselinovými sekvencemi (=) označuje domnělý transmembránový region; tečkovaná linie pod aminokyselinovou sekvencí označuje potenciální N-vázaná glykosylační místa (...).

označuje substituci adeninu (A) za guanin (G) u resistentních prasat.

* označuje terminační kodon.

Zkratky pro aminokyselinové zbytky jsou následující: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; a Y, Tyr.

Obr. 2 znázorňuje SEQ ID NO: 2. Zkratky na obr. 2 mají význam uvedený svrchu.

Dále se uvádí popis výhodných ztělesnění.

Molekulární analýza DNA polymorfismu spojených s resistenci prasat na onemocnění způsobené E. coli usnadňuje diagnostické testy pro selekci resistentních prasat pro křížení. Resistentní prasata se liší od sensitivních prasat v E. coli F18 receptorovém lokusu, jak bylo zjištěno markéry polymorfismu.

Předkládaný vynález poskytuje neivazivní metody a prostředky pro vysoce sensitivní a specifické odlišení prasat geneticky sensitivní na onemocnění spojená s infekcí F18 E. coli a prasat resistentních na tyto infekce. Bylo zjištěno, že DNA polymorfismus v prasečím genu pro α( 1,2)fukosyltransferasu (FUT1) odlišuje resistentní prasata od sensitivních prasat. Polymorfismus vzniká mutací (změnou) nukleotidové sekvence, která vede ke vzniku nové alely. Alela je stav genu. V populaci může existovat mnoho alel genu lišících se substitucemi dusíkatých bází, které pravděpodobně vznikly v důsledku mutací původní DNA molekuly. Současná existence více než jedné alely (které jsou též někdy označovány jako „varianty“) v populaci se nazývá genetický polymorfismus. Lokus, ve kterém může existovat více než jedna alela jako stabilní složka populace, je polymorfní lokus. Obvykle má jeden polymorfní lokus v populaci nízkou frekvenci.

Jak je určeno z biologického vzorku, výhodně z krve, mají resistentní prasata ve svých genomech polymorfismus, ve kterém je bází v pozici 307 (obr. 1) nukleotidové sekvence pouze adenin, zatímco bází ve stejné pozic u homozygotních sensitivních prasat je guanin. Heterozygotní prasata budou mít oba typy DNA a budou sensitivní. Polymorfismus je variací sekvence prasečího genu, jak uvádí Cohney a kol. (1996).

Na prasečích rodinách byla provedena analýza genetické vazby a byly stanoveny genetické asociace mezi polymorfismem ve FUT1 a resistenci na onemocnění u křížených prasat. Podle předkládaného vynálezu byl zjištěn polymorfismus v genu pro a(l,2)fukosyltransferasu 1. Polymor

-5CZ 298021 B6 fismus, který má substituci jedné nukleotidové báze v pozici 307, byl použit pro stanovení těsné vazby mezi genem pro fokusyltransferasu a S-systémem, ECF18R lokusem a jinými lokusy HAL vazebné skupiny.

Detekce těsné vazby mutace ve FUT1 a ECF18R umožnila vývoj molekulárního testu pro identifikaci prasat resistentních na adhesi E. coli F18, heterozygotů (nosičů) a prasat homozygně sensitivních. Tento diagnostický test identifikuje, s vysokou sensitivitou a specificitou, prasat, která jsou sensitivní na adematosní onemocnění a průjmová onemocnění po odstavení. Incidence polymorfismu podle předkládaného vynálezu se liší v chovech prasat. Vógeli a kol. (1997) uvádí frekvence M307 alely u 5 prasečích chovů, které nebyly navzájem příbuzné. Dostupnost diagnostického testu pro polymorfismus podle předkládaného vynálezu dává chovatelům možnost účinně eliminovat alelu citlivou na ECR18R z chodu prasat, což umožní eliminaci predispozice pro E. coli F18 bakteriální adhezi způsobující edematosní onemocnění a průjem po odstavení prasat.

Předkládaný vynález dále zahrnuje nukleotidové sekvence, které jsou variantami sekvence genu pro a(l,2)fukosyltransferasu 1, představující různé polymorfismy v páru bází 307 a diagnostické molekulární kity pro identifikaci polymorfismů v genu pro a(l,2)fukosyltransferasu.

Pro získání kandidátských genů pro lokus receptoru pro F18 E. coli (ECF18R) bylo izolováno 5 kosmidů a jeden genomový klon obsahující geny pro a(l,2)fukosyltransferasy, FUT1 a FUT2 (Meijerink a kol., 1997), z prasečí genomové knihovny. Mapování fluorescence in šitu hybridizace umístilo všechny tyto klony v proužku qll prasečího chromosomu 6 (SSCóqll). Analýza sekvence kosmidů vedla k charakterizaci (a) otevřeného čtecího rámce (ORF), délky 1098 párů bází, který je z 82,3 % identický k lidské FUT1 sekvenci, a (b) druhého ORF, délky 1023 párů bází, který je z 85 % identický k lidské FUT2 sekvenci. FUT1 a FUT2 lokusy se proto zdají být prasečími ekvivalenty lokusů lidské krevní skupiny H a Sekretor lokusu. Přímé sekvencování dvou ORF u prasat sensitivních nebo resistentních na adhesi a kolonizaci F18 E. coli (ECF18R) odhalilo dva polymorfismy v páru bází 307 (M307) a páru bází 857 (M857) FUT1 ORF. Nukleotidové pozice jsou počítány od ATG (kódujícího methioninu). Otevřený čtecí rámec rozprostírající se odtud k terminačními kodonu je délky 1098 nukleotidů. Nukleotidy před a po tomto ORF se mohou měnit, například jako na obr. 1. Analýza těchto mutací u 34 párů Landrace rodin s 221 potomky ukázala těsnou vazbu mezi lokusem řídícím resistenci a sensitivitu na E. coli F18 adhesi a kolonizaci v tenkém střevu (ECF18R) a lokusem inhibitoru krevních skupin S. Proto je M307 mutace dobrým markérem po selekci zvířat resistentních na E. coli F18 založenou na markéru. Bylo zjištěno, že jiná mutace v nukleotidové pozici 229 vede k polymorfismu, ve kterém je kodon kódující leucin (CTT) změněn na TTT (kódující fenylalanin). Mutace v pozici 714 (GAT —> GAC) (kódující kyselinu aspartovou) nevyvolá aminokyselinovou substituci. Žádný polymorfismus, který by odlišil sensitivní od resistentních prasat, nebyl identifikován ve FUT2.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady poskytují ztělesnění tomuto vynálezu.

Příklad 1: Test na resistentní prasata

Polymorfismus podle předkládaného vynálezu může být snadno identifikován za použití PCRRFLP testu. V tomto provedení test využívá fragment prasečí oc(l,2)fukosyltransferasy 1 o 160 párech bází amplifikovaný pomocí PCR za použití následujících primerů: 5'-CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3' a 5-GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3' (tabulka 1). Výhodnými podmínkami PCR pro toto provedení je 25 cyklů při následujících dobách a teplotách: 94 °C, 30 s; 60 °C, 45 s; 72 °C, 90 s. Amplifikovaná DNA od resistentních prasat byla trávena restrikčním enzymem Hgal, ale nebyla trávena restrikčním enzymem HinPI. Amplifikovaná DNA od

-6CZ 298021 B6 homozygotních sensitivních prasat trávena restrikčním enzymem HinPI. Amplifikovaná DNA od heterozygotních sensitivních prasat byla částečně trávena oběma enzymy.

V alternativním přístupu byla DNA izolována z prasečích jaderných buněk za použití standardních postupů. Přímé sekvencování prasečích FUT1 a FUT2 sekvencí a jejich sousedních regionů u zvířat různých ECF18R genotypů (BB, bb) vedlo k identifikaci dvou G->A přechodů v pozicích 307 a 857 (označených M307 a M857) FUT1 ORF. M307 přenos eliminuje restrikční místo pro Cfol. Amplifikace DNA izolované z prasečích jaderných buněk byla provedena pomocí standardních postupů s primery P6 a PÍ 1 (3 minuty při 95 °C, 30 cyklů o 30 s při 95 °C, 30 s při 56 °C a 30 s při 72 °C, po kterých následovala 7 minutová konečná extense při 72 °C), a po ní následovalo trávení Cfol a separace na 3% agarosovém gelu, která vedla k polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP). Homozygotní M307^AA zvířata měla 2 proužky. Homozygotní M307^GG zvířata měla fragmenty o 93, 241 a 87 párech bází. Heterozygotní zvířata měla všechny čtyři fragmenty.

Příklad 2: Sensitivita a specificita testu využívajícího a(l,2)fukosyltransferasu v detekci prasat resistentních na F18 E. coli.

Byla provedena studie pro stanovení asociace mezi resistencí na onemocnění a polymorfismus v pozici 307 FUT1 genu. 183 odstavených prasat (ve věku 2 až 6 měsíců) bylo získáno ze šesti různých chovů. Pouze o jednom chovu bylo před zahájením studie známo, že obsahuje resistentní zvířata a o tomto stádu bylo známo, že má vysokou incidenci prasečího stresového syndromu. U dalších 5 chovů nebyly známky prasečího stresového syndromu a incidence resistence na onemocnění nebyla známá. Prasata z každého chovu byla náhodně vybrána, humánně usmrcena a byly odebrány sleziny a vzorky tenkého střeva. Ze slezinové tkáně byla extrahována DNA a byla použita v PCR-RFLP testu popsaném v příkladu 1. Střevní buňky byly přečištěny seškrábnutím slizničního povrchu střeva, lýzou buněk v hypotonickém EDTA roztoku a promytím centrifugací. Přečištěné buňky kartáčového lemu střeva byly inkubovány sF18 E. coli. Tato směs byla vyšetřována mikroskopií s fázovým kontrastem. Tento test určil, zda jsou prasata sensitivní (vzorky střeva obsahovaly adherované bakterie) nebo resistentní (vzorky střeva neobsahovaly adherované bakterie). PCR-RFLP test na polymorfismus koreloval s testem vazby bakterií a buňky střeva u 53 z 53 resistentních prasat a u 128 ze 130 sensitivních prasat. Dvě prasata, která byla pomocí testu vazby bakterií na střevní buňky určena jako sensitivní byla chybně určena jako resistentní při použití PCR-RFLP testu. Dva ze šesti vyšetřovaných chovů obsahovaly resistentní prasata, zatímco pouze jeden chov měl prasečí stresový syndrom, což dokazuje, že PCR-RFLP test může identifikovat prasata resistentní na onemocnění u zvířat, která nemají prasečí stresový syndrom.

Příklad 3: Lokalizace FUT1 na chromosomu 6 (SSC6)

Kosmidy ETHsl, -s2, -s3, -s4 a -s6 byly identifikovány po skríningu kosmidové knihovny FUT nukleotidovou sondou získanou z prasečí genomové DNA s primery P7 a P10 a byly mapovány pomocí FISH a DISC-PCR do proužku ql 1 chromosomu 6.

Příklad 4: Identifikace ORF prasečí FUT1

Hybridizující kosmidy KspI, EcoRI a KspI/EcoRI tráví s radioaktivně značenými FUT1 fragmenty PóaPll asP7 aPlO pro Sothem blot analýzu ukazuje identické autoradiografícké signály pro ETHs2, -s4 a -s6, zatímco odlišné signály byly získány pro kosmidy ETHsl a -s3. Z kosmidu ETHs2 KspI byly izolovány subklony délky 940 bp a 6,2 kb, které odpovídají předpokládané délce hybridizujících KspI fragmentů na Southem blok analýze. Sekvence obou subklonů byly kombinovány za získání sekvence o 1501 párech bází, které byly v souladu s výsledky pří

-7CZ 298021 B6 mého sekvencování genomových PCR produktů. Sekvence o 1501 párech bází obsahuje otevřený čtecí ráme (ORF) o 1098 párech bází odpovídajících lidskému FUT1 ORF, s 82,3% nukleotidovou a 80,8% aminokyselinovou identitou. ORF kóduje polypeptid.

Příklad 5: identifikace prasečí FUT2 a pseudogenu FUTP

ETHsl má jeden DNA fragment (2,7 kb), který hybridizuje s FUT1 sekvencí, zatímco EThs3 má dva (2,7 kb a 8,2 kb) (Meijerink a kkol., 1997). Subklonování a částečně sekvencování 2,7 kb EcoRI fragmentu ETHsl a -s3 potvrdilo, že tyto dva fragmenty jsou identické. Sekvence má vysokou podobnost s lidským FUT2, ale má několik změn k NH₂ a -COOH terminálních regionech. Tyto změny vedou k posunu čtecích rámců, které nejsou slučitelné s konzervovaným ORF, proto se předpokládá, že sekvence získaná z 2,7 kb fragmentu představuje pseudogen (FUT2P). Po subklonování produktu trávení ETHs3 BamHI byly identifikovány hybridizující sekvence obsažené v 8,2 kb EcoRI fragmentu. Získané subklonované sekvence představují 1023 párů bází ORF a jsou z 85 % identické na nukleotidové úrovni a z 83 % identické na aminokyselinové úrovni se sekvencí lidského FUT2. Mez prasečí FUT2 sekvencí a FUT2P sekvencí získanou z 2,7 kb fragmentu bylo pozorováno mnoho rozdílů v NH₂ a -COOH terminálních regionech. Předpokládaná aminokyselinová sekvence odpovídá částečně určené aminokyselinové sekvenci prasečího Sekretoru enzymu (Thurin and Blaszczyk-Thurin, 1995). Prasečí FUT1, FUT2 a FUTP sekvence byly uloženy v genové bance (Gen Bank) po přírůstkovými čísly U70883, U70881 a U70882. FUT1 a FUT2 geny mají vysoce homologní sekvence. Toto bylo bráno v úvahu například při přípravě primerů. Kromě toho enzymová aktivita FUT1 a FUT2 musí být v dalších studiích odlišena.

Příklad 6: Identifikace M307 a M857 mutací a charakterizace M307

DNA byla izolována z prasečích jaderných buněk za použití standardních postupů. Přímé sekvencování prasečích FUT1 a FUT2 sekvencí a jejich sousedních regionů u zvířat různých ECF18R genotypů (BB, bb) vedlo k identifikaci dvou G -> A přenosů v pozicích 307 a 857 (označených M307 a M857). FUT1 ORF. M307 přenos eliminuje restrikční místo pro enzym Cfol. Amplifikace DNA izolované z prasečích jaderných buněk byla provedena pomocí standardních postupů s primery P6 a Pl 1 (3 minuty při 95 °C, 30 cyklů o 30 s při 95 °C, 30 s při 56 °C a 30 s při 72 °C, po kterých následovala 7-minutová konečná extense při 72 °C), a po ní následovalo trávení Cfol a separace na 3% agarosovém gelu, která vedla k polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP). Homozygotní M307^AA zvířata měla 2 proužky (fragmenty o 93 a 328 párech bází). Homozygotní M307^GG zvířata měla fragmenty o 87, 93 a 241 párech bází. Heterozygotní zvířata měla všechny čtyři fragmenty.

Příklad 7: Charakterizace mutace M857

M857 mutace je přesun, který eliminuje Acil místo. Primer PBEST byl navržen tak, aby eliminoval dvě další místa pro Acil v pozicích 866 a 872. PCR s primery P7 a PBEST (3 minuty při 95 °C, 30 cyklů o 30 s při 95 °C, 30 s při 56 °C a 30 s při 72 °C, po kterých následovala 7-minutová konečná extense při 72 °C), po které následovalo trávení Acil, umožnily PCR-RFLP analýzu na 3% agarosovém gelu. Homozygotní Μ857^ΛΑ zvířata vykazovala fragment o 174 párech bází, zatímco amplifikační produkty M857^GG vykazovaly fragmenty o 136 a 38 párech bází.

Příklad 8: Genetické mapování FUT1 genu

V Landrace prasečích rodinách ukázaly rekombinace mez M307 a lokusy HAL vazebné skupiny (S, ECF18R, RYR1, GPI, PGD) rekombinační frakce Θ < 0,04 (tabulka 2). Lod skoré Z pro

-8CZ 298021 B6 celkové rekombinační frakce byly mezi 24,5 a 50,6, což je silným důkazem vazby mezi těmito lokusy. Tato data umožňují genetické mapování FUT1 genu do HAL vazebné skupiny v těsné blízkosti S a ECF18R, které jsou oba ovlivněny FUT1. V pokusných Landrace rodinách byla zjištěna alelická asociace mez ECF18R a RYR1. Větší počet fenotypů RYR1^TT v pozici 1834 a RYR1 (genotyp citlivý na halotan) byl pozorován mezi prasaty resistentními na adematosní onemocnění prasat a průjmová onemocnění po odstavení (genotyp ECF18R^bb) (tabulka 3). Tato asociace alel je důsledkem vazebné nerovnováhy, to znamená odchylky pozorovaných haplotypových frekvencí od očekávaných haplotypových frekvencí při nezávislém dělení alel. Vazebná nerovnováha označuje nenáhodnou asociaci alel náležících do vázaných lokusů. Nicméně, vzhledem k nízké rychlosti rekombinace nemůže být žádný loku ručen jako signifikantně lepší než druhý.

Příklad 9: Asociace M307^A s EDF18R^b a M307^G s ECF18R^b

V Landrace (SL) a Large White (LW) prasatech je ECF18R^b (alela resistence na edematosní onemocnění prasat a na průjmová onemocnění po odstavení) 100% asociována sM307^A aECF18R^B (alela sensitivity na edematosní onemocnění prasat a na průjmová onemocnění po odstavení) 100% asociována s M307^G (kde A je adenin a G je guanin). U SL prasat odpovídá 88% (30/34) S^s všem ECF18R^b a M307^A haplotypům. Odpovídající hodnoty pro oba S^sECF18R^b a S^s-M307^A haplotypy byly 82% (9/11) u Large White prasat. V pokusných SL rodinách byl výskyt M857^A alely v FUT1 lokusu nízký a dokonce nepřítomný u LW prasat. Proto nebyla pozorována signifikantní gametická asociace mez alelami M857 a alelami sousedících genů G -> A přenosy v pozicích FUT11 307 a FUT1 857 byly zjišťovány s variabilními frekvencemi také u Duroc, Hampshire a Pietrain prasat, což naznačuje, že se tyto přenosy mohou vyskytovat také u jiných prasat.

Příklad 10: Distribuce FUT1 genotypů

Tabulka 4 ukazuje, že distribuce FUT1 genotypů v nukleotidové pozici 307 mezi ECF18R typy se statisticky významně odlišuje od očekávaného poměru při hypotéze, že se jedná o dva nezávislé genotypy. Z 119 zvířat ECF18R^b/b resistentních na edematosní onemocnění prasat a na průjmová onemocnění po odstavení mělo 118 genotyp M307^A/A v testu založeném na DNA. Jedno resistentní zvíře mělo genotyp M307^A/G. Ze 131 sensitivních prasat mělo 130 genotyp M307^A/G nebo M307^g/g. Jedno zvíře, citlivé na adhesi E. coli, bylo podle DNA testu homozygotní pro 1^307^. Data z tohoto příkladu a z příkladu 2, spolu s daty předchozích studií naznačují, že FUT1 gen je přítomen v S lokusu prasat a ECF18 lokusu. Ačkoliv 4 zvířata v tomto příkladu a v příkladu 2 neodpovídá hypotese, je pravděpodobné, že tato zvířata byla nesprávně fenotypizována s ohledem na sensitivitu/resistenci k onemocnění.

Příklad 11: Aminokyselinové změny v a(l,2)fukosyltransferase

G -> A změny v páru bází +307 a páru bází +857 genu pro a(l,2)fukosyltransferasu 1 vedou k předpokládané substituci aminokyseliny threoninu (neutrální polární) za alanin (neutrální nepolární) a glutaminu (neutrální polární) za arginin (bazická), kde tyto substituce mohou mít funkční důsledky v kódovaném produktu. C —> T změna v páru bází 229 vede k aminokyselinové substituci leucinu (neutrální nepolární) za fenylalanin (neutrální nepolární).

-9CZ 298021 B6

Tabulka 1: Sekvence kódujících (F) a reversních (R) příměrů a jejich relativní pozice vzhledem k start kodonům prasečí FUT1 a FUT2. (Příměry FUT1 P10 a FT1 PÍ 1 jsou získány z lidského FUT1 genu.)

Jméno primeru	Sekvence primeru	Pozice
FUTl P6 (R)	5'-CTTCAGCCAGGGCTCCTTTAAG-3'	+489
FLJTI P7 (F)	5'-TTACCTCCAGCAGGCTATGGAC-3’	+720
FUTl P10(R)	5’-TCCAGAGTGGAGACAAGTCTGC-3’	+ 1082
FUTl PÍ 1 (F)	5-CTGCCTGAACGTCTATCAAGATC-3'	+69
FUTl PJ6(F)	5'-AGAGTTTCCTCATGCCCACAGG-3'	-90
FUTl P18(R)	5'-CTGCTACAGGACCACCAGCATC-3‘	+1203
FUTl PBEST (R)	5-ACCAGCAGCGCAAAGTCCCTGAC GGGCACGGCCTC-3'	+893
FUT2P16(R)	5-CTCCCTGTGCCTTGGAAGTGAT-3'	+1094
FUT2P17(F)	5-AACTGCACTGCCAGCTTCATGC-3*	-83

Tabulka 2: Celkové rekombinační frakce (Θ), Lod skoré (Z) a počet informativních zvířat (N) pro M307 a lokus HAL vazebné skupiny v Landrace pokusné populaci

Pár lokusů	N	Θ	Z
S-ECF18R	183	0,01	50,6
M307-S	183	0,01	50,6
M307-ECF18R	216	0,01	57,1
M307-RYR1	198	0,02	47,2
M307-GPI	147	0,03	34,2
M307-PGD	147	0,04	24,5

- 10CZ 298021 B6

Tabulka 3: Frekvence haplotypů ve čtyřech lokusech (S-FUT1 (M307, M857)-ECF18R-RYR1) a Landrace (SL) pokusné populaci a u náhodně vybraných Large White (LW) prasat

Odrůda	Haplotyp3 v S-FUT1 (M307, M857)-ECF18R-RYR1)	Frekvence4 (počet)
SL	sAGbT	70 (28)
	SAGbC	5 (2)
	SGGBC	15 (6)
	SGABC	10 (4)
LW	SAGbC	56 (9)
	SGGBC	31 (5)
	SGGBC	13 (2)

³S: supresorový lokus pro A a O krevní typy (S a s).

FUT1 (M307): alterace adeninu (A) na guanin (G) v nukleotidu 307 genu pro oc(l,2)fukosyltransferasu (FUT1). FUT1 (M857): alterace adeninu (A) na guanin (G) v nukleotidu 857 genu pro a(l,2)fukosyltransferasu (FUT1). ECF18R: E. coli F18 receptor. Dominantní alela citlivosti je označena B a resistentní alela je označena b. RYR: ryanodinový receptor kosterního svalu. 10 C (cytosin) je dominantně resistentní a T (thymin) je sensitivní alela pro maligní hypertermii.

⁴ Frekvence haplotypů jsou uvedeny v procesech a absolutní počet je uveden v závorkách.

Tabulka 4: Distribuce genotypů, tetrachorické korelace (r) a statistická významnost asociace (x²aVx x²) asociovaných polymorfních FUT1 (M307) a ECF18R lokusů u Landrace (SL) pokusné populace a u náhodně vybraných Large White (LW) prasat

FUT1/M307
Odrůda Lokus genotyp	A/G	A/A r	x2	W2 X X5
SL	ECF18R6 b/b B/b	1 106	113 0,98 1	213,1	42,6***
	genotyp	A/G, G/G	A/A
LW	ECF18R6 b/b B/b, B/B	0 24	5 1,0 0	29,0	11,6***

- 11 CZ 298021 B6

Hmotnostní faktor w = 0,2 (SL) a 0,4 (LW) byl použit pro korekci chybění přesných výsledků vzniklých v důsledku zahrnutí příbuzných zvířat do dat, podle Cottermana (1947).

*** p <0,001.

⁶ Zvířata genotypu b/b v ECF18R lokusu jsou resistentní a zvířata genotypů B/b a B/B jsou citlivá na adhesi bakterií F18ab E. coli.

Způsoby

1. Primery

Příměry odvozené z lidského FUT1 genu byly použity pro amplifíkaci svého prasečího protějšku s genomové DNA. Z výsledných prasečích sekvencí byly navrženy specifické primery, které byly použity v další amplifíkaci a sekvencovacích reakcích (tabulka 1).

2. Vyhledávání v prasečí genomové knihovně

Prasečí genomové knihovny byly vyšetřovány buď prasečí FUT1 sondou získanou za použití příměrů P7 a P10, nebo prasečí FUT1 cDNA. Prasečí genomová knihovna, vytvořená v SuperCosl (Stragene, La Jolla, CA, USA) byla vyšetřována s dATP značenou a³²P (Prime It II, Stratagene) FUT1 sondou získanou z prasečí genomové DNA pomocí příměrů P7 a P10. Po hybridizaci dvojitých filtrů při 42 °C po dobu 15 hodin (50% formamid, 6 x SSC, 5 x Denhartův roztok, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml lososího spermatu) a dvojím promytím při 65 °C po dobu 30 minut (lxSSC, 0,1% SDS) byly identifikovány pozitivní kolonie po expozici na rentgenovém filmu (15 h, -80 °C).

3. In sítu hybridizace prasečích chromosomů v metafázi

Kosmidové klony ETHsl, ETHs2, ETHs3, ETHs4 a ETHs6 byly předmětem fluorescentní in sítu hybridizace (FISH) (Solinas Toldo a kol., 1993) nebo přímé in sítu chromosomální PCT (DISC PCR) na prasečích chromosomech v metafázi. Chromosomy v metafázy byly barveny na Q-proužky a byly vyfotografovány před hybridizací. Sondy byly značeny náhodným „primingem“ za použití biotin-16-dUTP. Detekce signálu a amplifíkace byly provedeny za použití avidin-FITC a biotynylovaného anti-avidinu. Chromosomy byly kontrastně barveny 4,6diamidino-2-fenylindolem a relativní pozice kosmidů byly určeny způsobem, který popsal Solinas Toldo, 1993.

4. Subklonování

Produkty enzymatického trávení genomových kolonií pozitivní na sondu byly separovány na agarosovém gelu, byly přeneseny na nylonovou membránu a proužky obsahující sondu byly subklonovány do plasmidů pro sekvencování FUT1. Sekvence FUT1 získaná tímto způsobem je uvedena na obr. 1.

Všechny kosmidy byly tráveny KspI, EcoRI a KspI/EcoRI a produkty trávení byly separovány na 0,8% agarosovém gelu a byly přeneseny na Hybond N nylonovou membránu (Meijerick a kol., 1997). Tento blot byl hybridizován s a³²P dATP značenými produkty PCR prasečí FUT1 (primery P6-P11 a P7-P10). Na základě autoradiografíckých signálů byly ETHsl, -s2 a -s3 podrobeny dalšími subklonování do pBluescript SK— a (Stratagene) a FUT sekvence byly určeny z těchto subklonů. Sekvence dvou FUT-podobných otevřených čtecích rámců (ORF) (FUT1 aFUT2) získané zkomsidů ETHs2 a -s3 byly srovnávány sECF18R pozitivními (BB/Bb) a negativními (bb) zvířaty pomocí přímého sekvencování PCR produktů.

- 12CZ 298021 B6

5. Polymerasová řetězová reakce a přímé sekvencování

Za použití Perkin Elmer Ready Reaction Dye Terminátor kitu (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) a 10 pmol primerů bylo provedeno cyklické sekvencování s teplotním programem stávajícím z počáteční denaturace při 95 °C po dobu 5 minut, po které následovalo 25 cyklů při 95 °C po dobu 30 s, 50 °C po dobu 15 s a 60 °C po dobu 4 minut. Primery použité pro amplifikaci a sekvencování prasečích genů pro α( 1,2)fukosyltransferasu jsou uvedeny v tabulce 1. Další primery byly navrženy tak, že braly v úvahu křížové anelování primerů způsobené značnou podobností FUT1, FUT2 a FUT2 pseudogenu. Vzorky byly analyzovány na 373A ABI sekvenátoru (Applied Biosystems lne.) a analýza sekvence byla provedena s GCG výbavou (Devereux, 1984).

6. Produkce informativního potomstva

Polymorfísmy v jednom nukleotidu byly analyzovány na 221 Landrace prasatech, která byla potomky 4 vepřů a 16 prasnic ana 29 Large White (LW) prasetech, která byla potomky 9 páření mezi nepříbuznými prasaty. Pro produkci většího počtu informativního potomstva pro vyšetřování vazby mezi prasečími geny kódujícími ECF18 receptory a vybranými lokusy polymorfismu byly provedeny pouze informativní Landrace křížení B/b x b/b.

7. Test kolonizace

Ve studii provedené Bertschingerem a kol., 1933, byla výše uvedená Landrace prasata také testována na sensitivitu pro ECF18 v estu kolonizace. Pro tento test byla prasata inokulována těsně po odstavení bakteriemi E. coli kmenu 124/76 serotypu O139:K12(B):H1 :F18 (Rippinger a kol., 1995). Bakterie ve stolici byly sledovány každý den. Rozsah kolonizace byl vypočítán jako průměr dvou nejvyšších fekálních skóre. Prasata s fekálním skóre 3,5, které odpovídá 6,7 log kolony tvořících jednotek (CFU)/g nebo více, byla považována za sensitivní pro kolonizaci. Tento limit byl stanoven na základě chybění mortality pod touto hodnotou a na skóre získaných od plně resistentních selat.

8. Vazebná analýza nukleotidových polymorfísmů

Výsledky jednonukleotidových polymorfísmů byly srovnávány stypizačními daty po ECF18R, která byla získána v in vitro adhesním testu, jak jej popsal Vogeli a kol. (1996), a s typizačními daty pro GPI-, PGD-, a-l-B-glykoprotein-(AlBG), ryanodinový receptor (RYR1), EAHa S-lokusy, jak je popsán Vogeli a kol. (1996). Analýza párové vazby a výpočet rekombinačních frakcí byly provedeny za použití CRI-MAP verze 2.4 programu (Gren a kol., 1990). Analýza vícebodové vazby byla provedena sekvenční insercí výše uvedených lokusů do mapy. Haplotypové frekvence byly vypočítány z povodních zvířat, pro Landrace rodiny a pro 8 rodičovský Large White zvířat, které byly haplotypovány na ECF18R z informací o potomstvu. Tetrachorické korelace ECF18R a mutací vFUTl (FUT1/M307) (polymorfísmy) byly vypočítány na všem Landrace potomstvu a Large White potomstvu.

9. Southem blot analýza

Byla provedena Southerb blot analýza kosmidů ETHsl, ETHs2 a ETHs3) po trávení enzymy KspI, EcoRI a KspI/EcoRI a po separaci na 0,8% agarose. Hybridizace s a³²P dATP značeným 5-FUT1 fragmentem (primery P6-P11) vedla kvzniku stejného hybridizujícího proužku o 940 párech bází pro produkty trávení KspI a KspI/EcoRI. Nicméně, hybridizace s 3-FUT1 fragmentem (primery P7-P10) (tabulka 1) ukázala 6,2kb KspI proužek a 1,1 kb KspI/EcoRI. Jak 5', tak 3' FUT1 fragmenty hybridizují na stejný 4,6kb EcoRI fragment. Tato skutečnost ukazuje na přítomnost KspI místa e FUT1 genu obsaženém v kosmidu ETHs2. Křížová hybridizace 3-FUT1 fragmentu detekuje 2,7kb a 8,2kb proužky, což vede k identifikaci sekvence FUT2 pseudogenu (nekompletní ORF) a FUT2 genu.

- 13 CZ 298021 B6

10. Polymorfísmus restrikčních fragmentů

Detekce (A) M307 G na A a (Β) M857 G na A mutace v prasečím FUT1 genu je dosažena analýzou polymorfísmu délky restrikčních fragmentů, za použití různých restrikčních enzymů. Trávení amplifikovaných FUT1 fragmentů Cfol (A) a Acil (B) vede k polymorfísmu restrikčních fragmentů (Meijerink a kol., 1997). (A) M307^A/A genotyp vytváří restrikční fragmenty délky 328 a 93 párů bází, zatímco M307^G/G genotyp vytváří restrikční fragmenty délky 93, 241 a 87 párů bází a heterozygotní M307^A/G genotyp vytváří všechny čtyři fragmenty.

(B) Trávení M857^A/A genotypu vytváří fragmenty délky 174 párů bází, zatímco trávení M857^G/G genotypu vytváří restrikční fragmenty délky 136 a 38 párů bází a trávení M857^AG genotypu vytváří všechny tři fragmenty.

11. Zdroj prasat

Data pro Swiss Landrace pokusnou populaci jsou získána ze dvou rodokmenů, které byly zjištěny v Institute of Veterinary Bycteriology, University of Zurich. Všechna ostatní prasata Large White, Swiss Landrace, Duroc, Hampshire a Pietrain plemen pocházela z různých chovných stád ve Švýcarsku. Ostatní prasata byla náhodně získána z farem na středozápadě USA.

Citované dokumenty:

Bertschinger et al. (1993) Veterinary Microbiology 33:79-89.

Cottermann (1947) Contrib. Lab. Verlebr. Biol. Univ. Mich. 33:1-21.

Cohney et al. (1996) Immunogenetics 44:76-79:

Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Res. 1:387-395.

Fujii et al. (1991) Science 253:448—451.

Green, et al. (1990) Documentation for CRI-MAP, Version 2.4, St. Louis: Washington University School of Medicine.

Kelly et al., (1994), Proč. Nati. Acad. Sci., USA. 91:5843-5847.

Meijerink, et al., (1997) Mamm, Genome 8:736-741.

Rippinger (1995) Vet. Microbial. 45:281-295.

Solinas Toldo et al.. (1993) Mamm. Genome 4: 720-727.

Thurin adn Blaszczyk-Thurin, (1995). J. Biol. Chem. 270 (44): 26577-265780.

Vógeli et al. (1996) Animal Genetics 27:321-328

Vogeli e/ al. (1997) Schweiz. Arch. Tierheilk. 139:479-484.

Pat. US 5 358 649, Maclennon et al.

Pat US 5 552 144, Valery et al.

WO 8604604 9877P, Inventor: Peterson.

- 14CZ 298021 B6

WO 9628967, Inventor: Koike, C.

WO 9413811, Inventors: Imberechts and Lintermans.

TW 266264, Inventors: Jeng and Liou.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (13)

1. Způsob pro identifikaci prasat resistentních na kolonizaci střeva E. coli, které je schopno vazbyECF18Ruprasete,vyznačující se tím, že

a) určení, zdaje přítomen genetický polymorfísmus v genu prasete pro oc(l,2)fukosyltransferasu 1 o SEQ ID NO: 12, kde dusíkatou bází v pozici 307 je adenin, nebo polymorfísmus v alelické asociaci s polymorfísmem v genu pro FUT1, který má adenin v pozici 307, v biologickém vzorku od prasete; a

b) pokud je prase homozygotní pro polymorfísmus v genu pro FUT1 nebo polymorfísmus v alelické asociaci s ním, tak určení prasete jako resistentního prasete.

2. Způsob pro identifikaci prasat resistentních na střevní onemocnění způsobená mikroorganismem E. coli F18 schopným se vázat na ECF18R u prasete, resistentních na kolonizaci střeva E. coli, které je schopno vazby ECF18R u prasete, vyznačující se tím, že zahrnuje

a) určení toho, zda v biologickém vzorku od prasete je dusíkatou bází v pozici 307 v genu pro a(l,2)fukosyltransferasu 1 o SEQ ID NO: 12 pouze adenin; a

b) identifikaci prasete jako resistentního tehdy, je-li dusíkatou bází v pozici 307 adenin.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, v y z n a č u j í c í se t í m , že E. coli je kmen F18.

4. Izolovaná molekula DNA, kódující gen pro α( 1,2)fukosyltransferasu 1 u prasat, kde dusíkatou bází v genu pro oc(l,2)fukosyltransferasu 1 v pozici 307 je adenin, přičemž gen pro FUT1 obsahuje SEQ ID NO: 12.

5. Izolovaná molekula DNA podle nároku 4, která má sekvenci nukleotidů uvedenou jako SEQ ID NO: 12.

6. Izolovaná molekula DNA podle nároku 5, ve které je místo guaninu v nukleotidové pozici 307 adenin.

7. Izolovaná molekula DNA, která je komplementární k nukleotidové sekvenci podle nároku 5 nebo 6.

8. Izolovaná molekula DNA podle nároku 5 se substitucí adeninu za guanin v nukleotidové pozici 857.

9. Izolovaná molekula DNA podle nároku 5 s thyminem v nukleotidové pozici 229.

10. Polypeptid kódovaný molekulo DNA podle nároku 4 nebo 5, kde uvedená molekula má α( 1,2)fukosyltransferasovou aktivitu.

- 15CZ 298021 B6

11. Fragment izolované molekuly DNA podle nároků 4, 5 nebo 7, který obsahuje pozici 307.

12. Vektor obsahující molekulu DNA podle některého z nároků 4 až 9 a 11.

13. Buňka transformovaná vektorem podle nároku 12.

2 výkresy

- 16CZ 298021 B6

Obr. 1

H w V P s R R H L c L T F L L V C 17 CT CGA GCC ATG TGG GTC ccc ' AGC : CGC : ccc : CAC CTC TGT CTG ACC TTC CTC ; CTA GTC TGT 51 v L A A I F F L N V Y Q D L F Y S G L D 37 GTT TTA GCA GCA ATT TTC TTC CTG AAC GTC TAT CAA GAC CTC TTT TAC ΜΠ GGC TTA . GAC 111 L L A L C P D H H V V S £ P V A I F C L 57 CTG CTG GCC CTG TGT CCA GAC CAT AAC GTG GTA TCA TCT ccc GTG GCC ATA TTC TGC CTG 171 A G T P V H P H A s D s c P K H P A s F 77 GCG GGC ACG CCG GTA CAC CCC AAC GCC TCC GAT TCC TGT ccc AAG CAT CCT GCC TCC TTT 23 1 s G T w T I Y P D G R F G N 0 M G Q Y A 97 TCC GGG ACC TGG ACT ATT TAC CCG GAT GGC CGG TTT GGG AAC CAG ATG GGA CAG TAT GCC 291 T L L A L A Q L N G R Q A F I Q P A M H 117 ACG CTG CTG GCC CTG Qcg CAG CTC AAC GGC CGC CAG GCC TTC ATC CAG CCT GCC ATG CAC 35 1 A V L A P V F R I T L P V L A P £ V 0 R 137 GCC GTC CTG GCC CCC GTG TTC CGC ATC ACG CTG CCT GTC CTG GCG CCC GAG GTA GAC AGG 411 H A P W R E L r L H D w H S E D Y A H L 157 CAC GCT CCT TGG CGG GAG CTG GAG CTT CAC GAC TGG ATG TCC GAG GAT TAT GCC CAC TTA 47 1 K E P w L K L T G F P c S w T F F H H L 177 AAG GAG ccc TGG CTG AAG CTC ACC GGC TTC CCC TGC TCC TGG ACC TTC TTC CAC CAC CTC 53 1 R E 0 I R s E F T L H D H L R Q E A 0 G 197 CGG GAG CAG ATC CGC AGC GAG TTC ACC CTG CAC GAC CAC CTT CGG CAA GAG GCC CAG GGG 591 V L S 0 F R L P R T G D R P S T F V G V 217 GTA CTG AGT CAG TTC CGT CTA CCC CGC ACA GGG GAC CGC CCC AGC ACC TTC GTG GGG GTC 65 1 H v R R G D Y L R V H P ^; K R W K G V v G 237 CAC GTG CGC CGC GGG GAC TAT CTG CGT GTG ATG CCC AAG CGC TGG AAG GGG GTG GTG GGT 71 1 D G A γ L 0 Q A M P W F R A R Y E A P V 257 GAC GGC GCT TAC CTC CAG CAG GCT ATG GAC TGG TTC CGG GCC CGA TAC GAA GCC CCC GTC 77 1 Γ V v T s » G M E w c R í: N I D T s R G 277 TTT GTG GTC ACC AGC AAC GGC ATG GAG TGG TGC CGG AAG AAC ATC GAC ACC TCC CGG GGG 83 1 D V I r A G D G R E A A P A R D Γ A L L 297 GAC GTG ATC TTT GCT GGC GAT GGG c©; GAG GCC GCG ccc GCC AGG GAC TTT GCG CTG CTG 89 1 V 0 C H H T I M T I G T F G Γ w A A Y L 317 GTG CAG TGC AAC CAC ACC ATC ATG ACC ATT GGC ACC TTC GGC TTC TGG GCC GCC TAC CTG 95 1 A G G D T I T L A H F T L P T S s F L K 337 GCT GGT GGA GAT ACC ATC TAC TTG GCT AAC TTC ACC CTG CCC ACT TCC AGC TTC CTG AAG 101 1 I r í: P E A A - L P r w V G I H A D L S 357 ATC TTT AAA CCC GAG GCT GCC TTC CTG CCC GAG TGG GTG GGC ATT AAT GCA GAC TTG TCT 107 1 P L 0 M L A G P 365 CCA CTC CAG ATG TTG GCT GGG CCT TGA ACC AGC CAG GAG CCT TTC TGG AAT AGC CTC GGT 1131 CAA ccc AGG GCC AGC GTT ATC 1 CTC CGG AAG CCC GAG TAA CTT CCG GAG ATG CTG GTG 119 1 GTC CTG TAG CAG GCT GGA CAC TTA TTT CAA GAG TGA TTC TAA TTG GCT GGA CTC AGA GGA 125 1 AAC CCT GCA G 1261

- 17CZ 298021 B6

Obr. 2

SEQ.ID.No.12

H W V P S R R L C L T F L L V C 17 CT CGA GCC Atg TGG GTC ccc AGC CGC CGC CAC CTC TGT CTG ACC TTC CTC CTA GTC TCT 51 v L A A I F Γ L H V Y Q D L Γ Y s G L· P 37 GTT TTA GCA GCA ATT TTC ttc CTG AAC GTC TAT CAA GAC CTC TTT TAC AGT GGC TTA GAC 111 L L A L C P D H N V V S S P v A I F C L 57 CTC CTC GCC CTG TGT CCA GAC CAT AAC GTG GTA TCA TCT CCC GTG GCC ATA TTC TGC CTG 171 A G T P V H P N A S P s C P X H P A s F 77 CCG GCC ACG CCG GTA CAC ccc AAC GCC TCC GAT TCC TGT CCC AAG CAT CCT GCC TCC TTT 231 s G T W T I Y P 0 G R F G ti C M G Q Y A 97 TCC GGG ACC TGG xcr ATT TAC CCG GAT GGC CGG TTT GGG AAC CAG ATG GGA CAG TAT GCC 291 T L L A L A Q L H G R Q A F I 0 P A H H 117 ACC CTC CTG GCC CTG GfcG CAG CTC AAC GGC CGC CAG GCC TTC ATC CAG CCT GCC ATG CAC 351 A V L A P V F R I T L P V L A P E V P R 137 GCC CTC CTC GCC CCC GTG TTC CGC ATC ACG CTG CCT GTC CTG GČG CCC GAG GTA GAC AGG 41 1 H A P H R E L E L II D H H s ε D Ϊ A H L 157 CAC GCT CCT TGG CGG GAG CTG GAG CTT CAC GAC TGG ATG TCC GAG GAT TAT GCC CAC TTA <71 K E P H L K L T G F P C S H T F F H H L 177 AAG GAG CCC TGG CTG AAG CTC ACC GGC TTC CCC TGC TCC TGG ACC TTC TTC CAC CAC CTC 531 R E 0 I R. S E F T L H D H L R Q E A Q G 197 CCG GAG CAG ATC CGC AGC GAG TTC ACC CTG CAC GAC CAC CTT CGG CAA GAG GCC CAG GGG 591 V L s 0 F R L P R T G D R P S T F V G V 217 OTA CTG AGT CAG TTC CGT CTA CCC CGC ACA GGG GAC CGC ccc AGC ACC TTC GTG GGG GTC €51 H V R R G P Y L R V H P K R W K G V V G 237 CAC GTC CCC CGC GGG GAC TAT CTG CGT GTG ATG CCC AAG CGC TGG AAG GGG GTG GTG GGT 711 P G A Y L Q Q A M P W F R λ R Y E A P V 257 GAC GCC GCT TAC CTC CAG CAG GCT ATG GAC TGG TTC CGG GCC CGA TAC GAA GCC CCC GTC 77 I r V V T S II G M E V C R R N I D T S R G 277 TTT GTG GTC ACC AGC AAC GGC ATG GAG TGG TGC CGG AAG AAC ATC GAC ACC TCC CGG GGG 831 0 V I r A G D G R E A A P A R D F A L L 297 GAC GTG ATC TTT GCT GCC GAT GGG C«G GAG GCC GCG CCC GCC AGC GAC TTT GCG CTG CTG 891 V 0 c tl H T I M T I G T F G F W A A Y L 317 GTG CAC TGC AAC CAC ACC ATC ATG ACC ATT GGC ACC TTC GGC TTC TGG GCC GCC TAC CTG 95 1 A C C 0 T I Y L A tl F T L P T S s F L i; 337 CCT GGT CGA CAT ACC ATC TAC TTG GCT AAC TTC ACC CTG ccc ACT TCC AGC TTC CTG AAG 101 1 I f K P E A A Γ L P E W V G I ti A D L S 357 ATC TTT AAA CCC GAG GCT GCC TTC. CTG CCC GAG TGG GTG GGC ATT AAT GCA GAC TTG TCT 107 1 P L 0 H L A G P 365 CCA CTC CAG ATG TTG GCT GGG CCT TGA ACC AGC CAG GAG CCT TTC TGG AAT AGC CTC GGT 1131 C/xA ccc AGG GCC AGC GTT ATG GGT CTC CGG AAG CCC GAG ΤΛΑ CTT CCG GAG ATG CTG GTG 1191 GTC CTG TAC CAG CCT GGA CAC TTA TTT CAA GAG TGA ttc ΤΛΑ TTG GCT GGA CTC AGA GGA 12S1